Αφηρημένο

Ιστορικό

microRNA (miRNA) είναι μια αναδυόμενη υποκατηγορία των μικρών μη-κωδικοποίησης RNAs που ρυθμίζει την έκφραση γονιδίων και έχει καθοριστικό ρόλο για πολλές φυσιολογικές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης του καρκίνου. Πρόσφατες εκθέσεις αποκάλυψαν το ρόλο των miRNAs ως ιδανικό βιοδείκτες και θεραπευτικών στόχων οφείλεται σε ιστό ή νόσο του ιδιαίτερου χαρακτήρα τους. Καρκίνος κεφαλής και τραχήλου (HNC) είναι μία κύρια αιτία θνησιμότητας και νοσηρότητας σχετίζονται με τον καρκίνο, και του λάρυγγα καρκίνος έχει την υψηλότερη συχνότητα σε αυτό. Ωστόσο, οι μοριακοί μηχανισμοί που εμπλέκονται στην λάρυγγα ανάπτυξη καρκίνου παραμένει να γίνει γνωστό και εξαιρετικά ευαίσθητο βιοδείκτες και νέα υποσχόμενη θεραπεία είναι απαραίτητη.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Για να εξερευνήσετε λαρυγγικό καρκίνο συγκεκριμένες miRNAs, RNA από 5 λαρυγγική χειρουργικά δείγματα, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου και μη καρκινικούς ιστούς υβριδοποιήθηκαν μικροσυστοιχιών μεταφέρουν 723 ανθρώπινα miRNAs. Τα προκύπτοντα εκφράζονται διαφορικά miRNAs ελέγχθηκαν περαιτέρω με τη χρήση ποσοτικής σε πραγματικό χρόνο PCR (qRT-PCR) σε δείγματα ιστών 43 λαρυγγική συμπεριλαμβανομένων των καρκίνων, μη-καρκινική ομολόγους, καλοήθεις ασθένειες και προκαρκινικές δυσπλασίες. Σημαντικές εκφραστικές διαφορές μεταξύ των ζεύγη είχαν αναπαραχθεί σε miR-133b, miR-455-5p, και miR-196a, μεταξύ των οποίων και miR-196a είναι η πιο πολλά υποσχόμενη βιοδείκτης του καρκίνου, όπως επικυρώθηκαν από qRT-PCR αναλύσεις σε επιπλέον δείγματα 84 ιστού. Ανάλυση βαθιά αλληλουχίας αποκάλυψε τόσο ποσοτικά όσο και ποιοτικά απόκλιση της έκφρασης isomiR miR-196a στον καρκίνο του λάρυγγα. Σε situ υβριδισμό επιβεβαιώνονται λαρυγγική ειδική για τον καρκίνο έκφραση του miR-196α και στα δύο καρκίνο και στρώμα καρκινικά κύτταρα. Τέλος, η αναστολή του miR-196a παρεμπόδισαν τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, τόσο του λάρυγγα του καρκίνου που προέρχονται από κύτταρα και ξενομοσχεύματος ποντικού μοντέλο.

Συμπεράσματα /Σημασία

Η μελέτη μας παρέχονται οι δυνατότητες που miR-196a μπορεί να είναι πολύ χρήσιμα στη διάγνωση και θεραπεία του καρκίνου του λάρυγγα

Παράθεση:. Saito Κ, Ιναγάκι K, Kamimoto Τ, Ito Y, Sugita Τ, Nakajo S, et al. (2013) microRNA-196a είναι ένας υποθετικός Διαγνωστικό βιοδεικτών και θεραπευτικός στόχος για τον καρκίνο του λάρυγγα. PLoS ONE 8 (8): e71480. doi: 10.1371 /journal.pone.0071480

Συντάκτης: Valerie W. Hu, The George Washington University, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 8 του Φλεβάρη 2013? Αποδεκτές: 28, Ιουνίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 14 Αυγούστου 2013

Copyright: © 2013 Saito et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση: α. Τμήμα της εργασίας αυτής υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση για Βιομηχανική Technology Research της Νέας Ενέργειας και Βιομηχανικής Οργάνωσης Τεχνολογικής Ανάπτυξης (NEDO? https://www.nedo.go.jp/english/index.html). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση ελήφθη για τη μελέτη αυτή

