Οι

Αφηρημένο

Ιστορικό

δεακετυλάσης αναστολείς της ιστόνης (HDACis) υπόσχεται αντικαρκινικά φάρμακα? Ωστόσο, οι μοριακοί μηχανισμοί που οδηγούν στην HDACi-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο δεν έχουν καλώς κατανοηθεί και δεν υπάρχει σαφής μηχανισμός ανθεκτικότητας έχει διασαφηνιστεί να εξηγήσει περιορισμένη αποτελεσματικότητα των HDACis σε κλινικές δοκιμές.

Μέθοδοι και Εκτίμηση

Εδώ, δείχνουμε ότι τα επίπεδα πρωτεΐνης του οδοφράγματος κινάση 1 (Chk1), το οποίο έχει σημαντικό ρόλο στην G

2 κυτταρική ρύθμιση σημείου ελέγχου κύκλου, ήταν σημαντικά μειωμένη σε πρωτεΐνη και μεταγραφική επίπεδα σε καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα επεξεργασμένα με παν-και επιλεκτική HDACis LBH589, Scriptaid, βαλπροϊκό οξύ, απισιδίνη, και MS-275. Σε HDACi επεξεργασμένα κύτταρα Chk1 λειτουργία ήταν μειωμένη, όπως προσδιορίζεται με μειωμένη ανασταλτική φωσφορυλίωση cdc25C και κατάντη cdc2 στόχο του και αυξημένη έκφραση του cdc25A και φωσφορυλιωμένων Η3 ιστόνης, έναν δείκτη μιτωτικών εισόδου. Σε πειράματα χρονικής πορείας, Chk1 ρύθμιση προς τα κάτω συνέβησαν μετά τη θεραπεία HDACi, προηγείται απόπτωση. Η έκτοπη έκφραση του Chk1 ξεπέρασε HDACi-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο, και προκατεργασία κυττάρων με την purvalanol αναστολέα cdc2 Α μπλοκάρει την είσοδο στη μίτωση και να προληφθεί ο κυτταρικός θάνατος από HDACis. Τέλος, φαρμακολογική αναστολή των Chk1 έδειξε ισχυρή συνεργική δράση με LBH589 στα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.

Συμπεράσματα

Τα αποτελέσματα αυτά ορίζουν ένα μονοπάτι μέσα από το οποίο η αναστολή Chk1 μπορεί να μεσολαβήσει HDACi που προκαλείται από την είσοδο μιτωτική και θάνατο των κυττάρων και δείχνουν ότι Chk1 θα μπορούσε να είναι ένα πρώιμο φαρμακοδυναμικές δείκτη για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας HDACi σε κλινικά δείγματα

Παράθεση:. Brazelle W, Kreahling JM, Gemmer J, Ma Υ, Κάρδαμο WD, Haura E, et al. (2010) Αναστολείς αποακετυλάσης ιστόνης ρυθμίζουν προς τα κάτω το Checkpoint Kinase 1 Έκφραση προκειμένου να προκληθεί θάνατος κυττάρων σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα. PLoS ONE 5 (12): e14335. doi: 10.1371 /journal.pone.0014335

Επιμέλεια: Rory Edward Morty, Πανεπιστήμιο του Giessen πνεύμονα Κέντρο, Γερμανία

Ελήφθη: 25 Ιουνίου 2010? Αποδεκτές: 26 Νοέμβρη 2010? Δημοσιεύθηκε: 14 Δεκέμβρη του 2010

Copyright: © 2010 Brazelle et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από τη χορήγηση SPORE Moffitt Κέντρο καρκίνου στον καρκίνο του πνεύμονα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή αποακετυλάσης αναστολείς

ιστόνης (HDACis) αντιπροσωπεύουν μια πολλά υποσχόμενη νέα κατηγορία ενώσεων για τη θεραπεία του καρκίνου [1]. Μερικά HDACis δείχνουν ευρεία δραστικότητα έναντι πολλαπλές κατηγορίες HDAC (Scriptaid, LBH589), ενώ άλλες είναι ταξική ή ισοτόπου επιλεκτική (MS-275) [1], [2].

Οι ακριβείς μηχανισμοί με τους οποίους HDACis ασκούν τους κυτταροτοξικά αποτελέσματα είναι άγνωστη? Ωστόσο, τα αποτελέσματα κατά του όγκου αυτών των φαρμάκων πιστεύεται ότι προκύπτει από υπερακετυλίωση ιστονών, απομεθυλίωση γονιδιωματικού DNA, και την ενεργοποίηση των γονιδίων που αναστέλλουν πολλαπλασιασμό και διεγείρουν απόπτωση [1]. Εκτός από επιγενετικές επιδράσεις τους, HDACis έχουν επίσης δειχθεί να έχουν σημαντικές μετα-μεταφραστική αποτελέσματα επί πρωτεΐνες μη-ιστόνης, συμπεριλαμβανομένων των παραγόντων μεταγραφής ρ53, πρωτεΐνη θερμικού σοκ 90 (HSP90), και α-τουμπουλίνης [3]. Εκτός από την άμεση αντι-ογκογόνο δράση, καταστολή της αγγειογένεσης από HDACis μπορεί επίσης να έχει αντίκτυπο στην αναστολή της ανάπτυξης του όγκου [4].

Ένα βασικό κανονιστικό βήμα για την G

2 /M κυττάρων μετάβαση κύκλου σε ευκαρυωτικά κύτταρα είναι ενεργοποίηση του συμπλέγματος cdc2-κυκλίνης Β [5]. Η σωστή ρύθμιση της cdc2 απαιτεί φωσφορυλίωση ενεργοποίησης για θρεονίνη-161 και ανασταλτική φωσφορυλιώσεις για θρεονίνη-14 και τυροσίνη-15 (Tyr15) [6]. Η ανασταλτική φωσφορυλίωση επί Tyr15 διατηρεί το σύμπλοκο cdc2-κυκλίνης Β σε μία ανενεργή κατάσταση, αν υπάρχει ατελώς αναπαραχθεί DNA ή κατεστραμμένο DNA στο κύτταρο [7], [8]. ενεργοποίηση Cdc2 μέσω της αφαίρεσης της ανασταλτικής φωσφορυλίωσης της από φωσφατάσες cdc25 επιτρέπει στα κύτταρα να εισέλθουν στην μιτωτική φάση του κυτταρικού [9] κύκλο. Chk1 είναι ένα κρίσιμο συστατικό της αντιγραφής του DNA, φάση ενδο-S, G

