Αφηρημένο

Μεταφρασμένη υποξία σε συμπαγείς όγκους ενεργοποιεί μεταγραφικά προγράμματα που προωθούν την μεταστατική μετασχηματισμό των κυττάρων. Όπως υποξία υπερ-αγγείωση, η απώλεια της πρωτεΐνης ρετινοβλαστώματος (Rb) είναι ένα γνώρισμα κοινό για προχωρημένα στάδια της εξέλιξης του όγκου σε πολλές μεταστατικούς καρκίνους. Ωστόσο, καμία σχέση μεταξύ του ρόλου του Rb και μεταστατικών διαδικασιών υποξία με γνώμονα έχει καθιερωθεί. Δείξαμε ότι το Rb είναι κύριος μεσολαβητής της υποξικής απόκριση που διαμεσολαβείται από HIF1α /β, το κύριο ρυθμιστή της απόκρισης υποξίας, και ουσιώδης συν-ενεργοποιητή του, τον /πρωτεΐνη ρετινοβλαστώματος-αλληλεπιδρώντας υποδοχέα θυρεοειδούς ορμόνης (TRIP230). Επιπλέον, η απώλεια της Rb αποκαλύπτει το πλήρες δυναμικό συν-ενεργοποίηση των TRIP230. Χρησιμοποιώντας μικρά προσεγγίσεις ανασταλτική RNA

in vivo

, διαπιστώσαμε ότι Rb εξασθενεί την κανονική φυσιολογική απάντηση στην υποξία από HIF1α. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η απώλεια της Rb οδηγεί σε υποξία εξαρτώμενη βιοχημικές αλλαγές που προωθούν την απόκτηση ενός επεμβατικού φαινοτύπου σε MCF7 κύτταρα καρκίνου του μαστού. Επιπλέον, το Rb είναι παρούσα σε HIF1α-ARNT /HIF1β μεταγραφικά συμπλέγματα που σχετίζονται με TRIP230 όπως καθορίζεται από δοκιμασίες συν-ανοσο-καταβύθιση, GST-pull-down και το chip. Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι το Rb είναι ένας αρνητικός ρυθμιστής της υποξίας-ρυθμίζονται μεταγραφή λόγω της άμεσης αποτελέσματά της επί του συμπλόκου HIF1. Το έργο αυτό αποτελεί τον πρώτο κρίκο μεταξύ της λειτουργικής κατάλυση της Rb στα καρκινικά κύτταρα και ενεργοποίηση HIF1α-εξαρτώμενη μεταγραφική και την εισβολή

Παράθεση:. Labrecque MP, Takhar ΜΚ, Jagdeo JM, Tam KJ, Chiu C, Wang ΤΥ, et al. (2014) Μια TRIP230-ρετινοβλάστωμα Protein Complex Ρυθμίζει υποξία Factor-1α-διαμεσολαβούμενη μεταγραφή και Cancer Cell εισβολή. PLoS ONE 9 (6): e99214. doi: 10.1371 /journal.pone.0099214

Επιμέλεια: Σόνια Rocha, Πανεπιστήμιο του Dundee, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 5 Μάρ, 2014? Αποδεκτές: 12 του Μάη, 2014? Δημοσιεύθηκε: 11, Ιούν του 2014

Copyright: © 2014 Labrecque et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα στοιχεία που περιλαμβάνονται στο χειρόγραφο

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από επιδοτήσεις λειτουργίας από την καναδική Καρκίνου του Μαστού Ίδρυμα π.Χ. /Γιούκον (https://www.cbcf.org/bc/Pages/default.aspx ) και τις φυσικές επιστήμες και το Συμβούλιο Έρευνας Μηχανικής, RGPIN 356355 (https://www.nserc-crsng.gc.ca/index_eng.asp) του Καναδά TVB. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

υποξία επαγώγιμου παράγοντα-1α (HIF1α), ορθόλογο της HIF2α, και ο συνεργάτης διμερισμό τους ο αρυλο υδρογονανθράκων υποδοχέα πυρηνικής μεταθέτη, (ARNT ή HIF1β) που απαρτίζουν το HIF1 συγκρότημα [1], [2] ρυθμίζει μια απόκριση κυττάρου σε συνθήκες χαμηλού οξυγόνου. Σε υγιή ιστό, το συγκρότημα HIF1 κατευθύνει την εντολή και σφιχτά ρυθμισμένη έκφραση των γονιδίων που ελέγχουν την

de novo

σύνθεση νέων αγγείων για τη στήριξη της ανάπτυξης ιστού ή ιστών εκ νέου διάχυσης. Κατά τη διάρκεια της υποξίας, HIF1α συσσωρεύεται, μετατοπίζεται στον πυρήνα, και δεσμεύει ARNT. Οι HIF1 συγκρότημα προσλαμβάνει συν-ενεργοποιητές, συμπεριλαμβανομένων CBP /p300 [3], και Υπνοδωμάτια, /Brg-1 [4] και ενεργοποιεί την έκφραση των γονιδίων, όπως ο αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας (VEGF), ερυθροποιητίνη (ΕΡΟ) και μεταστατικών δεικτών, CXCR4 και προκολλαγόνου λυσυλ υδροξυλάση 2 (PLOD2) [1], [5], [6]. Τα στοιχεία δείχνουν ότι το συγκρότημα HIF1 μπορεί να ενεργοποιήσει τη γονιδιακή έκφραση ανεξάρτητα ή σε συνεργασία με άλλους μεταγραφικούς παράγοντες [7], [8]. Επίδειξη ότι HIF1α είναι ικανή να αλληλεπιδρά με c-myc, Notch και πιο πρόσφατα FOXA2 να κατευθύνει εντολή μεταγραφή και ενίσχυση του σχηματισμού όγκων [9] – [11] αφήνει ανοικτή τη δυνατότητα ότι το σύμπλοκο HIF1 είναι ένας πυρήνας μεταγραφική μονάδα που διαμορφώνει πολλαπλά ενδοκυτταρικής σηματοδότησης δικτύων, πολλά από τα οποία μπορεί να εμπλέκονται σε μεταστατικό μετασχηματισμό. Έτσι, πολλά από τα μόρια που ελέγχουν διάφορες πτυχές της λειτουργίας HIF1 έχουν ακόμη ταυτοποιηθεί.