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Παρά το γεγονός ότι μερικοί από τους συγγραφείς απασχολούνται από εμπορικές επιχειρήσεις (ΚΕ Ito, Τ Sugita, και S. Nakajo με SRL, Inc., Τ Ishikura, H. Hanaoka, και T. Onozaki από Life Technologies Ιαπωνία), δεν έχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα σχετικά με το έργο αυτό. Αυτές οι απασχολήσεις δεν μεταβάλλουν την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Το 2004, 28.260 νέες περιπτώσεις της στοματικής κοιλότητας και του καρκίνου του φάρυγγα και 20.260 νέες περιπτώσεις του καρκίνου του λάρυγγα διαγνώστηκαν στις Ηνωμένες Πολιτείες, με αποτέλεσμα 7230 και 3830 θανάτους, αντιστοίχως [1], [2]. Παρά τις σημαντικές προόδους στην χειρουργική επέμβαση και ακτινοθεραπεία κατά τις τελευταίες δεκαετίες, τα ποσοστά επιβίωσης 5 ετών από το κεφάλι και το λαιμό ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (HNSCC) ασθενείς έχουν βελτιωθεί μέτρια μόνο εν μέρει λόγω του σχετικά υψηλού τοπικό ποσοστό υποτροπής. Επί του παρόντος, τοποπεριοχική HNC κατεργάζεται με ένα συνδυασμό χειρουργικής επέμβασης και της ακτινοβολίας με ή χωρίς χημειοθεραπεία, ενώ κάθε κατεργασία επιλογή οδηγεί σε καταστροφικές συνέπειες για την ομιλία και την κατάποση λειτουργία. Επιπλέον, οι χειρουργικές διαδικασίες στο κεφάλι και το λαιμό και την περιοχή της στοματικής κοιλότητας ως αποτέλεσμα συνήθως σε σημαντικές καλλυντικά παραμορφώσεις. Ακόμη και με τις προσεγγίσεις που αναφέρθηκαν η συνδυασμένη θεραπεία, οι ασθενείς με προχωρημένο HNC είναι συνεπώς ανάγκη από νέες και λιγότερο επεμβατικές θεραπείες για την υψηλή νοσηρότητα ασθένεια τους. Σε αυτή τη μελέτη, να σκεφτόμαστε σημαντική ετερογένεια των όγκων HNSCC, έχουμε επικεντρωθεί σε ένα μόνο καλά καθορισμένη ανατομική θέση, λάρυγγα. Ενώ λάρυγγα καρκίνος είναι πολύ ιάσιμος είτε με χειρουργική αφαίρεση ή ακτινοβολία όταν βρεθεί και να θεραπευτεί σε πρώιμο στάδιο, προχωρημένο καρκίνο παραμένει πολύ λιγότερο ιάσιμη με αποτέλεσμα σε καμία σημαντική βελτίωση της συνολικής επιβίωσης από το 1975 [3]. Έτσι, εξαιρετικά ευαίσθητο βιοδείκτες για την ανίχνευση του καρκίνου του λάρυγγα, ακόμη και σε πρώιμο στάδιο χωρίς κλινικά συμπτώματα, και σημαντικά τον αποτελεσματικό νέοι θεραπευτικοί παράγοντες είναι αναγκαία η περαιτέρω βελτίωση των αποτελεσμάτων του καρκίνου του λάρυγγα του ασθενούς. Επιπλέον, οι τρέχουσες προσεγγίσεις για να προβλέψει την έκβαση των ασθενών HNSCC περιλαμβάνουν εξέταση χρησιμοποιώντας κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους όπως πρωτοπαθούς όγκου, περιφερειακό κόμβο, μακρινή μετάσταση (TNM) – το στάδιο, το βάθος της εισβολής, και το βαθμό διαφοροποίησης. Ωστόσο, αυτές οι παράμετροι δεν αντικατοπτρίζουν με ακρίβεια την πρόγνωση των ασθενών και των πρόσθετων προγνωστικών και βιοδεικτών θα ήταν χρήσιμη για τη διαχείριση των ασθενών. Έτσι, μοριακή και κυτταρική βιολογία είναι ένα πολλά υποσχόμενο πεδίο μελέτης που μπορεί να οδηγήσει στην ανακάλυψη νέων βιολογικών δεικτών και νέων θεραπευτικών στόχων.

microRNA (miRNA), το οποίο κωδικοποιεί ένα μικρό μη-κωδικοποίησης του RNA του ~ 22 νουκλεοτιδίων, αναγνωρίζεται πλέον ως μια μεγάλη οικογένεια γονιδίων που εκφράζονται σε φυτά, ζώα, και ιούς καθώς και σε μονοκύτταρο φύκη [4]. Τα περισσότερα miRNAs των ζώων είναι εξελικτικά συντηρημένη και βρίσκονται συχνά σε σμήνη [5]. Πρωτογενής miRNAs (PRI-miRNAs) σχηματισμό δομές μίσχου-θηλιάς μεταγράφονται κατά κύριο λόγο από την RNA πολυμεράση II και διαδοχικά σε επεξεργασία από δύο RNase III-όπως ένζυμα, Drosha στο πυρήνα του κυττάρου και Dicer στο κυτταρόπλασμα, για να δημιουργήσει ώριμη miRNAs [6] , [7]. miRNAs ρυθμίζουν αρνητικά την έκφραση του γονιδίου σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο με διάσπαση ή /και μεταφραστικά καταστολή των στόχων mRNA τους μέσω αλληλεπίδρασης με τη χρήση τέλεια αντιστοίχιση βάση σε 5 ‘άκρο του ώριμου miRNA, που ονομάζεται επίσης την περιοχή σπόρου [8]. Πρόσφατες αναλύσεις βιοπληροφορική ανέφερε ότι πάνω από το 60% των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες έχουν τη δυνατότητα να συζευχθούν με και να ελέγχεται από miRNAs [9]. Περαιτέρω έρευνες απέδειξαν ότι miRNAs διαδραματίσουν εξαιρετικά σημαντικό ρόλο σε όλες σχεδόν τις πτυχές της βιολογίας, συμπεριλαμβανομένου του μεταβολισμού, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, απόπτωση, ανάπτυξη και διαφοροποίηση [10], [11].

Τα τελευταία χρόνια, υπήρξε μια σημαντικό ενδιαφέρον στην κατανόηση του ρόλου των miRNAs σε διεργασίες ασθένειας και απορύθμιση τους πιστεύεται ότι προάγουν την κακοήθη συμπεριφορά των όγκων [12]. Οι δεσμοί μεταξύ της παρεκκλίνουσας έκφρασης miRNAs και παθογένεση διαφόρων τύπων καρκίνου [12] – [14] τεκμηριώνονται

Επίσης, έχει αναφερθεί ότι miRNAs θα μπορούσε να είναι μια ιδανική βιοδεικτών για την ανίχνευση του καρκίνου, επειδή:. (I ) έκφραση miRNA συχνά δυσρυθμισμένη στον καρκίνο [15], [16], (ii) πρότυπα έκφρασης των miRNAs σε ανθρώπινο καρκίνο φαίνεται να είναι ιστο-ειδική [17], και (iii) miRNAs έχουν ασυνήθιστα υψηλή σταθερότητα ακόμη και σε φορμόλη-μόνιμη ιστούς [18]. Επιπλέον, η πρόσφατη εκτεταμένη έρευνα miRNA αποκάλυψε επίσης ότι οι miRNAs υπόσχεται θεραπευτικών στόχων σε καρκίνους συμπεριλαμβανομένων του παχέος εντέρου, του μαστού, του στομάχου και του ηπατοκυτταρικού κακοήθειες [19] – [26]

