Αφηρημένο

Αν και τα αποτελέσματα της σαγκουϊναρίνη, ένα αλκαλοειδές βενζοφαινανθριδίνης, σχετικά με την αναστολή ορισμένων ειδών ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων έχουν καθιερωθεί, οι υποκείμενοι μηχανισμοί δεν είναι πλήρως κατανοητοί. Αυτή η μελέτη διερεύνησε πιθανοί μηχανισμοί με τους οποίους σαγκουϊναρίνη ασκεί αντικαρκινική δράση της σε καλλιέργειες καρκίνου της ουροδόχου κύστης ανθρώπινες κυτταρικές σειρές (Τ24, EJ, και 5637). θεραπεία σαγκουϊναρίνη οδήγησε σε συγκέντρωση-απόκριση αύξησης αναστολή των καρκινικών κυττάρων κύστης με επαγωγή απόπτωσης. Σαγκουϊναρίνη απόπτωση συσχετίστηκε με την ανοδική ρύθμιση του Βαχ, το προς τα κάτω ρύθμιση της προσφοράς και ΧΙΑΡ, την ενεργοποίηση των κασπασών (-3, -8, -9 και), και η παραγωγή αυξήθηκε αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) . Το ROS καθαριστής Ν-ακετυλο κυστεϊνη (NAC) αντέστρεψε πλήρως τις σαγκουϊναρίνη-σκανδαλιζόμενο αποπτωτικά γεγονότα. Επιπλέον, σαγκουϊναρίνη αύξησε αποτελεσματικά την ενεργοποίηση του c-Jun Ν-τερματικής κινάσης (JNK) και η έκφραση της πρώιμης απόκρισης ανάπτυξης γονίδιο-1 (Egr-1), η οποία ανακτήθηκε με προεπεξεργασία με NAC. Επιπλέον, knockdown του

Egr-1

έκφραση με μικρό παρεμβαλλόμενο RNA εξασθενημένος σαγκουϊναρίνη απόπτωση, αλλά όχι τον αναστολέα JNK, υποδεικνύοντας ότι η παρακολούθηση της παραγωγής ROS μπλοκάρει τις σαγκουϊναρίνη επαγόμενη αποπτωτικά αποτελέσματα μέσω απορρύθμιση της έκφρασης του πρωτεΐνες Egr-1. Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα παρέχουν αποδείξεις ότι σαγκουϊναρίνη είναι ένας ισχυρός αντικαρκινικός παράγοντας, η οποία αναστέλλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων κύστης και επάγει την απόπτωση τους μέσω της παραγωγής ελεύθερων ριζών

Παράθεση:. Han MH, Πάρκο C, Jin CY , Kim GY, Chang YC, Σελήνη SK, et al. (2013) Η απόπτωση Πρόκληση ανθρώπινα κύτταρα καρκίνο της ουροδόχου κύστης από σαγκουϊναρίνη μέσω δραστικών μορφών οξυγόνου Μεσολαβεί Up-κανονισμός του Early Growth Response Gene-1. PLoS ONE 8 (5): e63425. doi: 10.1371 /journal.pone.0063425

Επιμέλεια: Subhash Gautam, Henry Ford Health System, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 19 Φεβρουαρίου του 2013? Δεκτές: 1 Απρίλη του 2013? Δημοσιεύθηκε: May 22, 2013

Copyright: © 2013 Han et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών της Κορέας (NRF) επιχορήγηση που χρηματοδοτείται από την κυβέρνηση της Κορέας (2012 – 0000476 και 2012046358). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

βενζο [c] αλκαλοειδή φαινανθριδίνης (BAS) είναι μια σχετικά μικρή ομάδα isochinoline αλκαλοειδή, τα οποία έχουν εντοπιστεί σε πολλά είδη φυτών των οικογενειών Papaveraceae, Fumariaceae, Ranunculaceae και Rutaceae [1]. Σαγκουϊναρίνη είναι ένα άλας τεταρτοταγούς αμμωνίου που ανήκουν σε αυτή την ομάδα του BAS. Έχει εξαχθεί από ορισμένα φυτά, συμπεριλαμβανομένων bloodroot (

Sanguinaria canadensis

L.), του Μεξικού φραγκοσυκιές παπαρούνας

Argemone Mexicana

L.,

Chelidonium majus,

και

Macleaya cordata

. [2], [3]. Σαγκουϊναρίνη έχει αποδειχθεί ότι διαθέτει ισχυρή αντιβακτηριακή και αντι-φλεγμονώδεις ιδιότητες [4] – [6]. Πρόσφατα δεδομένα έδειξαν επίσης ότι αυτή η ένωση μπορεί να επάγει απόπτωση σε ποικιλία καρκινικών κυτταρικών σειρών

in vitro

? ωστόσο, δεν δείχνουν οποιεσδήποτε τοξικές επιδράσεις σε φυσιολογικά κύτταρα όταν χορηγείται σε παρόμοιες δόσεις [7] – [16]

Αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) είναι άκρως αντιδραστικά μόρια.. Περιλαμβάνουν ρίζες υπεροξειδίου ανιόν, υπεροξείδιο του υδρογόνου, μονήρες οξυγόνο, και ρίζες υδροξυλίου. ROS γενικά προέρχονται από το φυσιολογικό μεταβολισμό του οξυγόνου, και τα μιτοχόνδρια είναι η κύρια πηγή των ROS. Αν και τα βασικά επίπεδα των ROS χρησιμεύσει ως φυσιολογικός ρυθμιστής σε κανονική πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των κυττάρων, τα υψηλά επίπεδα των ROS μπορεί να προκαλέσει σοβαρή βλάβη στο DNA και τις πρωτεΐνες, οδηγώντας σε απόπτωση [17] – [19]. Επιπλέον, η υπερβολική οξειδωτικό στρες απευθύνεται συγκεκριμένα σε μιτοχόνδρια, προκαλώντας απώλεια της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικό (

ΔΨm

) και τα μιτοχόνδρια απόπτωση που διαμεσολαβείται [17] – [19]. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι η παραγωγή των ROS από σαγκουϊναρίνη ξεκινά καταρράκτες των σημάτων κυτταρικού θανάτου σε ορισμένες ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές

in vitro

[12], [13], [15].

