Αφηρημένο

Ιστορικό

Σήμερα, είναι καλά Διαπιστώθηκε ότι ο καρκίνος προκύπτει σε χρόνια φλεγμονή των ιστών. Ένας αριθμός NOD-σαν υποδοχείς (ΕΜΑΜ) μορφή inflammasomes, ενδοκυτταρική πολυπρωτεϊνικό σύμπλοκα κρίσιμη για την παραγωγή ώριμων προ-φλεγμονώδεις κυτοκίνες (IL-1β και IL-18). Ως χρόνια φλεγμονή του γαστρικού βλεννογόνου είναι συνέπεια του

Helicobacter pylori

λοίμωξη, διερευνήσαμε το ρόλο των γενετικών πολυμορφισμών και έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στην οδό σηματοδότησης NLR σε

H. pylori

μόλυνσης και των σχετικών γαστρικού καρκίνου (GC).

Υλικά και Μέθοδοι

Πενήντα ένα γενετικών πολυμορφισμών γονότυπος σε 310 κινεζικής καταγωγής (87 περιπτώσεις GC μη-καρδιακή και 223 ελέγχους με λειτουργική δυσπεψία). Επιπλέον, η γονιδιακή έκφραση του 84 μόρια που εμπλέκονται στην οδό σηματοδότησης NLR αξιολογήθηκε σε ΤΗΡ-1 κύτταρα προκλήθηκαν με δυο

H. pylori s

τρένα, GC026 (GC) και 26695 (γαστρίτιδα).

Αποτελέσματα

CARD8

-rs11672725,

NLRP3

-rs10754558,

NLRP3

-rs4612666,

NLRP12

-rs199475867 και

NLRX1

-rs10790286 έδειξε σημαντικές συσχετίσεις με GC. Στην πολυπαραγοντική ανάλυση,

CARD8

-rs11672725 παρέμεινε ένα παράγοντα κινδύνου (OR: 4,80, 95% CI: 1,39 – 16,58). Περαιτέρω,

NLRP12-

rs2866112 αυξάνει τον κίνδυνο του

H. πυλωρού

λοίμωξη (OR: 2,13, 95% CI: 1,22 – 3,71). αναλύσεις στατιστική εκτίμηση του κοινού επίδραση του

H. pylori

μόλυνση και τα επιλεγμένα πολυμορφισμοί αποκάλυψε ισχυρές ενώσεις με GC (

CARD8

,

NLRP3

,

CASP1

και

NLRP12

πολυμορφισμοί). Σε αναλύσεις της γονιδιακής έκφρασης, πέντε γονίδια που κωδικοποιούν ΕΜΑΜ ήταν σημαντικά ρυθμίζονται

H. pylori

-challenged κύτταρα (

NLRC4

,

NLRC5

,

NLRP9

,

NLRP12

και

NLRX1

). Είναι ενδιαφέρον, επίμονη up-ρύθμιση του

NFKB1

με ταυτόχρονη ρύθμιση προς τα κάτω των

NLRP12

και

NLRX1

παρατηρήθηκε σε

H. pylori

GC026-πρόκληση κύτταρα. Περαιτέρω, ο ΝΡ-κΒ γονιδίων στόχων που κωδικοποιούν προ-φλεγμονωδών κυτοκινών, χημειοκινών και μορίων που εμπλέκονται στην καρκινογένεση ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε

H. pylori

GC026-πρόκληση κύτταρα.

Συμπεράσματα

Μυθιστόρημα συσχετίσεις μεταξύ πολυμορφισμών στην οδό σηματοδότησης NLR (

CARD8

,

NLRP3

,

NLRP12

,

NLRX1

, και

CASP1

) και GC προσδιορίστηκαν σε Κινέζους ιδιώτες. γενετικών πολυμορφισμών μας και τα αποτελέσματα της γονιδιακής έκφρασης τονίζουν τη σημασία του μονοπατιού σηματοδότησης NLR στη γαστρική καρκινογένεση και στενή αλληλεπίδραση με NF-κΒ

Παράθεση:. Καστάνο-Rodríguez Ν, Kaakoush ΟΧΙ, Goh KL, Fock KM, Μίτσελ HM (2014) Το NOD-Όπως Receptor σηματοδότηση Διαδρομή στο

Helicobacter pylori

Λοίμωξη και σχετίζονται με τον καρκίνο του γαστρικού: A case-control μελέτη και αναλύσεις γονιδιακής έκφρασης. PLoS ONE 9 (6): e98899. doi: 10.1371 /journal.pone.0098899

Επιμέλεια: David M. Ojcius, Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια Merced, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2, Μαρ 2014? Αποδεκτές: 8 Μαΐου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 5 Ιουνίου του 2014