2 /M φάση, και μιτωτική άτρακτο σημεία ελέγχου-συναρμολόγησης [10]. Σε απόκριση σε μια ποικιλία από γονιδιοτοξική στρεσογόνους παράγοντες, Chk1 ενεργοποιείται με ανάντη κινάσες όπως ΑΤΜ και ATR, οδηγώντας σε αυξημένη αποδόμηση proteosomal της φωσφατάσης cdc25A και η αναστολή της cdc25C διαμέσου-216 σερίνη (Ser216) φωσφορυλίωση, συλλογικά προκαλώντας αδρανοποίηση των cdc2 και, κατά συνέπεια, G

2 /M σύλληψης [10] – [14].

Επιπλέον, συνδυάζοντας HDACis με τις ρυθμιστικές αρχές του G2 σημείου ελέγχου θα μπορούσε να βελτιώσει την αποτελεσματικότητα και τη βοήθεια στην υπερνίκηση αντίσταση. Στην πραγματικότητα, η άμεση φαρμακολογική αναστολή ή siRNA knockdown του Chk1 έχει αποδειχθεί ότι προκαλεί το σημείο ελέγχου κατάργησης, κυτοκινητικής παλινδρόμηση, και πολυπυρήνωση, καθώς και ανώμαλο διαχωρισμό χρωμοσωμάτων και χρωμοσωμική αστάθεια [15]. Επομένως, οι αναστολείς Chk1, η οποία καταργεί αποτελεσματικά το S και G

2 σημεία ελέγχου, που ερευνώνται σε κλινικές δοκιμές είτε μόνη της είτε σε συνδυασμό με κυτταροτοξικούς παράγοντες [16] – [18] και μπορεί να συνδυαστεί αποτελεσματικά με HDACi να ενισχυθεί κυτταροτοξικά αποτελέσματα .

Εδώ, έχουμε αποδείξει ότι η θεραπεία HDACi ρυθμίζει αρνητικά την έκφραση της πρωτεΐνης Chk1, η οποία με τη σειρά της οδηγεί σε μη προγραμματισμένη ενεργοποίηση cdc2, μιτωτική είσοδο, και θάνατο κυττάρου σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης δείχνουν ότι Chk1 ρύθμιση προς τα κάτω και κατάργηση του G

2 οδοφράγματος είναι σημαντικά ρυθμιστικά βήματα στην ευαισθησία και την αντίσταση στην κυτταροτοξική επίδραση της θεραπείας HDACi σε κύτταρα μη-μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC). Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι Chk1 θα μπορούσε να είναι ένα πρώιμο φαρμακοδυναμική δείκτη για την πρόβλεψη και την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας των HDACis και αναστολέων Chk1 μπορεί να ενισχύσει την κυτταροτοξική επίδραση του HDACis σε κλινικές μελέτες.

Αποτελέσματα

Θεραπεία των κυττάρων NSCLC με HDACis προκαλεί G

2 /M αναστολή του κυτταρικού κύκλου και κυτταρικό θάνατο

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι ένα παν-HDACi LBH589 (IC

50 κυμαίνεται μεταξύ περίπου 9 και 54 nmol /L) προκαλεί διακοπή της αναπτύξεως και κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα NSCLC [19]. Για την ανάλυση των μοριακών μηχανισμών με τους οποίους HDACis ρυθμίζουν την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και κυτταρικό θάνατο, ασύγχρονα αυξανόμενη Α549 (EGFR φυσικού τύπου, Κ-Ras μετάλλαξης, και ρ53 άγριου τύπου) και PC9 (EGFR μετάλλαξη, K-ras άγριου τύπου, και ρ53 μεταλλαγμένη) [20] – [22] κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με LBH589 (40 ηΜ) για 24 ώρες και συλλέχθηκαν για ανάλυση με κυτταρομετρία ροής. Το Σχήμα 1 δείχνει ότι σε PC9 και Α549 κύτταρα LBH589 θεραπεία παρήγαγε μια αξιοσημείωτη αύξηση στα κύτταρα του G

2 /M φάση υποδηλώνουν μια G

2 /M αποκλεισμός και μια σημαντική μείωση κυττάρων S-φάσης. Τα αποτελέσματα αυτά είναι σε συμφωνία με τις προηγούμενες αναφορές ότι HDACis οδηγήσει σε G

2 /M σύλληψη και αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα NSCLC [19].

Μια

, Τα ασύγχρονα αναπτυσσόμενα κύτταρα επωάστηκαν σε μέσο με 5% FCS για 24 ώρες απουσία (έλεγχος, C) ή παρουσία (L) του LBH589. Το ποσοστό των κυττάρων σε διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής.

B

, Ιστόγραμμα αναπαράσταση των δεδομένων κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής.

Η

Όπως απεικονίζεται στο σχήμα 2Α, μικροσκοπική εξέταση των κυττάρων σε επεξεργασία με LBH589 παρήγαγε μια σειρά διαφορετικών πυρηνικών μορφολογίες, από binucleation να πολυπυρήνωση. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η θεραπεία LBH589 προκαλεί κυτταρικό θάνατο που σχετίζεται με ανώμαλη μίτωση και απέτυχε κυτταροκίνηση, που είναι ενδεικτικά της μιτωτικής καταστροφής, έναν τύπο κυτταρικού θανάτου που λαμβάνει χώρα κατά τη διάρκεια της μίτωσης και έχει περιγραφεί προηγουμένως σε κύτταρα επεξεργασμένα με το HDACi τριχοστατίνη Α [ ,,,0],23].

κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με φορέα (έλεγχος) ή 40 ηΜ LBH589 για 24 ώρες.

Μια

, τα βέλη δείχνουν δι- ή πολυπύρηνα κύτταρα με μειωμένη κυτοκίνησης σε LBH589-επεξεργασμένα κύτταρα NSCLC.