αντιδραστικού οξυγόνου είδη (ROS) είναι άκρως αντιδραστικά μόρια. Περιλαμβάνουν ρίζες υπεροξειδίου ανιόν, υπεροξείδιο του υδρογόνου, μονήρες οξυγόνο, και ρίζες υδροξυλίου. ROS γενικά προέρχονται από το φυσιολογικό μεταβολισμό του οξυγόνου, και τα μιτοχόνδρια είναι η κύρια πηγή των ROS. Αν και τα βασικά επίπεδα των ROS χρησιμεύσει ως φυσιολογικός ρυθμιστής σε κανονική πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των κυττάρων, μελέτες έχουν δείξει ότι τα υψηλά επίπεδα των ROS μπορεί να προκαλέσει σοβαρή βλάβη στο DNA και τις πρωτεΐνες, οδηγώντας σε απόπτωση [17] – [19]. Επιπλέον, η υπερβολική οξειδωτικό στρες απευθύνεται συγκεκριμένα σε μιτοχόνδρια, προκαλώντας απώλεια της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικό (

ΔΨm

) και τα μιτοχόνδρια απόπτωση που διαμεσολαβείται [17] – [19]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η παραγωγή των ROS από σαγκουϊναρίνη ξεκινά καταρράκτες των σημάτων κυτταρικού θανάτου σε κάποια ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών

in vitro

[12], [13], [15].

Μεταξύ πολλές οξειδοαναγωγικές-ρυθμιζόμενα γονίδια, η πρώιμη ανάπτυξη απόκριση-1 (Egr-1), ένα ψευδαργύρου-δακτύλου μεταγραφικού παράγοντα, έχει ενδιαφέρον, διότι ταχέως και παροδικά που προκαλείται από μια σειρά εξωκυτταρικών ερεθισμάτων [20] – [22] και από όλες οι επαγωγείς των ROS μεσολάβηση σηματοδότησης και φλεγμονής [23] – [28]. Ως εκ τούτου, το Egr-1 μπορεί να διαδραματίσει κρίσιμο ρόλο στο συντονισμό κυτταρικά γεγονότα που ακολούθησαν oxidantive στρες [29] – [31]. Ωστόσο, ο ρόλος του Egr-1 στην απόπτωση μονοπάτια που ενεργοποιούνται από ROS στα κύτταρα του καρκίνου σηματοδότησης σε επεξεργασία με σαγκουϊναρίνη δεν έχει οριοθετηθεί.

Η παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν οι κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου της ουροδόχου κύστης, Τ24, EJ, και 5637, να εξετάσει την κυτταροτοξική αποτελεσματικότητα του σαγκουϊναρίνη και για τη διερεύνηση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν την αποπτωτική δραστηριότητα που προκαλείται από σαγκουϊναρίνη. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι οδοί σηματοδότησης αποπτωτικά σαγκουϊναρίνη επαγόμενη διαμορφωμένου την δραστικότητα του Bcl-2 και ο αναστολέας της πρωτεΐνης απόπτωσης (ΙΑΡ) οικογένεια πρωτεϊνών και οδήγησε σε μιτοχονδριακή δυσλειτουργία, την ενεργοποίηση των κασπασών, και την επαγωγή της Egr-1. Τα αποτελέσματα έδειξαν επίσης ότι οι ROS είναι κρίσιμη ρυθμιστές των σαγκουϊναρίνη που προκαλείται από αποπτωτικά γεγονότα.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture and Cell Βιωσιμότητας Δοκιμασία

Ανθρώπινο κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης ( Τ24, EJ, και 5637) ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640, συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS, Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA) και 1% πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη στους 37 ° C σε ένα υγρό περιβάλλον που περιέχει 5% CO

2. Σαγκουϊναρίνη (Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, ΜΟ, USA) διαλύθηκε σε μεθανόλη ως ένα διάλυμα στοκ σε μια συγκέντρωση 10 mM και φυλάχτηκε σε δείγματα στους -20 ° C. Για τη μελέτη βιωσιμότητας κυττάρων, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο. Μετά από 24 ώρες σταθεροποίηση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις σαγκουϊναρίνη για περαιτέρω 24 ώρες. Μετά την κατεργασία, η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ, Sigma-Aldrich), το οποίο βασίζεται στην μετατροπή του ΜΤΤ προς ΜΤΤ φορμαζάνης από μιτοχονδριακά ένζυμα.

πυρηνική χρώση με ϋΑΡΙ

Μετά την κατεργασία των κυττάρων με σαγκουϊναρίνη για 24 ώρες, αυτά συλλέχθηκαν, πλύθηκαν σε παγωμένο ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS), και μονιμοποιήθηκαν με 3,7% παραφορμαλδεΰδη (Sigma-Aldrich) σε PBS για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα στερεωμένα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και βάφτηκαν με 4,6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλιο (ϋΑΡΙ, Sigma-Aldrich) διαλύματος (2,5 μg /ml) για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Αλλαγές στην πυρηνική μορφολογία των κυττάρων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Carl Zeiss, Germany).