Όλα αυτά τα θέματα είναι σημαντικά για την παροχή μια βαθύτερη. κατανόηση των ρόλων των miRNAs σε HNSCC παθογένεση και ως πιθανοί προγνωστικοί και διαγνωστικών δεικτών, καθώς και ως θεραπευτικοί στόχοι σε HNSCC. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε προφίλ της έκφρασης των 723 μοναδικών ανθρώπινων miRNAs σε 3 καρκίνους του λάρυγγα, 2 noncancerous ομολόγους λαρυγγική χρησιμοποιώντας μικροδιατάξεις ολιγονουκλεοτιδίων με μια δομή φουρκέτας που ενσωματώνεται πάνω στο 5 ‘άκρο του ανιχνευτή [27] κατασκευάζεται από ένα ολιγονουκλεοτίδιο συνθέτη ink-jet [28] (Agilent Ανθρωπίνων miRNA V2, Agilent Technologies) και εντοπίστηκαν αρκετές miRNAs που θα μπορούσαν να χρησιμεύσουν ως πιθανοί δείκτες διάγνωσης της νόσου. Επιβεβαιώσαμε περαιτέρω την έκφραση των επιλεγμένων miRNAs χρήση qRT-PCR (δοκιμασίες TaqMan® miRNA, Applied Biosystems) σε 5 noncancerous ομολόγους, 14 πολύποδες ή οζίδια, 12 δυσπλασίες και 17 καρκίνοι του λάρυγγα να παρέχουν στοιχεία υποδηλώνουν ότι η μεταβολή των επιπέδων έκφρασης των miRNAs έχουν μια λειτουργική κατά συνέπεια στον καρκίνο του λάρυγγα.

In situ υβριδισμού

(ISH) περαιτέρω αποδείχθηκε η σημαντικά διαφορική έκφραση των miRNAs σε βλάβη του καρκίνου σε σύγκριση με την κανονική πλακωδών κυττάρων του επιθηλίου.

Εμείς αξιολογηθεί περαιτέρω ο αντίκτυπος των miR-196a αναστολή

στο

vitro

και

στο

vivo

στην ανάπτυξη της HNSCC να αξιολογήσουν το δυναμικό των miRNA ως νέο θεραπευτικό στόχο για ΕΘΕΓ.

υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

το ερευνητικό πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Keio University School of Medicine και Sano Kousei Γενικό Νοσοκομείο. Όλα τα δείγματα ιστού ελήφθησαν με σκοπό την διαγνωστική βιοψία ή θεραπείες από τους ασθενείς που υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση μετά την έγκριση της μελέτης από το διοικητικό συμβούλιο θεσμική αναθεώρηση στο Keio University School of Medicine και Sano Kousei Γενικό Νοσοκομείο. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς

Τα ζώα φροντίζονται και να χρησιμοποιούνται σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που εγκρίθηκε από την επιτροπή των ζώων Φροντίδα και Χρήση του Keio University School of Medicine (αριθμός άδειας για αυτή τη μελέτη:. 10243- (0 )). Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις πραγματοποιήθηκε υπό τριβρωμοαιθανόλη αναισθησία, και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

Ασθενείς και δείγματα

Ένα μέρος του δείγματος υποβλήθηκε σε επεξεργασία για φορμόλη σταθερό και έχει εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) διαδικασία, που ακολουθείται από συνήθη παθολογικές αναλύσεις, ενώ η εναπομένουσα ιστός κορέστηκε σε RNA

αργότερα

® (Ambion, Foster City, CA) και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι την επεξεργασία. Όλα τα δείγματα FFPE εξετάστηκαν από έμπειρους παθολόγους για να επιβεβαιώσετε τις διαγνώσεις. Τα χαρακτηριστικά των ασθενών και παθολογικές στάσης συνοψίζονται στον Πίνακα 1.

Η

Αντιδραστήρια

Εκτός εάν αναφέρεται διαφορετικά, συνήθεις χημικές ύλες ελήφθησαν είτε από Sigma-Aldrich (Saint Louis, ΜΟ) ή Wako ( Osaka, Japan). miR-196a αναστολέα (HSA-miR-196a miRIDIAN Φουρκέτα αναστολέα, IH-300529-06) και αναστολέα αρνητικού ελέγχου (έλεγχος, miRIDIAN microRNA Αναστολέας Negative Control αρ. 1, IN-001005-01) που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη είχαν αγοραστεί από Dharmacon (Lafayette, CO). miRIDIAN φουρκέτας Inhibitor σχεδιάστηκε για να αναστέλλουν τη λειτουργία RISC του στόχου miRNA με δίκλωνο περιοχή της [29]. Για

in situ υβριδισμού

(ISH) του miR-196a, η 3′-DIG-επισημασμένο κλειδωμένη οξύ-ενσωματωθεί miRNA ανιχνευτή νουκλεϊκού (miRCURY LNA ™ microRNA Ανίχνευση Probe, Exiqon, Vedbaek, Δανία) χρησιμοποιήθηκε σε αυτό το μελέτη.

RNA Εκχύλιση και Ανάλυση Microarray miRNA

Ολικό RNA συμπεριλαμβανομένων RNA χαμηλού μοριακού βάρους από δείγματα ιστών και καρκινικών κυτταρικών γραμμών απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το mirVana ™ miRNA κιτ απομόνωσης (Ambion) σύμφωνα με το τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ποιότητα των δειγμάτων RNA εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας μια Agilent 2100 Bioanalyzer, και μόνο τα δείγματα που πληρούν τα κριτήρια του 28S /18S & gt? 1 και RNA Ακεραιότητα Αριθμός (RIN) ≥7.5 χρησιμοποιήθηκαν για όλες τις αναλύσεις

Για. ανάλυσης μικροσυστοιχιών, χρησιμοποιήσαμε την ανθρώπινη miRNA μικροσυστοιχιών Kit V2 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), το οποίο περιέχει 20-40 διαθέτει στόχευση καθένα από 723 ανθρώπινα miRNAs (Agilent σχεδιασμό ID 019118) [30], όπως σχολιασμένη στο Sanger miRBase, απελευθέρωση 10.1 [31]. Σήμανση και υβριδοποίηση του συνολικού RNA δείγματα διεξήχθησαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εκατό ng του ολικού RNA χρησιμοποιείται σαν είσοδος στην αντίδραση σήμανσης, και ολόκληρη η αντίδραση υβριδοποιήθηκε σε κάθε συστοιχία για 20 ώρες στους 55 ° C. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με τη χρήση Agilent GeneSpring GX7.3. Κανονική μάρτυρες και τα δείγματα καρκίνου του συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας t-test του Welch (ρ & lt? 0,05) και εκφράζονται διαφορικά miRNAs με τουλάχιστον μια 2-πλάσια αλλαγή στην έκφραση θεωρήθηκαν δυναμικό βιοδείκτες. Όλα τα εσωτερικά δεδομένα της ανάλυσης μικροσυστοιχιών των miRNAs έχουν κατατεθεί στο Gene Expression Omnibus (GEO) με αριθμό προσχώρησης της GSE47610.

