Αφηρημένο

Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι ορισμένοι συμπαγείς όγκους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου των ωοθηκών, περιέχει ξεχωριστούς πληθυσμούς των βλαστικών κυττάρων που είναι υπεύθυνα για την έναρξη του όγκου, της ανάπτυξης, χημειο-αντίσταση, και την επανάληψη. Το μονοπάτι Hippo έχει προσελκύσει μεγάλη προσοχή και ορισμένοι ερευνητές έχουν επικεντρωθεί σε λειτουργίες YAP για τη διατήρηση βλαστική ικανότητα και την κυτταρική διαφοροποίηση. Σε αυτή τη μελέτη, απομονώσαμε με επιτυχία τα ωοθηκών καρκίνο κύτταρα έναρξης (OCICs) και απέδειξαν YAP προωθείται αυτο-ανανέωση των ωοθηκών ξεκινήσει κυττάρων (OCIC) μέσω κατάντη συν-ενεργοποιητή ΗΣΑΤΚ της. YAP και ΗΣΑΤΚ οικογένειες που απαιτείται για τη διατήρηση της έκφρασης συγκεκριμένων γονιδίων που μπορούν να συμμετέχουν στην βλαστική ικανότητα και χημειοαντίσταση OCICs ». Στο σύνολό τους, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η πρώτη YAP /ΗΣΑΤΚ συν-ενεργοποιητή ρυθμίζεται καρκίνο ξεκίνησε κυττάρων pluripotency των ωοθηκών και χημειο-αντίσταση. Πρότεινε ένα νέο μηχανισμό για την αντοχή στα φάρμακα στην βλαστικών κυττάρων του καρκίνου που σηματοδοτικό μονοπάτι Hippo-YAP θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως θεραπευτικοί στόχοι για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών σε κλινικές

Παράθεση:. Xia Υ, Ζανγκ YL, Yu C, Chang Τ , Fan ΗΥ (2014) YAP /ΗΣΑΤΚ Co-Activator Ρυθμιζόμενη pluripotency και χημειοαντίσταση στον καρκίνο των ωοθηκών Initiated κύτταρα. PLoS ONE 9 (11): e109575. doi: 10.1371 /journal.pone.0109575

Επιμέλεια: Χονγκ Wanjin, Ινστιτούτο Μοριακής και Κυτταρικής Βιολογίας, Biopolis, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 21 του Ιουνίου, 2014? Δεκτές: 1 του Σεπτεμβρίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 4 Νοεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 Xia et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81172473, 31371449), το Εθνικό Πρόγραμμα Βασικής Έρευνας της Κίνας (2011CB944504, 2012CB944403 ), και βασική επιστημονική έρευνα Χρηματοδότηση του Πανεπιστημίου Zhejiang (2011QN81001). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η πιο θανατηφόρα γυναικολογικών κακοηθειών, κυρίως λόγω της έλλειψης έγκαιρης ανίχνευσης, η οποία οδηγεί στους περισσότερους ασθενείς που διαγιγνώσκονται σε προχωρημένο στάδιο της ασθένειας αυτής [1], [2]. Οι μηχανισμοί που διέπουν τον καρκίνο ανθεκτικότητας στα φάρμακα και στην επανάληψη παραμένουν αβέβαιες. Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι ορισμένοι συμπαγείς όγκους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου των ωοθηκών, περιέχουν διακριτοί πληθυσμοί βλαστικών κυττάρων που είναι υπεύθυνα για την έναρξη του όγκου, την ανάπτυξη, χημειο-αντίσταση, και την επανάληψη [3] – [6]. Υπάρχει κάποια σκέψη ότι χημειοθεραπευτική αντοχή από τον καρκίνο των ωοθηκών είναι κατά κύριο λόγο οφείλεται στην ύπαρξη των μικρών πληθυσμών των καρκινικών βλαστοκυττάρων (ΚΕΠ).

Μερικές μελέτες ανέφεραν ότι ΚΕΠ οργανωμένη αγκύρωση-ανεξάρτητη, αυτόνομη, σφαιρικές δομές [7] . Παρόμοιες δομές παρατηρήθηκαν σε καρκίνο των ωοθηκών κύτταρα ασθενούς ασκίτη, η οποία περιελάμβανε ένα μικρό υποπληθυσμό κυττάρων όγκου-πολλαπλασιαστικό που ήταν σε θέση να οργανώσει σε σφαιροειδή. Είναι γνωστό ότι τα υψηλά επίπεδα έκφρασης δεικτών των βλαστικών κυττάρων, όπως ΥΧΕ-4, SOX-2, Nanog, και Notch-1, μπορεί να ανιχνευθεί στα ΚΕΠ [8]. Μερικοί δείκτες κυτταρικής επιφάνειας είναι επίσης ιδιαίτερα εκφράζονται από ΚΕΠ, συμπεριλαμβανομένων CD44, CD117, CD133 και [9], [10]. Είναι ευρέως αποδεκτό ότι τα καρκινικά κύτταρα με υψηλή CD44 και έκφραση CD117 γίνει ιδιαίτερα ογκογόνο και να αποκαταστήσετε την αρχική ιεραρχία του όγκου τους [11].

Μια πισίνα βλαστικών κυττάρων που περιλαμβάνει καρκινικά βλαστικά κύτταρα είναι επίσης στενά ρυθμίζεται από τη σηματοδότηση μονοπατιών από το μικρο-περιβάλλον της βλαστοκυττάρων θέση. Μεταξύ αυτών, ιπποπόταμος μονοπάτι έχει προσελκύσει ιδιαίτερη προσοχή, και ορισμένοι ερευνητές έχουν επικεντρωθεί σε λειτουργίες YAP για τη διατήρηση βλαστική ικανότητα και την κυτταρική διαφοροποίηση [12], [13]. Η έκτοπη έκφραση YAP προλαμβάνει την διαφοροποίηση των κυττάρων ES

in vitro

και διατηρεί τον φαινότυπο των βλαστικών κυττάρων [14], [15]. Ωστόσο, μέχρι σήμερα, τα μέλη της οικογένειας ΗΣΑΤΚ, τα οποία είναι YAP κατάντη συν-ενεργοποιητές, δεν έχουν διερευνηθεί διεξοδικά στα καρκινικά βλαστικά κύτταρα.

Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των διαφόρων οδών, συμπεριλαμβανομένης της σκαντζόχοιρος [16], Wnt [17] – [19], ΜΑΡΚ [20], PI3K [21], και τα μονοπάτια Hippo [22] – [24], είχαν εμπλακεί σε βλαστικών κυττάρων pluripotency και τη ρύθμιση καρκινογένεση. Νοκ ντάουν από τα βασικά συστατικά της οδού Hippo επηρεάζονται ομοιόσταση των ιστών στην Πλατυέλμινθες

Macrostomum Lignano

και προκάλεσε την υπερ-πολλαπλασιασμός των βλαστικών κυττάρων [12]. LATS2, ένα ογκοκατασταλτικό κινάσης της οδού Hippo, μετα-μεταγραφικά καταστέλλει κυτταρικό επαναπρογραμματισμό του ανθρώπου [25]. YAP είναι λειτουργικά σημαντικό για τους όγκου κατασταλτικά αποτελέσματα επί LKB1, ένα ανάντη καταστολέας του καρκίνου στην οδό ΜΑΡΚ [26].

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε με επιτυχία απομονωμένες βλαστοκυττάρων σφαίρες από ξενομοσχεύματα όγκου ποντικού που προέρχονται από ανθρώπινο ωοθηκικό τα καρκινικά κύτταρα. Αυτά τα κύτταρα σχηματισμού σφαίρας ήταν άκρως ογκογονική και θα μπορούσε να διαδώσει σειριακά με την αρχική φαινοτύπους όγκου τους. Με βάση αυτή ενισχύεται, επαναλήψιμη ογκογονικότητα, έχουμε ορίσει αυτές σχηματισμού σφαίρας κυττάρων των ωοθηκών καρκίνο κύτταρα έναρξης (OCICs), σύμφωνα με την προηγουμένως αποδεκτή ορολογία. Αυτή η υπο-πληθυσμού των καρκινικών κυττάρων επίσης είχε ενισχυθεί βλαστική ικανότητα και ναρκωτικών αντίσταση OCICs »μέσω YAP /ΗΣΑΤΚ ρυθμίζουν την έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων. Τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζονται πρόσφατες παρατηρήσεις, συμπεριλαμβανομένης και της δικής μας, ότι YAP-TEADs προσδιορίζονται τα επίπεδα των ωοθηκών καρκίνο κακοήθειας και παρέχονται πρόσθετες μηχανιστικές γνώσεις σχετικά με τους ρόλους των YAP και TEADs στον καρκίνο των ωοθηκών.

Υλικά και Μέθοδοι

Ο καρκίνος των ωοθηκών κίνηση κυττάρων (OCIC) την απομόνωση και καλλιέργεια

Για να αποκτήσετε OCICs, εμείς υποδόρια ένεση κύτταρα Α2780 γραμμή ωοθήκης καρκινικών κυττάρων σε γυμνά ποντίκια (2 × 10

6 κύτταρα ανά ποντίκι). Μετά από μια διάμετρο όγκου έφθασε περίπου 1,5 cm (συνήθως στις τέσσερις εβδομάδες μετά την ένεση), απομακρύναμε το καρκινικό ιστό, κόβονται σε μικρά κομμάτια, και υπέστη πέψη με κολλαγενάση για την παρασκευή εναιωρήματα μονών κυττάρων. Στη συνέχεια τα συλλεγέντα μονά κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε DMEM-F12 άνευ ορού (Invitrogen) συμπληρωμένο με 5 μg /ml ινσουλίνης (Sigma), 20 ng /ml ανθρώπινου ανασυνδυασμένου επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF? Invitrogen), 10 ng /ml βασικό αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών (FGF-β? Invitrogen), και 0,4% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA? Sigma) σε Ultra Low πλάκες Συνημμένο (Corning). OCICs και τα κύτταρα ελέγχου ήταν όλα διαχωρίζεται από άλλα κύτταρα με χρήση συνεχούς φυγοκέντρησης βαθμίδωσης πυκνότητας. Τα κύτταρα ελέγχου ελήφθησαν επίσης με έγχυση κυττάρων Α2780 σε γυμνά ποντίκια και οι μέθοδοι διαχωρισμού ήταν παρόμοιες με εκείνες που χρησιμοποιούνται για OCICs. Μπορούν καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία Ultra Low Συνημμένο (Corning) και το μέσο ήταν παρόμοια με OCICs εκτός από το ότι το μέσο καλλιέργειας που περιλαμβάνεται 10% εμβρυϊκό ορό βοοειδούς (FBS). Όλα τα μέσα που περιλαμβάνονται πενικιλλίνη (10 μονάδες /ml) και στρεπτομυκίνη (10 ng /ml) και τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C με 5% CO

2. Μέσο αλλάζονται κάθε 3 ημέρες.

μοντέλο ξενομοσχεύματος γυμνού ποντικού

Τα ποντίκια υποβάλλονται σε επεξεργασία σύμφωνα με τον Οδηγό ΝΙΗ για τη Φροντίδα και Χρήση των πειραματόζωων, έχει εγκριθεί από επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Zhejiang. Οι ποντικοί στεγάστηκαν σε ένα ελεγχόμενης θερμοκρασίας δωμάτιο με κατάλληλη σκοτάδι-φως κύκλους, τροφοδοτείται με μια κανονική δίαιτα, και διατηρείται υπό την φροντίδα της Μονάδας Laboratory Animal, Πανεπιστήμιο Zhejiang, Κίνα. Τα καρκινικά κύτταρα μεταμοσχευμένα γυμνούς ποντικούς ωοθηκών εγχύθηκαν 2 χ 10

6 κύτταρα και εξετάζονται καθημερινά για περίπου τρεις εβδομάδες. Αφού η διάμετρος του όγκου έφθασε σε 1,5 cm, οι ποντικοί υποβλήθηκαν σε ευθανασία με τη χρήση CO

2 Μέθοδος εισπνοή προτού θυσιαστούν. Για να εκτιμηθεί OCIC ογκογόνο ικανότητα

in vivo

, σφαιροειδή μετρήθηκαν, επαναιωρήθηκαν σε 100 μΐ PBS, και στη συνέχεια με ένεση υποδορίως μέσα στα αριστερά πλευρά του 4 εβδομάδων θηλυκών γυμνών ποντικών. Οι συγκεντρώσεις των κυττάρων που χρησιμοποιούνται κυμαίνονταν από 10

