Αφηρημένο

Η απορρύθμιση microRNAs παίζουν ρόλο στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου, αλλά λίγα είναι γνωστά για τη διανομή ιστών και κυττάρων τους στο συνεχές της κανονικής βλεννογόνου μέσω της προκακοήθων αδένωμα σε επεμβατικές αδενοκαρκίνωμα. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να εξετάσει το πρότυπο έκφρασης του συμπλέγματος miR-17-92 (miR-17, miR-18, miR-19, miR-20 και miR-92), καθώς και miR-21, miR-31 , miR-135b, και miR-145 στις αρχές κλινικά διαγνωσμένο καρκίνο του παχέος εντέρου. Τα microRNAs αναλύθηκαν με χρωμογόνο

in situ υβριδισμού

στην αλληλουχία φυσιολογικού αδένωμα-αδενοκαρκίνωμα εννέα αδενοκαρκινώματα αναπτύσσονται σε πολύποδες του βλεννογόνου του παχέος εντέρου. Στη συνέχεια, η έκφραση επιλεγμένων microRNAs ελέγχθηκε σε 24 βλεννογόνου πολύποδες καρκίνο του παχέος εντέρου. Η έκφραση του miR-17 περιορίστηκε στα επιθηλιακά κύτταρα, και τα επίπεδα έκφρασης αυξήθηκαν στην μεταβατική ζώνη από φυσιολογική έως αδενωματώδη ιστό. Τα μέλη του συμπλέγματος miR-17-92, miR-19b, miR-20a, και miR-92a, ακολούθησε το ίδιο μοτίβο έκφρασης, αλλά miR-17 ήταν η πιο κυρίαρχη. Μια αυξημένη έκφραση του miR-21 βρέθηκε στο σχετιζόμενο με όγκο στρώματος με την πιο δραματική αύξηση από αδένωμα προς αδενοκαρκίνωμα, ενώ ο αριθμός των θετικών miR-145 που μοιάζουν με ινοβλάστες κύτταρα στο κανονικό ίδιο υμένα (στρώμα) μειώθηκε με σταδιακό τρόπο σε όλη την ακολουθία της κανονικής-αδένωμα-αδενοκαρκίνωμα. Συνάγεται το συμπέρασμα ότι η έκφραση του miR-17, miR-21, και miR-145 αλλαγές στα αρχικά στάδια της ακολουθίας φυσιολογικού αδένωμα-αδενοκαρκίνωμα. Έτσι, αυτά τα microRNAs μπορεί να παίζει ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Knudsen KN, Nielsen BS, Lindebjerg J, Hansen TF, Holst R, Sørensen FB (2015) microRNA-17 είναι η πιο Up -Regulated μέλος του συμπλέγματος miR-17-92 κατά τη διάρκεια της Πρώιμης καρκίνου του παχέος εντέρου Evolution. PLoS ONE 10 (10): e0140503. doi: 10.1371 /journal.pone.0140503

Επιμέλεια: Jin Ερ Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center & amp? Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 11 Ιουν 2015? Αποδεκτές: 24 Σεπ 2015? Δημοσιεύθηκε: 14 Οκτωβρίου 2015

Copyright: © 2015 Knudsen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από την Περιφέρεια Ταμείου Νότιας Δανίας PhD (αριθμός επιχορήγηση 12/6786, https://www.regionsyddanmark.dk/wm325002), Η Πανεπιστήμιο της Νότιας Δανίας (www.sdu.dk), το Συμβούλιο Έρευνας της Lillebælt Νοσοκομείου (https://www.sygehuslillebaelt.dk/wm223295), βασιλιά Christian Ιδρύματος X (https://kongehuset.dk/Menu/Fonde–legater/Kong-Christian-den-Tiendes-Fond/kong-christian-den-tiendesfond), Το Ίδρυμα Family Spogaard (https://www.cancer.dk/forskning/stoette-til-forskning/familien-spogaards-fond/), Aase και Ίδρυμα Ejnar Danielsen (αριθμός επιχορήγηση 10-000789, http: //www.danielsensfond .dk /Default.aspx), και μέλος του Κοινοβουλίου J. Christensen και η σύζυγός του Ιδρύματος Κ Christensen. Όλες οι επιχορηγήσεις που αναφέρονται παραπάνω δόθηκαν ΚΝΚ. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. BSN απασχολείται από μια εμπορική εταιρεία (Bioneer A /S, Δανία). Ο χρηματοδότης παρέχεται στήριξη με τη μορφή του μισθού, αλλά δεν έχουν κανένα πρόσθετο ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. BSN απασχολείται από ένα εμπορική εταιρεία (Bioneer A /S, Δανία). Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι μεταξύ ένα από τα πιο κοινούς καρκίνους παγκοσμίως [1]. Ένα σημαντικό κλάσμα αυτών των καρκίνων πιστεύεται να αναπτυχθεί με σταδιακό τρόπο από την κανονική βλεννογόνο του κόλου μέσω προκαρκινικές αδένωμα στο διηθητικό αδενοκαρκίνωμα, ως αποτέλεσμα των πολύπλοκων γενετικών και επιγενετικών αλλαγών [2-4]. Τα microRNAs (miRNAs) είναι μια κατηγορία μη-κωδικοποίησης RNA μεσολαβούν μετα-μεταγραφικής ρύθμισης που έχουν ενοχοποιηθεί στην καρκινογένεση και του παχέος εξέλιξης του όγκου, ενεργώντας ως ογκογονίδια και κατασταλτικά του όγκου [5-7]. Τα miRNAs, τα οποία γενικά περιέχουν ~ 22 νουκλεοτίδια, στοχεύουν περισσότερο από το 60% όλων των γονιδίων που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη [8], και κάθε miRNA μπορούν δυνητικά να καταστείλουν εκατοντάδες γονιδίων στόχων [9].