Το συγκρότημα HIF1 εκτελεί αυτή τη λειτουργία με την πρόσληψη μεταγραφικές πρωτεΐνες συν-ενεργοποιητή, συμπεριλαμβανομένου του υποδοχέα θυρεοειδούς ορμόνης /σε πρωτεΐνες ρετινοβλαστώματος αλληλεπιδρώντα 230 (TRIP230) στις ρυθμιστικές περιοχές του υποξία-γονιδίων που αποκρίνονται για την ενεργοποίηση της μεταγραφής [12]. TRIP230, ταυτοποιήθηκε αρχικά ως υποδοχέας θυρεοειδούς ορμόνης (TR) -interacting πρωτεΐνη που ενισχυμένη TRs δραστηριότητα [13]. Επιπλέον, TRIP230 έχει απομονωθεί ως μέρος του P160 συν-ενεργοποιητή συγκρότημα [14], ένα bona fide ARNT συν-ενεργοποιητή συγκρότημα [15]. Σημαντικά, έχουμε αποδείξει ότι TRIP230 στρατολογείται από ARNT ως μεταγραφικός συν-ενεργοποιητή και είναι απαραίτητη για την μεταγραφική δραστικότητα του συμπλόκου HIF1 [12]. Επιπλέον, έχει δειχθεί ότι αλληλεπιδρά με TRIP230 Rb και Rb ότι εξασθενεί TRIP230 ενισχυμένη TR-καθοδηγούμενη μεταγραφή [16]. Αυτό και μια επακόλουθη μελέτη έδειξε ότι μόνο ο υπερ-φωσφορυλιωμένη μορφή του Rb αλληλεπιδρά με TRIP230 [17] τονίζοντας μία λειτουργία Rb διακριτή από κανονική E2F-εξαρτώμενη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, ειδικά για υπο-φωσφορυλιωμένη μορφή της.

απώλεια

RB1 ​​

, το γονίδιο το οποίο κωδικοποιεί για το Rb [18], και ή απώλειας λειτουργίας του Rb συνδέεται με την ανάπτυξη και μεταστατική εξέλιξη πολλών άλλων στερεών όγκων συμπεριλαμβανομένων των καρκίνων της ωοθήκης, πνεύμονα, του μαστού, του προστάτη και του εγκεφάλου [19] – [23]. Η καλύτερα κατανοητή η λειτουργία του Rb είναι αυτή του κυτταρικού κύκλου ρυθμιστής καταστολή E2F λειτουργία παράγοντα μεταγραφής έτσι μεσολάβηση πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης [24] κυττάρων. Hypo-φωσφορυλιωμένη μπλοκ Rb κυτταρικό κύκλο εξέλιξης μέσω σύνδεσης με E2F μεταγραφικών παραγόντων που επηρεάζουν τα αποτελέσματα E2F-εξαρτώμενη μεταγραφική. Αυτό επιτυγχάνεται με την πρόσληψη της χρωματίνης, την αναδιαμόρφωση της μεταγραφής πρωτεϊνών καταστολέα όπως Sin3a /β, HDACs, SUV39H1 και DNMT1 [25] – [27]. Υπερ-φωσφορυλιωμένη Rb αδυνατεί να καταστείλει E2Fs και τους επιτρέπει να ενεργοποιήσετε ή να καταστείλει διάφορα προγράμματα γονιδιακής έκφρασης [24].

Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι η Rb μπορεί να έχουν φυσιολογικούς ρόλους εκτός από την κανονική E2F λειτουργία του [28]. Προηγουμένως, δείξαμε μια άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ TRIP230 και ARNT [12]. Επιπλέον, αποδείξαμε ότι TRIP230 ήταν απαραίτητη για μεταγραφή διαμεσολαβείται από δύο διακριτές συνεργάτες διμερισμό ARNT, δηλαδή τον υποδοχέα αρυλ υδρογονάνθρακα και HIF1α [12]. Στην έκθεση αυτή, θα παρέχει την πρώτη απόδειξη για την ύπαρξη ενός συμπλόκου Rb-TRIP230-ARNT που μεσολαβεί μεταγραφή HIF1. Επιπλέον, δείχνουμε ότι Rb εξασθενεί τη δραστηριότητα των συμπλοκών μεταγραφική ARNT λόγω της σύνδεσής του με TRIP230 και ανεξάρτητη της E2F. Τελικά, το έργο αυτό αποκαλύπτει την ικανότητα του Rb να ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση HIF1-ενεργοποιείται με συνέπειες για το μετασχηματισμό των καρκινικών κυττάρων.

Αποτελέσματα

HIF1-ρυθμίζεται η γονιδιακή έκφραση Ενισχυμένη από siRNA Νοκ-κάτω της Rb

TRIP230 είναι γνωστό ότι συνδέεται άμεσα με TR και ARNT [12], [16]. Δεδομένου ότι η υπερ-φωσφορυλιωμένη-Rb καταστέλλει συν-ενεργοποιημένα δραστηριότητα TR TRIP230 [16], [17] και ότι η έκφραση TRIP230 απαιτείται για μεταγραφική δραστηριότητα των εταίρων ARNT, AHR και HIF1α [12], υποθέσαμε ότι Rb ίσως εξασθενεί υποξία επαγόμενη μεταγραφή του γονιδίου. Για να εξεταστεί ο ρόλος του Rb στη συσσώρευση των ειδών mRNA του γονιδίου-στόχου που προκαλείται από υποξαιμία, εμείς απεμπλουτισμένο Rb σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές με siRNA μεσολάβηση γονίδιο

knock-down

. MCF7 και LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν είτε με κωδικοποιημένο (SCX) ελέγχουν siRNA ή δύο Rb-ειδική siRNAs και τη συσσώρευση του mRNA των γονιδίων στόχων HIF1 εκτίθενται σε φυσιολογική οξυγόνωση και υποξία συγκρίθηκαν (Σχήμα 1). Rb RNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης ισοδύναμα καταστέλλεται υπό δύο νορμοξικές και υποξικές συνθήκες (Σχήματα 1Α, και Ε). Καμία αλλαγή δεν παρατηρήθηκε σε CXCR4 ή έκφραση VEGF σε Rb siRNA επιμολυσμένα κύτταρα κάτω από νορμοξικές συνθήκες, ωστόσο η αύξηση της συσσώρευσης mRNA PLOD2 υπό νορμοξικές συνθήκες παρατηρήθηκε σε κύτταρα MCF7 (Εικόνα 1 D) αλλά όχι σε κύτταρα LNCaP (Σχήμα 1 Ε). Επιπλέον, τα κύτταρα MCF7 διαμολυσμένα με το RB-ειδικά siRNAs εμφάνισαν σημαντικά αυξημένη συσσώρευση mRNA των γονιδίων στόχων HIF1 CXCR4, VEGF και PLOD2 υπό υποξικές συνθήκες (Εικόνα 1Β-D). Μια παρόμοια υποξία-εξαρτώμενη επίδραση στην επαγωγή CXCR4, VEGF και PLOD2 παρατηρήθηκε σε απάντηση στην καταστολή Rb έκφραση σε καρκίνο του προστάτη LNCaP κύτταρα (Σχήμα 1 Ε) γεγονός που υποδηλώνει ότι η παρατήρηση αυτή δεν έχει τον τύπο του κυττάρου ειδικό.