4 έως 10

5 σε OCIC και ομάδες ελέγχου και οι ποντικοί διαιρέθηκαν σε δύο ομάδες και τέσσερα ποντίκια σε κάθε υποομάδα. Ξεκινώντας από μία εβδομάδα μετά την ένεση, μεταμοσχευμένα ποντίκια παρατηρήθηκαν καθημερινά για μάζες όγκου και όγκου. Ένας ποντικός θυσιάστηκε ανώδυνα όταν μια διάμετρο όγκου έφθασε 1,5 εκατοστά. Ξενομοσχεύματος όγκοι αποκόπηκαν, μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη, ενσωματωμένο σε παραφίνη, και τεμαχίστηκαν με ένα Leica περιστροφικό μικροτόμο (5 μm πάχος). Οι τομές χρησιμοποιήθηκαν για Η &?. Ε χρώση, ανοσοϊστοχημεία, και ιστολογικές αξιολογήσεις

ανοσοφθορισμού χρώση

OCIC σφαιροειδή συλλέχθηκαν και τοποθετήθηκαν σε γυάλινες αντικειμενοφόρες πλάκες, μονιμοποιήθηκαν σε παραφορμαλδεΰδη (4 ° C, 30 min) , διαπερατά με PBS που περιείχε 0,3% Triton Χ-100 (PBST), και επωάζονται με ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού (PBST που περιέχει 5% αλβουμίνη βόειου ορού). Τα σφαιροειδή διαδοχικά ανιχνεύθηκαν με τα πρωτεύοντα αντισώματα και Alexa Fluor 594- ή 488-συζευγμένα δευτερογενή αντισώματα (Molecular Probes). Τα πλακίδια τοποθετήθηκαν χρησιμοποιώντας Vectashield με 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλιο (ϋΑΡΙ, Vector Laboratories). Ψηφιακές εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο επιφθορισμού (Nikon Eclipse 80i) με 4-100X στόχους.

Ανοσοϊστοχημεία

ξενομοσχεύματα όγκου μονιμοποιήθηκαν για μία νύχτα σε 10% PBS ρυθμιστικό 4% παραφορμαλδεΰδη, και στη συνέχεια ενσωματώνονται σε παραφίνη. Τα τμήματα κόπηκαν με μικροτόμο Leica RM2235 σε 5 μm πάχους και χρωματίσθηκαν με τα υποδεικνυόμενα πρώτα αντισώματα για ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας κιτ Vector ABC (Vector Laboratories). Εν συντομία, τομές αποπαραφινοποιήθηκαν, επανυδατώθηκαν και επωάστηκαν σε 0.3% Η

2O

2. Μετά ανάκτηση αντιγόνου με τη χρήση 10 mM κιτρικού νατρίου (ρΗ 6.0), οι τομές επωάστηκαν σε φυσιολογικό ορό κατσίκας. Αυτά τα δείγματα στη συνέχεια ανιχνεύθηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα. Μετά την πλύση με PBS που περιείχε 0,05% Tween-20 (PBS-T), τα δείγματα επωάστηκαν με ένα δευτερογενές αντίσωμα και πλύθηκαν και πάλι με PBS-T πριν από την επώαση με διάλυμα ABC. Χρώμα αναπτύχθηκε με διαμινοβενζιδίνη (DAB) υπόστρωμα (Kit DAB Substrate, Vector Laboratories). Οι τομές πλύθηκαν, αντιχρωματίστηκαν, αφυδατωμένα, και τοποθετείται με μόνιμο μέσο στερέωσης Vectamount (Vector Laboratories). Οι τομές παρατηρήθηκαν κάτω από ένα Nikon Eclipse 80i μικροσκόπιο (Nikon Corporation). Ο αρνητικός μάρτυρας αντικαταστάθηκε το πρωτογενές αντίσωμα με PBS επώασης.

λεντοϊών shRNA μόλυνση και το σχηματισμό κλώνος δοκιμασία

ιός που κωδικοποιείται για

Yap

και

Tead1 /3 /4

σύντομο RNAs φουρκέτα (Τα siRNAs) ή μη-στόχο ολιγονουκλεοτιδίων ως μάρτυρας ήταν από GenePharma (Σανγκάη, Κίνα). Σύντομης παρεμβολής RNA που για

Yap

και

Tead1 /4.3

επιλέγονται από διαφορετικές αλληλουχίες στόχους εισήχθησαν σε LV-3 /GFP + Puro φορείς. Τα κύτταρα στις σφαίρες μολύνθηκαν με

Yap

και /ή

Tead1 /04.03

shRNA φακοϊού για 48 ώρες.

Yap

-ειδικές Τα siRNAs ήταν: 5′-CCCAGTTAAATGTTCACCAAT-3 ‘(shYAP # 1) και 5′-GCCACCAAGCTAGATAAAGAA-3’ (shYAP # 2). Δύο Τα siRNAs χρησιμοποιήθηκαν για να στοχεύσουν

Tead1

,

Tead3

, και

Tead4

μαζί: 5′-ATGATCAACTTCATCCACAAG-3 ‘και 5′-GATCAACTTCATCCACAAGCT-3’. αποδοτικότητα Παρεμβολή επαληθεύτηκε με RT-PCR και κηλίδωση Western. Lentivirus μολυσμένα OCICs απλώθηκαν εις τριπλούν σε πλάκες 12 φρεατίων (1000 κύτταρα /φρεάτιο) για 14 ημέρες. Το μέσο αντικαθίσταται κάθε 48 ώρες και ορατές αποικίες μετρήθηκαν με μικροσκοπία φωτός.

αξιολογήσεων διαφοροποίηση σφαιροειδές

σφαίρες κυττάρων καλλιεργήθηκαν κάτω από πρότυπες συνθήκες διαφοροποίησης (DMEM /F12 συμπληρωμένο με 10% FBS), και Ultra Low πλάκες Συνημμένο (Corning). Μετά από 14 ημέρες σε καλλιέργεια, κυτταρική μορφολογία αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα Zeiss Axiovert 40 ανεστραμμένο μικροσκόπιο με λογισμικό Axio-Vision. Οι δείκτες κυτταρικής επιφάνειας (CD44 και CD117) ανιχνεύθηκαν με χρώση ανοσοφθορισμού. Μια επιθήλιο δείκτης διαφοροποίησης, Cytokeratin-7 (CK-7), και τον καρκίνο των ωοθηκών αντιγόνο-125 (CA125) χρησιμοποιήθηκαν για χρώση ανοσοφθορισμού, που ακολουθείται από επώαση με FITC-επισημασμένο αντι-ποντικού κατσίκας ή IgG αντι-κουνελιού. Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με 4, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλης (DAPI? Santa Cruz).