TaqMan® ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR δοκιμασία των miRNAs

Η επίπεδα έκφρασης του κάθε miRNA επιβεβαιώθηκαν με TaqMan® ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (qRT-PCR) Δοκιμασία χρήση μεμονωμένων ειδικούς εκκινητές και ανιχνευτές σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Applied Biosystems, Foster City, CA). Εν συντομία, 10 ng του συνολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα με miRNA-ειδικούς εκκινητές stem-loop (Applied Biosystems), και το PCR εκτελέστηκε με το παραγόμενο RNA-ειδικό cDNA σε διάλυμα PCR δοκιμασία ειδική γονιδιακή TaqMan® miRNA πραγματικό χρόνο σχετικά με ένα StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Η αντίδραση διεξήχθη στους 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 45 κύκλους των 95 ° C για 15 s, και 60 ° C για 60 s. Όλα τα δείγματα μετρήθηκαν εις τριπλούν, συμπεριλαμβανομένων αντιδράσεις NTC. Η κανονικοποίηση διεξήχθη με το μικρό U6 πυρηνικό RNA (RNU6B? Applied Biosystems), και η σχετική έκφραση υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο συγκριτικής Ct (κατώφλι Κύκλος). Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση paired t-test για να συγκριθούν τα επίπεδα έκφρασης σε ζεύγη και δοκιμή Tukey-Kramer να συγκρίνουν τα επίπεδα έκφρασης μεταξύ πολλών ασθενειών και περαιτέρω αναλύσεις διεξήχθησαν από την δοκιμή U κατά ζεύγη Mann-Whitney. Το επίπεδο σημαντικότητας ορίστηκε στο p & lt?. 0.05

Next Generation αλληλουχίας των miRNAs

ανάλυση της αλληλουχίας επόμενη γενιά

διεξήχθη χρησιμοποιώντας Applied Biosystems σταθερό σύστημα ™ και στερεών ™ Μικρές Έκφραση RNA Kit σύμφωνα με στερεά ™ Σύστημα 3 Οδηγός χρήσης (Applied Biosystems). Το ποσοστό των μικρών RNA ανά συνολική μάζα RNA υπολογίστηκε με Agilent 2100 Bioanalyzer. Η μικρή περιεκτικότητα RNA εμπλουτίστηκε χρησιμοποιώντας κλασματοποίηση flashPAGE ™ (Ambion), αν χρειαστεί. Τα μικρά είδη RNA (10-40 nt) στη συνέχεια μετατρέπεται σε βιβλιοθήκες cDNA που χρησιμοποιούν στερεά ™ Small Έκφραση RNA Kit (Applied Biosystems), ακολουθούμενη από καθαρισμό και επιλογής μεγέθους με PAGE γύρω ~105-150 bp. Κλωνική ενίσχυση πάνω σε σφαιρίδια με γαλάκτωμα PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το στερεό κιτ ™ EPCR. Παρασκευασμένα σφαιρίδια υποβλήθηκαν σε τρέξιμο ελέγχου ποιότητας και στη συνέχεια αλληλουχήθηκαν επί στερεών ™ 3 Analyzer. Σύνολο 11,6 έως 35.900.000 ακολουθία διαβάζει ελήφθησαν από κάθε βιβλιοθήκη, και κατάντη ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του αγωγού σύστημα στερεάς ™ μικρά RNA Ανάλυση Pipeline Tool (corona RNA2MAP έκδοση 0.50). Όλα διαβάζει χαρτογραφήθηκαν διαδοχικά κατά (1) ριβοσωμικό RNA και RNA μεταφοράς, (2) γνωστές αλληλουχίες αναφοράς του miRNAs σε Sanger miRBase Release 18, (3) hg19 συναρμολόγησης ανθρώπινου γονιδιώματος αναφοράς (Genome Αναφοράς Consortium GRCh37) καθώς και της ανθρώπινης μιτοχονδριακό γονιδίωμα ( NC_001807.4). Το άθροισμα του αριθμού των σύντομων αναφέρει ότι αντιστοιχίζονται σε κάθε περιοχή ενδιαφέροντος κανονικοποιήθηκε προς το συνολικό αναφοράς-χαρτογραφήθηκε σύντομο διαβάζει σε κάθε δείγμα βιβλιοθήκη, και χρησιμοποιούνται ως πρώτες τιμές έκφραση της αντίστοιχης περιοχής. Διατήρηση και επαναλάβετε πληροφορίες που ελήφθη με τη χρήση του προγράμματος περιήγησης πίνακα Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια στη Σάντα Κρουζ. Δείγματα που αναλύθηκαν περιλαμβάνουν 2 καρκίνοι του λάρυγγα (T416, 66 αρσενικά yo, T3N0? T506, 74 αρσενικά yo, T3N2c) και προηγμένα δείγματα καρκίνου και 3 θηλώματα του λάρυγγα (T421, 33 αρσενικά yo, ενηλίκων εμφάνιση? T484, 33 αρσενικά yo, ενηλίκων εμφάνιση? T502, 38 αρσενικά yo, ενηλίκων εμφάνιση) ως δείγματα μη-καρκίνου. Όλα τα εσωτερικά δεδομένα της αλληλουχίας επόμενη γενιά των miRNAs κατατέθηκαν στο ϋϋΒΙ Ακολουθία Διαβάστε Αρχείο (SRA) με αριθμό προσχώρησης της PRJDB994.