Τα microRNAs εκφράζονται ως μεταγραφές που περιέχει ένα ενιαίο miRNA όπως miR-21 ή έναν αριθμό ώριμων miRNAs (polycistrons), όπως και τα miR-143/145 και miR-17-92 clusters. Το σύμπλεγμα miR-17-92 περιέχει έξι διαφορετικές miRNAs: miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-19b, miR-20a, και miR-92a, με ένα εξαιρετικά παρόμοια ακολουθία μεταξύ miR-19a και miR-19b και μεταξύ miR-17 και miR-20a [10]. Όλα τα μέλη του συμπλέγματος έχουν βρεθεί αυξημένα σε ορθοκολικό καρκινικό ιστό σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό, αν και με ποικίλες έκφραση κάθε μεμονωμένο συστατικό [11-13]. Άλλα συχνά περιγράφεται up-ρυθμίζονται miRNAs σε καρκίνο του παχέος εντέρου είναι miR-21 και miR-31 [14-16], ενώ miR-145 είναι ένα από τα πιο σταθερά κάτω-ρυθμίζονται miRNAs [15-18]. Επιπλέον, miR-135b έχει αναφερθεί ότι εμπλέκεται στην πρώιμη ογκογένεσης [19,20].

Παρά τη μαζική συνεχιζόμενη έρευνα για miRNA σε καρκίνο του παχέος εντέρου, μόνο λίγες μελέτες έχουν διερευνήσει τις αλλαγές miRNA κατά μήκος ολόκληρης της κανονικοποιημένο αδένωμα-αδενοκαρκίνωμα (NA-AC) ακολουθία [20-24]. Bartley

et al

βρέθηκαν συνολικά 230 διαφορικά εκφρασμένων miRNAs στο εξελικτικό μοντέλο NA-AC συμπεριλαμβανομένων των miR-17, miR-19, miR-92a, και miR-21 [21], ενώ άλλοι ερευνητές έχουν αναφερθεί miR-31 και miR-135b να είναι μεταξύ των πιο συχνά άλλαξε miRNAs [20,22,25]. Έχει επίσης δειχθεί ότι miR-21 πάνω ρύθμιση από αδένωμα προς αδενοκαρκίνωμα είναι αποτέλεσμα της αυξημένης έκφρασης σε καρκίνο που σχετίζεται με ινοβλάστες στρωματικών στον όγκο μικρο-περιβάλλον [26]. Ωστόσο, πληροφορίες σχετικά με την κατανομή των ιστών και των κυττάρων των miRNAs στην συνέχεια της σειράς Ν-Α-AC εξακολουθεί να είναι πενιχρά. Γνώση των miRNA εντοπισμού και της έκφρασης είναι θεμελιώδους σημασίας για την κατανόηση ακριβής ρόλος τους στην έναρξη, ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου.

Τα αδενοκαρκινώματα αναπτύσσονται στην βλεννογόνου πολύποδες (ΑΚΕ) παρέχει τη μοναδική ευκαιρία να μελετήσει η πρώιμη διαδοχική ανάπτυξη του αδενοκαρκινώματος εντός του ίδιου του ασθενούς. Χρησιμοποιώντας τις χώρες ΑΚΕ του παχέος εντέρου ως ένα μοντέλο της σειράς NA-AC, ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν η περιγραφή των τρόπων έκφρασης των μελών του συμπλέγματος miR-17-92, καθώς και miR-21, miR-31, miR-135b και miR-145 στην ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου, με έμφαση στα επιπολασμό τους, τη διανομή ιστών και κυτταρικής προέλευσης.

Υλικά και Μέθοδοι

Ο ιστός διερευνηθεί στην παρούσα μελέτη αποτελούνταν από δύο ανεξάρτητα σύνολα κλινικές, διαγνωστικά δείγματα: ένα σύνολο τεστ εννέα φορμόλη σταθερό, έχει εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) χώρες ΑΚΕ και ένα σύνολο επικύρωσης της 24ης FFPE χώρες ΑΚΕ από το παχύ έντερο. Όλα τα τεμάχια ιστού ελήφθησαν από τη διαγνωστική παθολογία αρχείο του Τμήματος Παθολογικής Κλινικής, Νοσοκομείο Vejle. Τα δείγματα για τη μελέτη της δοκιμής είχαν αρχικά διαγνωστεί κατά τη διάρκεια μιας μελέτης σκοπιμότητας προσυμπτωματικό έλεγχο του καρκίνου του παχέος εντέρου που διεξάγονται από το 2005 έως το 2006 στην κομητεία του Vejle της Δανίας, ενώ το σύνολο επικύρωσης προέρχεται από αναφέρεται ασθενών διαγιγνώσκονται σε Vejle Νοσοκομείο από το 2005 μέχρι το 2009. Μόνο τα συμβατικά αδενοκαρκινώματα ήταν περιλαμβάνονται και των βλεννογόνων πολυπόδων περιέχουν οδοντωτή αδενώματα αποκλείστηκαν. Επιβεβαίωση της διάγνωσης και της εκ νέου ταξινόμησης των αδενωματωδών συστατικών στα πολύποδες είχαν πραγματοποιηθεί από έμπειρο γαστρεντερικό παθολόγος. Λεπτομερείς πληροφορίες για τον ασθενή φαίνεται στον Πίνακα 1.

Η

Κατά την έναρξη της μελέτης, κάθε ιστολογική ενότητα περιλαμβάνονται και τα τρία συστατικά των χωρών ΑΚΕ,

i

.

e

. φυσιολογικό βλεννογόνο, αδενωματώδη ιστό, και επεμβατική αδενοκαρκίνωμα. Ωστόσο, καθώς περισσότερα τμήματα κόπηκαν από τα κομμάτια ιστού έλειπαν ορισμένες περιοχές ενδιαφέροντος, και έτσι δύο δείγματα από το σύνολο δοκιμής και μέχρι έξι από το σύνολο επικύρωσης απέτυχε να δώσει πλήρη στοιχεία από όλα τα τρία διαμερίσματα της αλληλουχίας NA-AC.

Η μελέτη εγκρίθηκε από τις Ηθικές επιτροπές Περιφερειακής επιστημονική Νότιας Δανίας (ID # S-20120075) και απαλλαγή από την υποχρέωση της ενήμερης συγκατάθεσης. Η μελέτη είχε καταχωρηθεί στην Υπηρεσία Προστασίας Δεδομένων της Δανίας, και το Μητρώο της Δανίας Ανθρωπίνων Αξιοποίηση ιστών ζητήθηκε η γνώμη πριν χρησιμοποιηθεί οποιαδήποτε δείγματα ιστών.