B

, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ ή διασπώνται πολυ (ΑΟΡ-ριβόζη) πολυμεράσης (cPARP) αντίσωμα (× 100 ή 400 × μεγέθυνση).

C

, ανάλυση κηλίδος Western που αποδεικνύει ότι HDAC αναστολή από LBH589 προκαλεί φωσφορυλίωση της ιστόνης Η3 (Η3-P10), της ιστόνης Η4 ακετυλίωση (ακετυλο-H4), και διάσπαση PARP (cPARP) σε κύτταρα Α549 που έλαβαν θεραπεία με LBH589 για 24 ώρες. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Δεδομένου ότι τα κύτταρα του G

2- και Μ-φάσης δεν θα μπορούσαν να διακριθούν με βάση τις διαφορές τους στο περιεχόμενο DNA με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής, ελέγξαμε αν τα κύτταρα συνελήφθη στο G

2 /M μετά τη θεραπεία HDACi εισάγετε μιτωτική φάση. Για το σκοπό αυτό, πραγματοποίησαν την πρώτη χρώση ανοσοφθορισμού χρησιμοποιώντας το αντίσωμα κατά του διασπασμένου πολυ (ΑΟΡ-ριβόζη) πολυμεράσης (cPARP) και έδειξαν ότι η θεραπεία LBH589 προκαλεί αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο στο 78% των διπύρηνα μιτωτικών κυττάρων (Σχήμα 2Β). Στη συνέχεια, σε ανάλυση κηλίδος Western ελέγξαμε εάν η αναστολή HDAC ενισχύει H3 φωσφορυλίωση ιστόνης στη σερίνη-10, η οποία λαμβάνει χώρα κατά την έναρξη της μίτωσης. Σχήμα 2C απεικονίζει ότι η θεραπεία LBH589 προκάλεσε φωσφορυλίωση της ιστόνης Η3 συνοδεύεται από αυξημένη ακετυλίωση των ιστονών και της διάσπασης PARP, υποδεικνύοντας ότι η θεραπεία HDACi προκαλεί τα κύτταρα NSCLC να εισέλθουν μίτωση και υφίστανται κυτταρικό θάνατο. Για να καθοριστεί εάν κυτταρικής ανάπτυξης και των αλλαγών βιωσιμότητα παρατηρήθηκε μετά από αγωγή LBH589 είναι μια γενικευμένη επίδραση της αναστολής HDAC, χρησιμοποιήσαμε επίσης ένα άλλο τηγάνι-HDACi, Scriptaid (1 μΜ), το οποίο προκάλεσε βιοχημικές μεταβολές διακριθούν από εκείνα που παρουσιάζονται παραπάνω χρησιμοποιώντας LBH589 (Σχήμα 3).

A

, Α549, PC9, Η1299, Η292, Η358, Η441 και HCC827 κύτταρα καλλιεργήθηκαν με την παρουσία του οχήματος (γ), ή LBH589 (LBH) 40 ηΜ για 24 ώρες και επίπεδα έκφρασης του cPARP, φωσφορυλίωση CDC2 (pCDC2

Y15), CHK1, και ακετυλιωμένης Η4 ιστόνης (ακετυλο-H4) προσδιορίστηκαν με στύπωμα Western και ποσοτικά με τη χρήση του λογισμικού AlphaEase. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

B

, PC9 και Α549 κύτταρα καλλιεργήθηκαν με την παρουσία του οχήματος (γ), ή LBH589 (LBH) 40 nm, ή Scriptaid (S) 1 μΜ για 24 ώρες και τα επίπεδα έκφρασης του cPARP, τυροσίνη-15 φωσφορυλίωση της CDC2 (pCDC2

Y15), σερίνη-216 φωσφορυλίωση CDC25C (pCDC25c

S216), cdc25A (T-cdc25A), CDC25C (T-CDC25C) και CDC2 (T-CDC2), ακετυλιωμένο ιστόνης Η4 ( ακετυλο-Η4), και κυκλίνης Β1 προσδιορίστηκε με ανάλυση κηλίδας Western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

C

, φάρμακο μεσολάβηση αλλαγών στην έκφραση του CHK1, CHK2, ΑΚΤ, και c-RAF προσδιορίστηκαν με ανάλυση κηλίδας Western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

D

, PC9 ή Α549 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς 40 ηΜ LBH589 και αναλύθηκαν για αννεξίνη θετικά κύτταρα χρησιμοποιώντας το BD αννεξίνης V-FITC /7-AAD kit κυτταρομετρία ροής.

E

, κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε αγωγή με το MS-275 (MS), (500 ηΜ), βαλπροϊκό οξύ (VA) (1 mm), ή απισιδίνη (ΑΡΙ) (400 ηΜ) για 24 ώρες. Τα επίπεδα έκφρασης του cPARP, CHK1, pCDC2

Y15, και β-ακτίνης προσδιορίστηκαν με ανάλυση κηλίδας Western. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

Η

Αποτελέσματα αναστολή HDAC σε ενεργοποίηση των πρωτεϊνών cdc25 και cdc2 που απαιτούνται για την μιτωτική είσοδο

Η ενεργοποίηση της πρωτεΐνης κινάση cdc2 από την πρωτεΐνη cdc25 φωσφατάσες είναι ένα κεντρικό ρυθμιστικό στάδιο για την G