κύτταρα MCF7 (Α , Β, Γ και Δ) και κύτταρα LNCaP (Ε) επιμολύνθηκαν είτε με μπερδεμένο siRNA (SCX) ή Rb siRNAs SIRB 1, και SIRB 2. Εικοσιτέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση τα κύτταρα είτε διατηρήθηκαν υπό νορμοξικές συνθήκες ή 1% O

2 για περαιτέρω 24 ώρες. Η γονιδιακή έκφραση προσδιορίστηκε με ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου μετά από την απομόνωση και την αντίστροφη μεταγραφή του ολικού RNA. VEGF, CXCR4, PLOD2 και Rb έκφραση κανονικοποιήθηκαν σε ουσιαστικά δραστική 36Β4 γονιδιακής έκφρασης. Ανοικτό μπάρες αντιπροσωπεύουν νορμοξίας (20% O

2) και έκλεισε (γκρι) μπάρες αντιπροσωπεύουν υποξία (1% O

2). Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν ± S.D. * P & lt?. 0.05

Η

Rb και Rb που σχετίζονται με Πρωτεΐνες καταστολέα προσλαμβάνονται σε ρυθμιστικές περιοχές του υποξία γονίδια που επάγονται κατά τη διάρκεια Ενεργός Μεταγραφή

Παρατηρήσαμε ότι η απώλεια της Rb οδήγησε σε υπερβολική έκφραση των γονιδίων στόχων HIF1 σε υποξία-εξαρτώμενο τρόπο. Έτσι, μας ενδιαφέρει να καθορίσει εάν η παρουσία του Rb θα μπορούσε να καταγραφεί πάνω από τα ρυθμιστικές περιοχές HIF1 ρυθμιζόμενα γονίδια που φιλοξενούν και χαρακτηρίζεται στοιχεία απόκρισης υποξίας κατά τη διάρκεια ενεργοποιηθεί η μεταγραφή? δηλαδή ο προαγωγός VEGF και ΕΡΟ ενισχυτή. Μία σχηματική των περιοχών αυτών και η τοποθέτηση των ολιγονουκλεοτιδίων για PCR ενίσχυση της χρωματίνης απεικονίζονται στο Σχήμα 2Α. Χρωματίνης ανοσο-καταβύθισης (μάρκας) ανάλυση έδειξε ότι το Rb συνδέεται με ρυθμιστικές περιοχές των HIF1-ρυθμιζόμενα γονίδια, VEGF και ΕΡΟ σε ένα υποξία-εξαρτώμενο τρόπο σε κύτταρα MCF7 (Εικόνα 2Β). Για να εξασφαλιστεί ότι οι πειραματικές συνθήκες μας παράγεται η κατάλληλη απάντηση στην υποξία, θα καθιζάνουν επίσης χρωματίνης με αντισώματα για να HIF1α, ARNT, TRIP230 ή IgG κουνελιού ελέγχου. Έλεγχος IgG ήταν ανίκανος προς κατακρήμνιση χρωματίνης που περιέχει τις ρυθμιστικές περιοχές του VEGF και ΕΡΟ. Όπως έχουμε αποδείξει προηγουμένως [12], ήμασταν πιο εύκολα σε θέση να ενισχύσουν χρωματίνη κατακρημνίστηκε από κυτταρολύματα αγωγή υποξία, παρά από αυτά που προέρχονται από προϊόντα λύσης διατηρήθηκαν υπό νορμοξικές συνθήκες χρησιμοποιώντας τα αντισώματα HIF1α, ARNT, TRIP230 και Rb. Θα μπορούσαμε να ενισχύσει τα χαμηλά επίπεδα του υποκινητή του VEGF και ΕΡΟ ενισχυτή υπό ορθοξικές συνθήκες (Σχήμα 2Β), όταν κατακρήμνιση χρωματίνης με TRIP230 αντισώματος μας, ως εκ τούτου, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε την περίπτωση ότι TRIP230 συνεργάτες με HREs σε χαμηλά επίπεδα παρά την κανονική τάση οξυγόνου. Ωστόσο, η αδυναμία μας να ανιχνεύσουμε HIF1α ή HIF2α πρωτεΐνη υπό αυτές τις συνθήκες (Σχήμα 2C) υποδηλώνει την πιθανότητα ότι το Rb δεν προσλαμβάνεται σε αυτές τις περιοχές HRE υπό ορθοξικές συνθήκες.

(Α) Μία σχηματική του εγγύς υποκινητή VEGF και ΕΡΟ ενισχυτή και η σχετική θέση των ολιγονουκλεοτιδίων που χρησιμοποιούνται για PCR ενίσχυση. (Β) Το καθεστώς του HIF1α, ARNT, TRIP230, και Rb στον υποκινητή του VEGF και ΕΡΟ ενισχυτή σε κύτταρα MCF7 όπως προσδιορίζεται με χρωματίνη-ανοσο-καταβύθιση (μάρκας) και αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) και σε σύγκριση με αντιδράσεις ενίσχυσης που προέρχονται από προϊόντα λύσης καθιζάνει με IgG ελέγχου. Όλες οι μάρκες έγιναν τουλάχιστον τρεις φορές, εκτός αν υποδεικνύεται. Τα επίπεδα της πρωτεΐνης (C) HIF1α και HIF2α εμπλουτίζεται δραματικά κατά τη διάρκεια της υποξίας σε κύτταρα MCF7. κύτταρα MCF7 διατηρήθηκαν σε καλλιέργεια σε είτε 20% ή 1% O