Flow Cytometry Ανάλυση για το υπο-G1 φάση

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν μία φορά με PBS, σταθεροποιήθηκαν σε παγωμένο 70% αιθανόλη, και αποθηκεύθηκαν στους 4 ° C. Πριν από την ανάλυση, τα κύτταρα πλύθηκαν και πάλι με PBS, αιωρήθηκαν σε 1 ml ενός ιωδιούχου κρύο προπίδιο (ΡΙ, Sigma-Aldrich) διάλυμα που περιέχει 100 mg /ml RNase Α, 50 μg /ml ΡΙ, 0.1% (w /v) κιτρικό νάτριο, και 0.1% (ν /ν) ΝΡ-40 και περαιτέρω επωάσθηκε επί πάγου για 30 λεπτά στο σκοτάδι. αναλύσεις κυτταρομετρίας ροής εκτελέστηκαν χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής (FACS Calibur? Becton Dickinson, San Jose, CA, USA), και το Cell-Quest Pro λογισμικό χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η σχετική περιεκτικότητα DNA με βάση την παρουσία του ερυθρού φθορισμού [19].

Ανίχνευση απόπτωσης με Annexin-V FITC Χρώση

Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και επαναιωρήθηκαν σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης αννεξίνης-ν που περιέχει 10 mM HEPES /NaOH (ρΗ 7.4), 140 mM NaCl και 2,5 mM ΟαΟ

2. Δείγματα των κυττάρων επωάστηκαν με ισοθειοκυανική αννεξίνης-ν φλουορεσκεΐνη (FITC amp, Ε &? D Systems? Minneapolis, ΜΝ, USA), αναμίχθηκαν και επωάστηκαν για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. ΡΙ σε συγκέντρωση 5 μg /ml προστέθηκε για να διακρίνει τα νεκρωτικά κύτταρα. Τα αποπτωτικά κύτταρα (V

+ /ΡΙ

-). Μετρήθηκαν με κυτταρόμετρο ροής

Μέτρηση Ενδοκυττάρια ROS

παραγωγή ROS παρακολουθήθηκε χρησιμοποιώντας το σταθερό μη πολικών βαφής 2, 7 διχλωροφθορεσκεϊνης διοξεικό (DCFH-DA, Sigma-Aldrich). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων και επωάζονται παρουσία ή απουσία σαγκουϊναρίνη για διαφορετικές χρονικές περιόδους. Αργότερα, τα κύτταρα επωάστηκαν με 10 mM DCFH-DA για 30 λεπτά. Η παραγωγή ROS στα κύτταρα παρακολουθήθηκε με ένα κυτταρόμετρο ροής χρησιμοποιώντας το λογισμικό pro κυττάρων-Quest [32]. Η παραγωγή ενδοκυτταρικής ROS παρακολουθήθηκε επίσης από την εκπομπή φθορισμού της DCFH-DA εντός των κυττάρων χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού.

Protein Extraction και κηλίδωση Western

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν δύο φορές σε PBS στους 4 ° C. Σύνολο κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε λύση σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (40 mM Tris [ρΗ 8,0], 120 mM NaCl, 0,5% ΝΡ-40, 0,1 mM ορθοβαναδικό νάτριο, 2 μg /ml απροτινίνη, 2 μg /ml λευπεπτίνη, και 100 μg /ml φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονυλοφθορίδιο). Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν, και οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία πρωτεΐνης Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για την ανάλυση του στυπώματος Western, ίσες ποσότητες εκχυλίσματα πρωτεΐνης προέρχονται από πήγματα SDS-πολυακρυλαμιδίου και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Schleicher & amp? Schuell, Keene, ΝΗ, USA) με ηλεκτροκηλίδωση. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% άπαχο ξηρό γάλα σε PBS με Tween 20 ρυθμιστικό διάλυμα (PBS-T) (20 mM Tris [ρΗ 7,5], 100 mM NaCl, και 0.1% Tween 20) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με τα πρωτεύοντα αντισώματα, ανιχνεύθηκαν με δευτεροταγή αντισώματα συνδεδεμένη με ένζυμο, και οπτικοποιούνται με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (ECL? Amersham Corp, Arlington Heights, IL, USA) σύμφωνα με την συνιστώμενη διαδικασία. Τα πρωτογενή αντισώματα αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA) και Cell Signaling Technology Inc. (Boston, ΜΑ, USA). Σημασμένο με υπεροξειδάση αντι-κουνελιού γαϊδάρου ανοσοσφαιρίνης και υπεροξειδάσης-επισημασμένο προβάτου αντι-ποντικού ανοσοσφαιρίνης αγοράστηκαν από την Amersham Corp.

In vitro Caspase Δραστηριότητα Δοκιμασία

Η κασπάση δραστηριότητες προσδιορίστηκαν με χρωματομετρικές δοκιμασίες χρησιμοποιώντας κασπάσης-3, -8, -9 και κιτ ενεργοποίησης σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (R &? D Systems). Εν συντομία, τα κύτταρα λύθηκαν σε ένα ρυθμιστικό λύσης για 30 λεπτά σε λουτρό πάγου. Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και επωάστηκαν στους 37 ° C με το ρυθμιστικό αντίδρασης, το οποίο περιείχε διθειοθρεϊτόλη και τα υποστρώματα Asp-Glu-Val-Asp (DEVD) -ρ-νιτροανιλίνη (ρΝΑ) για κασπάση-3, Ile-Glu-Thr-Asp (IETD) -ρΝΑ για κασπάση-8, και Leu-Glu-His-Asp (LEHD) -ρΝΑ για κασπάση-9. Η οπτική πυκνότητα του μίγματος της αντίδρασης ποσοστώθηκε φασματοφωτομετρικώς σε μήκος κύματος 405 nm.