2 /M μετάπτωσης σε ευκαρυωτικά [9]. Η αποφωσφορυλίωση του cdc25C επί Ser216 αυξάνει τη δράση της κατά τη διάρκεια της μετάβασης της φάσης-Μ, οδηγώντας σε ενεργοποίηση της κινάσης cdc2 [10]. Για να διερευνηθεί αν HDACi επαγόμενη εισόδου μιτωτική και κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από την ενεργοποίηση του cdc25 /cdc2 μονοπάτι, PC9, Α549, Η1299, Η292, Η358, Η441 και HCC827 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς LBH589, και ανάλυση στυπώματος Western εκτελέστηκε. Το Σχήμα 3Α δείχνει θεραπεία HDACi οδήγησε σε αυξημένα επίπεδα της διάσπασης PARP, μια μείωση στην ανασταλτική φωσφορυλίωση επί cdc2 και 45 έως 94% μείωση (με βάση την ποσοτική ανάλυση Western blot) συνολικά Chk1 μεταξύ των 7 διαφορετικές κυτταρικές γραμμές NSCLC, με A549s δείχνει την πλέον σημαντική μείωση στην Chk1 πρωτεΐνη. Οι αλλαγές αυτές όλες συνδέονται με μια αύξηση στην ακετυλίωση των ιστονών. Περαιτέρω έρευνα των Α549 και PC9 κύτταρα επεξεργασμένα με HDACis τηγάνι (Σχήμα 3Β), LBH589 και Scriptaid, έδειξαν ενεργοποίηση των cdc25C και cdc2, όπως αξιολογήθηκε από μια μείωση στην ανασταλτική φωσφορυλίωση τους σε Ser216 και Tyr15, αντίστοιχα, οι οποίες συνοδεύονται από αυξημένη Η4 ιστόνης ακετυλίωση. Δεν παρατηρήθηκε μείωση παρατηρήθηκε στα επίπεδα έκφρασης του συνόλου των πρωτεϊνών cdc25C και cdc2 (Σχήμα 3Β). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι HDACi επαγόμενη εισόδου μιτωτική προκαλείται από αυξημένη δραστικότητα cdc25 /cdc2. Επιπλέον, η θεραπεία HDACi αύξησε επίσης το επίπεδο έκφρασης των cdc25A, η οποία αποτελεί αντικείμενο Chk1 για ταχεία διάσπαση (Σχήμα 3Β). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι, σε HDACi-επεξεργασμένα κύτταρα, το βιολογικό λειτουργία της Chk1 ανεστάλη.

Εκτός από φωσφορυλίωση στη θέση Tyr15, μια άλλη σημαντική μηχανισμός ρύθμισης δραστηριότητα cdc2 και της εξέλιξης σε μιτωτική φάση του κυτταρικού κύκλου είναι πολύπλοκη του σχηματισμός με κυκλίνη Β, ένα απαιτούμενο συμπαράγοντα για τη δραστηριότητα cdc2 κινάσης. Έτσι, την επόμενη προσδιοριστεί εάν η θεραπεία HDACi επηρεάζει τα επίπεδα έκφρασης Β κυκλίνης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β, τα κύτταρα NSCLC αγωγή με LBH589 ή Scriptaid εμφανίζονται υψηλότερα συνολικά επίπεδα έκφρασης κυκλίνης Β1. Σε συνδυασμό με τη μειωμένη Tyr15 φωσφορυλίωση της cdc2, το εύρημα αυτό υποδηλώνει υψηλό cdc2-κυκλίνη δραστηριότητας Β σε HDACi-επεξεργασμένα κύτταρα, παρέχοντας περαιτέρω υποστήριξη ότι τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με HDACis είναι σε θέση να εισέλθουν μίτωση.

Η αναστολή της δράσης HDAC συσχετίζεται με μειωμένη Chk1 έκφραση σε κύτταρα NSCLC

Η σειρά και πιστότητα του κυτταρικού κύκλου συνδέονται με την ακεραιότητα της Chk1 και οδούς cdc25 φωσφατάση. Συντήρηση της οδού /cdc25 Chk1 είναι απαραίτητη για τα κύτταρα να προχωρήσει κανονικά μέσω ενός ατάραχος κύκλο κυτταρικής διαίρεσης και για τα κύτταρα να συλλάβει σε απάντηση για το σημείο ελέγχου ενεργοποίησης [10].

Για να καθοριστεί ο ρόλος της Chk1 στο HDACi που προκαλείται ενεργοποίηση του cdc25C και cdc2, αναλύσαμε τις αλλαγές στα επίπεδα των Chk1 πρωτεΐνης σε κύτταρα κατεργασμένα με HDACis. Η ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως έδειξε ότι η θεραπεία με LBH589 ή Scriptaid προκαλεί σημαντική μείωση στην έκφραση της Chk1 πρωτεΐνης (Εικόνα 3C). Αυτή η αναστολή φαίνεται να είναι ειδική καθώς δεν παρατηρήθηκε μεταβολή στην έκφραση του Chk2 πρωτεΐνης, ένα άλλο ρυθμιστή του οδοφράγματος βλάβη του DNA μονοπάτι [10] σηματοδότησης, [11].

HDACis, συμπεριλαμβανομένων LBH589, έχουν αναφερθεί σε απενεργοποιούν λειτουργικά HSP90 μέσω ακετυλίωση πρωτεΐνης, οδηγώντας σε εξάντληση των πρωτεϊνών πελάτη όπως ΑΚΤ και c-RAF [22]. Είναι ενδιαφέρον, Chk1 πρωτεΐνη έχει επίσης αναφερθεί ότι είναι ένας πελάτης HSP90 [24], [25], υποδηλώνοντας ότι η αδρανοποίηση του HSP90 με HDACis μπορεί να ευθύνονται για την αποδόμηση του Chk1 παρατηρηθεί στα πειράματά μας. Για να ελεγχθεί αυτή η πιθανότητα, αναλύσαμε εάν Chk1 ρύθμιση προς τα κάτω συμπίπτει με μειωμένη έκφραση του ΑΚΤ και c-RAF σε εκχυλίσματα που παρασκευάζονται από κύτταρα κατεργασμένα με LBH589 ή Scriptaid. Όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 3C, δεν παρατηρήθηκαν μεταβολές στα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών ΑΚΤ ή c-RAF υπό τις συνθήκες όπου LBH589 και Scriptaid προκαλούνται Chk1 μειορρύθμιση.

Για να καταδειχθεί περαιτέρω τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα της θεραπείας HDACi σε κύτταρα NSCLC μετρήσαμε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο χρησιμοποιώντας ανίχνευση αννεξίνης V. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3D, PC9 και Α549 κύτταρα έδειξαν μια μετρημένη αύξηση στην ποσότητα αννεξίνης θετικών κυττάρων υποδεικνύοντας ότι η αγωγή με HDACi οδηγεί σε σημαντική αύξηση των κυττάρων που υφίστανται απόπτωση.