2 για 24 ώρες. Πυρηνικά εκχυλίσματα αναλύθηκαν με ανοσο-κηλίδος και μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με αντισώματα καθαρισμένα με συγγένεια προς HIF1α και α-τουμπουλίνης. Διαδοχική πλινθίο του εγγύς υποκινητή του VEGF και ΕΡΟ ενισχυτή χρησιμοποιώντας είτε αντι-HIF1α (D) ή (Ε) αντισωμάτων-ARNT αντι καθαρισμένη με συγγένεια που ακολουθείται από ανοσο-καταβύθιση με αντι-TRIP230 και αντι-Rb αντισώματα. (F) πλινθίο του υποκινητή του VEGF μετά σε κύτταρα MCF7 μετά από επιμόλυνση με είτε κωδικοποιημένα siRNA ή siRb1 και ανοσο-κατακρήμνιση με αντι-TRIP230 αντίσωμα. Οι τιμές εκφράζονται ως φορές εμπλουτισμό για τον έλεγχο και προσδιορίστηκαν με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR. Κάθε πειραματική τιμή διορθώθηκε για είσοδο και τα πειράματα διεξήχθησαν δύο φορές. Ανάλυση ανοσοστυπώματος (G) των κυτταρολυμάτων MCF7 siRNA επιμολυσμένα χρησιμοποιήθηκαν σε πειράματα chip. (H) πλινθίο του Rb-καταστολέα συγκρότημα πρωτεϊνών σε κύτταρα MCF7. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία όπως περιγράφεται παραπάνω και συγκροτήματα χρωματίνης απομονώθηκαν με αντισώματα καθαρισμένα με συγγένεια κατευθύνεται προς Sin3a, Sin3b και HDACs 1-3.

Η

Έχουμε επεκτείνει τις έρευνές μας, σε μια προσπάθεια να καθοριστεί εάν TRIP230 και Rb έχουν την ικανότητα να αλληλεπιδρούν με μεμονωμένα στοιχεία DNA σε συνεννόηση με HIF1α και ARNT σε στοιχεία υποξική απόκριση. Πραγματοποιήσαμε μια διαδοχική δοκιμασία ChIP δύο σταδίων, πρώτα απομόνωση χρωματίνης με αντισώματα καθαρισμένα με συγγένεια προς Arnt ή HIF1α ακολουθούμενη από καθίζηση των εν λόγω καθαρισμένων κλασμάτων χρωματίνης με αντισώματα προς TRIP230 και Rb. Σε κάθε περίπτωση προαγωγός VEGF DNA ενισχύθηκε με PCR σε ένα υποξία-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 2D και Ε) υποδηλώνοντας έντονα ότι HIF1α, ARNT, TRIP230 και Rb είναι παρόν σε HREs σε ένα σύμπλεγμα πολλαπλών πρωτεϊνών. Επιπλέον, knock-down του Rb όπως αξιολογείται με ανοσο-στύπωμα (Εικόνα 2G), δεν οδήγησε σε περαιτέρω εμπλουτισμό του TRIP230 στον υποκινητή του VEGF (Εικόνα 2F) υποδηλώνοντας ότι το Rb δεν παρεμβάλλεται TRIP230 στρατολόγησης HIF1 ανταποκρινόμενα στοιχεία.

Τέλος, μας ενδιαφέρει να δούμε αν είναι γνωστή Rb-συνδέονται συγκροτήματα καταστολέα [26], [27] ήταν παρούσα σε αυτά τα στοιχεία κατά τη διάρκεια της υποξίας με γνώμονα την μεταγραφή. ανάλυση ChIP αποκάλυψε ο Sin3a /b, HDAC1 και HDAC3 εμπλουτίστηκαν στα HIF-απόκρισης ρυθμιστικές περιοχές τόσο του VEGF και τα γονίδια ΕΡΟ υπό συνθήκες υποξίας (Σχήμα 2Η) στήριξη υπόθεση μας ότι το Rb είναι μέρος του μεταγραφικού καταστολέα συγκρότημα που δρουν στο HIF1 ρυθμιζόμενη μεταγραφή. Σε αντίθεση, HDAC2 συμπεριφέρθηκε σε μια πιο κανονική μόδα και απολύθηκε από αυτές τις περιοχές σε υποξία-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 2Η). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι οι μεταγραφικές πρωτεΐνες καταστολέα προσλαμβάνονται με γονίδια υποξία ρυθμίζεται κατά τη διάρκεια της ενεργοποιημένης μεταγραφής. Επιπλέον, αυτές οι παρατηρήσεις υποστηρίζουν την υπόθεση ότι η μεταγραφή πρέπει να εξασθενεί για να εξασφαλιστεί η κατάλληλη μεταγραφική απόκριση.

ARNT και TRIP230 είναι απαραίτητες για την Rb-ρύθμιση των HIF1 Δραστηριότητα

Από Rb και TRIP230 αλληλεπιδρούν πρωτεΐνες , τα ποσοτικά πειράματα RT-PCR επαναλήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα siRNA που κατευθύνεται προς TRIP230. Υποξική επαγωγή του γονιδίου της συσσώρευσης CXCR4 mRNA ήταν σοβαρά μειωμένη κατά knock-down της TRIP230 (Σχήμα 3Α και Β). Knock-down του Rb υπό αυτές τις συνθήκες, όπως αποδεικνύεται από ανάλυση ανοσο-κηλίδος (Σχήμα 3Β) δεν οδήγησε σε σημαντική αύξηση των CXCR4 mRNA, παρέχοντας περαιτέρω απόδειξη ότι αυτή η επίδραση είναι TRIP230-εξαρτώμενη. Εικόνες ολόκληρων ανοσο-στυπώματα μπορεί να βρεθεί στο Σχήμα S1. Επιπλέον, η απώλεια του Rb δεν οδήγησε σε αύξηση της συσσώρευσης CXCR4 mRNA σε κύτταρα αποκοπεί για ARNT με siRNA μεσολάβηση knock-down υποδηλώνοντας περαιτέρω ότι η επίδραση που προκαλείται από το Rb είναι υποξία-εξαρτώμενο (Σχήμα 3C και D). Επιπλέον, siRNA μεσολάβηση καταστολή της έκφρασης DP1 σε κύτταρα MCF7 ανταποκρίθηκαν στην υποξία τόσο εύκολα όσο τα κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 3C και Ε) που δείχνει ότι η λειτουργία διαμορφωτική του Rb σε γονίδια HIF-ρυθμιζόμενων είναι ανεξάρτητη από E2F και αποσυνδέεται από κανονική ρόλος Rb ως ένας μεσολαβητής του κυτταρικού κύκλου.