In situ υβριδισμός

για miR-196a

Το

in situ

ανίχνευση πραγματοποιήθηκε σε σειριακές τομές παραφίνης 4 μm συμπεριλαμβανομένων των κανονικών βλεννογόνου και του λάρυγγα υλικό του καρκίνου του 74 yo αρσενικό ασθενή που υποβλήθηκε σε ολική λαρυγγεκτομή για πλήρη κατάργηση της προηγμένης όγκου Τ3. Οι τομές αποπαραφινοποιήθηκαν και στη συνέχεια υπέστη πέψη με πρωτεϊνάση Κ (10 μg /ml) για 5 λεπτά στους 37 ° C. Μετά πέψη με πρωτεϊνάση Κ, οι τομές σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη, και οι πλάκες στη συνέχεια υβριδοποιήθηκαν με 4 pmol Exiqon του miRCURY LNA ανιχνευτή ανίχνευσης συμπληρωματικό προς miR-196a σε ρυθμιστικό διάλυμα υβριδοποίησης (50% φορμαμίδιο, 5 χ SSC, 0.1% Tween, 9.2 mM κιτρικό οξύ (ρΗ 6), 50 μg /ml ηπαρίνη, και 500 μg /ml RNA ζυμομύκητα) όλη τη νύκτα στους 50 ° C. Ένα περιπλεγμένο και ένας ανιχνευτής RNU6B (Exiqon) χρησιμοποιήθηκαν επίσης ως αρνητικοί και θετικοί μάρτυρες αντίστοιχα. Στη συνέχεια, μετά από επώαση με θραύσματα αντι-DIG-ΑΡ Fab συζευγμένο με αλκαλική φωσφατάση αραιωμένο 1:50 σε διάλυμα αποκλεισμού (Roche, Βασιλεία, Ελβετία) επί 3 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου, τα υβριδοποιημένα ανιχνευτές ανιχνεύθηκαν με την εφαρμογή νιτροκυανούν χλωριούχου τετραζολίου /5- βρωμο-4-χλωρο-3-ινδολυλο φωσφορικό χρώμα υποστρώματος (Roche) στα πλακίδια. Διαφάνειες ήταν αντίθετα με πυρηνική γρήγορη κόκκινη και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Nikon ECLIPSE 55I μικροσκόπιο.

Cell Culture και διαμόλυνση

κεφαλής και τραχήλου από πλακώδες επιθήλιο καρκίνωμα (HNSCC) κυτταρικές σειρές, που προέρχεται από τη γλώσσα (HSC- 2, HSC-3, HSC-4), ούλα (SAS), η στοματική κοιλότητα (Ca9-22), του λάρυγγα (JHU-011) και του φάρυγγα (FaDu), ήταν όλα διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% θερμικά -inactivated βόειο εμβρυϊκό ορό και 1% πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη στους 37 ° C σε 5% CO

2.

Για προσδιορισμούς επιμόλυνση, τα κύτταρα διαμολύνθηκαν είτε με αναστολέα miR-196α ή αναστολέα αρνητικού μάρτυρα χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη ™ 2000 αντιδραστήριο (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ο αρνητικός μάρτυρας αναστολέας βασίστηκε στο C. elegans miRNA και αντιστοιχεί σε cel-miR-239b. Ο έλεγχος έχει αναλυθεί από BLAST έναντι όλων γονιδιωματικές αλληλουχίες ανθρώπου, ποντικού και αρουραίου και αλληλουχίες miRNA στην βάση δεδομένων αλληλουχίας miRBase. Αυτό το μόριο έχει τον ίδιο σχεδιασμό και τροποποιήσεις ως αναστολείς miRIDIAN microRNA που είναι γνωστό για τη στόχευση του mRNA. Κάθε πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν και ανεξάρτητα τουλάχιστον 3 φορές.

Κυττάρων Η βιωσιμότητα και δοκιμασία κυτταροτοξικότητας

JHU-011 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε ένα τρυβλίο 24 φρεατίων σε πυκνότητα 2 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο και σπάρθηκαν επί 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν, όπως περιγράφεται παραπάνω και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων προσδιορίστηκε με μέτρηση απευθείας των κυττάρων σε 0, 3 και 5 ημέρες μετά την επιμόλυνση. Εν συντομία, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με 0,4% trypan blue για να μετρηθεί η έκταση του κυτταρικού θανάτου χρησιμοποιώντας Countess ™ (Invitrogen). Ένα πυρηνικό αντιχρωματισμός χρησιμοποιώντας Hoechst 33258 εκτελέστηκε επίσης για την οπτικοποίηση των βιώσιμων κυττάρων σε 3 ημέρες μετά την επιμόλυνση.

Επιπλέον, η βιωσιμότητα των κυττάρων και την κυτταροτοξικότητα εκτιμήθηκαν με δραστηριότητες απόκλιση πρωτεάσης χρησιμοποιώντας MultiTox Fluor-Multiplex κυτταροτοξικότητας Δοκιμασία (Promega, Fitchburg, WI) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε συγκέντρωση 5 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο σε 96 διαδικασίες πλάκα και την επιμόλυνση καλά διεξήχθησαν 24 ώρες μετά την σπορά. Στη συνέχεια, η δραστικότητα ζωντανή δραστικότητα πρωτεάσης των κυττάρων και πρωτεάση νεκρών κυττάρων μετρήθηκαν σε 3 ημέρες μετά την επιμόλυνση με την προσθήκη γλυκυλ-φαινυλαλανυλ-aminofluorocoumarin (GF-AFC) ή δις-αλανυλ-αλανυλ-pnenylalanyl-ροδαμίνη 110 (δις-AAF-R110) όπως πεπτιδικά υποστρώματα, αντιστοίχως. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 37 ° C και με αποτέλεσμα ο φθορισμός μετρήθηκε (φθορισμού ζωντανών κυττάρων 400

Ex /505

Em? Φθορισμού νεκρών κυττάρων 485

Ex /520

Em) για να ληφθεί οι σχετικές μονάδες φθορισμού (RFU).