Για να προσδιοριστεί αν η επιλεκτική HDACis επίσης προκαλούν αναστολή Chk1 , Α549 και PC9 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το MS-275 που αναστέλλει επιλεκτικά HDAC1, και σε μικρότερο βαθμό HDAC3. Όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 3Ε, το MS-275 (0,5 μΜ) που παράγεται αλλαγές στην έκφραση των Chk1, φωσφορυλιωμένης cdc2 (Tyr15), και cPARP παρόμοια με τα αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν με LBH589 και Scriptaid. Δύο άλλες κατηγορίας Ι HDACis βαλπροϊκό οξύ (1 mM) και απισιδίνη (400 nm) παράγεται επίσης ταυτόσημα αποτελέσματα (Σχήμα 3Ε). Αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν ότι HDACi μεσολάβηση Chk1 προς τα κάτω ρύθμιση δεν φαρμάκου εξαρτάται και HDACs κατηγορίας Ι είναι πιθανόν μεσολαβητές της επίδρασης HDACi επί Chk1 ρύθμιση προς τα κάτω σε κύτταρα NSCLC.

Chk1 κατάργηση προηγείται έναρξη της απόπτωσης με LBH589

Chk1 έχει αναφερθεί να υπόκειται σε κασπάσης με τη μεσολάβηση αποικοδόμηση σε κύτταρα που υποβάλλονται σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο [26]. Κατά συνέπεια, αναλύσαμε σε πειράματα χρονικής πορείας είτε προς τα κάτω ρύθμιση της Chk1 πρωτεΐνης παρατηρήθηκαν σε HDACi-κατεργασμένα κύτταρα είναι η αιτία ή η συνέπεια της αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, η θεραπεία των κυττάρων Α549 με LBH589 οδήγησε σε μείωση 70% σε Chk1 πρωτεΐνη εντός 1 ώρας από τη θεραπεία, με βάση την ποσοτικοποίηση των Western blots, που συνοδεύτηκε από μειωμένη φωσφο-cdc25C (Ser216) και φωσφο-cdc2 ( Tyr15) επίπεδα συμβατά με τη λειτουργική αδρανοποίηση της δραστηριότητας Chk1. Σπουδαιότητας, οι αλλαγές αυτές συνέβησαν πριν ανιχνεύσιμη ενεργοποίηση της κασπάσης, όπως αποδεικνύεται από διάσπαση PARP που πρώτα παρατηρήθηκε στις 12 ώρες της θεραπείας. Ένα παρόμοιο προφίλ πορεία του χρόνου παρατηρήθηκε σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με PC9 LBH589 ή Scriptaid (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Α549 κύτταρα χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με LBH589 (40 ηΜ) για διάφορα χρονικά σημεία. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν, και τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης του cPARP, CHK1, φωσφορυλίωση Tyr15 του pCDC2 (pCDC2

Y15), η φωσφορυλίωση Ser216 του CDC25C (pCDC25

S216), ακετυλο-Η4, και η κυκλίνη Β1 προσδιορίστηκαν.

Β

, ανάλυση της έκφρασης Ποσοτική Chk1 mRNA. Ολικό RNA παρασκευάστηκε από κύτταρα Α549 μετά από 24 ώρες θεραπείας με 40 ηΜ LBH589 ή όχημα. τα επίπεδα έκφρασης του mRNA ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ανάλυση σε πραγματικό χρόνο PCR. Όλα τα αποτελέσματα ομαλοποιήθηκαν στα επίπεδα GAPDH mRNA, και οι μέσες και οι τυπικές αποκλίσεις τιμών από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα φαίνονται.

C

, έκτοπη έκφραση της Chk1 αντιστρέφει HDACi απόπτωση αλλά όχι ακετυλίωση των ιστονών. κύτταρα Α549 διαμολύνθηκαν παροδικά με ένα άδειο φορέα (έλεγχος) ή GFP- ή FLAG-tagged (GFP-CHK1 ή FLAG-CHK1) Chk1 πλασμίδιο έκφρασης. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν χωρίς (μάρτυρας, C) ή με LBH589 (L) (40 ηΜ) για επιπλέον 24 ώρα πριν από τη συγκομιδή για ανάλυση στυπώματος Western. Θεραπεία-επέφερε αλλαγές στα cPARP, ακετυλο-Η4, φωσφο-CDC2

Y15, και εκτοπικά εκφραζόμενη GFP-CHK1 ή FLAG-CHK1 πρωτεΐνες προσδιορίστηκαν με ανάλυση κηλίδας Western. έκφραση β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν 3 φορές, και ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα δείχνεται. Τα βέλη δείχνουν την θέση του GFP-CHK1 και FLAG-CHK1 πρωτεΐνες.

D

, στην πρωτοβάθμια δείγματα ασθενών με NSCLC, Chk1 πρωτεΐνη ρύθμιση προς τα κάτω συσχετίζεται με αυξημένη cPARP

ex vivo

. δείγματα όγκων συλλέχθηκαν με μια βελόνα 23-gauge από όγκους που λαμβάνονται από ασθενή, και τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία εις διπλούν με φορέα (έλεγχος) ή LBH589 (40 ηΜ) για 18 ώρες. Μετά τη θεραπεία, προσκολλημένα και μη προσκολλημένα κύτταρα συγκεντρώθηκαν, κυτταρικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν και τα επίπεδα έκφρασης του cPARP, Chk1, και ακετυλο-Η3 αναλύθηκαν με κηλίδα Western. έκφραση β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. SCC: καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων? AC:.. Αδενοκαρκίνωμα

Η

Συνολικά, τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζουν ένα μοντέλο όπου η αναστολή της έκφρασης Chk1 από HDACis οδηγεί σε κυτταρικό θάνατο μέσω μη προγραμματισμένη ενεργοποίηση της μίτωσης προώθηση cdc2 κινάσης σε κύτταρα NSCLC

επεξεργασία HDACi οδηγεί στην μεταγραφική αρνητική ρύθμιση της Chk1

για να προσδιοριστεί εάν η θεραπεία HDACi ρυθμίζει την έκφραση Chk1 στο μεταγραφικό επίπεδο σε κύτταρα NSCLC, εκτελέσαμε PCR πραγματικού χρόνου. Όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 4Β, η ποσοτική ανάλυση αποκάλυψε RNA περισσότερο από μια μείωση κατά 50% στα επίπεδα Chk1 mRNA σε κύτταρα Α549 24 ώρες μετά την αγωγή LBH589 (40 ηΜ). Το εύρημα αυτό δείχνει ότι η θεραπεία HDACi οδηγεί σε μεταγραφική καταστολή των Chk1 στα κύτταρα NSCLC.