Chemotherapy δοκιμασίες ευαισθησίας παράγοντα

σφαιροειδή κυττάρων διαχωρίστηκαν και σπάρθηκαν σε 4000 κύτταρα /φρεάτιο σε 96- φρεατίων Ultra Low Συνημμένο (Corning) και καλλιεργήθηκαν με ελεύθερο ορού DMEM /F12 συμπληρωμένο με αυξητικούς παράγοντες. OCICs και τον έλεγχο των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με σισπλατίνη (20 έως 60 μΜ), ταξόλη (2 έως 20 μΜ), ή μπλεομυκίνη (20 μΜ έως 100 μΜ) για 48 ώρες. Μετά από καλλιέργεια για 48 ώρες, η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ μέτρησης κυττάρων-8 (Dojndo, Japan), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. ποσοστά επιβίωσης των κυττάρων ορίζεται ως το ποσοστό των κυττάρων που επιβιώνουν αγωγή με φάρμακο διαιρείται με μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

ανάλυση μικροσυστοιχιών Ποσοτική PCR και πραγματικού χρόνου RT-PCR

Human Cancer Drug Resistance RT

2 Profiler PCR array (QIAGEN # 330231) χρησιμοποιήθηκε για να τον προσδιορισμό των προφίλ έκφρασης των γονιδίων 84 που εμπλέκονται στη ρύθμιση της χημειοθεραπείας. Εκκινητές για 84 γονίδια δοκιμής και 5 γονίδια καθαριότητας (

B2M

,

Hprt1

,

Rpl13a

,

GAPDH

, και

Actb

) περιλήφθηκαν σε κάθε πλάκα 96 φρεατίων. Ένα κιτ First Strand (QIAGEN # 330401) και SYBR Green qPCR βασικού μείγματος (QIAGEN # 330500) ήταν από SABiosciences. qPCR διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (SABiosciences RT

2 Σύστημα Array Profiler PCR) χρησιμοποιώντας μία συσκευή Bio-Rad CFX96TM PCR Πραγματικού χρόνου. Η ανάλυση των δεδομένων έγινε χρησιμοποιώντας το ηλεκτρονικό SABiosciences PCR ανάλυση των δεδομένων συστοιχίας, όπως περιγράφεται στο πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

σφαιροειδές κύτταρα, διαφοροποιημένα κύτταρα σφαιροειδές, ή πρωτογενή κύτταρα όγκου τοποθετήθηκαν σε άνευ ΚΝΑάσης μικροσωλήνες. Η εκχύλιση του ολικού RNA και την αντίστροφη μεταγραφή έγιναν με RNAiso Plus και ένα κιτ Αντίστροφη Μεταγραφή Mix (Takala), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ολικό RNA (0.5 μ§) μεταγράφηκε αντιστράφηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ σύνθεσης cDNA (Bio-Rad). Real-time PCR αντιδράσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ένα CFX96 Real-Time Σύστημα Ανίχνευσης PCR (Bio-Rad). Κάθε δείγμα cDNA ελέγχθηκε εις τριπλούν. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό αλλαγών γονιδιακής έκφρασης, η μέθοδος △△ Ct χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό σχετική πολλαπλών μεταβολών μετά την ομαλοποίηση στο

Actb

(β-ακτίνη) επίπεδα mRNA. Οι αλληλουχίες εκκινητή RT-PCR ειδική γονιδιακή φαίνονται στον Πίνακα S1.

εκχύλιση πρωτεϊνών και ανάλυση κηλιδώσεως Western

Τα κύτταρα λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης κυττάρου (Beyotime) που περιελάμβανε έναν κατάλληλο όγκο του α κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche). Σύνολο πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και μετά μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη φθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Milipore, USA). Μη ειδικές θέσεις σύνδεσης αποκλείστηκαν με 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε TBST σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Μετά από ανίχνευση με πρωτεύοντα αντισώματα, οι μεμβράνες επωάστηκαν με υπεροξειδάση αρμορακίας-συνδεδεμένη αντισώματα αντι-κουνελιού (Cell Signaling Technologies, Danvers, ΜΑ) και στη συνέχεια πλένονται. Τα δεσμευμένα αντισώματα οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ενισχυμένο κιτ ανίχνευσης χημειοφωταύγειας (Amersham). Τα πρωτογενή αντισώματα ήταν: αντι-YAP, αντι-Oct-4, αντι-Notch-1, αντι-ακτίνης, το σύνολο των οποίων ήταν από τη Cell Signaling Technology. Ένα αντι-TEAD1 (1:1000? 5.178 – 1) αντίσωμα ήταν από Epitomics. Anti-TEAD2 (1:1000? LS-C119063) και αντι-TEAD3 (1:1000? LS-C30406) αντισώματα ήταν από την διάρκεια ζωής των Βιοεπιστημών. Anti-TEAD4 (1:1000? Ab97460) αντίσωμα ήταν από Abcam. Οι πρωτεΐνες έγιναν ορατές χρησιμοποιώντας ένα Dura σήμα υπέρ Υπόστρωμα (Millipore, USA).

Στατιστική ανάλυση

Όλες οι δοκιμασίες έγιναν εις τριπλούν. λογισμικού GraphPad Prism (GraphPad Prism, San Diego, CA) χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση των αποτελεσμάτων της ομάδας από Chi-square τεστ ή ANOVA, ανάλογα με την περίπτωση. Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές για την P & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Ο καρκίνος των ωοθηκών ξεκινήσει σφαίρες έχουν ιδιότητες κατά του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων

Πρωτογενή κύτταρα καρκίνου των ωοθηκών διαχωρίστηκαν και τοποθετήθηκαν σε φιάλες χωρίς επικάλυψη πολιτισμού στην μέσο άνευ ορού συμπληρωμένο με EGF, FGF-b, ινσουλίνη, και BSA. Μετά από μία εβδομάδα σε καλλιέργεια, μη-προσκολλημένα σφαιρικά συσσωματώματα κυττάρων παρατηρήθηκαν στον πυθμένα αυτών των φιαλών. Σε ένα μήνα αργότερα, σφαίρες με αυξημένη μεγέθη ήταν σαφώς παρατηρήθηκαν (Εικ. 1Α). Συνήθως 5 × 10

6~1 × 10

7 πέψη κύτταρα ξενομόσχευμα τέθηκαν σε πολιτισμό, και περίπου 2-4% από αυτούς μετατράπηκαν σε OCICs υπό τις προϋποθέσεις στερούνται ορού. Real-time RT-PCR και κηλίδωση Western αποτελέσματα έδειξαν ότι οι δείκτες αρχέγονων κυττάρων ΥΧΕ-4, SOX-2, νεστίνη, Notch-1, και Nanog ήταν όλα πολύ που εκφράζονται από αυτά τα κύτταρα σε σφαίρες (Εικ. 1Β).