λαρυγγικό Cancer Μοντέλα ξενομοσχεύματος

τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε 6-εβδομάδων αρσενικά BALB /c γυμνά ποντίκια ηυ /ηυ. Τα ζώα φροντίζονται και να χρησιμοποιούνται σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που εγκρίθηκε από την επιτροπή των ζώων Φροντίδα και Χρήση του Keio University School of Medicine (Τόκιο, Ιαπωνία). Δέκα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε 2 ομάδες των 5 ποντικών. Η αποτελεσματικότητα της θεραπείας και στις δύο όγκους και μετάσταση τοποπεριοχική λεμφαδένα τους εξετάστηκε σε κάθε από τις ακόλουθες 2 ομάδες: Ομάδα 1, αναστολέας miR-196a? Ομάδα 2, ο αναστολέας αρνητικός έλεγχος (έλεγχος). Οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν με ενδοπεριτοναϊκή ένεση 5-7 mg τριβρωμοαιθανόλη. Ορθοτοπική ξενομοσχεύματος όγκοι που δημιουργούνται γύρω από το λαιμό στο επίπεδο του λάρυγγα με υποδόρια ένεση 5 × 10

6 JHU-011 κύτταρα με μια βελόνα 25 gauge. Μετά από μία εβδομάδα, οι όγκοι μετρήθηκαν σε τρεις διαστάσεις, χρησιμοποιώντας δαγκάνες, και στη συνέχεια είτε αναστολέα ή ελέγχου σε συνδυασμό με AteloGene ™ (Koken, Tokyo, Japan) (1 nmol /200 μΙ) miR-196α εγχύθηκε μέσα στα υποδόρια χώρους γύρω όγκων. Επιπρόσθετες θεραπείες διεξήχθησαν σε 13 και 19 ημέρες μετά τον εμβολιασμό των καρκινικών κυττάρων και περιοδική μέτρηση του όγκου διεξήχθη μέχρι και 12 εβδομάδες μετά την ένεση. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία και οι μάζες των όγκων συλλέχθηκαν, τότε κόβεται σε 2 κομμάτια. Το ήμισυ του κάθε όγκου καθορίστηκε σε 10% ουδέτερη ρυθμισμένη φορμαλίνη για όλη τη νύχτα, αφυδατώνονται με βήμα-προς-βήμα αιθανόλη, και ενσωματωμένα σε παραφίνη. Υπολειμματική ήμισυ του όγκου ήταν κορεσμένη σε RNA

αργότερα

® (Ambion) και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C. Διμερείς τραχηλικούς λεμφαδένες συλλέχθηκαν, snap-κατεψυγμένα και τομές παραφίνης. χρώση αιματοξυλίνης-Ηωσίνη πραγματοποιήθηκε σε ενσωματωμένα σε παραφίνη δείγματα για ιστολογική ανάλυση. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση t-test για να συγκρίνουμε το θεραπευτικό αποτέλεσμα του αναστολέα miR-196a κατά του καρκίνου του λάρυγγα

στο

vitro

και

στο

vivo

. Το επίπεδο σημαντικότητας ορίστηκε στο p & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

μικροσυστοιχιών Διαλογή των αλλαγμένη έκφραση των miRNAs στο λάρυγγα Καρκίνος

Για την αναγνώριση miRNAs απορυθμίζεται σε καρκίνους του λάρυγγα, εξετάσαμε για πρώτη φορά το προφίλ έκφρασης των 723 ανθρώπινη ώριμη miRNAs σε ιστούς 5 του λάρυγγα (3 καρκίνοι του λάρυγγα και 2 παρακείμενα noncancerous ομολόγους του λάρυγγα) χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι 5 miRNAs (miR-130b-5P (πρώην ορίζεται ως miR-130Β *), miR-196a, miR-455-3p, miR-455-5p, και miR-801) ή 2 miRNAs (miR-133b και miR-145) ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα ή προς τα κάτω ρυθμισμένα, αντιστοίχως του λάρυγγα καρκίνους (Σχήμα 1Α). Είναι ενδιαφέρον ότι, τα επίπεδα έκφρασης του είτε ας-7 οικογένεια, miR-15, miR-16, ή miR-17-92 συμπλέγματος, που είναι γνωστό ότι σχετίζονται με διάφορες άλλες μορφές καρκίνου, δεν ήταν προφανώς διαφορετική μεταξύ του λάρυγγα καρκινικούς ιστούς και άλλα noncancerous ιστούς (Εικόνα 1Β).

είναι

Σύνολα σύγκριση μεταξύ των καρκίνων και των παρακείμενων noncancerous ομολόγων, σχεδιάζοντας την αφθονία ενός δεδομένου miRNA σε ένα σύνολο δεδομένων κατά την αντίστοιχη αξία του σε άλλο σύνολο δεδομένων, τόσο σε λογαριθμική κλίμακα. 723 ανθρώπινα miRNAs συμπεριλήφθηκαν στην μικροσυστοιχία Agilent. (Α) Σύγκριση μεταξύ της κανονικής ελέγχου και τα δείγματα καρκίνου απέδειξε την ανοδική ρύθμιση των 5 miRNAs (miR-130 Β-5P, miR-196a, miR-455-3p, miR-455-5p, και miR-801) και την κατάντη ρύθμιση των 2 miRNAs (miR-133b και miR-145). (Β) Τα επίπεδα έκφρασης του ας-7 οικογένεια, miR-15, miR-16, ή miR-17-92 συμπλέγματος, είναι γνωστό ότι εμπλέκονται σε διάφορες άλλες μορφές καρκίνου, δεν ήταν σημαντικά διαφορετικά μεταξύ κανονικών ελέγχων και καρκίνων (

ανώτερο δεξί πάνελ

και

κάτω πάνελ

). Τα επίπεδα έκφρασης των 723 ανθρώπινα miRNAs επίσης δείξει (

πάνω αριστερά πάνελ

).