(α) κύτταρα MCF7 διαμολύνθηκαν είτε με μπερδεμένο siRNA (SCX) ή Rb siRNAs SIRB 1, και SIRB 2, ή ένας συνδυασμός TRIP230 siRNA και siRb1. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση τα κύτταρα είτε διατηρήθηκαν υπό νορμοξικές συνθήκες ή 1% O

2 για περαιτέρω 24 ώρες. Η γονιδιακή έκφραση προσδιορίστηκε με ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου μετά από την απομόνωση και την αντίστροφη μεταγραφή του ολικού RNA. έκφραση CXCR4 ομαλοποιήθηκε σε ουσιαστικά δραστική 36Β4 γονιδιακής έκφρασης. (Β) Ανάλυση ανοσοστυπώματος του TRIP230 και Rb μετά siRNA επιμόλυνση με είτε κωδικοποιημένα siRNA, ή ένα συνδυασμό siTRIP230 και SIRB. Αλφα-τουμπουλίνης (α-τουμπουλίνης) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. κύτταρα (C) MCF7 διαμολύνθηκαν είτε με μπερδεμένο siRNA (SCX) ή Rb siRNAs SIRB 1, και SIRB 2, ή ARNT, ή DP1 siRNA ή με συνδυασμό των ARNT /Rb1 siRNA και υποβλήθηκε σε επεξεργασία όπως περιγράφηκε ανωτέρω. (D) Ανοσο-blot των ARNT και α-μπανιέρα μετά από επιμόλυνση με είτε περιπλεγμένο έλεγχο του siRNA που κατευθύνεται προς ARNT. (Ε) Ανοσο-blot των DP1, TRIP230 και α-τουμπουλίνης (α-τουμπουλίνης). κύτταρα MCF7 διαμολύνθηκαν είτε με περιπλεγμένο ελέγχου (SCX) ή siRNA που κατευθύνεται προς DP1. Τα δεδομένα στο Σχήμα 3Α και 3C αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας αμφίδρομη ΑΝΟνΑ-. * P & lt?. 0.01

Η

Απώλεια Rb οδηγεί σε μια αύξηση στην HIF1 Target Gene Expression Πρωτεΐνη

Μας ενδιέφερε να καθοριστεί εάν η επίδραση του Rb-loss σε συσσώρευση mRNA αντικατοπτρίζεται σε επίπεδο πρωτεϊνών των γονιδίων στόχων HIF1 και, ιδίως εάν επηρεάστηκαν προ-μεταστατικό παράγοντες. Έτσι, εξετάσαμε επίσης το ρόλο του Rb στην έκφραση των κατάντη μεταστατικών δεικτών που είναι ευαίσθητα στην υποξία. Απώλεια Rb οδήγησε σε ταυτόχρονη αύξηση των επιπέδων πρωτεΐνης CXCR4 μετά από 48 ώρες υποξίας και PLOD2 μετά 96 ώρες από την υποξία (Σχήμα 4Α). Επιπλέον, 24 ώρες έκθεσης σε υποξία με Rb knock-down οδήγησε επίσης σε μια αύξηση στην έκφραση του μεσεγχυματικών δείκτη, βιμεντίνη (Σχήμα S2A). Επιπλέον, η απώλεια του Rb δεν αύξησε τα ενδογενή επίπεδα του HIF1α (Σχήμα 4Α), γεγονός που υποδηλώνει ότι η παρατηρούμενη υποξική επίδραση δεν οφείλεται σε μια αύξηση στην έκφραση HIF1α ή σταθερότητα. Τέλος, προηγούμενες εκθέσεις έδειξαν ότι TRIP230 συνεργάτες με υπερ-φωσφορυλιωμένη Rb [16], [17]. λύματα ανοσοκαθήλωση από κύτταρα MCF7 και LNCaP με αντισώματα που κατευθύνονται προς Rb, Rb-φωσφο-σερίνη

780 και Rb-φωσφο-σερίνη

807/811 αποδεικνύουν ότι υπάρχει μία σημαντική ποσότητα φωσφορυλιωμένου Rb σε MCF7 και LNCaP κύτταρα (Σχήμα 4Β).

κύτταρα MCF7 (Α) διαμολύνθηκαν είτε με μπερδεμένο siRNA (SCX) ή Rb siRNAs SIRB 1, και SIRB 2. Rb, CXCR4, HIF1α, PLOD2 και α-τουμπουλίνης επίπεδα πρωτεΐνης ήταν αξιολογούνται με ανοσο-στύπωμα μετά από έκθεση σε ατμοσφαιρικούς O

2 ή 1% O

2 για 48 (Rb και CXCR4) ή 96 ώρες (HIF1α, και PLOD2). (Β) Ανοσο-blots των κυτταρικών λυμάτων ολόκληρο από MCF7 και LNCaP κυττάρων είτε αριστερά στην φυσιολογική οξυγόνωση (Ν) ή υποβάλλεται σε επεξεργασία με 1% O

2 για 6 ώρες (Η). Οι κηλίδες διερευνήθηκαν με πρωτογενή αντισώματα προς το σύνολο των Rb, Rb-φωσφο-σερίνη

780 (Rb-pS

780), Rb-φωσφο-σερίνη

807/811 (Rb-pS

807/811 ), ή α-τουμπουλίνης ως μάρτυρας φόρτωσης.

Η

Απώλεια Rb Προωθεί μια επεμβατική Φαινότυπος στον καρκίνο MCF7 κύτταρα του μαστού

Η ικανότητα της Rb knock-down για να ενισχύσει HIF1 συγκρότημα μεταγραφικό δραστηριότητα και η έκφραση πρωτεΐνης μας οδήγησε να αξιολογήσει εάν η καταστολή Rb θα μπορούσε επίσης να ενισχύσει την υποξία προκαλούμενη κυτταρική εισβολή σε παραδοσιακά μη διηθητικού καρκίνου του μαστού MCF7 κύτταρα [29]. Για τα κύτταρα με ένα πλήρες συμπλήρωμα του Rb (δηλαδή κύτταρα επιμολυσμένα με έλεγχο SCX siRNA), υποξία είχε καμία επίδραση στην εισβολή των κυττάρων MCF7 στο matrigel (Σχήμα 5Α και Β). Ωστόσο, siRNA knock-down του Rb οδήγησε σε αυξημένη διείσδυση των κυττάρων MCF7 υπό συνθήκες υποξίας, αλλά δεν είχε καμία επίδραση στην εισβολή υπό νορμοξικές συνθήκες (Σχήμα 5Α και Β). Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν το ρόλο του Rb ως καταστολέας όγκου της μεταστατικής προγραμμάτων υποξία ρυθμίζεται.