Copyright: © 2014 Καστάνο-Rodríguez et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Συμβούλιο Καρκίνου της Νότιας Νέας Ουαλίας, Αυστραλία (Grant No.66 /04). ΌΧΙ. Kaakoush υποστηρίζεται από μια πρώιμη υποτροφία Καριέρας από το Εθνικό Σύστημα Υγείας και του Συμβουλίου Ιατρικής Έρευνας της Αυστραλίας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η συνολική συχνότητα εμφάνισης καρκίνου του στομάχου (GC) κυμαίνεται ευρέως μεταξύ των χωρών. Σύμφωνα με τα παγκόσμια στατιστικά του καρκίνου, συνολικά 952.000 νέες περιπτώσεις GC και 723.000 θάνατοι GC που σχετίζονται εκτιμάται ότι συνέβη το 2012, αντιπροσωπεύοντας το 6,8% του συνόλου των περιπτώσεων καρκίνου και 8,8% του συνόλου του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους [1]. Πάνω από το 70% των νέων κρουσμάτων και των θανάτων συμβαίνουν στις αναπτυσσόμενες χώρες, με τα υψηλότερα ποσοστά επίπτωσης που αναφέρθηκαν στην Ανατολική Ασία, την Ανατολική Ευρώπη και την Κεντρική και Νότια Αμερική [2].

Το παθογόνο βακτήριο

ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού

αποτελεί ουσιαστικό αιτιολογικός παράγοντας για GC (IARC, 1994), ωστόσο, οι προηγούμενες μελέτες δείχνουν ότι εκτός από την

H. pylori

μόλυνση και διατροφικούς παράγοντες, η γενετική υποδοχής συμβάλλει στην GC [3]. Γενετικοί πολυμορφισμοί έχουν αναδειχθεί τα τελευταία χρόνια ως καθοριστικοί παράγοντες της ευαισθησίας και η σοβαρότητα της νόσου, η οποία είναι ιδιαίτερα αληθές στο γαστρεντερικό κακοήθειας [4]. Ως εκ τούτου, πολυμορφισμοί εντός γονίδια που εμπλέκονται στην έμφυτη και προσαρμοστική ανοσία θα μπορούσε να διαδραματίσει ένα σημαντικό ρόλο στην παθογένεση του

H. pylori

μόλυνση και την ανάπτυξη του

H. pylori

-σχετικών επιπλοκών συμπεριλαμβανομένων GC.

Germ-line κωδικοποιούνται υποδοχείς γνωστή ως υποδοχείς αναγνώρισης προτύπων (PRRs) αποτελούν μέρος του έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος και είναι κομβικής σημασίας για την ανίχνευση της αμετάβλητης μικροβιακών μοτίβα γνωστά ως παθογόνο -associated μοριακών μοντέλων (PAMPs). Οι PRRs έχουν χωριστεί σε πέντε διακριτές γενετικές και λειτουργικές κλάδοι: νουκλεοτίδιο-πεδίο σύνδεσης ολιγομερισμού (NOD) προσομοιαζόντων υποδοχέων (ΕΜΑΜ), ΤοΙΙ υποδοχείς, υποδοχείς λεκτίνης τύπου C, γονίδιο ρετινοϊκού οξέος που επάγεται (RIG) -I-σαν υποδοχείς και απουσιάζει στο μελάνωμα 2 (AIM2) -όπως υποδοχείς [5] [6].

Η οικογένεια NLR όχι μόνο αναγνωρίζουν PAMPs αλλά και ζημίες που σχετίζονται με μοριακές μορφές (αποσβένει) στο κυτταρόπλασμα, τα οποία είναι ενδογενείς συνδέτες που παράγονται μετά από τραυματισμό ιστού ή κυτταρικό θάνατο [7]. Το ΕΜΑΜ χαρακτηριστική δομή περιλαμβάνει ένα κεντρικό πεδίο νουκλεοτιδίου δέσμευσης και ολιγομερισμού (NACHT) η οποία είναι παρούσα σε όλα τα μέλη της οικογένειας NLR, ένα C-τερματικό πλούσιες σε λευκίνη επαναλήψεις (LRRs) και ένα Ν-τερματικό πρόσληψη κασπάσης (CARD) ή pyrin (PYD ) τομέα. Με βάση την φυλογενετική ανάλυση των NACHT τομείς, διαπιστώθηκε ότι η οικογένεια NLR περιλαμβάνει τρεις υπο-οικογένειες: 1) η οικογένεια NOD που περιλαμβάνει NOD1-2, NOD 3 /NLRC3, NOD4 /NLRC5, NOD5 /NLRX1 και CIITA, 2) οι NLRPs συμπεριλαμβανομένων NLRP1-14 (επίσης γνωστή ως NALPs), και 3) η υποοικογένεια IPAF το οποίο αποτελείται από IPAF (NLRC4) και ΝΑΙΡ [7]. Η inflammasome NLRP3, η πιο πλήρως χαρακτηριζόμενη inflammasome, αποτελείται από την πρωτεΐνη ικριώματος NLRP3, το απόπτωση σχετίζεται κόκκος-σαν πρωτεΐνη (ASC) και κασπάσης-1. NLRP3 αλληλεπιδρά και στρατολογεί το ASC προσαρμογέα μέσω PYD-PYD αλληλεπίδραση [8]. Αυτή η αλληλεπίδραση οδηγεί στην πρόσληψη της κασπάσης-1, ένα ενδοκυτταρικό ασπαρτικό πρωτεάση ειδική κυστεΐνη, η οποία στη συνέχεια θα οδηγούσε στην ωρίμανση και την απελευθέρωση των προφλεγμονωδών κυτοκινών όπως η IL-1β και IL-18.