Α: Εικόνες των μη προσφυόμενων σφαιρικών συστάδων κυττάρων που προέρχονται από καλλιεργημένα πρωτογενή καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Ράβδοι κλίμακας = 100 μΜ. Β: κηλίδωση Western και σε πραγματικό χρόνο τα αποτελέσματα RT-PCR που δείχνει ενισχυμένη έκφραση των υποδεικνυόμενων γονιδίων σε OCICs. Σχετικά επίπεδα mRNA προσδιορίστηκαν με ομαλοποίηση σε ενδογενή επίπεδα του mRNA β-ακτίνης (που χρησιμοποιείται ως ένας εσωτερικός έλεγχος) με χρήση του Microsoft Excel. Για κάθε υποδεικνύεται γονίδιο, το σχετικό επίπεδο μεταγραφής του (αριστερή γραμμή του κάθε γραφήματος) δείγμα ελέγχου ορίστηκε σε 1. Τα σχετικά επίπεδα μεταγραφήματος από άλλα δείγματα συγκρίθηκαν με τον έλεγχο, και είναι πτυσσόμενα αλλαγές που φαίνονται στο γράφημα. C-D: Εκπρόσωπος αποτελέσματα χρώση ανοσοφθορισμού για την έκφραση CA125, CK7, CD44 και CD117 σε αδιαφοροποίητα και διαφοροποιημένα OCICs. Οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI. Κλίμακα bar = 100 μΜ για όλα τα πάνελ.

Η

Στη συνέχεια, ερευνήσαμε αν αυτά τα σφαίρα κύτταρα είχαν αγκύρωση-ανεξάρτητο αυτο-ανανέωση. Καλλιεργήσαμε σφαιροειδή επί 14 ημέρες υπό συνθήκες διαφοροποίησης (παράγοντες ανάπτυξης αποσύρεται και μέσο που περιείχε 10% FBS). Τα κύτταρα σφαιροειδές άλλαξε από επιπλέοντα κύτταρα για προσκολλημένα κύτταρα, απέκτησε επιθηλιακή μορφολογία, και σχηματίζεται CA125 και CK-7-θετικά συμμετρική αποικίες (Εικ. 1 C). (CA125 και CK-7 είναι καθιερωμένες δεικτών κυτταρικής επιφάνειας των διαφοροποιημένων επιθηλιακών καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών.) Επιπλέον, οι προηγουμένως αναφερθείσες κυτταρικής επιφάνειας δείκτες ωοθηκών επιθηλιακών βλαστικών κυττάρων, CD44 και CD117, εκφράστηκαν σε πολύ υψηλότερα επίπεδα σε κύτταρα σφαίρα σε σχέση με το διαφοροποιημένα επίπεδα κύτταρα (εικόνα 1δ).

σφαίρα που σχηματίζουν τα κύτταρα είναι έντονα ογκογόνο

Εμείς εξέτασε κατά πόσον αυτές προσδιορίζονται κύτταρα σχηματισμού σφαίρας ήταν τόσο έντονα ογκογόνο και άλλων αναφέρθηκε επιθηλιακού καρκίνου έναρξη κύτταρα. Συγκρίσιμα αριθμούς κυττάρων σφαίρας και κύτταρα ελέγχου εγχύθηκαν υποδορίως στα πλευρά γυμνών ποντικών. Σε δύο εβδομάδες αργότερα, οι όγκοι βρέθηκαν σε τρεις από τις τέσσερις αθυμικών γυμνών ποντικών που είχαν ενεθεί με 10

4 κύτταρα σφαίρα. Ωστόσο, οι όγκοι δεν βρέθηκαν σε ποντίκια που είχαν ενεθεί με διαφοροποιημένα κύτταρα όγκου ωοθήκης, ακόμη και σε 10

5 κύτταρα ανά ενοφθαλμισμό (Εικ. 2Α). Η συγκέντρωση των κυττάρων φαίνεται στο Σχ. 2Α είναι 10

4 ανά ποντίκια και άλλες συγκεντρώσεις αποτελέσματα δεν έχουν δείξει

Α:. Εικόνες άτριχων ποντικών που δείχνει ξενομόσχευμα σχηματισμό των ωοθηκών όγκου μετά την έγχυση OCIC σφαίρες. Οι συγκεντρώσεις κυττάρων χρησιμοποιήθηκαν 10

4 σε κάθε ομάδα. Β: Η &? Ε αποτελέσματα χρώσης που δείχνει την ιστολογία όγκων που προέρχονται από υποδορίως μεταμοσχευθεί OCIC σφαιροειδή. Γ: Αποτελέσματα Εκπρόσωπος IHC για CA125 και έκφραση YAP σε ανθρώπινους όγκους ξενομοσχεύματος που προέρχεται από OCICs. Ειδικά έκφραση πρωτεΐνης υποδεικνύεται από το καφέ χρώμα και οι πυρήνες (μπλε) βάφτηκαν αντίθετα με DAPI. D: Αποτελέσματα Αντιπροσωπευτικά IHC για την έκφραση των δεικτών πλειοδυναμίας Oct4, SOX2, και Nanog σε όγκους των ωοθηκών ξενομοσχεύματος που προέρχονται από OCIC σφαιροειδή. Ε: Αποτελέσματα Εκπρόσωπος IHC για την φωσφορυλιωμένη ΑΚΤ και pMAPK (/2 ERK1) έκφραση στους όγκους ξενομοσχεύματος που προέρχονται από OCICs. Κλίμακα ράβδου = 200 μΜ για πάνελ ΒΕ