Η θεραπεία με μικρό παρεμβαλλόμενο RNA

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα 6-φρεατίων με αρχική πυκνότητα 1,5 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο. Μετά από 24 ώρες σταθεροποίησης, αυτά επιμολύνθηκαν με 100 ηΜ μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) κατά της ανθρώπινης Egr-1 ή ίση ποσότητα μη ειδικής άσχετο RNA (Dharmacon, Chicago, IL, USA) χρησιμοποιώντας ένα αντιδραστήριο διαμόλυνσης (Genefectine, Genetrone Biotech , Σεούλ, Κορέα), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από 24 ώρες επιμόλυνσης, τα κύτταρα επωάστηκαν υπό τις υποδεικνυόμενες συνθήκες.

Στατιστική Ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι όροι ± SD. Στατιστικές συγκρίσεις έγιναν με τη χρήση SPSS 12.0 που ακολουθείται από δοκιμασία του Fisher. Σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το αταίριαστο του Student

t-test

. Ένα

σ

αξία & lt? 0.05 έγινε δεκτή ως ένδειξη στατιστικής σημαντικότητας

Αποτελέσματα

Επιδράσεις της σαγκουϊναρίνη για την Κυτταρική Βιωσιμότητα και απόπτωση επαγωγή

Για να. διερευνηθεί κατά πόσο σαγκουϊναρίνη ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων ουροδόχου κύστης, τρεις γραμμές κυττάρων καρκίνου της ουροδόχου κύστης (Τ24, EJ, και 5637) διεγέρθηκαν με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις σαγκουϊναρίνη για 24 ώρες, και μια δοκιμασία ΜΤΤ διεξήχθη. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1, η θεραπεία με σαγκουϊναρίνη μείωσε τη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων κύστης σε ένα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο. Έτσι, περαιτέρω πειράματα για να προσδιοριστεί αν αυτή η ανασταλτική δράση του σαγκουϊναρίνη στην βιωσιμότητα των κυττάρων ήταν το αποτέλεσμα αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Πρώτον, η χρώση ϋΑΡΙ προσδιορίζεται μορφολογικές αλλαγές στα κύτταρα, όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α. Η θεραπεία με 1.5 μΜ σαγκουϊναρίνη οδήγησε σε σημαντικό αριθμό κυττάρων με συμπύκνωση της χρωματίνης, απώλεια πυρηνικών κατασκευών, και το σχηματισμό αποπτωτικών σωμάτων, ενώ τα χαρακτηριστικά αυτά δεν παρατηρήθηκαν σε κύτταρα ελέγχου. Δεύτερον, η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής για την ανίχνευση των κυτταρικών πληθυσμών υποδιπλοειδή προσδιορίζεται τους βαθμούς της απόπτωσης στα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με σανγκουϊναρίνη. Όπως υποδεικνύεται στην Εικ. 2Β, η προσθήκη 1,5 μΜ σαγκουϊναρίνη στα κύτταρα της ουροδόχου κύστης οδήγησε σε αυξημένη συσσώρευση των κυττάρων στη φάση υπο-G1. Τρίτον, οι αναλύσεις κυτταρομετρίας ροής με αννεξίνη V και χρώση ΡΙ προσδιορίζεται το μέγεθος της απόπτωσης που προκαλείται από σανγκουϊναρίνη. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2C, οι αριθμοί των κυττάρων αννεξίνης ν-θετικής έδειξε σημαντικές αυξήσεις στα κύτταρα σαγκουϊναρίνη σε σύγκριση με το τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου. Συνεπώς, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ο καρκίνος της ουροδόχου κύστης κύτταρα μπορεί υφίστανται απόπτωση μετά από έκθεση σε σαγκουϊναρίνη.

Τ24, 5637, και τα κύτταρα EJ υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις σαγκουϊναρίνη για 24 ώρες, σύμφωνα με τις μετρήσεις της κυτταρικής βιωσιμότητας με μία δοκιμασία ΜΤΤ. Τα δεδομένα αναφέρονται ως μέσο ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Σημαντικά διαφορετικό από τον έλεγχο, *

σ

& lt?. 0.05

Η

(Α) Τα κύτταρα επωάστηκαν με 1,5 μΜ σαγκουϊναρίνη για 24 ώρες και στη συνέχεια βάφονται με DAPI. Οι χρωματισμένες πυρήνες στη συνέχεια παρατηρήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού (μεγέθυνση, χ 400) χρησιμοποιώντας ένα μπλε φίλτρο. (Β) Για την ποσοτικοποίηση του βαθμού απόπτωσης που επάγεται από σαγκουϊναρίνη, τα κύτταρα αξιολογήθηκαν για την περιεκτικότητα DNA υπο-G1 χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής. (C) Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με ΡΙΤΟ-συζευγμένο αννεξίνης-ν και ΡΙ για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Τα αποπτωτικά κύτταρα προσδιορίστηκαν μετρώντας το ποσοστό της αννεξίνης V (+), PI (-) κύτταρα και το ποσοστό των αννεξίνης V (+), ΡΙ (+) κυττάρων. Τα δεδομένα αναφέρονται ως μέσο ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Σημαντικά διαφορετικό από τον έλεγχο, *

σ

& lt?. 0.05

Η

Διαφοροποίηση των Bcl-2 και ΙΑΡ πρωτεϊνών της οικογένειας, και ενεργοποίηση της κασπάσης από σαγκουϊναρίνη