Στην ανάλυση υβριδισμού επί τόπου

Η

In situ υβριδισμού

(ISH) για miR-17, miR-21, miR-145, miR-126, miR-31, miR-125b, miR-135b, miR-200b, miR-18a, miR19b , miR-20a, και miR-92a διεξήχθη βασικά όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27]. Οι αλληλουχίες ανιχνευτή miRNA και πειραματικές λεπτομέρειες παρουσιάζονται στον Πίνακα S1. Εν συντομία, η ανάλυση ISH διεξήχθη επί 6 μm τομές πάχους χρησιμοποιώντας ένα όργανο Tecan Evo (Männedorf, Ελβετία). Δοκιμασία βελτιστοποίηση για να προσδιοριστεί βέλτιστες συγκεντρώσεις καθετήρα και θερμοκρασίες υβριδισμού επιτεύχθηκε πριν από την ανάλυση. Οι τομές προ-πέψη με πρωτεϊνάση-Κ (15 μg /ml) στους 37 ° C για 8 λεπτά, προ-υβριδοποιήθηκε στους 57 ° C για 15 λεπτά, και υβριδίσθηκαν με διπλό καρβοξυφλουορεσκεΐνη (FAM) σημασμένο Locked Nucleic Acid (LNA) ανιχνευτές (Exiqon A /S, Δανία). Μετά αυστηρές εκπλύσεις σε ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικού φυσιολογικού ορού-νάτριο, οι ανιχνευτές ανιχνεύθηκαν με αντι-FAM θραύσματα Fab συζευγμένο με αλκαλική φωσφατάση πρόβατα που ακολουθείται από επώαση σε υπόστρωμα που περιέχει 4-νιτροτετραζολίου και 5-βρωμο-4-χλωρο-3′-ινδολυλφωσφορικό (Roche , Δανία) με αποτέλεσμα ένα σκούρο μπλε χρώση, και, τέλος, αντίθετα με nuclear fast κόκκινο (Vector Laboratories, CA)

Η μορφολογική αξιολόγηση της έκφρασης miRNA και β-κατενίνης

Όλα τα πλακίδια αξιολογήθηκαν υποκειμενικά και σημείωσε ημι-ποσοτικά, σύμφωνα με την ένταση miRNA (0 = αρνητική, 1 = ασθενής, 2 = ισχυρή) και το ποσοστό των χρωματισμένων κυττάρων (0 = & lt? 50%, 1 = & gt? 50%), εκτός για miR-21. Η συνολική βαθμολογία προσδιορίστηκε με την προσθήκη των βαθμολογίες έντασης και αναλογία και dichotomising το άθροισμα σε «χαμηλό» (0-1) ή «υψηλή» (στείλει 2-3) έκφρασης. Λόγω σε ένα ευρύ φάσμα των miR-21 θετικά κύτταρα στα δείγματα, η αναλογία των miR-21 προετοιμασμένα κύτταρα κατηγοριοποιήθηκε ως 0 = & lt? 1%, 1 = 1% -50% και 2 = & gt? 50%, και ο βαθμολογία ένταση εργαζόταν όπως περιγράφεται παραπάνω. Η συνολική βαθμολογία miR-21 χωρίστηκε σε τρεις κατηγορίες: 0-1 = χαμηλή? 2-3 = μέτριο? 4 = υψηλή έκφραση.

Έκφραση

β-κατενίνης αξιολογήθηκε για μεμβρανώδη, κυτταροπλασματική και πυρηνική χρώση. Δεδομένου ότι η κυτταροπλασματική αντίδραση ομοιογενώς κατανεμημένη στα διαμερίσματα του όγκου, μόνο η ένταση βαθμολογήθηκε (αδύναμη, μέτρια και ισχυρά). Επειδή η κυτταροπλασματική χρώση έκρυψε τον μεμβρανώδη ανοσοαντίδραση σε πολλές αδενωματώδεις και επεμβατική περιοχές, μεμβρανώδη χρώση δεν σκόραρε σε αυτά τα διαμερίσματα. Πυρηνική χρώση χωρίστηκε σε δύο ομάδες: αρνητική = καμία πυρηνική αντίδραση δει και θετικά = κυμαίνονται από λίγα διάσπαρτα θετικά κύτταρα, εστιακή αντίδραση, ή διάχυτη αντίδραση

Εικόνα ανάλυση

Η μορφολογική αξιολόγηση τεκμηριωμένη. μια έντονη ανοδική ρύθμιση του miR-17 στα επιθηλιακά κύτταρα, τα οποία ονομάζονται για περαιτέρω ανάλυση χρησιμοποιώντας την ακόλουθη αντικειμενική προσέγγιση: Ψηφιακή ολόκληρη εικόνες διαφάνεια ελήφθησαν με στόχο x20, χρησιμοποιώντας ένα Axio Σάρωση Ζ1 φωτεινό σαρωτή τομέα (Carl Zeiss, Γερμανία). Η ανάλυση εικόνας των ψηφιακών διαφανειών διεξήχθη χρησιμοποιώντας λογισμικό VisiomorphDP (Visiopharm, Δανία). Στις 16 περιπτώσεις, ποσοτικές εκτιμήσεις του σήματος ISH miR-17 λήφθηκαν σε περιοχές με φυσιολογικό βλεννογόνο του κόλου (Ν), χαμηλής ποιότητας αδένωμα (LGA), υψηλής ποιότητας αδένωμα (HGA), και το αδενοκαρκίνωμα, όταν η ομογενής συστατικά του ιστού ήταν εμφανής . Οι περιοχές αυτές προσδιορίζονται από έναν έμπειρο γαστρεντερικό παθολόγος και περιβαλλόμενο ως περιοχές ενδιαφέροντος (ROI) στις ψηφιακές ολόκληρη διαφάνειες. Οκτώ περιπτώσεις αναλύθηκαν εις διπλούν και συνενώθηκαν τα δεδομένα από τις δύο πλάκες. Οι μέσες περιοχές αξιολογήθηκαν (του ROIs) ήταν: N: 5,2 mm

2 (n = 24)? LGA 6.1 mm

2 (n = 9)? HGA: 7,4 χιλιοστά

2 (n = 21), και το αδενοκαρκίνωμα 8.2 mm

2 (n = 24), όπου n είναι ο αριθμός των αντιπροσωπευτικών των ROI. Ένας ταξινομητής pixel είχε εκπαιδευτεί να διακρίνουν το μπλε σήμα ISH από το κόκκινο επίχρωση, η μη χρωματισμένα και ασθενώς χρωματισμένο ιστού, και στους τομείς των ιστών-free, και με ανώτατο όριο της έντασης διακρίσεις μέσο μπλε από έντονο μπλε. Οι ακόλουθες παράμετροι ελήφθησαν κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας εικόνας από κάθε ROI: έκταση του μέσου μπλε, περιοχή έντονης μπλε, και το συνολικό εμβαδόν του ατόμου ROIs. Οι σχετικές κλάσματα περιοχή, περιοχές της μέσης + έντονο μπλε διαιρείται με τη συνολική έκταση (αυθαίρετη μονάδα), θεωρήθηκαν αντιπροσωπευτικές για τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του miR-17.