Είκοσι τέσσερις ώρες μετά siRNA επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε δοκιμασία εισβολή Matrigel. Οι πλάκες επωάστηκαν σε νορμοξικά (20% O

2) ή υποξικές συνθήκες (1% O

2) στους 37 ° C για 24 ώρες και εισβάλλοντας κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και κατέστησαν ορατά με κυανούν τολουϊδίνης. (Α) φωτομικρογραφίες των κυττάρων MCF7 matrigel-ενσωματωμένα. (Β) Αριθμητική αναπαράσταση της σχετικής εισβολής των κυττάρων MCF7 matrigel-embedded μετά τη θεραπεία με SCX ή SIRB και έκθεση σε νορμοξικές ή υποξικές συνθήκες (n = 6), (Γ) knock-down του Rb σε κύτταρα MCF7 δεν μεταβάλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε απάντηση CoCl

2. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNA όπως περιγράφεται παραπάνω. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα ή 100 μΜ CoCl

2 για την ενεργοποίηση και HIF1α κύτταρα μετρήθηκαν σε 0, 6, 12, 24, 36 48, και 72 ώρες αργότερα. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν ± S.E.M. * Ρ & lt?. 0.01

Η

Είχαμε την ανησυχία ότι η αυξημένη διεισδυτικότητα μπορεί να οφείλεται σε μια δραματική αύξηση στον πολλαπλασιασμό κυττάρου λόγω της απώλειας του Rb έλεγχο του κυτταρικού κύκλου. Για την αποφυγή περιόδων παρατεταμένης, σοβαρή υποξία, αποδείξαμε ότι ο σταθεροποιητικός παράγοντας HIF1α CoCl

2 θα μιμούνται τα αποτελέσματα της υποξίας στον προσδιορισμό matrigel (Σχήμα S2C). Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν περαιτέρω την υπόθεση μας ότι οι παρατηρούμενες επιδράσεις που προκαλούνται μέσω του συγκροτήματος HIF1. Με CoCl

2 καθιερωθεί ως ένα αποτελεσματικό μιμητικό της υποξίας μετά knock-down του Rb εις τον ποσοτικό προσδιορισμό matrigel, ήμασταν σε θέση να καθορίσει εάν η παρατηρούμενη αύξηση στην κυτταρική εισβολή οφείλεται στην αύξηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Σχήμα 5C). MCF7 δυναμική κυτταρική ανάπτυξη παρακολουθούνταν σε τακτά χρονικά διαστήματα με μέτρηση βιώσιμων κυττάρων κατά τη διάρκεια μιας περιόδου 72 ωρών. Σε κύτταρα επιμολυσμένα με είτε SCX ελέγχου siRNA ή Rb siRNA και με ξεχωριστά δείγματα κάθε διατηρούνται είτε παρουσία ή απουσία CoCl

2, παρατηρήσαμε ότι η απώλεια του Rb μειωμένο πολλαπλασιασμό τόσο un-θεραπεία και CoCl

2 κατεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 5C) χωρίς σημαντική διαφορά μεταξύ των άλλων θεραπειών. Ομοίως, Matrigel εισβολής των κυττάρων ελέγχου SCX ήταν δυσδιάκριτες υπό οποιαδήποτε κατάσταση. Διαλογή κυττάρων μετά από χρώση με ιωδιούχο προπίδιο αποκάλυψαν ένα μεγαλύτερο ποσοστό των κυττάρων knock-down Rb στην υπο-G1 φάση του κυτταρικού κύκλου (Σχήμα 5D και Ε). Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα αυτά υποδεικνύουν έντονα ότι η απώλεια του Rb προάγει κυτταρική εισβολή σε υποξία με τρόπο που εξαρτάται και ότι τα αποτελέσματα αυτά δεν οφείλονται σε αυξημένο αριθμό κυττάρων ή πολλαπλασιασμού.

Rb Associates με το PAS-B /TRIP230- αλληλεπίδραση περιοχής της πρωτεΐνης ARNT

Η δυνατότητα που ARNT, TRIP230 και Rb θα μπορούσε να είναι μέρος μιας πολυμερικό σύμπλοκο εξερευνήθηκε με ανοσο-καταβύθιση των συμπλοκών συνδέεται TRIP230 από τα πυρηνικά εκχυλίσματα κυττάρων MCF7 επωάστηκαν για 6 ώρες κάτω από υποξικές συνθήκες (Σχήμα 6Α). Ανάλυση ανοσο-στυπώματος αποκάλυψε ARNT και Rb να είναι παρόντες στο αντι-TRIP230 ανοσο-ίζημα ενώ κανένας από τους τρεις παράγοντες ανιχνεύθηκαν στα ιζήματα των προϊόντων λύσης διεξήχθη με μη-άνοσο IgG. Αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν ισχυρές ενδείξεις ότι φυσική πρωτεΐνη TRIP230 είναι ικανή αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης με ARNT και Rb.

(Α) Ανοσο-blot των συμπλοκών κατακρημνίστηκε χρησιμοποιώντας είτε ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού που κατευθύνεται προς TRIP230 ή τον έλεγχο του ποντικιού IgG από τα πυρηνικά εκχυλίσματα κυττάρων MCF7. Τα στυπώματα ανιχνεύθηκαν για την παρουσία TRIP30, ARNT και Rb. Η αριστερή λωρίδα κάθε κηλίδα περιλαμβάνει πυρηνικό εκχύλισμα που αντιπροσωπεύουν το 10% των εισροών. (Β) GST-ARNT-PAS-Β είναι ικανό να βγάλει προς τα κάτω TRIP230 και Rb. Ανάλυση ανοσο-κηλίδα της GST-ARNT-PAS-Β pull-down και GST pull-down των TRIP230 και Rb από MCF7 πυρηνικά εκχυλίσματα. χαρακτηριστικές ομάδες GST σταθεροποιήθηκαν σε σφαιρίδια γλουταθειόνης-αγαρόζης και επωάζονται για 90 λεπτά στους 4 βαθμούς C με 500 μg του πυρηνικού εκχυλίσματος MCF7 κυττάρων. λωρίδες εισόδου φορτώθηκαν με 250 μg του πυρηνικού εκχυλίσματος. Πλήρεις κηλίδες για πάνελ Α και Β μπορεί να βρεθεί στο Συμπληρωματικό Σχήμα S1. GST-ARNT-PAS-Β είναι ικανό να βγάλει προς τα κάτω φωσφορυλιωμένη Rb. (C) Ανάλυση ανοσοστυπώματος του GST-ARNT-PAS-Β pull-down και GST pull-down του Rb-φωσφο-σερίνη

780 (Rb-pS

780) από MCF7 πυρηνικά εκχυλίσματα συλλέγονται από κύτταρα τα αριστερά σε νορμοξία (Ν) ή υποβάλλεται σε επεξεργασία με 1% O