Η ρόλος του Bcl-2 και των πρωτεϊνών της οικογένειας ΙΑΡ προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western για να διερευνήσει ποια μηχανισμοί που εμπλέκονται στην σαγκουϊναρίνη επαγόμενη απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα κύστης. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Α, η θεραπεία των καρκινικών κυττάρων κύστης με 1,5 μΜ σαγκουϊναρίνη δεν προκάλεσε σημαντικές αλλαγές στην έκφραση των πρωτεϊνών αντιαποπτωτικών Bcl-2 και Bcl-XL. Ωστόσο, τα επίπεδα των προαποπτωτικών Bax αυξήθηκαν και οι αντιαποπτωτικού πρωτεΐνης ΧΙΑΡ μειώθηκε σε απόκριση σε σανγκουϊναρίνη. Επιπλέον, η μείωση των προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bid έδειξε μια αξιοσημείωτη αύξηση με θεραπεία σαγκουϊναρίνη σε όλες τις κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Για να καθοριστεί εάν σαγκουϊναρίνη επαγόμενη απόπτωση συνδέεται με την ενεργοποίηση των κασπασών, εξετάστηκε η έκφραση και η δραστηριότητα των κασπασών σε κύτταρα σαγκουϊναρίνη φάρμακο. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία σαγκουϊναρίνη κάτω ρυθμισμένα τα επίπεδα των procaspase-3 πρωτεΐνες και αύξησε τα επίπεδα της δραστικής κασπάσης-3. Τα επίπεδα procaspase-8 και -9 πρωτεΐνες επίσης ρυθμίζεται προς τα κάτω στις σαγκουϊναρίνη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχ. 3Β). Για περαιτέρω ποσοτικοποίηση του πρωτεολυτική ενεργοποίηση του procaspase-3, -8, -9 και, τα προϊόντα λύσης εξισώνονται από την πρωτεΐνη από τα κύτταρα σε επεξεργασία με σαγκουϊναρίνη αναλύθηκαν για ενζυματική δραστηριότητές τους. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3C, η θεραπεία σαγκουϊναρίνη αυξήθηκε σημαντικά τις δραστηριότητές κασπάσης τους. αναλύσεις Μεταγενέστερες στύπωμα Western έδειξε την προοδευτική πρωτεολυτική διάσπαση της πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης της πρωτεΐνης (PARP), η οποία είναι μια προς τα κάτω στόχος του ενεργοποιημένου κασπάσης-3 [33], στα κύτταρα μετά την επεξεργασία σαγκουϊναρίνη (Εικ. 3Β) .

(Α και Β) Μετά από 24 ώρες επώασης με σαγκουϊναρίνη, οι κυτταρικές πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με πηκτώματα SDS-πολυακρυλαμιδίου και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα, και οι πρωτεΐνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ανίχνευσης ECL. Για να επιβεβαιωθεί ίση φόρτωση, ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. (Γ) Για να προσδιοριστεί η

in vitro

δραστηριότητα κασπάσης, κλάσματα επωάστηκαν με DEVD-ρΝΑ, IETD-ρΝΑ, και LEHD-ρΝΑ ως υποστρωμάτων για κασπάση-3, -8, -9 και, αντίστοιχα, και τότε μετρήθηκαν οι απελευθερώνονται προϊόντα φθορισμού. Κάθε σημείο αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD από τις αντιπροσωπευτικές πειράματα που πραγματοποιήθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές. Μια Φοιτητών

t-test

(*

σ

& lt? 0,05 vs. μάρτυρα). Χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση της στατιστικής σημαντικότητας των αποτελεσμάτων

Η

Sanguinarine- επαγόμενη απόπτωση συνδέεται με την παραγωγή ROS

Για να καθοριστεί εάν σαγκουϊναρίνη επαγόμενη απόπτωση σχετίστηκε με ROS μεσολάβηση οξειδωτικού στρες, ενδοκυτταρική παραγωγή ROS μετρήθηκε με τη δοκιμασία φθορισμού DCFH-DA χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής. Όπως υποδεικνύεται στην Εικ. 4Α, όταν τα κύτταρα εκτέθηκαν σε σαγκουϊναρίνη, το επίπεδο της ενδοκυτταρικής ROS αυξήθηκε δραστικά στα 30 λεπτά (πάνω από ένα 8-πλάσια αύξηση σε σύγκριση με τον έλεγχο), και μειώθηκε με το χρόνο στη συνέχεια. Προηγούμενη αγωγή των κυττάρων με ένα πολύ γνωστό καθαριστή ROS, Ν-ακετυλοκυστεϊνη (NAC), μειώνονται σημαντικά αυξημένο επίπεδο αυτό ROS στα κύτταρα σαγκουϊναρίνη φάρμακο. Η παραγωγή ενδοκυτταρικής ROS παρακολουθήθηκε επίσης από την εκπομπή φθορισμού της DCFH-DA μέσα στα κύτταρα Τ24 χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού. Η αυξημένη ένταση του DCF-DA χρώση παρατηρήθηκε στα κύτταρα σαγκουϊναρίνη επεξεργασμένα ήταν χρονικά εξαρτώμενο καταργηθεί για τον έλεγχο των επιπέδων με την παρουσία του NAC (Εικ. 4Β). Για να καθοριστεί εάν σαγκουϊναρίνη επαγόμενη παραγωγή ROS οφειλόταν στην επαγωγή απόπτωσης, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με NAC για 1 ώρα και συν-επωάστηκαν με σαγκουϊναρίνη για περαιτέρω 24 ώρες. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Α, οι ανασταλτικές επιδράσεις της NAC στην σαγκουϊναρίνη επαγόμενη παραγωγή ROS συσχετίζεται με μια αξιοσημείωτη αναστολή του αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου που μετράται από το κυτταρόμετρο ροής. Επιπλέον, αναστέλλοντας την παραγωγή ROS με προκατεργασία των κυττάρων με NAC παρεμπόδισε την σαγκουϊναρίνη επαγόμενη ενεργοποίηση κασπασών, την διάσπαση της PARP, και τη διαμόρφωση του Bcl-2 και την οικογένεια πρωτεϊνών ΙΑΡ (Σχ. 5Β και C). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ένα σύστημα ROS ροών παίζει ουσιαστικό ρόλο στην σαγκουϊναρίνη επαγόμενη απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα κύστης.