Η ανοσοϊστοχημεία (IHC)

IHC πραγματοποιήθηκε σε τομές ιστών 4 μm από τα ίδια στοιχεία που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση ISH. EnVision FLEX +, ποντίκι, υψηλής pH, (Link) (Dako, Glostrup, Δανία κωδικό K8002) χρησιμοποιήθηκε για την ανάκτηση επιτόπου και χρώση IHC.

Για φωσφατάση και tensin ομόλογο ανάλυση (PTEN), τα πλακίδια επωάστηκαν με αντίσωμα ΡΤΕΝ (1: 200, Dako, Δανία, κωδικός M3627) για 30 λεπτά, ενισχύθηκαν με αντίσωμα ποντικού σύνδεσμο για 20 λεπτά ακολουθούμενη από χρένο ανίχνευση υπεροξειδάσης-πολυμερούς επί 30 λεπτά. χρώση αντισώματος διεξήχθη σε Dako Autostainer Plus (Dako, Δανία) χρησιμοποιώντας 3,3′-διαμινοβενζιδίνη ως χρωμογόνο και αιματοξυλίνη Mayers ως αντιχρώση. Πλήρης αρνητική αντίδραση IHC θεωρήθηκε ως απώλεια της PTEN.

Κατάσταση πρωτεΐνη Ασυμφωνία επισκευή είχε πραγματοποιηθεί συνήθως χρησιμοποιώντας IHC για περίπου το ήμισυ των δειγμάτων κατά τη διάρκεια της πρωτοβάθμιας διαδικασίας διάγνωσης παθο-ανατομικές. Οι υπόλοιπες περιπτώσεις βάφτηκαν με αντισώματα έναντι MLH1 (1: 100, Novocastra, το Ηνωμένο Βασίλειο, τον κωδικό NCL-L-MLH1), MSH2 (1: 100, Novocastra, το Ηνωμένο Βασίλειο, τον κωδικό NCL-MSH2), MSH6 (BD Transduction Laboratories, USA, κωδικός 610919) και PMS2 (1: 500, BD Pharmingen, ΗΠΑ, κωδικός 556415). Μη νεοπλασματικά κύτταρα εντός και γύρω από τον όγκο χρησίμευσε ως εσωτερικός θετικός έλεγχος, και για τους αρνητικούς μάρτυρες είχε παραλειφθεί το πρωτογενές αντίσωμα

IHC αναλύσεις για λείου μυός ακτίνη (1: 1000, Dako, Δανία, M0851)., Δεσμίνη (1: 400, Dako, Δανία, M0760) και h-καλδεσμόνη (1: 200, Dako, Δανία, M3557) πραγματοποιήθηκαν σε δείγματα από το σύνολο της δοκιμής, ενώ η ανάλυση για β-κατενίνης (1: 2000, BD Biosciences, Η.Π.Α. , κωδικός 610153) πραγματοποιήθηκε στο σετ επικύρωσης.

Στατιστική ανάλυση

Συνεχής δεδομένα miR-17 που λαμβάνεται από την ανάλυση της εικόνας ήταν λογαριθμικά μετασχηματισμένων για να αποδώσει ένα κανονική κατανομή των υπολειμμάτων. Για να προσαρμόσετε για διακύμανση στο ίδιο άτομο, ένα πολυπαραγοντικό μοντέλο παλινδρόμησης μικτά αποτελέσματα γραμμική με τυχαία αποτελέσματα για το αναγνωριστικό δείγματος χρησιμοποιήθηκε για την εξέταση των συσχετίσεων μεταξύ log-miR-17 και των σταθερών συμπαράγοντες: τύπο ιστού, την ηλικία, το φύλο, και ιστολογία του αδενώματος. Στη συνέχεια, γραμμικούς συνδυασμούς των εκτιμητών χρησιμοποιήθηκαν για να συγκριθούν τα επίπεδα έκφρασης miR-17 μεταξύ των ομάδων. Ρ-τιμές μικρότερες από 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν στο STATA έκδοση 13 (StataCorp, TX, USA)

Αποτελέσματα

Test περιπτώσεις:. Μορφολογικά

αξιολόγηση

Σύμφωνα με κριτικές βιβλιογραφία [5-7,21 , 22,28-30], επιλέξαμε να εξετάσει την έκφραση του miR-17, miR-21, miR-31, miR-125b, miR-126, miR-135b, miR-145 και miR-200b στη δοκιμή ομάδα των εννέα χωρών ΑΚΕ.

από τις οκτώ δοκιμαστεί miRNAs, miR-17, miR-21, και miR-145 έδειξαν διαφορική έκφραση με τη σειρά NA-AC (Σχήμα 1Α-1F). Σε επτά από τις εννέα περιπτώσεις, ένας αυξημένος miR-17 έκφραση στα επιθηλιακά κύτταρα παρατηρήθηκε στην μεταβατική ζώνη από φυσιολογική έως αδενωματώδη ιστό. Η έκφραση διατηρήθηκε σε καρκινικά επιθηλιακά κύτταρα. Σε όλα τα δείγματα, miR-21 έκφρασης κυρίως βρίσκονται στις ινοβλάστες, όπως στρωματικά κύτταρα των δυσπλαστικών και επεμβατική περιοχές των χωρών ΑΚΕ με μόνο αραιά και εστιακά αντίδραση στα καρκινικά επιθηλιακά κύτταρα. Το μοτίβο έκφρασης φάνηκε να αυξάνεται με σταδιακό τρόπο σε όλη την ακολουθία Ν-Α-Ο. Όλες οι περιπτώσεις έδειξαν ισχυρή έκφραση του miR-145 φαίνεται στα λεία μυϊκά κύτταρα (SMC) και αγγειακά κύτταρα λείου μυός (VSMC), καθώς και σε στρωματικά κύτταρα που ομοιάζουν με ινοβλάστη. Τα τελευταία κύτταρα εντοπίστηκαν σε στενή γειτνίαση των επιθηλιακών κρυπτών και εμφανίστηκε να μειώνεται κατά το αδενωματώδη και καρκινικό ιστό σε έξι από τις επτά διαθέσιμες περιπτώσεις. IHC στα ίδια δείγματα αποκάλυψαν μια θετική αντίδραση για λείου μυός α-ακτίνης και δεσμίνη, ενώ h-καλδεσμόνη ήταν αρνητική, υποδηλώνοντας ότι αυτά τα miR-145-θετικά κύτταρα είναι μυοϊνοβλαστικής προέλευσης