έκτοπη έκφραση της Chk1 ξεπερνά LBH589 απόπτωση

Για να προσδιοριστεί η σημασία της Chk1 ρύθμιση προς τα κάτω σε HDACi που προκαλείται αποπτωτικών κυττάρων ο θάνατος, έχουμε ως στόχο να καθορίσει εάν έκτοπη έκφραση της Chk1 μπορεί να ξεπεράσει τον κυτταρικό θάνατο που προκλήθηκε από LBH589. Ως εκ τούτου, τα κύτταρα Α549 διαμολύνθηκαν παροδικά με πλασμίδιο που κωδικοποιεί ένα Chk1 GFP-tagged πρωτείνης σύντηξης Chk1. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4C, η παροδική έκφραση της έκτοπης πρωτεΐνης Chk1 κατέστειλε LBH589 επαγόμενη απόπτωση, όπως ανιχνεύεται από διάσπαση πρωτεΐνης PARP. Επιπλέον, σε κύτταρα που εκφράζουν έκτοπη Chk1, θεραπεία LBH589 απέτυχε να ενεργοποιήσει cdc2, όπως αξιολογήθηκε από Tyr15 αποφωσφορυλίωσης (Σχήμα 4C), ενώ δεν παρατηρήθηκαν αλλαγές στην HDACi προκαλούμενη ακετυλίωση ιστόνης. Παρόμοια δεδομένα ελήφθησαν με ένα πλασμίδιο έκφρασης Chk1 Flag-tagged σε κύτταρα NSCLC (Σχήμα 4C). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι Chk1 ρύθμιση προς τα κάτω διαδραματίζει ουσιαστικό ρόλο στην HDACi μεσολάβηση κυτταρικό θάνατο.

Chk1 ρύθμιση προς τα κάτω συσχετίζεται με αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε πρωτογενή κύτταρα NSCLC αγωγή με LBH589

ex vivo

Η

Για να επαληθεύσετε τη ρύθμιση προς τα κάτω των Chk1 σε κλινικά σχετικές δείγματα όγκων, τα καρκινικά κύτταρα που συλλέγονται από όγκους ασθενών με NSCLC υποβλήθηκαν σε θεραπεία ex vivo με LBH589. Σύνολο πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν, και φάρμακο με τη μεσολάβηση αλλαγών στην έκφραση του Chk1, ακετυλίωσης ιστόνης, και διάσπαση PARP αναλύθηκαν με κηλίδα Western. Όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 4D, ex vivo επεξεργασία των κυττάρων με LBH589 (40 ηΜ) προκάλεσε αυξημένη ιστόνης Η4 ακετυλίωση σε όλα τα δείγματα όγκων, ενώ θεραπεία LBH589 αυξημένη διάσπαση PARP σε μόνο 2 από 5 δείγματα, η οποία συσχετίζεται στενά με Chk1 μειορρύθμιση. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν τα ευρήματα που παρουσιάζονται παραπάνω με κυτταρικές σειρές NSCLC και δείχνουν ότι μειώθηκε Chk1 και φωσφο-cdc2 επίπεδα (Tyr15) μπορεί να είναι ευαίσθητοι φαρμακοδυναμικές δείκτες για την αποτελεσματικότητα HDACi σε δείγματα όγκων των ασθενών για την πρόβλεψη και την εκτίμηση της ανταπόκρισης του ασθενούς στη θεραπεία HDACi σε κλινικές μελέτες.

HDACi μεσολάβηση κυτταρικό θάνατο απαιτεί μιτωτική είσοδο

Τα στοιχεία που παρουσιάζονται παραπάνω υποστήριξης ένα μοντέλο όπου η αποτυχία της Chk1 μεσολάβηση ενεργοποίησης οδοφράγματος διαδραματίζει ουσιαστικό ρόλο στην HDACi μεσολάβηση κυτταρικό θάνατο. Έτσι, υποθέτουμε ότι ο αποκλεισμός της μιτωτικής εισόδου θα μείωνε την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων στην κυτταροτοξική δράση της θεραπείας HDACi. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, κύτταρα Α549 προκατεργάστηκαν με έναν ισχυρό αναστολέα cdc2, purvalanol Α [27], για να εμποδίσει την είσοδο στη μίτωση. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής δείχνει ότι το 40 ηΜ LBH589 για 24 ώρες προκάλεσε σημαντική αύξηση των κυττάρων σε G

2 /Μ και μια περίπου 20-πλάσια αύξηση της υπο-G

1 κορυφή (υποδιπλοειδή κύτταρα) μετά από 24 ώρες θεραπεία, σύμφωνα με αυξημένο κυτταρικό θάνατο. Η αύξηση στην υπο-G

1 πληθυσμού μετά τη θεραπεία LBH589, ωστόσο, μειώθηκε σημαντικά με προκατεργασία των κυττάρων με purvalanol Α (Σχήμα 5), υποδεικνύοντας ότι μιτωτική αποκλεισμός προκαλεί αντίσταση στην κυτταροτοξική δράση του LBH589. Για να επιβεβαιωθεί αυτή η παρατήρηση, εκτελέσαμε ανάλυση κηλίδος Western με εκχυλίσματα που παρασκευάζονται από κύτταρα Α549 εκτέθηκαν σε LBH589 με ή χωρίς μία προεπεξεργασία purvalanol. Το Σχήμα 5 απεικονίζει ότι purvalanol μία προεπεξεργασία ανέστειλε LBH589 επαγόμενη αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, όπως μετρήθηκε με cPARP, παρέχοντας περαιτέρω υποστήριξη που HDACi-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο απαιτεί μεγάλο βαθμό την έναρξη της μίτωσης.