Η

Η &?.. Ε αποτελέσματα χρώσης έδειξαν ότι οι όγκοι που προέρχονται από τα κύτταρα εγχέονται σχηματισμού σφαίρας είχε μια ιστολογική παρόμοια με εκείνη του Α2780 κυττάρων εγχύθηκε όγκους (Σχήμα 2Β ). Αυτοί οι ιστοί του όγκου εξέφρασαν υψηλά επίπεδα YAP και ήταν θετικά για CA-125, ένα σημειωτή αδενοκαρκίνωμα ωοθηκών (Σχ. 2C). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα κύτταρα σχηματισμού σφαίρας είχαμε είχαν άκρως ογκογονική και θα μπορούσε να διαδοθεί σειριακά στο αρχικό φαινότυπο όγκου τους. Με βάση αυτή ενισχύεται, επαναλήψιμη ογκογονικότητα, έχουμε ορίσει αυτές σχηματισμού σφαίρας κυττάρων των ωοθηκών καρκίνο κύτταρα έναρξης (OCICs), σύμφωνα με την προηγουμένως αποδεκτή ορολογία. Επιπλέον, ανιχνεύσαμε επίσης τους δείκτες αρχέγονων κυττάρων (Oct4, SOX2, και Nanog) έκφραση και τα επίπεδα φωσφορυλίωσης ΑΚΤ /ΜΑΡΚ σε αυτούς τους καρκινικούς ιστούς με διαφορετικό κύτταρο προέλευσης (Σχ. 2D-Ε). Τα αποτελέσματα επίσης έδειξαν ότι τα γονίδια αυτά έχουν υψηλότερα επίπεδα έκφρασης από ότι στους μάρτυρες.

YAP και ΗΣΑΤΚ απαιτούνται για τη διατήρηση OCIC πλειοδυναμία

Μια προηγούμενη έκθεση έδειξε ότι YAP είχε εμπλακεί σε iPS κυττάρων συντήρησης σύμφωνα με αδιαφοροποίητο συνθήκες [14]. Έτσι, η υπόθεση ότι YAP θα μπορούσε επίσης να διατηρούν πλειοδυναμία καρκίνο βλαστικών κυττάρων των ωοθηκών. τα μέλη της οικογένειας YAP και ΗΣΑΤΚ, εκτός από TEAD2, ήταν όλα εκφράζονται σε σημαντικά υψηλότερα επίπεδα από ό, τι OCICs από διαφοροποιημένα κύτταρα καρκίνου των ωοθηκών (Σχ. 3Α-Γ). Επιπλέον, τα επίπεδα mRNA των γνωστών γονιδίων στόχων YAP /ΗΣΑΤΚ, συμπεριλαμβανομένων

Runx2

,

Itgb2

, και

ErbB4

, ήταν όλα σημαντικά αυξημένη στην OCIC κύτταρα, υποδηλώνοντας ότι YAP /δραστηριότητας ΗΣΑΤΚ ήταν υψηλή σε αυτά τα κύτταρα (Σχ. 3D). Αυτά τα αποτελέσματα ήταν σύμφωνα με αυτά σε προηγούμενη έκθεση [27]

AC:. Real-time RT-PCR (Α), χρώση ανοσοφθορισμού (Β), και κηλίδωση Western (C) αποτελέσματα για YAP και TEAD1- 4 επίπεδα έκφρασης σε πρωτογενή καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών (έλεγχος) και OCICs. Οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI. D: Real-time RT-PCR αποτελέσματα για τα επίπεδα mRNA γνωστών γονιδίων στόχων YAP /ΗΣΑΤΚ, συμπεριλαμβανομένων των

Runx2

,

Itgb2

, και

ErbB4

, σε πρωτοπαθή καρκίνο των ωοθηκών κύτταρα (έλεγχος) και OCIC κύτταρα. EF:. Real-time RT-PCR αποτελέσματα για τη βελτίωση της αποτελεσματικότητας εξάντληση RNAi της YAP, TEAD1, TEAD3 και TEAD4, μετά τη χρήση δύο διαφορετικών Τα siRNAs για κάθε γονίδιο

Η

Για να διερευνηθεί εάν YAP και ΗΣΑΤΚ τα μέλη της οικογένειας συμμετείχαν στη διατήρηση OCIC πλειοδυναμίας, εμείς νοκ-κάτω

Yap

και

Tead1 /3.4

έκφραση σε OCICs χρησιμοποιώντας τα siRNAs. RT-PCR αποτελέσματα επιβεβαίωσαν τα knock-down της αποτελεσματικότητας του υποδεικνύεται Τα siRNAs (Σχ. 3Ε-F). Ανοσοφθορισμού αποτελέσματα χρώσης έδειξαν ότι Οκτώβριος-4 έκφραση ήταν ασθενέστερη σε shYAP και shTEAD αντιμετωπίζονται OCICs σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου (Εικ. 4Α). Εκτός από την ΥΧΕ 4, η έκφραση άλλων δεικτών βλαστικών κυττάρων »είχε επίσης μειωθεί, όπως προσδιορίζεται με RT-PCR και κηλίδωση Western (Σχ. 4Β-C). Σε μια δοκιμασία σχηματισμού clony, όταν τα κύτταρα σχηματισμού σφαίρας υποβλήθηκαν σε θεραπεία με το

Yap

shRNA, τα σφαιροειδή ήταν μικρότερες (Εικ. 4D). Παρόμοιες μορφολογικές αλλαγές παρατηρήθηκαν επίσης για sh

Tead1 /3/4 για

κατεργασμένα OCICs (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ένα YAP /ΗΣΑΤΚ συν-ενεργοποιητής που απαιτούνται για τη διατήρηση OCIC πλειοδυναμία

Α:. Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα χρώση ανοσοφθορισμού για Οκτώβριος-4 έκφραση σε

Yap

– και

Tead1 /3/4

-silenced OCICs. BC: Real-time RT-PCR (Β) και κηλίδωση Western (C) τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι αναγραφόμενες γονίδια κάτω-ρυθμίζονται σε OCICs μετά την εξάντληση RNAi του

Yap

και

Tead1 /3/4

. D: Εικόνες OCIC σφαιρικές συστάδες χωρίς (επάνω πάνελ) και με (κάτω πάνελ) sh

Yap

-Θεραπεία από 200 φορές μεγέθυνση

Η

YAP-ΗΣΑΤΚ προσδίδει χημειοαντοχή να. OCICs

Μια ιδιότητα των βλαστικών κυττάρων του καρκίνου είναι η αντοχή τους σε συμβατικούς παράγοντες χημειοθεραπείας. Έτσι, προσδιορίζεται η ευαισθησία OCICs »στη σισπλατίνη, ταξόλη, και βλεομυκίνη θεραπείες. Πρωτογενή κύτταρα όγκου παρουσίασαν ευαισθησίες σε αυτά τα χημειοθεραπευτικά φάρμακα με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 5Α). Σε σύγκριση με κύτταρα πρωτογενούς όγκου, OCICs παρουσίασαν αυξημένη αντοχή στη σισπλατίνη, ταξόλη, και βλεομυκίνη (Εικ. 5Α). Ωστόσο, OCICs με

Yap

και

Tead1 /03.04

νοκ ντάουν είχαν μειωμένα ποσοστά επιβίωσης (Εικ. 5Β). Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν την υπόθεση ότι YAP-ΗΣΑΤΚ ενίσχυσε την αντοχή φαρμάκου των βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν στον καρκίνο των ωοθηκών.