(Α & amp?. Β ) miR-17 σε φυσιολογικό (Ν) και αδενωματωδών (Α) ιστού και σε αδενοκαρκίνωμα (AC)? (C & amp? D) miR-21 έκφραση σε στρώμα του αδενώματος σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό και στα καρκινικά κύτταρα που συσχετίζονται με στρώμα (*). Μια μικρή ομάδα των επιθηλιακών κυττάρων όγκων θετικά είναι επίσης παρούσα (λευκό βέλος)? (Ε) miR-145 φαίνεται σε λεία μυϊκά κύτταρα (βέλος) και αγγειακά κύτταρα λείου μυός (κεφαλή βέλους)? στην μεγέθυνση (F) μειωμένο αριθμό miR-145 θετικά ινοβλάστες σαν κύτταρα βρίσκονται στο αδένωμα (βέλος) σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό (κεφαλή βέλους)? σήμα (G) Αχνό miR-125b παρατηρήθηκε στο μυϊκό βλεννογόνο (mm)? (H) miR-200b παρατηρήθηκε στα επιθηλιακά κύτταρα στη βάση των κρυπτών, αλλά στην περίπτωση αυτή, επίσης, στα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα? (Ι) miR-126 φαίνεται αποκλειστικά στα ενδοθηλιακά κύτταρα? (J) Ο καθετήρας αγωνίζομαι έδειξε μόνο διακριτή χρώση φόντο.

Η

Ένα θετικό μήνυμα για miR-125b, miR-126 και miR-200b ήταν παρούσα στα δείγματα, ωστόσο, δεν διαφορικής έκφρασης για οποιαδήποτε των τριών αυτών Mirs παρατηρήθηκε κατά τη σύγκριση των τριών διαμερισμάτων (Σχ 1G-1i). Ένα ασθενές σήμα miR-125b παρατηρήθηκε στις ινοβλάστες στην κανονική βλεννογόνο και SMC σε πέντε από εννέα περιπτώσεις. Όλα τα δείγματα έδειξαν miR-200b θετικά επιθηλιακά κύτταρα, ειδικά στη βάση της κανονικής εντερικών κρυπτών, καθώς και ένα θετικό σήμα στο αδενωματώδη και καρκινικού επιθηλίου. έκφραση του miR-126 περιορίστηκε στα ενδοθηλιακά κύτταρα και ήταν παρούσα σε όλα τα τρία διαμερίσματα.

Όχι έκφραση του miR-31 και miR-135b ανιχνεύθηκε στα δείγματα δοκιμής εννέα.

μελέτη επικύρωσης : Μορφολογική αξιολόγηση των miR-17, miR-21, και miR-145 έκφρασης

Με βάση τα αποτελέσματα που προέκυψαν από το σύνολο της δοκιμής, αναλύσεις των miR-17, miR-21, και miR-145 συνεχίστηκαν περαιτέρω στο σύνολο επικύρωσης των 24 χωρών ΑΚΕ. Το σήμα miR-17 βρέθηκε αποκλειστικά στα επιθηλιακά κύτταρα. Χαμηλή έκφραση παρατηρήθηκε στα φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα στη βάση των κρυπτών, ενώ η υψηλή έκφραση παρατηρήθηκε στην μεταβατική ζώνη από φυσιολογικό να αδενωματώδη ιστό σε 96% (23/24) των περιπτώσεων (Πίνακας 2). Η έκφραση διατηρήθηκε στο αδενοκαρκίνωμα στο 96% (22/23) των περιπτώσεων, ενώ το σήμα μειώθηκε σε μία περίπτωση (4%). Μόνο ένα δείγμα έδειξαν αυξημένη έκφραση από αδένωμα σε αδενοκαρκίνωμα. Αυτές οι δύο περιπτώσεις δεν διαφέρουν κλινικά από τις άλλες περιπτώσεις το σύνολο επικύρωσης.

Η

Αντίστοιχα με τα ευρήματα στο σύνολο δοκιμών, miR-21 έκφρασης κυρίως βρίσκονται στα στρωματικά κύτταρα που περιβάλλουν το δυσπλαστικών και καρκινικές αδένες. Μία περίπτωση, ωστόσο, έδειξε έκφραση miR-21 σε καρκινικά επιθηλιακά κύτταρα, και σε τρία άλλα δείγματα παρατηρήθηκε επίσης εστιακή έκφραση στα επιθηλιακά κύτταρα του όγκου. Δεν ιστοπαθολογικές ή κλινικές διαφορές καταγράφηκαν ανάμεσα σε αυτές τις τέσσερις περιπτώσεις σε σύγκριση με τις άλλες 20 περιπτώσεις. Μέτρια έκφραση του miR-21 εμφανίστηκε στην μεταβατική ζώνη από την κανονική σε αδένωμα στα στρωματικά κύτταρα σε 71% (17/24) των περιπτώσεων. Οι υπόλοιπες περιπτώσεις έδειξαν αυξημένη έκφραση από αδένωμα σε αδενοκαρκίνωμα (Πίνακας 2). Στο 41% ​​(9/22) των περιπτώσεων, η προς τα πάνω ρύθμιση εντάθηκε σε όλη τη σειρά NA-AC με μέτρια έκφραση του miR-21 στο αδενώματος και υψηλή έκφραση στην επεμβατική εστίες.