H. pylori

μόλυνση, τα πρώτα τέσσερα φυσικοχημικές εμπόδια είναι το στρώμα βλέννης, γαστρικό επιθηλιακά κύτταρα, τα TLRs και οι ΕΜΑΜ. Ένας περιορισμένος αριθμός μελετών έχει αξιολογηθεί η αλληλεπίδραση μεταξύ του μονοπατιού σηματοδότησης NLR και

H. pylori

. Για παράδειγμα, μια αρχική μελέτη από Basak et al. [9] έδειξε ότι όχι μόνο

H. pylori

λιποπολυσακχαρίτη (LPS) ενεργοποιεί κασπάση-1, αλλά ότι αυτή η ενεργοποίηση της κασπάσης-1 εμπλέκεται στην επαγόμενη από LPS IL-1β ωρίμανση. Αργότερα, Χίτζλερ et al. [10] έδειξε ότι

H. pylori

μόλυνση ενεργοποιεί κασπάση-1, οδηγώντας σε IL-1β /IL-18 επεξεργασία και έκκριση, τόσο σε καλλιεργημένα δενδριτικά κύτταρα (DCs) και

in vivo

. Σταθερά, δύο πρόσφατες μελέτες, χρησιμοποιώντας ανθρώπινα γαστρικά κυτταρικές γραμμές, επιβεβαίωσε αυξημένη έκφραση της κασπάσης-1, IL-1β και IL-18 σε

H. pylori

μολυνθέντα κύτταρα [11], [12]. Επιπλέον, μια πρόσφατη μελέτη από Kim et al. [13] έδειξε ότι η έκκριση της IL-1β με DCs έχουν μολυνθεί με

H. pylori

απαιτεί TLR2, NOD2 και το inflammasome NLRP3.

Ως εκ τούτου, οι προηγούμενες μελέτες δείχνουν σαφώς ότι, σε απάντηση

H. pylori

, inflammasome εξαρτώμενη ενεργοποίηση της κασπάσης-1 είναι κρίσιμη για την παραγωγή ώριμων προ-φλεγμονώδεις κυτοκίνες που είναι ζωτικής σημασίας για Th1 αποκρίσεις που σχετίζονται με γαστρικό ανοσοπαθολογία. Δεδομένου ότι λίγα είναι γνωστά για τον ρόλο των inflammasomes και άλλα μόρια που εμπλέκονται στην οδό σηματοδότησης NLR σε απόκριση

H. pylori

λοίμωξη, και ότι οι σχετικές λειτουργικώς πολυμορφισμών σε γονίδια αυτού του βραχίονα του ανοσοποιητικού συστήματος έχουν τη δυνατότητα να επηρεάσουν το μέγεθος και την κατεύθυνση της απόκρισης του ξενιστή έναντι της λοίμωξης, διερευνήσαμε το ρόλο του μονοπατιού σηματοδότησης NLR, συμπεριλαμβανομένων inflammasome- συγγενή μόρια, σε ποσοστό

H. pylori

ανάπτυξη-σχετικών GC αξιολογώντας 51 γενετικούς πολυμορφισμούς στα κινεζικά άτομα, ένα γνωστό πληθυσμό υψηλού κινδύνου για GC, και την αντιμετώπιση του γονιδιακή έκφραση των 84 μορίων που εμπλέκονται στην NLR μονοπάτια σηματοδότησης σε μονοκυτταρική γραμμή κυττάρων κατά την έκθεση στο

Η . pylori

.

Υλικά και Μέθοδοι

γονοτυπικός πολυμορφισμών Συμμετέχει στην NOD-όπως δήλωση Receptor σηματοδότηση Pathway

Δεοντολογίας.