Κύτταρα κατεργασμένα με LBH589 40 ηΜ, με ή χωρίς Pur Α (10 μΜ) προεπεξεργασία αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής για τη διανομή του κυτταρικού κύκλου ή με κηλίδα Western για τον προσδιορισμό του φαρμάκου με μεσολάβηση αλλαγές στην cPARP. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

αναστολείς HDAC και Chk1 εμφανίζουν συνεργική δράση στα κύτταρα NSCLC

Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι οι στόχοι της θεραπείας HDACi Chk1 να επάγει ακατάλληλη εισόδου μιτωτική και εξασκεί έτσι κυτταροτοξικά αποτελέσματα του επί κυττάρων όγκου. Η μειωμένη ευαισθησία των κυττάρων στην θεραπεία HDACi παρατηρήθηκε σε κύτταρα Α549 που εκφράζουν εκτοπικά Chk1 (Σχήμα 4C) προτείνει ότι η ενεργοποίηση του Chk1 και κατάντη μονοπάτι σηματοδότησης της, η οποία ελέγχει την G

2 σημείο ελέγχου, μπορεί να προκαλέσει αντίσταση στην θεραπεία HDACi. Έτσι, είναι εύλογο ότι οι αναστολείς Chk1 μπορεί να ενισχύσουν κυτταροτοξικές επιδράσεις της HDACis σε καρκινικά κύτταρα που είναι ανθεκτικά σε HDACis. Για να ελεγχθεί αυτή η πιθανότητα, κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με LBH589 και ενός αναστολέα Chk1 (UCN-01) για 24 ώρες. Το Σχήμα 6Α δείχνει ότι, σε χαμηλές συγκεντρώσεις, ούτε LBH589 (4 ηΜ) ούτε UCN-01 (250 ηΜ) μόνο του μπορεί να προκαλέσει διάσπαση PARP σε κύτταρα Α549, ενώ ο συνδυασμός αυτών των δύο φαρμάκων αυξήθηκαν δραστικά διάσπασης πρωτεΐνης PARP, υποδεικνύοντας μια πιθανή συνέργεια. Να επιβεβαιώσει τη συνεργιστική αλληλεπίδραση μεταξύ αναστολέων HDAC και Chk1, είμαστε δίπλα εκτελούνται μέση ανάλυση επίδραση της δόσης. Για το σκοπό αυτό, τα κύτταρα Α549 εκτέθηκαν σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις LBH589, UCN-01 ή ο συνδυασμός αυτών των φαρμάκων σε σταθερή αναλογία. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας CT-Μπλε δοκιμασίας, και το αποτέλεσμα αναλύθηκε χρησιμοποιώντας διάμεσος ανάλυση επίδραση. Όπως φαίνεται στα Σχήματα 6Β και 6C, έκθεση των κυττάρων στον συνδυασμό των αναστολέων LBH589 και Chk1 ασκούσαν ισχυρή συνεργική δράση. Χρησιμοποιώντας αυτές τις ίδιες μεθόδους, μία συνεργική αλληλεπίδραση παρατηρήθηκε επίσης μεταξύ LBH589 και ενός νέου αναστολέα Chk1 AZD7762 [28] σε κύτταρα NSCLC που είχε ως αποτέλεσμα μία τιμή CI 0,76 ενδεικτική ενός μετρίως συνεργική επίδραση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

A

, κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με LBH589 40 nm και /ή ένα UCN-01 (250 ηΜ) για 24 ώρες, εκχυλίσματα κυττάρου παρασκευάστηκαν και ανάλυση στυπώματος Western εκτελέστηκε με PARP (t: συνολική, γ: διασπαστεί). Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον 3 φορές, και ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα δείχνεται.

B

, κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με LBH589 και UCN-01 είτε μόνο του ή σε συνδυασμό με σταθερή αναλογία (δύο παρα είκοσι) για 72 ώρες. Οι συγκεντρώσεις του φαρμάκου υποδεικνύεται στον οριζόντιο άξονα και καταγράφεται σε κυτταρική βιωσιμότητα των φρεατίων ελέγχου, το οποίο αυθαίρετα ορίζεται σε 100% βιωσιμότητα για κάθε πείραμα. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν ± SD από 4 πηγάδια επανάληψη.

C

, συνδυασμένα αποτελέσματα του αναστολέα LBH589 και Chk1 UCN-01 ποσοτικοποιείται με τον δείκτη Chou και Talalay συνδυασμού (CI) μέθοδο (40). Η CI χρησιμοποιείται για το συνδυασμό των φαρμάκων αναλύσεις προσδιορίστηκε με την εξίσωση ισοβολόγραμμα (βλέπε κείμενο). Κατάταξη σύμβολα (+/-) δείχνουν μέση υπολογισμένη Chou και Talalay δείκτη συνδυασμού (CI) σειρά (+++, ισχυρή συνέργεια).

Η

Τα δεδομένα που παρουσιάζονται παραπάνω δείχνουν ότι φάρμακα που αναστέλλουν τη δράση των πρωτεϊνών ότι ρυθμίζουν αρνητικά τη λειτουργία του συμπλόκου cdc2-κυκλίνης Β μπορεί να ενισχύσουν την G

2 οδοφράγματος κατάργηση και κυτταροτοξικά αποτελέσματα των HDACis σε καρκινικά κύτταρα.

Συζήτηση

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η HDACi επαγόμενη κυτταρικού θανάτου σχετίζεται με παρεκκλίνουσα μίτωση και διάσπαση των σημείων ελέγχου του κυτταρικού κύκλου [29] – [34]. Ωστόσο, οι μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους θεραπεία HDACi οδηγεί σε μιτωτικά κυτταρικό θάνατο δεν είναι καλά κατανοητός. Εδώ, δείξαμε ότι η αγωγή HDACi ανθρώπινων κυττάρων NSCLC οδηγεί σε αρνητική ρύθμιση των συνολικών επιπέδων πρωτεΐνης Chk1. Δείξαμε ότι αυτή η προς τα κάτω ρύθμιση είναι βιολογικώς σχετικό με την επίδειξη μιας ταυτόχρονη μείωση των επιπέδων της ανασταλτικής φωσφορυλίωσης του κλειδιού του κυτταρικού κύκλου ρυθμιστικές πρωτεΐνες cdc25C και cdc2. Τα μειωμένα επίπεδα της ολικής πρωτεΐνης Chk1 προηγήθηκε επαγωγή της απόπτωσης και ακετυλίωση των ιστονών, αποδεικνύοντας ότι Chk1 ρύθμιση προς τα κάτω είναι ένα πρώιμο συμβάν σε λειτουργία HDACi δράσης και ότι διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στον κυτταρικό θάνατο των ναρκωτικών με τη μεσολάβηση.