Η ανάλυση του miR-145 έδειξαν θετικά pericryptal μοιάζουν με ινοβλάστες στρωματικά κύτταρα στην κανονική lamina propria εκτός από την SMC των αρτηριών και μυϊκά στρώματα στο τοίχωμα του παχέος εντέρου. Στις μισές από τις περιπτώσεις, ο αριθμός των miR-145 θετικά pericryptal, που μοιάζουν με ινοβλάστες κύτταρα μειώθηκαν κατά την μεταβατική ζώνη από φυσιολογική έως αδενωματώδη ιστό. Αυτή η μείωση ήταν ακόμα πιο εμφανής όταν συγκρίνεται φυσιολογικό να καρκινικού ιστού με μείωση παρατηρήθηκε στο 86% (19/22) των περιπτώσεων (Πίνακας 2). Το θετικό σήμα στο SMC και VSMC παρέμεινε αμετάβλητη σε όλα τα τρία διαμερίσματα.

Ανάλυση για miR-135b επαναλήφθηκε σε όλα τα δείγματα επικύρωσης 24, αλλά κανένα σήμα ISH βρέθηκε. Η υπόθεση με την αναντιστοιχία ανεπάρκεια πρωτεΐνης επισκευή δεν εμφανίζει ένα προφίλ έκφρασης των miRNAs διαφορετικό από τα καλά περιπτώσεις, ούτε και τις τρεις περιπτώσεις με μετάσταση.

Η έκφραση της β-κατενίνης με τη σειρά NA-AC

Distinct κυρίαρχο μεμβρανώδη και αδύναμη κυτταροπλασματική χρώση για β-κατενίνης ήταν παρόν σε όλες τις 24 περιπτώσεις (100%) του μη-νεοπλασματικές επιθήλιο, ενώ δεν πυρηνική συσσώρευση παρατηρήθηκε (S2 τραπέζι και μια σε S1 Σχ). Στα αδενωματώδη συστατικά, κυτταροπλασματική έκφραση αυξήθηκε σε 95% (20/21) των περιπτώσεων (S2 πίνακα). 62% (13/21) των αδενωμάτων εμφανίζονται επίσης θετική πυρηνική χρώση, ενώ αυτό παρατηρήθηκε στο 95% (20/21) των αδενοκαρκινώματα, τις περισσότερες φορές στο μεταναστευτικό μέτωπο ή /και σε όγκο εκβλάστηση κύτταρα (Β + Γ S1 σχήμα). Αυξημένη κυτταροπλασματική αντίδραση παρατηρήθηκε σε όλα τα 21 (100%) αδενοκαρκινώματα (S2 Πίνακας).

Ανάλυση

Εικόνα του miR-17

εξετάστηκε περαιτέρω Ένα υποσύνολο των 16 επιλεγεί τυχαία δείγματα από το σύνολο επικύρωσης με ανάλυση εικόνας για την ποσοτική miR-17 τις εκτιμήσεις της έκφρασης σε περιοχές με φυσιολογικό ιστό, LGA, HGA και το αδενοκαρκίνωμα. Οι εκτιμήσεις της έκφρασης miR-17 ελήφθησαν ως κλάσματα περιοχή (

i

.

e

. Λεκιασμένη περιοχή διαιρείται με τη συνολική έκταση) και οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε δεδομένα μετασχηματίζονται καταγραφής. Τα αποτελέσματα από την πολυμεταβλητή μικτό γραμμικής παλινδρόμησης φαίνονται στον Πίνακα 3. Log-miR-17 αυξήθηκε από φυσιολογικό ιστό σε χαμηλές και υψηλές βαθμού αδενωματώδη ιστού και επίσης σε διηθητικό καρκίνο (p = 0.03, ρ & lt? 0.001 και ρ & lt? 0.001 αντίστοιχα? ενδο- συντελεστής συσχέτισης τάξης = 0,19). Το σχήμα 2 δείχνει μια συνολική αύξηση κατά 10% (από την αυθαίρετη μονάδα) σε ολόκληρη την αλληλουχία NA-AC, και ότι η προς τα πάνω ρύθμιση συνέβη με σταδιακό τρόπο ξεκινώντας με άνοδο 2,4% από την κανονική προς LGA (p = 0.03) και πρόσθετη αύξηση 6,9% από χαμηλής ποιότητας σε HGA (p & lt? 0.001). Δεν παρατηρήθηκε διαφορά στο ημερολόγιο miR-17 έκφραση παρατηρήθηκε στην εξέλιξη από HGA προς αδενοκαρκίνωμα (p = 0.84). Το ιστολογικό τύπο του αδενώματος, σωληνοειδή, λαχνών ή tubulo-λαχνών, δεν συνδέθηκε με log-miR-17 έκφραση, ωστόσο, μια ένωση με την ηλικία των ανδρών ασθενών παρατηρήθηκε (p & lt? 0.001). (Πίνακας 3)

η αυξημένη έκφραση του miR-17 σε χαμηλής ποιότητας αδένωμα (LGA), υψηλής ποιότητας αδένωμα (HGA) και το αδενοκαρκίνωμα (AC) του παχέος εντέρου σε σύγκριση με το φυσιολογικό ιστό

η

η έκφραση της miR-17-92 μέλη συμπλέγματος

miR-17 είναι ένα από τα έξι ώριμη miRNAs που κωδικοποιείται από το πολυσιστρονικό σύμπλεγμα miR-17-92. Ως εκ τούτου, επελέγησαν έξι περιπτώσεις από την επικύρωση που με τη υποκειμενικά ισχυρότερη έκφραση του miR-17 για περαιτέρω ανάλυση ISH σχετικά με τα μέλη του συμπλέγματος miR-18a, miR-19b, miR-20a, και miR-92a. Ο ανιχνευτής miR-19b θεωρήθηκε κοινή για τις δύο miR-19 ισομορφές, όπως miR-19a διαφέρει από miR-19β με μόνο ένα νουκλεοτίδιο κάνει 100% των διακρίσεων απίθανο να συμβεί στη δοκιμασία ISH. Η αλληλουχία ανιχνευτή miR-17 διαφέρει από miR-20a από τρεις θέσεις νουκλεοτιδίων (S1 πίνακα). Τα σήματα του miR-19b, miR-20a, και miR-92a ήταν, όπως και miR-17, περιορίζεται στα επιθηλιακά κύτταρα, αλλά η έκφραση ήταν ασθενέστερη από εκείνη που παρατηρήθηκε για miR-17 (Σχήμα 3Α και 3C-3E). Μια προς τα άνω ρύθμιση παρατηρήθηκε στην μεταβατική ζώνη από κανονική σε αδενωματώδη ιστό, και το πάνω-ρυθμισμένη έκφραση διατηρήθηκε στο αδενοκαρκίνωμα. Ένα πολύ εξασθενημένο σήμα miR-18a στα επιθηλιακά κύτταρα παρατηρήθηκε σε τέσσερις από τις έξι περιπτώσεις στην μεταβατική ζώνη από την κανονική σε προκαρκινικές ιστού (Σχήμα 3Β), ενώ πιο έντονο σήμα ISH βρέθηκε σε μερικά μικρά, στρογγυλεμένα κύτταρα λεμφοκυττάρων που μοιάζει στο στρώμα του propria lamina