Η

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR Επικύρωση των miRNA έκφραση στο λάρυγγα Καρκίνος

Στη συνέχεια, να επιβεβαιώσει και να επικυρώνει τις διαπιστώσεις που προκύπτουν από ανάλυση μικροσυστοιχιών μας, πραγματοποιήσαμε PCR πραγματικού χρόνου (qRT-PCR) ποσοτική ανάλυση (TaqMan® microRNA αναλύσεις, Applied Biosystems) χρησιμοποιώντας 5 ζεύγη των καρκίνων του πρωτογενούς λάρυγγα και συμφωνημένα noncancerous ιστούς τους. Παρά το γεγονός ότι η ανάλυση μικροσυστοιχιών αποκάλυψε τα πάνω ρύθμιση των 5 miRNAs και ρύθμιση προς τα κάτω των 2 miRNAs, miR-801 είναι τώρα θεωρείται ότι είναι ένα κομμάτι της U11 συρραφής RNA και αφαιρείται από το miRBase [31]. miR-145 είχε εξαιρείται επίσης από τις περαιτέρω μελέτες, επειδή έχει αναφερθεί να συχνά κάτω ρυθμισμένα σε καρκίνους σε πολλαπλά όργανα, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη [32], του καρκίνου του μαστού [33], ο καρκίνος της ουροδόχου κύστης [34], ο καρκίνος του παχέος εντέρου [35 ], [36], τον καρκίνο των ωοθηκών [37], καρκίνο του οισοφάγου [38], ο καρκίνος του πνεύμονα [39], [40], ρινοφαρυγγικό καρκίνο [41], γαστρικού καρκίνου [42], καθώς και κακοήθειες Β-κυττάρων [43] και θεωρείται ότι δεν είναι η κατάλληλη βιοδείκτη για τον καρκίνο του λάρυγγα.

miR-455-5p αντί του miR-455-3p χρησιμοποιήθηκε σε περαιτέρω μελέτες, γιατί miRNAs 3p και 5p δημιουργούνται από τις δύο πλευρές του ίδιου προδρόμου πηγάζουν να έχουν παρόμοιες ακολουθίες και την πρόσφατη έκθεση πρότεινε την πιθανή συμμετοχή του miR-455-5p στην εξέλιξη του καρκίνου [44]. Έτσι, η ανάλυση qRT-PCR πραγματοποιήθηκε σε υπολειμματική 4 miRNAs (δηλαδή, miR-130 Β-5P, miR-196a, miR-455-5p, και miR-133b). Τα επίπεδα έκφρασης αυτών των miRNAs συγκρίθηκαν μεταξύ 5 καρκινικούς ιστούς και των παρακείμενων ιστών noncancerous τους. Τα αποτελέσματα ήταν συνεπή με εκείνα που λαμβάνονται από τις αναλύσεις μικροσυστοιχιών, ειδικά όταν συνδυάζεται δείγματα συγκρίθηκαν με τους ίδιους ασθενείς (Σχήματα 2Α και Β). Υψηλότερα επίπεδα έκφρασης του miR-130b-5P παρατηρήθηκαν σε καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με τις γειτονικές τους ελέγχους σε 4 από 5 ζεύγη. Επιπλέον, τα επίπεδα έκφρασης του miR-196a και miR-455-5p ήταν σημαντικά υψηλότερα σε καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με τις γειτονικές τους ελέγχους (MIR-196α, ρ = 0,0460? MiR-455-5p, ρ = 0.0286) (Σχήμα 2Α), ενώ επίπεδο έκφρασης του miR-133b ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε δείγματα καρκίνου του σύγκριση με τους ελέγχους (ρ = 0.0274) (Σχήμα 2Β).

Σχετική εκφράσεις του λάρυγγα σχετίζονται με τον καρκίνο miRNAs σε 5 ζεύγη δειγμάτων μετρήθηκαν με TaqMan® qRT- PCR ανάλυση και φαίνεται στο

αριστερό πάνελ

. Τα επίπεδα έκφρασης σε παρακείμενες noncancerous ομολόγους (NCS) σε κάθε ζεύγος οριστεί να είναι το 1 σε

δεξιά πάνελ

για σαφή οπτικοποίηση σημαντική διαφορά φορές σε κάθε miRNA. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσες τιμές με τυπικές αποκλίσεις. (Α) Up-ρύθμιση των 2 miRNAs (miR-196a και miR-455-5p) επιβεβαιώθηκε σε καρκίνους όταν 5 καρκίνοι σε σύγκριση με NCS τους. *,

σ

& lt? 0,05. (Β) miR-133b ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω σε καρκίνους σε όλες τις 5 ζεύγη. παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές των επιπέδων έκφρασης του miR-196a, miR-455-5p, και miR-133b μεταξύ ζεύγη. *,

σ

& lt?. 0.05

Η

Έτσι, από αυτά τα 4 miRNAs, 3 miRNAs (δηλαδή, miR-196a, miR-455-5p και miR-133b) έδειξαν σημαντικά διαφορετικά επίπεδα έκφρασης σε ιστούς του καρκίνου σε σύγκριση με συμφωνημένα ιστούς τον έλεγχό τους και την περαιτέρω ποσοτικοποίηση των miRNAs διεξήχθη χρησιμοποιώντας 48 δείγματα του λάρυγγα. Τα δείγματα αυτά περιλαμβάνονται 5 noncancerous ομολόγους, 14 καλοήθεις βλάβες (πολύποδας, οζίδιο, πολυποειδής, ή υπερκεράτωση), 12 δυσπλασίες, και 17 καρκίνοι του λάρυγγα. Όταν μελετήθηκαν 48 δείγματα, το επίπεδο έκφρασης του miR-455-5p ήταν σημαντικά υψηλότερη σε καρκίνους σε σύγκριση με παρακείμενες μη καρκινικό ομολόγους και καλοήθεις ιστούς του λάρυγγα (p = 0,0113). Επιπλέον, το επίπεδο έκφρασης του miR-196α ήταν σαφώς υψηλότερη σε καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με μη καρκινικό άλλους ιστούς (παρακείμενα noncancerous ομολόγους και καλοήθεις ιστούς του λάρυγγα, ρ = 0,0003? Δυσπλασίες, ρ = 0.0040) (Σχήμα 3Α). Αν και miR-133b έδειξαν σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης όταν δείγματα καρκίνο συγκρίθηκαν με συμφωνημένα noncancerous ιστούς του λάρυγγα (Σχήμα 2Β), το επίπεδο έκφρασης αυτού του miRNA δεν ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε δείγματα καρκίνου όταν συγκρίνεται με μη καρκινικό άλλους ιστούς (noncancerous ομολόγους και καλοήθεις ιστούς του λάρυγγα, p = 0,8353? δυσπλασίες, p = 0,2185) στην μελέτη χρησιμοποιώντας πολλαπλά δείγματα (Σχήμα 3Β)