(Α) Τα κύτταρα επωάστηκαν με 1,5 μΜ σαγκουϊναρίνη για τους υποδεικνυόμενους χρόνους, ή προκατεργάστηκαν με 10 mM NAC για 1 ώρα και περαιτέρω σε επεξεργασία με 1,5 μΜ σαγκουϊναρίνη για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. Αυτά στη συνέχεια χρωματίστηκαν με DCFH-DA. γενεά ROS μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής. Κάθε σημείο αντιπροσωπεύει το μέσο όρο των αντιπροσωπευτικών πειραμάτων πραγματοποιήθηκε δύο φορές. (Β) DCFH φθορισμού σε κύτταρα Τ24 καλλιεργούνται κάτω από τις ίδιες συνθήκες όπως (Α) προσδιορίστηκε σύμφωνα με φθορισμό χρησιμοποιώντας ένα πράσινο φίλτρο. Τουλάχιστον πέντε πεδία προβλήθηκαν σε κάθε ένα από τα πειράματα.

Η

(Α) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς NAC (10 mM) για 1 ώρα πριν από την πρόκληση με 1.5 μΜ σαγκουϊναρίνη για 24 ώρες. Αυτοί συλλέχθηκαν και χρωματίστηκαν με ΡΙΤΟ-συζευγμένο αννεξίνης-ν και ΡΙ για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Τα δεδομένα αναφέρονται ως μέσο ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Μια Φοιτητών

t-test

(*

σ

& lt? 0,05 έναντι του μάρτυρα χωρίς επέμβαση?

#

σ

& lt? 0,05 έναντι κυττάρων σαγκουϊναρίνη-θεραπεία) ήταν χρησιμοποιούνται για την ανάλυση της στατιστικής σημαντικότητας των αποτελεσμάτων. (Β) στη συνέχεια συλλέχθηκαν, και τις δεικνυόμενες πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με ανάλυση κηλίδας Western. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. (Γ) Για να προσδιοριστεί η

in vitro

δραστηριότητα κασπάσης, κλάσματα επωάστηκαν στους 37 ° C για 1 h, και μετρήθηκαν οι απελευθερώνονται προϊόντα φθορισμού. Κάθε σημείο αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD αντιπροσωπευτικών πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές. Μια Φοιτητών

t-test

(*

σ

& lt? 0,05 έναντι του μάρτυρα χωρίς επέμβαση?

#

σ

& lt? 0,05 έναντι κυττάρων σαγκουϊναρίνη-θεραπεία) ήταν χρησιμοποιούνται για την ανάλυση της στατιστικής σημαντικότητας των αποτελεσμάτων.

η

σαγκουϊναρίνη επαγόμενη απόπτωση δεν σχετίζεται με την ενεργοποίηση της JNK

Πολλές προηγούμενες εκθέσεις έδειξαν ότι κυτταροτοξικά ROS σηματοδότηση φαίνεται να διαμεσολαβείται, εν μέρει, από την ενεργοποίηση του (JNK) καταρράκτη κινάσης c-Jun-Ν-τερματικό αντί της ρ38 ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ) ή το εξωκυτταρικό σήμα ρυθμίζεται κινάσης (ERK) [34] – [36]. Έτσι, η παρούσα μελέτη διερεύνησε την εμπλοκή της JNK σε σαγκουϊναρίνη επαγόμενη απόπτωση. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Α, η φωσφορυλίωση της JNK ήταν ανιχνεύσιμο μετά τόσο λίγο όσο 15-30 λεπτά της θεραπείας σαγκουϊναρίνη και παρέμεινε για τουλάχιστον 1-4 ώρες της θεραπείας. Ωστόσο, η ROS καθαριστή NAC μπλοκάρει τελείως την ενισχυμένη φωσφορυλίωση της JNK (Εικ. 6Β). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η οδός της JNK έχει ενεργοποιηθεί σε ένα ROS-εξαρτώμενο τρόπο σε απόκριση προς την παρουσία σαγκουϊναρίνης. Για να καθοριστεί εάν η ενεργοποίηση του JNK συμμετείχαν σε απόπτωση, η επίδραση ενός συγκεκριμένου αναστολέα JNK, SP600125, στα κύτταρα σαγκουϊναρίνη αγωγή ελέγχθηκε. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η προεπεξεργασία SP600125 δεν εξασθενούν τη συσσώρευση των αποπτωτικών κυττάρων συγκριτικά με τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με SP600125 μόνο (Σχ. 6C). Τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η φωσφορυλίωση JNK ROS-εξαρτώμενη δεν συμβαίνει ανάντη του σαγκουϊναρίνη απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα κύστης.

(Α) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με σαγκουϊναρίνη για τους υποδεικνυόμενους χρόνους, ή (β) υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με NAC για 1 ώρα και προκλήθηκαν με σαγκουϊναρίνη για 24 ώρες. Αυτά στη συνέχεια συλλέχθηκαν, και τις δεικνυόμενες πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με ανάλυση κηλίδας Western χρησιμοποιώντας αντι-ρ-JNK, αντι-ΙΝΚ αντισώματα, και ένα σύστημα ανίχνευσης ECL. (C) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς SP600125 για 1 ώρα πριν την πρόκληση με σαγκουϊναρίνη για 24 ώρες. Τα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής για να προσδιοριστεί αννεξίνης-ν. Τα δεδομένα αναφέρονται ως μέσο ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Για την στατιστική ανάλυση, η

t-test

εκτελέστηκε (*

σ

& lt? 0,05 έναντι μη επεξεργασμένα κύτταρα).