(Α) Έκφραση του miR-17.? (Β) miR-18a? (C) miR-19b? (D) miR-20a? (Ε) miR-92a και (F) καθετήρας αγώνα στην κανονική (Ν) και αδενωματωδών (Α) ιστού. Σημειώστε την αυξημένη ένταση χρώσης στα αδενωματώδεις κρύπτες σε σύγκριση με την κανονική κρύπτη.

Η

έκφραση ΡΤΕΝ δεν έχει σχέση με miR-17 ή miR-21 έκφρασης

Όλοι οι περιπτώσεις και από τις δύο ομάδες μελέτης βάφτηκαν για PTEN, επικυρωμένη στόχο τόσο για miR-17 και miR-21 [31,32]. Στο σετ επικύρωσης, 21% (5/24) των ΑΚΕ έδειξε πλήρη απώλεια της ΡΤΕΝ αλλά μόνο εστιακά εντός στο επιθήλιο του αδενωματωδών ή /και επεμβατική περιοχές. Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκε μια αντίστροφη συσχέτιση του ΡΤΕΝ και miR-17 έκφρασης και miR-21 έκφρασης. Καμία απώλεια PTEN είχε δει τις εννέα περιπτώσεις δοκιμών.

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε κλινικές, διαγνωστικά δείγματα των αλλοιώσεων του παχέος εντέρου που περιέχει τη σειρά NA-AC για να εξερευνήσετε την έκφραση μιας σειράς miRNAs γνωστό από [5-7,28] να εκφράζονται κατά την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου βιβλιογραφία? miR-17, miR-21, miR-31, miR-125b, miR-126, miR-135b, miR-145 και miR-200b. Χρησιμοποιεί χρωμογόνο ISH, βρήκαμε ότι η έκφραση του miR-17, miR-21, και miR-145 ήταν ιδιαίτερα δυναμική στα πρώτα στάδια της ανάπτυξης του καρκίνου του παχέος εντέρου. Η ανάλυση εικόνας των miR-17 χρωματισμένο αλλοιώσεις έδειξε ότι αυτό το miRNA επάγεται στην πρώιμη μετάβαση από Ν προς LGA και ακόμα περισσότερο δραματικά σε HGA. Η έκφραση του miR-17 βρέθηκε να είναι επιθηλιακής προέλευσης, όπως ήταν και η περίπτωση των άλλων miRNAs στο σύμπλεγμα miR-17-92. miR-17 βρέθηκε να είναι η πιο διαδεδομένη miRNA από το σύμπλεγμα miR-17-92.

Η μελέτη μας είναι η πρώτη που δείχνει ότι το miR-17

in situ

αυξάνει την έκφραση νωρίς από την κανονική βλεννογόνου σε LGA και φτάνει σε ένα οροπέδιο της έκφρασης στα HGA που δεν είναι υπερβολική σε πρόδηλη αδενοκαρκίνωμα. Το εύρημα αυτό συμφωνεί με τα ευρήματα από Bartley

et al

, ο οποίος ανέφερε ένα παρόμοιο μοτίβο έκφρασης του miR-17 χρησιμοποιώντας qRT-PCR [21]. Άλλες μελέτες έχουν δείξει ότι το miR-17 επίπεδα συνέχισαν να αυξάνονται από αδένωμα σε αδενοκαρκίνωμα [11,33,34], αλλά σε αντίθεση με τη μελέτη μας και τα ευρήματα από Bartley

et al

, οι μελέτες αυτές δεν συγκρίνουν ιστό που λαμβάνεται από τα ίδια άτομα, και μπορεί έτσι να συνδέεται με αυξημένη διακύμανση μεταξύ των ατόμων.

με βάση την απλή, μορφολογική σύγκριση των εντάσεων χρώση σήματος ISH, βρήκαμε miR-17 να είναι το πιο up-ρυθμίζονται μέλος συμπλέγματος σε τόσο αδενωματώδη και καρκινικό ιστό, ακολουθούμενη από miR-92a, miR-20a, miR-19b, και miR-18a. Humphreys

et al

, χρησιμοποιώντας την τεχνική qRT-PCR, διαπίστωσε επίσης miR-17 να είναι το υψηλότερο που εκφράζεται miR στο ταμπλό miR-17-92 στο Dukes Α και Γ του παχέος εντέρου [13], ενώ qRT-PCR τα αποτελέσματα από άλλες μελέτες διαπίστωσαν miR-92a να είναι η πιο βαθιά εκφράζεται miRNA σε αδενωματώδεις ή /και καρκινικού ιστού ορθοκολικού [11,12,33]. Όλες αυτές οι τρεις μελέτες, ωστόσο, επιβεβαιώνουν το εύρημα μας ότι το miR-18a είναι το λιγότερο που εξέφρασε μέλος συμπλέγματος, και ότι miR-19a /b και η έκφραση του miR-20a είναι σταθερά υψηλότερες από ό, τι miR-18a [11-13,33]. Δεν μπορεί να αποκλειστεί ότι η συγγένεια δέσμευσης (θερμοκρασίες τήξης) των ανιχνευτών LNA που χρησιμοποιούνται μπορεί να έχουν συμβάλει με τις διαφορετικές εντάσεις χρώσης που παρατηρήθηκε.