2 για 6 ώρες (Η). δοκιμασία ανοσο-κατακρήμνισης (D) χρωματίνης του ενισχυτή και του VEGF περιοχές προαγωγού ΕΡΟ στα κύτταρα MCF7 χρησιμοποιώντας έλεγχο ή Rb-φωσφο-σερίνη

780 αντισώματα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται ανωτέρω. Rb εξασθενεί TRIP230 μεσολάβηση συν-ενεργοποίηση της δραστηριότητας ARNT-εξαρτώμενη μεταγραφική. Οι τομείς Rb- και ARNT-αλληλεπίδραση υποδεικνύεται. κύτταρα Hepa-1c1c7 (Ε) και τα κύτταρα MCF7 (F) επιμολύνθηκαν με μια υποξαιμία αποκρίνεται 4xHRE καθοδηγείται λουσιφεράσης κατασκεύασμα ως ρεπόρτερ, πλασμίδια έκφρασης για TRIP230, TRIP230ΔRB και Rb όπως υποδεικνύεται και υποβάλλεται σε 1% O

2 ή την ατμοσφαιρική (20%) O

2 για 24 ώρες. Λύματα ολόκληρων κυττάρων αναλύθηκαν για δραστικότητα λουσιφεράσης. (G) Μία σχηματική του μεταλλαγμένου TRIP230ΔRB. επίπεδα (H) TRIP230 πρωτεΐνη δεν επηρεάζονται από την επιμόλυνση του Rb πλασμιδίου έκφρασης σε κύτταρα Hepa1c1c7. Λύματα ολόκληρων κυττάρων αναλύθηκαν με ανοσο-κηλίδος και μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με αντισώματα καθαρισμένα με συγγένεια προς TRIP230, Rb και α-τουμπουλίνης. * P & lt?. 0.05

Η

Δεδομένου ότι οι προηγούμενες

in vitro

μελέτες αλληλεπίδρασης καθορίζεται ότι Rb δεν αλληλεπιδρά άμεσα με ARNT [30], μπορούμε, συνεπώς, ενδιαφέρονται για να καθορίσει εάν η αλληλεπίδραση TRIP230 τομέα εντός ARNT θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την απομόνωση Rb από πυρηνικά εκχυλίσματα MCF7 κυττάρων. Partch και οι συνεργάτες του έχουν αναγνωρίσει ότι η περιοχή αλληλεπίδρασης TRIP230 μέσα ARNT βρίσκεται στην περιοχή PAS-Β της [31]. Εμείς λιωμένο αμινοξέα 344 έως 479 που φιλοξενεί το επεκτάθηκε τομέα PAS-Β των ARNT ποντικιού για GST. Χρησιμοποιώντας αυτό το ελάχιστο πεδίο αλληλεπίδρασης έγινε εν μέρει για να μειώσει την πιθανότητα ARNT να αλληλεπιδρούν με άλλες πυρηνικές πρωτεΐνες. Τραβήξτε προς τα κάτω των TRIP230 και Rb από πυρηνικά εκχυλίσματα από υποξία-Fi κύτταρα MCF7 ήταν δραματικά εμπλουτισμένο με τη χρήση του τομέα GST-ARNT-PAS-Β σε σύγκριση με το GST μόνη της (Σχήμα 6Β). Έτσι, είναι πιθανό ότι μια ARNT συγκρότημα συμπεριλαμβανομένων TRIP230 και Rb διαμορφώνεται μέσω του τομέα ARNT PAS-B. Αυτός ο τομέας μεσολαβεί στην αλληλεπίδραση μεταξύ ARNT και πολλαπλές συν-ενεργοποιητές που είναι απαραίτητα για ARNT διαμεσολαβούμενη μεταγραφή: δηλαδή, TRIP230 [12], οι P160 /NCoA /SRC-οικογένεια των μεταγραφικών συν-ενεργοποιητές [15], και το κακάο [32] .

Τέλος, θελήσαμε να καθορίσει συγκεκριμένα, αν υπερ-φωσφορυλιωμένη Rb ενεπλάκη σε HIF1 ρυθμιζόμενη μεταγραφή του γονιδίου. Εμείς ερωτάται ανοσο-κηλίδες με ένα αντι-φωσφο-σερίνη

780 Rb-ειδικό αντίσωμα μετά pull-down χρησιμοποιώντας GST-PAS-B. Με αυτόν τον τρόπο, παρατηρήσαμε υπερ-φωσφορυλιωμένη Rb εις κηλίδες που δημιουργούνται από νορμοξικές και υποξικές πυρηνικά εκχυλίσματα κυττάρων MCF7 (Εικόνα 6C). Επιπλέον, ανάκριση των μεταγραφικών ρυθμιστικών περιοχών της HRE που περιέχει προαγωγό VEGF και ΕΡΟ ενισχυτή αποκάλυψε την παρουσία Rb-pSer

780 σε υποξία-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 6D).

TRIP230 μεσολαβούσα Κατασταλτικά Επιδράσεις της Rb επί HIF-ρυθμιζόμενη μεταγραφή

Έχουμε αποδείξει ότι Rb συν-καθαρίζεται με TRIP230 και ότι Rb εξασθενεί την συσσώρευση του mRNA του γονιδίου-στόχου που προκαλείται από υποξαιμία και τα επίπεδα πρωτεΐνης. Προκειμένου να προσδιοριστεί εάν η ικανότητα του Rb να διαμορφώνουν HIF1 ρυθμιζόμενη μεταγραφική δραστικότητα διαμεσολαβείται μέσω TRIP230, εξετάσαμε επιδράσεις του Rb στην έκφραση ενός κατασκευάσματος ανταποκριτή υποξαιμία αποκρίνεται χρησιμοποιώντας μεταλλάξεις διαγραφής του TRIP230 σε κύτταρα RB και αρνητικών κατά Gramm κυτταρικές γραμμές . Rb-αρνητικά κύτταρα Hepa1c1c7 επιμολύνθηκαν με ένα πλασμίδιο έκφρασης που κωδικοποιεί TRIP230, ή ένα μεταγραφικά αρμόδια διαγραφή-μεταλλάκτη TRIP230 (TRIP230ΔRb? Σχηματικό στο Σχήμα 6G) έλλειψη του πεδίου Rb-αλληλεπίδραση [17], ένα πλασμίδιο έκφρασης Rb cDNA και ένα συνθετικό λουσιφεράσης κατασκεύασμα ανταποκριτή που περιέχει ένα προαγωγό πολυμερισμένες υποξαιμία στοιχείο απόκρισης (HRE) (Σχήμα 6Ε). Rb κατάργησε υποξική επαγωγή της δραστικότητας ανταποκριτή σε κύτταρα επιμολυσμένα με άγριου τύπου TRIP230, αλλά ήταν αναποτελεσματική σε κύτταρα επιμολυσμένα με τον μεταλλαγμένο TRIP230. Η επιμόλυνση του Rb στην κυτταρική σειρά Hepa1c1c7 δεν είχε καμία επίδραση στα επίπεδα της ενδογενούς πρωτεΐνης TRIP230 (Σχήμα 6Η). Πράγματι, η τιτλοδότηση των αυξανόμενων ποσοτήτων του πλασμιδίου Rb-έκφραση καταστέλλεται δραστικότητα ανταποκριτή υποξία σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα S2B). Η επιμόλυνση του μεταλλαγμένου TRIP230 σε Rb-θετικά MCF7 κύτταρα καρκίνου ανθρώπινου μαστού ενισχυθεί περαιτέρω η έκφραση του γονιδίου αναφοράς (Σχήμα 6F), λειτουργώντας έτσι ως κυρίαρχος αρνητικός πιθανό με τον ανταγωνισμό για HREs με το ενδογενές TRIP230 άγριου τύπου. Τα δεδομένα αυτά συλλογικά υποδηλώνουν ότι μειώνουν τις σχετικές συνέπειες Rb για HIF1 μεταγραφική δραστηριότητα φαίνεται να διαμεσολαβείται από TRIP230.