Η

Σύλλογος ROS-εξαρτώμενη Up- ρύθμιση του Egr-1 με σαγκουϊναρίνη απόπτωση

Τέλος, η πιθανή σχέση μεταξύ σαγκουϊναρίνη επαγόμενη απόπτωση και Egr-1 έκφραση διερευνήθηκε. Όπως φαίνεται στο Σχ. αναλύσεις 7Α, η χρονική πορεία έδειξε ότι 1,5 μΜ σαγκουϊναρίνης επάγεται πρωτεϊνών Egr-1 εντός 2 ωρών, και αυτά δεν επέστρεψε στη βασική γραμμή για 4 ώρες. Όπως σαγκουϊναρίνη δημιουργούνται ROS εντός 0,5 ώρες, τα επίπεδα των ROS μειώθηκε μετά από 2 h (Σχ. 4), και η έκφραση του Egr-1 με σαγκουϊναρίνη μέγιστο αυξήθηκε κατά την περίοδο της θεραπείας 2-4 h, το δυναμικό ROS προκαλούμενη ρύθμιση της επαγωγής του Egr-1 διερευνήθηκε. έδειξε δεδομένα ανοσοκηλίδωση ότι η παρεμπόδιση της παραγωγής ROS δια προκατεργασίας των κυττάρων με NAC σημαντικά εξαλειφθεί σαγκουϊναρίνη επαγόμενη πρωτεΐνες Egr-1 στις τρεις κυτταρικές σειρές (Σχ. 7Β). Για να ερευνηθεί ο ρόλος του Egr-1 σε σαγκουϊναρίνη επαγόμενη απόπτωση, γονιδιακή έκφραση Egr-1 ήταν επιτυχώς τα κάτω ρυθμισμένα με χρήση Egr-1 siRNA (Σχ. 7C). Η επίδρασή του στην διάσπαση PARP, καθώς και σε επαγωγή απόπτωσης, στη συνέχεια αξιολογούνται. Όπως φαίνεται στο Σχ. 7D και Ε, η αναστολή της Egr-1 έκφραση αμβλυνθούν αποτελεσματικά την σαγκουϊναρίνη επαγόμενη αποικοδόμηση του PARP και τη συσσώρευση των αποπτωτικών κυττάρων υπο-G1. Τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν ότι η επαγωγή απόπτωσης από σαγκουϊναρίνη λαμβάνει χώρα σε ένα Egr-1-εξαρτώμενο τρόπο και ότι η αύξηση της παραγωγής ROS απαιτείται για την ενεργοποίηση του Egr-1 και της εμφάνισης σαγκουϊναρίνη επαγόμενη απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα κύστης.

τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με σαγκουϊναρίνη για τους υποδεικνυόμενους χρόνους (Α) ή σε επεξεργασία με ή χωρίς NAC για 1 ώρα πριν την πρόκληση με σαγκουϊναρίνη για 2 ώρες (Β). Στη συνέχεια, ίσες ποσότητες πρωτεϊνών (30 μ§) διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα SDS-πολυακρυλαμιδίου και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με αντίσωμα αντι-Egr-1, και οι πρωτεΐνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ανίχνευσης ECL. (Ο-Ε) Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNA κατά της ανθρώπινης Egr-1 χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο επιμόλυνσης. Μετά από 24 h επιμόλυνσης, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με σαγκουϊναρίνη για άλλες 2 h (C) ή 24 h (D και Ε). Αυτά στη συνέχεια συλλέχθηκαν, και τις δεικνυόμενες πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με ανάλυση κηλίδας Western (C και D). Επιπλέον, τα κύτταρα αξιολογούνται από κυτταρόμετρο ροής για αννεξίνη-ν (D). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Η στατιστική σημαντικότητα των αποτελεσμάτων αναλύθηκε με έναν μαθητή του

t-test

(*

σ

& lt? 0,05 έναντι του μάρτυρα χωρίς επέμβαση?

#

σ

& lt? 0,01 έναντι κυττάρων σαγκουϊναρίνη-θεραπεία).