(Α) τα επίπεδα έκφρασης του miR-455-5p και miR-196α μετρήθηκαν με TaqMan® qRT-PCR. χρησιμοποιώντας 48 δείγματα ιστών. Τα γειτονικά noncancerous ιστούς (noncancerous ομολόγους, NCs) εμφανίζεται ως ανοικτό τετράπλευρα. Σημαντική αυξητική ρύθμιση του miR-455-5p παρατηρήθηκε σε καρκίνους σε σύγκριση με NCS και καλοήθη δείγματα. Τα επίπεδα έκφρασης του miR-196α ήταν σημαντικά υψηλότερα σε καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με είτε NCs και καλοήθεις δείγματα ή προκαρκινική δείγματα δυσπλασία. Μπάρες δείχνουν μέση τιμή της κάθε ομάδας. *,

σ

& lt? 0,05. επίπεδα (Β) Έκφραση miR-133b εξετάστηκαν επίσης σε πολλαπλά δείγματα. Παρόλο που παρατηρήθηκε σχετικά χαμηλότερη έκφραση σε καρκίνους, οι διαφορές δεν ήταν στατιστικά σημαντικές σε σύγκριση με τις άλλες ομάδες. Μπάρες δείχνουν μέση τιμή της κάθε ομάδας. *,

σ

& lt?. 0.05

Η

Ως εκ τούτου, να διερευνήσει περαιτέρω τη σημασία του miR-196a ως μια πολλά υποσχόμενη βιοδείκτης για τον καρκίνο του λάρυγγα, η ανάλυση qRT-PCR του miR-196a ήταν πραγματοποιήθηκε σε 84 ιστολογικά δείγματα επαληθεύεται (15 noncancerous ομολόγους, 24 καλοήθεις παθήσεις, 18 δυσπλασίες, 27 καρκίνοι του λάρυγγα) και 7 HNSCC κυτταρικές σειρές. Η μελέτη έδειξε ότι αυξανόμενη τάση του επιπέδου έκφρασης miR-196α παρατηρήθηκε όταν δείγματα καρκίνο συγκρίθηκαν με μη καρκινικό ομολόγους, καλοήθεις ιστούς, ή δυσπλασίες (Σχήμα 4Α). Η έκφραση του miR-196a σε καρκίνους ήταν σημαντικά υψηλότερη από ό, τι ταιριάζει ζευγαρωμένα δείγματα τους (p = 0.005) και ήταν επίσης εμφανής σε λαρυγγική καρκινική κυτταρική σειρά κυττάρων JHU-011 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, βρήκαμε την έκφραση του miR-196α ήταν σημαντικά υψηλότερη σε προχωρημένο καρκίνο από πρώιμο καρκίνο (p = 0,0045? Σχήμα 4Β,

αριστερό πλαίσιο

), καθώς επίσης και σε πρώιμο καρκίνο από προκαρκινικές δυσπλασία (p = 0,0263? Εικόνα 4Β,

δεξί πάνελ

). Μαζί με αυτά τα ευρήματα, miR-196a θα μπορούσε να είναι ένα ευνοϊκό δείκτη για τον καρκίνο του λάρυγγα.

(Α) Η σημασία του miR-196a ως μια πολλά υποσχόμενη βιοδείκτης για τον καρκίνο του λάρυγγα επιβεβαιώθηκε από TaqMan® qRT-PCR χρησιμοποιώντας 84 ιστού δείγματα. Η δοκιμασία περιλάμβανε επίσης 7 HNSCC κυτταρικές γραμμές. Οι noncancerous ομολόγους (NCS) εμφανίζεται ως ανοικτό τετράπλευρα. Μπάρες δείχνουν μέση τιμή της κάθε ομάδας. (Β) Το επίπεδο έκφρασης του miR-196α ήταν υψηλότερη σε προχωρημένους καρκίνους (Τ3 και Τ4) σε σύγκριση με την πρώιμη καρκίνους (Τ1 και Τ2) (

αριστερό πλαίσιο

). Επιπλέον, παρατηρήθηκε σημαντικά υψηλότερο επίπεδο έκφρασης miR-196a στις αρχές δείγματα καρκίνου T1a σε σύγκριση με τα δείγματα προκαρκινική δυσπλασία (

δεξί πάνελ

). Μπάρες δείχνουν μέση τιμή της κάθε ομάδας. *,

σ

& lt?. 0.05

Η

ποιοτική διαφορά των isomiRs miR-196a αποκαλύπτεται από Deep αλληλουχίας

Η πρόσφατη έλευση της τεχνολογίας βαθιά αλληλουχίας αποκάλυψε ότι υπάρχουν συνήθως μεταβολές στις ώριμες ακολουθίες miRNA όπως επινοήθηκε με τον όρο «isomiR» [45]. Τέτοιες μεταβολές που προκαλούνται κυρίως από τη μετατόπιση των θέσεων διάσπασης όταν ώριμη miRNAs επεξεργασία από Drosha και Dicer, αλλά επίσης εισήγαγε τερματικό προσθήκες νουκλεοτιδίων ή εσωτερική επεξεργασία του RNA. Αν και φυσιολογική σημασία για την ποικιλομορφία των isomiR παραμένουν ασαφείς, συσσωρεύονται ενδείξεις υποδηλώνουν ότι υπάρχουν αναπτυξιακές /ιστού-ειδική προτίμηση στο φάσμα του isomiRs.

Έτσι, για να διερευνηθεί η πιθανή ετερογένεια στα προφίλ έκφρασης των isomiRs miR-196a μεταξύ του καρκίνου του λάρυγγα και ιστών μη καρκινικών, ανάλυση βαθιά αλληλούχιση των μικρών RNA διεξήχθη με τη χρήση Applied Biosystems στερεό σύστημα (Kamimoto Τ et al., χειρόγραφο που υποβλήθηκε). Υπάρχουν δύο διακριτά γονίδια για miR-196α, δηλαδή

mir-196α-1

σε chr17 και

mir-196a-2

σε CHR12, και μεταγράφηκε τους ώριμη miRNAs μοιράζονται την ίδια 5 ‘βραχίονα *,

σ

& lt? 0,05. *,

σ

& lt? 0,05. *,

σ

& lt? 0,05. *,

σ

& lt? 0,05.