Βρήκαμε την έκφραση όλων των μελέτησε τα μέλη του συμπλέγματος miR-17-92 για να είναι περιορίζονται στα επιθηλιακά κύτταρα. Παρόμοια ευρήματα του miR-17 και την έκφραση του miR-92a έχουν αναφερθεί από άλλους ερευνητές [31,33-35], αν και μια ομάδα παρατήρησε επίσης μερικές miR-17 θετικά στρωματικά κύτταρα [35]. Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε μια έντονη σήμα miR-18a σε μερικές μικρές, στρογγυλεμένες λεμφοκυττάρων-όπως στρωματικά κύτταρα στο χόριο σε τέσσερις από έξι δείγματα. Ωστόσο, δεδομένου ότι κανένα άλλο μέλος του συμπλέγματος εκφράστηκε, το σήμα είναι πιο πιθανό να αντιπροσωπεύουν διασταυρούμενη υβριδοποίηση με ένα άλλο RNA στόχου.

Ο ρόλος του miR-17 σε επιθηλιακά κύτταρα του παχέος εντέρου στην ανάπτυξη καρκίνου είναι ακόμα ασαφής. Μια πιθανή λειτουργία θα μπορούσε να είναι η αναστολή του παράγοντα E2F μεταγραφής 1,

E2F1

, ενός υποθετικού ογκοκατασταλτικό γονίδιο. Αυξημένη έκφραση του E2F1 έχει συνδεθεί με μείωση του πολλαπλασιασμού και αυξημένη απόπτωση σε καρκίνο του παχέος εντέρου [36,37]. Είναι ενδιαφέρον ότι, μια αντίστροφη σχέση μεταξύ E2F1 και miR-17 έχει αποδειχθεί σε ιστό καρκίνου του κόλου [35,38]. Monzo

κ.ά.

έδειξε ότι η επιμόλυνση των αντι-miR-17 είχε σαν αποτέλεσμα αυξημένη έκφραση E2F1 και μειωμένη πολλαπλασιασμό των κυττάρων [35], και Kanaan

κ.ά.

έδειξε ότι η επιμόλυνση των miR-17 σε ΗΤ-29 ορθοκολικού κύτταρα αδενοκαρκινώματος να οδηγήσει σε μειωμένη έκφραση E2F1 [39]. Σε μια μελέτη για τη νευρωνική διαφοροποίηση γράμμωσης της απεριόριστης σωματικών βλαστικών κυττάρων, μια άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ miR-17 και E2F1 έχει τεκμηριωθεί [40]. Έτσι, η αυξημένη έκφραση του miR-17 σε επιθηλιακά κύτταρα του παχέος εντέρου μπορούν να συμβάλουν στην ογκογένεση μέσω της προώθησης του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Πρόσθετες μελέτες έχουν πράγματι απαιτούνται για την αξιολόγηση της σχέσης μεταξύ miR-17 και E2F1 σε καρκίνο του παχέος εντέρου και θα απαιτήσει προσεκτική εξέταση των αντίστοιχων έκφρασή τους σε επαρκή μορφολογικά χαρακτηριστική περιοχές υπάρχουν σε τέτοιες μοναδικά δείγματα. Τα σετ μελέτης που χρησιμοποιούνται στην παρούσα μελέτη δεν επιτρέπουν την περαιτέρω ανάλυση, δεδομένου ότι οι αντιπροσωπευτικές περιοχές δεν ήταν πλέον διαθέσιμο σε σημαντικό κλάσμα του υλικού.

Η υποθετική ογκο-miR, miR-21, βρέθηκε κυρίως σε στρωματικά κύτταρα που περιβάλλουν τα δυσπλαστικά, αδενωματώδη και καρκινικών επιθηλιακών κυττάρων. Η ένταση της έκφρασης miR-21 αυξήθηκαν σε ολόκληρη την αλληλουχία Ν-A-AC με την υψηλότερη έκφραση παρατηρείται στον καρκίνο που σχετίζεται με στρώμα. Τα αποτελέσματά μας επιβεβαιώνουν τα ευρήματα των Yamamichi

et al

[26]. Εκτός από μία περίπτωση με miR-21 θετικά επιθήλιο του όγκου μόνο, ένα κυρίως στρωματικά έκφραση του miR-21 εμφανίζονται στα υπόλοιπα 23 + 9 δείγματα. Λαμβάνοντας υπόψη το μικρό μέγεθος του δείγματος που χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη από Yamamichi

et al

καθώς και αυτή παρούσα, δεν μπορεί να αποκλειστεί εντελώς ότι η πρώιμη έκφραση του miR-21 θα μπορούσε να είναι ένα επιθηλιακό φαινόμενο. Παρ ‘όλα αυτά, οι μεγάλες μελέτες για miR-21 σε πιο προηγμένες παχέος εντέρου καταδεικνύουν σαφώς miR-21 να εντοπίζεται στο διαμέρισμα στρωματικά [27,41,42].

Παρατηρήσαμε ότι ο αριθμός των miR-145 θετικά, pericryptal μοιάζουν με ινοβλάστες κύτταρα μειώθηκε σταδιακά με τη σειρά NA-AC. Μειωμένα επίπεδα miR-145 σε καρκίνο του παχέος εντέρου σε σύγκριση με φυσιολογικό κόλον, όπως μετράται με qPCR, έχουν βρεθεί σε πολλές μελέτες, και miR-145 έχει θεωρηθεί από καιρό μια πιθανή ογκοκατασταλτικό. Ωστόσο, πρόσφατα, αυτή η θεωρία αμφισβητήθηκε [43]. Χρησιμοποιώντας ISH, Chivukula

κ.ά.

βρήκαν ότι miR-145 εκφράζεται μόνο σε κύτταρα μεσεγχυματικά και όχι επιθηλιακά κύτταρα στο παχύ έντερο ποντικού, ενώ miR-145 ήταν σχεδόν μη ανιχνεύσιμη με qRT-PCR σε καθαρισμένο ποντικού και ανθρώπου εντερικού επιθηλίου [ ,,,0],44]. Οι συγγραφείς κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι το miR-145 λειτουργεί ως επιθηλιακά ογκοκατασταλτικό ήταν απίθανη, και ότι τα προηγούμενα αποτελέσματα του miR-145 η απώλεια ήταν πιο πιθανό σχετίζονται με διαφορές στην κυτταρική σύνθεση του φυσιολογικού και καρκινικού ιστού [43,44].