Συζήτηση

Έχουμε διαπιστώσει ότι Rb εξασθενεί η φυσιολογική αντίδραση στην υποξία από HIF1α και ότι πρόκειται για μια αναπόσπαστο και απαραίτητο μέρος του μεταγραφικού συμπλόκου HIF1 δυνάμει άμεση αλληλεπίδραση με TRIP230. Αυτή η επίδραση είναι ανεξάρτητη από άλλες αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης, όπως το κατασταλτικό αποτέλεσμα του Rb χάθηκε σε κύτταρα που υπερεκφράζουν ένα μεταγραφικά αρμόδια μετάλλαγμα του TRIP230 έλλειψη του πεδίου Rb-αλληλεπίδραση (Σχήμα 6Ε και F) και σε κύτταρα εξαντλούνται από TRIP230 (Σχήμα 3Α ). Επιπλέον, siRNA μεσολάβηση knock-down του Rb οδήγησε σε ταυτόχρονη αύξηση των γνωστών γονιδίων στόχων HIF1 σε υποξία με τρόπο που εξαρτάται σε ανθρώπινο MCF7 του μαστού και σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές LNCaP του προστάτη (Σχήμα 1). Επιπλέον, ήμασταν σε θέση να καταγράψει Rb πάνω καλώς χαρακτηρισμένα HREs στις ρυθμιστικές περιοχές ΕΡΟ και VEGF (Σχήμα 2) γεγονός που υποδηλώνει ότι το Rb μπορεί να ρυθμίζει την έκφραση αυτών των γονιδίων σε μεταγραφικό επίπεδο.

Η TRIP230 συνενεργοποιητή ήταν κλωνοποιηθεί και χαρακτηριστεί με βάση την ικανότητά του να αλληλεπιδρά με τον υποδοχέα θυρεοειδούς ορμόνης (TR) και να ενισχύσει τη λειτουργία του διενεργοποίησης [13], [16], και λόγω της ικανότητάς της να αλληλεπιδρά με το Rb [16]. Στην τελευταία αυτή έκθεση, στοιχεία που παρουσίασε το οποίο υποστήριζε ρόλο για Rb ως μεταγραφικός εξασθένησης της λειτουργίας του υποδοχέα των θυρεοειδικών ορμονών, πιθανόν με τη μεσολάβηση του TRIP230 μεταγραφικού συν-ενεργοποιητή. TRIP230 βρέθηκε αργότερα να δρα ως ένα ουσιαστικό συν-ενεργοποιητή για δραστηριότητες ARNT εξαρτώμενη μεταγραφική, συμπεριλαμβανομένης γονιδιακής έκφρασης που προκαλείται από υποξαιμία [12]. Είναι σημαντικό ότι, βρήκαμε ότι TRIP230 δεν αλληλεπιδρούν με HIF1α σε ένα δύο-υβριδίων ζυμομύκητα δοκιμασίας (Τ Beischlag, αδημοσίευτα δεδομένα). μελέτες ανοσο-καταβύθιση μας απασχολούν αντισώματα που κατευθύνονται προς TRIP230 αποδεικνύουν ότι η ενδογενής ARNT και Rb αλληλεπιδρούν με TRIP230 στα κύτταρα MCF7 (Εικόνα 6Α) την περαιτέρω στήριξη υπόθεσή μας ότι η Rb είναι μέρος ενός μεταγραφικού συμπλόκου HIF1.

Για να οριοθετηθούν περαιτέρω η φύση αυτής υποθετικών συγκρότημα και να καθορίσει εάν υπάρχουν ARNT, TRIP230 και Rb σε ένα ενιαίο συγκρότημα, θα εξαλειφθούν άλλες διασυνδέσεις γνωστές αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης εντός ARNT και να χρησιμοποιηθεί μια στρατηγική GST pull-down συγγένειας δέσμευσης TRIP230 και Rb. Η συνολική ανάλυση από την GST pull-down εκτελείται από Elferink και οι συνεργάτες του δεν μπόρεσαν να αποδείξουν την άμεση αλληλεπίδραση με ARNT και Rb

in vitro

[30]. Επιπλέον, με βάση προηγούμενες μελέτες μας που χαρακτηρίζουν την αλληλεπίδραση μεταξύ ARNT και TRIP230 [12], Partch και οι συνεργάτες του εντόπισαν αμινοξέα μέσα στην περιοχή ARNT PAS-B που διαμεσολαβούν την αλληλεπίδραση ARNT-TRIP230 [31]. Σχεδιάσαμε μια σύντηξης GST-ARNT-PAS-Β, εξαλείφοντας έτσι άλλους τομείς αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης μέσα ARNT. Η ικανότητα της περιοχής ARNT-PAS-Β για να τραβήξει προς τα κάτω Rb υποστηρίζει την ύπαρξη ενός πολυ-μερές σύμπλοκο που περιέχει ARNT, TRIP230 και Rb (Σχήμα 6Β). Πράγματι, ο τομέας PAS-B έχει αναδειχθεί ως μια καλόπιστη πλατφόρμα για την πρόσληψη των πολλαπλών μορφών του μεταγραφικού συν-ρυθμιστικών συμπλέγματα [12], [15], [31], [33].

Η HIF1 * P & lt? 0,05.