A. Τα ποσοστά επιβίωσης των πρωτογενών καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών (έλεγχος) και OCICs μετά από θεραπεία με σισπλατίνη (CDDP), ταξόλη, ή βλεομυκίνη στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις. OCICs και κύτταρα ελέγχου υποβλήθηκαν σε θεραπεία με φάρμακα για 48 ώρες. *, Ρ & lt? 0,01, σε σύγκριση με την αντίστοιχη ομάδα ελέγχου. **, Ρ & lt? 0.001, σε σύγκριση με την αντίστοιχη ομάδα ελέγχου. B. Ποσοστά επιβίωσης του OCICs με ή χωρίς

Yap

και

Tead1 /3/4 για

knockdown μετά τη θεραπεία με CDDP, ταξόλη, ή βλεομυκίνη στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 48 ώρες. ns, δεν είναι σημαντική? *, P & lt? 0,01? ** P & lt? 0.001. C-D: Σε πραγματικό χρόνο αποτελέσματα RT-PCR δείχνει ότι οι αναγραφόμενες γονίδια εκφράστηκαν σε OCICs σε υψηλότερα επίπεδα από ό, τι στην πρωτοβάθμια ωοθηκικών καρκινικών κυττάρων (C). επίπεδα έκφρασης αναφέρεται γονιδίων »στην OCICs ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται με

Yap

και

Tead1 /3.4

RNAi (D). *, P & lt? 0,01? ** P & lt? 0.001. Ε κηλίδωση Western αποτελέσματα για τα επίπεδα ΑΚΤ και ρΑΚΤ σε OCICs με ή χωρίς

Yap /Tead1 /4.3

shRNA θεραπεία.

Η

YAP up-ρυθμίζει GSK3A και την έκφραση ABCB1 για την ενίσχυση της αντοχή στα φάρμακα OCICs »

για τον προσδιορισμό των γονιδίων ανθεκτικών στα φάρμακα που εμπλέκονται στη ρύθμιση OCICs, χρησιμοποιήσαμε την ανάλυση του γονιδίου μικροσυστοιχιών ανθεκτικών στα φάρμακα για OCICs και εντόπισε πολλαπλές υποθετική γονίδια χημειοαντίσταση που σχετίζονται με τα οποία εκφράζεται έντονα σε OCICs. Ένα πίνακα σύνοψη των ευρημάτων μικροσυστοιχιών τους με τις αντίστοιχες μεταβολές φορές δόθηκαν στον Πίνακα S1. Το φάρμακο-αντίσταση σχετίζονται γονίδια ABCB1, ABCC1 GSK3A, είχαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα έκφρασης σε OCICs ό, τι σε πρωτογενή καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών (Σχ. 5C). Ερευνήσαμε περαιτέρω, εάν αυτά τα γονίδια που ρυθμίζονται από YAP-TEADs στην OCICs. Μεταξύ αυτών των γονιδίων, ABCB1 και GSK3A ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε

Yap /ΗΣΑΤΚ

-depleted OCICs, ενώ ABCC1 έκφραση δεν επηρεάστηκε σημαντικά (Εικ. 5D).

Επιπλέον,

Gsk3a

,

Gsk3b,

και

έκφραση p53

γονιδίου ανιχνεύθηκε επίσης σε OCICs (Εικ. 5C). Μεταξύ αυτών,

Gsk3a

και

p53

ήταν εντυπωσιακά κάτω-ρυθμίζονται σε

Yap /ΗΣΑΤΚ

-depleted OCICs και

Gsk3b

αλλάξει ελάχιστα (Εικ. 5D ). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι YAP και TEADs αυξημένη αντίσταση στο φάρμακο OCICs »από πάνω και κάτω ρύθμισης των εν λόγω γονιδίων που εμπλέκονται στο μεταβολισμό των φαρμάκων και την επιβίωση των κυττάρων.

Το μονοπάτι σηματοδότησης ΡΙ3Κ είναι γνωστό να συνεργαστεί με το μονοπάτι Hippo να ρυθμίσουν κυτταρική ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό [28]. Φωσφορυλιωμένη επίπεδα AKT ήταν υψηλά στην OCICs και μειωμένη με τις

Yap

και /ή

Tead1 /4.3

εξάντληση. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα συνολικά επίπεδα AKT ήταν επίσης προς τα κάτω σε

Yap /Tead1 /3.4

συν-εξαντλημένο OCICs. Τα αποτελέσματα έδειξαν επίσης ότι YAP /TEADs ήταν απαραίτητα για τη διατήρηση της PI3K δραστηριότητα μονοπάτι /ΑΚΤ στον OCICs (Σχ. 5Ε).

Τα γονίδια ΜΑΡΚ μονοπάτι που εμπλέκονται στην YAP διατηρείται OCIC πλειοδυναμία

Τα αποτελέσματα της qPCR ανάλυση μικροσυστοιχιών (Πίνακας S2) έδειξε ότι πολλά γονίδια που εμπλέκονται σε μονοπάτια ΜΑΡΚ, συμπεριλαμβανομένων των

c-Fos

,

EGFR

, και

Igf2r

, είχαν υψηλότερα επίπεδα έκφρασης σε OCICs ό, τι σε πρωτογενή καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών (Σχ. 6Α). έκφρασή τους ήταν κάτω-ρυθμίζονται μετά από

Yap

και

Tead1 /03.04

shRNA θεραπεία (Εικ. 6Β). Επειδή c-Jun και c-fos σχηματίζουν το συγκρότημα και τη λειτουργία του ΑΡ-1 μαζί, εξετάσαμε

c-Jun

γονιδιακή έκφραση σε αυτά τα δείγματα και βρέθηκαν παρόμοια αποτελέσματα (Σχ. 6Α-Β). Η