η

Συζήτηση

Για τη μελέτη των μηχανισμών με τους οποίους θεραπεία σαγκουϊναρίνη επάγει απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα κύστης, η παρούσα μελέτη εξέτασε μια σειρά από δείκτες που σχετίζονται με την αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Ο μηχανισμός της απόπτωσης διαιρείται σε δύο οδούς: μια εξωγενή θάνατος μεσολάβηση υποδοχέα αποπτωτική οδό και εγγενές μιτοχόνδρια μεσολάβηση αποπτωτική παθολογική οδό. Η ενεργοποίηση της κασπάσης θεωρείται γενικά ένα βασικό χαρακτηριστικό γνώρισμα της απόπτωσης σε αυτά τα μονοπάτια. Η εξωγενής οδός ενεργοποιείται στην κυτταρική επιφάνεια, όταν ένας ειδικός συνδετήρας θάνατος συνδέεται με αντίστοιχο υποδοχέα κυτταρικής επιφάνειας του. Σε αυτό το μονοπάτι, κασπάσης-8 δρα ως κασπάση εκκινητή, το οποίο ενεργοποιεί τις κασπάσες κατάντη τελεστή, όπως κασπάση-3, -6 και -7. Από την άλλη πλευρά, η ενδογενής οδός έχει ένα αποπτωτικό σήμα που προέρχεται από το εσωτερικό των κυττάρων, και στηρίζεται στη διαπερατότητας των μιτοχονδριακών μεμβρανών για να απελευθερώσει apoptogenic μιτοχονδριακών πρωτεϊνών στο κυτοσόλιο, ενεργοποιώντας έτσι την κασπάση-9 εκκινητή. Η ενεργοποιημένη κασπάση-9 εκκινεί καθοδικά συμβάντα με την άμεση διάσπαση και ενεργοποίηση κασπασών τελεστή, δημιουργώντας ένα θραύσμα το οποίο ενεργοποιεί το μιτοχονδριακό μονοπάτι [37], [38]. Η απόπτωση μπορεί επίσης να ρυθμίζεται με διάφορα γονιδιακά προϊόντα, όπως το Bcl-2 οικογένειας αντιαποπτωτικών και προαποπτωτικών πρωτεϊνών, και η οικογένεια πρωτεϊνών ΙΑΡ, τα οποία είναι ικανά να δεσμεύουν και να αναστέλλουν κασπάσες [39], [40]. Στο μιτοχονδριακό μονοπάτι θανάτου, η αναλογία της έκφρασης των προαποπτωτικών πρωτεϊνών όπως Βαχ και Bak και αντιαποπτωτικού πρωτεΐνες όπως Bcl-2 και Bcl-xL καθορίζει τελικά κυτταρικό θάνατο ή την επιβίωση. Επιπλέον, η κασπάση-8 μεσολαβεί στην ενδογενή οδό μέσω διάσπαση της προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών προσφορές, BH3-μόνο πρωτεΐνη, σε μια κολοβωμένη Bid (tBid) μέσω μετατόπισης από το κυτοσόλιο στο μιτοχόνδρια, προκαλώντας μιτοχονδριακή δυσλειτουργία, που ακολουθείται από την ενεργοποίηση των caspase- 9 [41]. Αυτή η μελέτη έδειξε ότι η έκφραση του προαποπτωτικών Bax έδειξαν αύξηση στην σαγκουϊναρίνη επαγόμενη απόπτωση, ενώ η ποσότητα του αντιαποπτωτικών Bcl-2 και Bcl-xL παρέμεινε σχετικά αμετάβλητη (Εικ. 3Α). Τα δεδομένα έδειξαν επίσης ότι η θεραπεία σαγκουϊναρίνη επαγόμενη απόπτωση μέσω της ενεργοποίησης δύο κασπάσες έναρξης, κασπάσης-8 και -9, οι οποίες εμπλέκονται στα εξωγενείς και ενδογενείς οδούς, αντίστοιχα, καθώς και τελεστή κασπάσης-3 (Σχ. 3Β και C), η οποία συνδέεται με την ταυτόχρονη διάσπαση της PARP, ενός ενεργοποιημένου κασπάσης-3-στόχο πρωτεΐνη υπόστρωμα (Εικ. 3Β) [33]. Επιπλέον, η θεραπεία σαγκουϊναρίνη μείωσε την έκφραση του ΧΙΑΡ, ένα μέλος της οικογένειας ΙΑΡ πρωτεϊνών (Σχ. 3Α), τα οποία έχουν αναφερθεί ότι ασκούν αντιαποπτωτικά αποτελέσματα επειδή λειτουργούν ως άμεσοι αναστολείς των ενεργοποιημένων κασπασών [37], [39]. Περαιτέρω, η έκθεση των κυττάρων σε σαγκουϊναρίνη οδήγησε σε σημαντική μείωση στο σύνολο της προσφοράς, υποδεικνύοντας ότι η προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών, Bid, περικόπηκε (Εικ. 3Α). Έτσι, τα παρόντα δεδομένα δεικνύουν ότι και οι δύο εξωγενή και ενδογενή μονοπάτια μπορεί να έχουν συμβάλει, τουλάχιστον εν μέρει, στην σαγκουϊναρίνη απόπτωση που επάγεται από τα καρκινικά κύτταρα ανθρώπινης κύστεως.

Τοποθέτηση στοιχεία δείχνουν ότι τα κατεστραμμένα μιτοχόνδρια διεγείρουν παραγωγή ROS και ότι δυσανάλογη παραγωγή ROS προκαλεί απόπτωση μέσω της εσωτερικής οδού προκαλώντας ζημιά σε μιτοχόνδρια μέσω της ενεργοποίησης των κασπασών [17] – [19]. Τα δεδομένα έδειξαν ότι η θεραπεία σαγκουϊναρίνη είχε σαν αποτέλεσμα σημαντικά αυξημένη παραγωγή ROS νωρίς στη διαδικασία. Συγκαλλιέργεια με NAC, ένα χρησιμοποιούνται συνήθως ROS οδοκαθαριστής, ουσιαστικά μπλοκάρει την παραγωγή ROS (Εικ. 4). Επιπλέον, αναστέλλοντας την παραγωγή ROS εντελώς εμπόδισε την απόπτωση (Σχ. 5Α) και ανακτήθηκε το σαγκουϊναρίνη επαγόμενη ενεργοποίηση κασπασών, την υποβάθμιση των PARP, και το προς τα κάτω ρύθμιση των ΧΙΑΡ και της έκφρασης ολόκληρο Bid (Σχ. 5Β και C). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ROS παραγωγή από σαγκουϊναρίνη απαιτείται για επαγωγή απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα κύστης.

Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι διάφορα ερεθίσματα αποπτωτικά μπορούν γρήγορα να ενεργοποιήσει MAPKs, οι οποίες περιλαμβάνουν JNK, ERK, και p38MAPK. Μεταξύ αυτών, η οδός της JNK, ως ανάντη μονοπατιού σηματοδότησης της κασπάσης-3, μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση της απόπτωσης σε απόκριση σε ελεύθερες ρίζες που παράγονται από την υπεριώδη ακτινοβολία ή άμεση εφαρμογή του H

2O

2 [42] , [43]. Έτσι, η παρούσα μελέτη διερεύνησε κατά πόσον αυτή η οδός σήμα εμπλέκεται στην αποπτωτική επίδραση σαγκουϊναρίνης σε καρκινικά κύτταρα κύστης. Τα δεδομένα έδειξαν ότι η φωσφορυλίωση JNK συμβαίνει ταχέως, εντός 30 λεπτών από τη θεραπεία σαγκουϊναρίνη, και επιμένει για τουλάχιστον 1-6 ώρες μετά την έκθεση σαγκουϊναρίνη (Σχ. 6Α).