Chk1 έκφρασης έχει δειχθεί ότι παρουσιάζουν διακυμάνσεις κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου [35]. Ωστόσο, δεδομένου ότι Chk1 εκφράζεται κυρίως στο S για να Μ φάση του κυτταρικού κύκλου και στα δύο επίπεδα RNA και πρωτεϊνών [35], είναι απίθανο ότι HDACi μεσολάβηση αναστολή της Chk1 είναι συνέπεια της διακοπής της ανάπτυξης σε G

2 /Μ φάση. πειράματα RT-PCT έδειξε ότι μεταγραφική αναστολή της Chk1 παίζει σημαντικό ρόλο στην HDACi μεσολάβηση ρύθμιση της Chk1 πρωτεΐνης. Ο μηχανισμός με τον οποίο HDACis ρυθμίζουν η μεταγραφική έκφραση του Chk1 είναι άγνωστη και μένει να διευκρινιστεί.

Κατεργασία καρκινικών κυττάρων με τηγάνι HDACis έχει αναφερθεί ότι προκαλεί ακετυλίωση της Hsp90 μέσω αναστολής του HDAC6 και εξάντληση αρκετών πελάτη Hsp90 πρωτεΐνες συμπεριλαμβανομένων ΑΚΤ και c-RAF [22], [36], [37]. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι κάτω από τις συνθήκες όπου LBH589 επάγεται Chk1 ρύθμιση προς τα κάτω, δεν παρατηρήθηκε αναστολή παρατηρήθηκε στα επίπεδα έκφρασης του ΑΚΤ και c-RAF. Περαιτέρω, οι εκλεκτικοί αναστολείς HDAC βαλπροϊκό οξύ, απισιδίνη και MS-275 που δεν είναι γνωστό ανασταλτικά αποτελέσματα επί HDAC6 ήταν σε θέση να αναστείλουν την έκφραση Chk1. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η αναστολή της έκφρασης Chk1 σε HDACi επεξεργασμένα κύτταρα πιθανόν δεν διαμεσολαβείται από αδρανοποίηση των HSP90 πρωτεΐνη, αλλά είναι μάλλον οφείλεται στην καταστολή της έκφρασης CHK1.

Μία από τις μεγαλύτερες προκλήσεις στην ανάπτυξη του HDACis είναι ο ορισμός των κλινικά σχετικές παραμέτρους για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας του φαρμάκου στους όγκους των ασθενών στο πρώιμο στάδιο της θεραπείας για να προβλέψει την κλινική έκβαση. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι προς τα κάτω ρύθμιση επιπέδων ολικής πρωτεΐνης Chk1 συσχετίζεται πολύ περισσότερο έντονα με επαγωγή κυτταροτοξικής επίδρασης και όχι με υπερακετυλίωση ιστόνης σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές και σε πρωτογενή κύτταρα που λαμβάνονται από NSCLC όγκους ασθενών ex vivo. Μαζί, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η ρύθμιση προς τα κάτω των Chk1 και Tyr15 φωσφορυλίωση των επιπέδων cdc2 μπορεί να είναι ευαίσθητοι και κλινικά σχετικές φαρμακοδυναμικές δείκτες της αποτελεσματικότητας της HDACis.

Παρά την υπόσχεσή τους ως μια αναδυόμενη θεραπεία του καρκίνου, σε κλινικές δοκιμές, η αποτελεσματικότητα της HDACis υπήρξε περιορισμένη και δεν υπάρχει σαφής μηχανισμός αντίστασης έχει διευκρινιστεί [1]. παρόντα αποτελέσματα μας παρέχουν μια πιθανή εικόνα του μηχανισμού δράσης HDACi και αντίστασης. Δείξαμε ότι η έκτοπη έκφραση της Chk1 και της πρόληψης της μιτωτικής εισόδου από έναν αναστολέα purvalanol cdc2 μειωμένη LBH589-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι το επίπεδο της έκφρασης Chk1 ή κατάσταση ενεργοποίησης των ενζύμων που ρυθμίζουν την έναρξη της φάσης-Μ, όπως σύμπλοκο cdc25 και cdc2-κυκλίνη Β, μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στον καθορισμό της ευαισθησίας ή της αντίστασης των καρκινικών κυττάρων να HDACis. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται εδώ προτείνουν ένα μοντέλο όπου μιτωτική είσοδο είναι ένα απαιτούμενο βήμα για HDACi μεσολάβηση κυτταρικό θάνατο. Επιπλέον, κυτταρικούς μηχανισμούς που μπλοκάρουν Chk1 ρύθμιση προς τα κάτω ή /και παράκαμψη Chk1 και δρουν απευθείας στο G

2 ελέγχου σημείο ελέγχου για την αποτροπή των κυττάρων να εισέλθουν μιτωτική φάση θα μπορούσε να προκαλέσει αντίσταση στην HDACis. Για παράδειγμα, Chk1 έχει δειχθεί ότι είναι άκρως εκφραζόμενη σε NSCLC όγκους [38], η οποία μπορεί να προσδίδουν αντοχή σε HDACi επαγόμενη εισόδου μιτωτική και κυτταρικό θάνατο. Ετσι, σε όγκους με αυξημένη δραστικότητα Chk1, ορθολογική συνδυασμούς HDACis με φάρμακα που αναστέλλουν Chk1 ταυτοχρόνως και κατάντη μονοπατιών σηματοδότησης του ελέγχει G

2 /M σημείο ελέγχου του κυτταρικού κύκλου μπορεί να αυξήσει τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα του HDACis.

HDACis έχει αποδειχθεί ότι συνεργεί με παράγοντες που βλάπτουν το DNA [1]. Πάντως, οι μοριακοί μηχανισμοί της παρούσας συνέργεια δεν καλά γίνει κατανοητή.