EGFR

και

Igf2r

γονίδια κωδικοποιούν για τον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) και ινσουλίνη αυξητικού παράγοντα 2 υποδοχέα (IGF2R), αντίστοιχα. Αυτά είναι σημαντικά υποδοχείς κυτταρικής μεμβράνης που μεταδίδουν κλειδί εξωκυτταρικά σήματα προς τον πυρήνα με την ενεργοποίηση καταρρακτών κινάσης ΜΑΡ. Η φωσφορυλιωμένη και ενεργοποιημένα ΜΑΡ κινασών μετατοπίζονται από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα να μεσολαβήσει c-fos και την ενεργοποίηση της μεταγραφής c-jun. Μερικές μελέτες έδειξαν ότι YAP ρυθμιζόμενα γονίδια ΗΣΑΤΚ την πλειορύθμιση ο

Areg

γονίδιο, το οποίο αλληλεπιδρά με τον υποδοχέα /ΤΟΡ-α EGF για την προώθηση της ανάπτυξης των φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα [29], [30]. Έτσι, τα αποτελέσματα μας πρότειναν ότι αυτά τα γονίδια σε μονοπάτια ΜΑΡΚ μπορεί να εμπλέκεται στην YAP διατηρείται OCIC πλειοδυναμίας.

A. Αποτελέσματα σε πραγματικό χρόνο RT-PCR δείχνει ότι οι αναγραφόμενες γονίδια εκφράστηκαν σε OCICs σε υψηλότερα επίπεδα από ό, τι στην πρωτοβάθμια ωοθηκικών καρκινικών κυττάρων (ελέγχου). Β πραγματικό χρόνο αποτελέσματα RT-PCR που δείχνουν ότι τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων έδειξε »ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε OCICs με

Yap

/

Tead1 /04.03

RNAi.

Συζήτηση

όγκων εμφάνιση και την εξέλιξη είναι στενά συνδεδεμένα με ανώμαλη ανάπτυξη των σωματικών κυττάρων και τη διαφοροποίηση. Υπάρχουν μικροί αριθμοί συγκεκριμένων κυττάρων ή των λεγόμενων βλαστοκυττάρων στο σώμα μας περιλαμβάνονται ωοθηκικού ιστού που είναι ικανά να αυτο-ανανέωσης και κατευθυνόμενη διαφοροποίηση [31] – [33]. Ως μέρος αυτών των κυττάρων, ο καρκίνος του βλαστικά κύτταρα έχουν προσελκύσει πρόσφατα την προσοχή. Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι ένα πολύ μικρότερο πληθυσμό αρχέγονων κυττάρων του καρκίνου πράγματι υπήρχαν σε ορισμένους ιστούς καρκίνου, η οποία ξεκίνησε την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και ήταν συνδεδεμένος με βλαστικών κυττάρων συντήρηση ακινήτων, ογκογένεση, κακοήθη μετάσταση, και την επανάληψη [34]. Καρκίνος βλαστικά κύτταρα έχουν πολλά σημαντικά χαρακτηριστικά, που περιλαμβάνονται κλώνος ικανότητα σχηματισμού, την έκφραση των δεικτών των βλαστικών κυττάρων και ειδικούς δείκτες κυτταρικής επιφάνειας, κυτταρική διαφοροποίηση και μορφολογική ταυτοποίηση, και ισχυρή ογκογόνο ικανότητα.

Σε αυτή τη μελέτη, απομονώσαμε επιτυχώς ωοθηκών καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν από ποντίκια που φέρουν όγκο και απέδειξαν ότι αυτά τα κύτταρα είχαν τα χαρακτηριστικά του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων που περιγράφονται παραπάνω. Μετά από περίπου ένα μήνα σε καλλιέργεια, OCICs σχηματίζονται συστάδες που περιείχε πολυάριθμες κύτταρα και είχαν διαμέτρους έως 500 μm. OCICs όχι μόνο είχε ισχυρή κλωνογονικού ικανότητα, αλλά εξέφρασε επίσης δείκτες των κυττάρων του καρκίνου του στελέχους σε υψηλά επίπεδα. Αποτελέσματα διαφοροποίηση κυττάρων έδειξε ότι τα σφαιροειδή απομονώσαμε πράγματι είχε τα χαρακτηριστικά του επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών. Τα ογκογόνα ποσοστά αυτών των OCICs ήταν σημαντικά υψηλότερες από αυτές των πρωτογενών καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών και τα δεδομένα αυτά δεν έχει δειχθεί στο Σχήμα 2.

Πολλά μονοπάτια σηματοδότησης, όπως η Wnt, ΡΙ3Κ, ΜΑΡΚ μονοπάτια σηματοδότησης, υπήρξαν αναφερθεί να σχετίζεται στενά με βλαστικά κύτταρα και το μονοπάτι Hippo [18], [19]. Το μονοπάτι Hippo έχει επίσης λάβει ιδιαίτερη προσοχή όσον αφορά την αναχαίτιση των μηχανισμών ρύθμισης των κυττάρων και την καρκινογένεση [23], [35], [36]. Μερικές μελέτες δείχνουν ότι το γονίδιο YAP ρυθμίζεται επιθηλιακών επισκευή βλαστικών κυττάρων και εντερική βλαστικών κυττάρων και τη λειτουργία αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων [37] – [40]. κύτταρα και δραστηριότητα όγκου-πολλαπλασιαστικό συνέβαλαν στην εξέλιξη του όγκου του πνεύμονα και τη μετάσταση σε CD24-εξαρτώμενη και Yap /Taz-dependent pathways [41]. YAP ανεστάλη με κατενίνης κατά τη διάρκεια του κυτταρικού πολλαπλασιασμού επιδερμικών αρχέγονων και την ανάπτυξη του καρκίνου του δέρματος μέσω του μονοπατιού Wnt σήμα [42]. Σε αντίθεση, YAP περιορίζεται σήματα Wnt κατά την διάρκεια της εντερικής αναγέννηση. Στη μελέτη μας, τα επίπεδα φωσφορυλίωσης ΑΚΤ και ΜΑΡΚ ήταν δραματικά υψηλότερη έκφραση όχι μόνο στην OCIC ιστούς όγκων αλλά επίσης και σε OCICs.

Τα διαγονιδιακά έκφραση της YAP μειωμένη έκφραση του γονιδίου-στόχου Wnt και είχε ως αποτέλεσμα την ταχεία απώλεια των εντερικών κρυπτών. Επιπλέον, μια απώλεια YAP σαν αποτέλεσμα υπερπλασία και την επέκταση των εντερικών βλαστικά κύτταρα (διυπηρεσιακών διαβουλεύσεων) και εξειδικευμένες κύτταρα [38].