Αυτή η μελέτη ήταν που εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ανθρωπίνων Δεοντολογίας (HREC) του Πανεπιστημίου της Νέας Νότιας Ουαλίας (UNSW) (HREC 08115 και HREC 02.144). Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε άτομο που προσλαμβάνονται με τη μελέτη.

Τα άτομα της μελέτης.

Τα υποκείμενα ήταν κινεζικής καταγωγής άτομα που υποβλήθηκαν σε ενδοσκόπηση του άνω γαστρεντερικού στο Γενικό Νοσοκομείο Changi (Σιγκαπούρη) και το Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο της Μαλαισίας (Κουάλα Λουμπούρ), μεταξύ Ιανουαρίου 2004 και Απριλίου 2007. Οι ασθενείς που είναι γνωστό ότι έχουν μολυνθεί με τον ιό της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας ή που είχαν συνταγογραφηθεί μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα, αντι-μικροβιακών παραγόντων ή κατασταλτικά οξύ κατά την περίοδο των δύο μηνών πριν από την πρόσληψη αποκλείστηκαν.

Ογδόντα επτά ασθενείς που διαγνώστηκαν πρόσφατα με ένα πρωτεύον μη καρδιακή GC (Διεθνούς ταξινόμησης των Νόσων, 9

ου αναθεώρηση, κωδικός 151) με βάση την ιστολογική επιβεβαίωση κλήθηκαν να συμμετάσχουν σε η μελέτη. Η ομάδα ελέγχου περιελάμβανε 223 άτομα που έχουν διαγνωσθεί με λειτουργική δυσπεψία (FD), η οποία ορίζεται ως επίμονη ή επαναλαμβανόμενη συμπτώματα (πόνος ή δυσφορία κεντραρισμένη στην άνω κοιλιακή χώρα) σε απουσία οργανικής νόσου (συμπεριλαμβανομένου στο άνω ενδοσκόπηση), σύμφωνα με την Ρώμη ΙΙ σύστημα ταξινόμησης [14].

Helicobacter pylori

ανίχνευσης.

H. pylori

αντισωμάτων IgG σε αυτές Κινέζους ιδιώτες προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα in-house ένζυμο-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία [15] και ανοσοαποτύπωση (ΔΠΠ Helico Blot 2.1, βουλευτής Biomedicals, Αυστραλία).

επιλογή πολυμορφισμοί.

οι ηλεκτρονικές βάσεις δεδομένων (PUBMED, Scopus, Science Direct, Οβίδιος, Biosis Previews, βάσεις δεδομένων Scirus, CINAHL, IMBIOMED, ​​Scielo και πασχαλιές) ερευνήθηκαν μέχρι τον Φεβρουάριο του 2013 για πολυμορφισμούς που εμπλέκονται στην οδό σηματοδότησης NLR που σχετίζονται με τον καρκίνο, μολυσματική ασθένεια ή ήταν λειτουργικά σχετικό. Πενήντα ένα πολυμορφισμούς σε 6 γονίδια, τα οποία αναφέρθηκαν για να έχουν μια μικρή συχνότητα αλληλόμορφο (San Diego, CA , ΗΠΑ) [16], [17] διευκόλυνση της Αυστραλίας Genome Research Ltd, Αγία Λουκία, Πανεπιστήμιο του Queensland, Αυστραλία.

Ένας πολυμορφισμός που δεν θα μπορούσαν να συμπεριληφθούν στην ανάλυση Sequenom MassARRAY Iplex, γνωστή ως

NLRP3-

42 bp-VNTR, ο γονότυπος μέσω τυποποιημένων PCR. Εκκινητές σχεδιάστηκαν με την έκδοση Ολίγο Primer Λογισμικό Ανάλυσης 6,71 (Insights Μοριακής Βιολογίας, Inc? Colorado Springs, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Διεξήχθησαν πειράματα με τη χρήση του 2720 Thermal Cycler (Applied Biosystems? Foster City, USA). Τα προϊόντα PCR υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1.5% και οπτικοποιήθηκαν υπό υπεριώδη ακτινοβολία με τη χρήση του Συστήματος Gel Doc 2000 (Bio-Rad? Hercules, USA). Οι αλληλουχίες του εκκινητή και τις συνθήκες θερμικής ανακύκλωσης για γονότυπων του πολυμορφισμού που περιγράφονται στον Πίνακα S2 στο Πίνακες S1.

Τέσσερις πολυμορφισμών (

CARD8

-rs2043211,

CARD8

-rs6509368 ,

CARD8

-rs12984929 και

NLRP3

-rs10754558) γονότυπου με φασματομετρία μάζας MALDI-TOF επιλέχθηκαν τυχαία για την επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων με τη χρήση πραγματικού χρόνου PCR. Οι αλληλουχίες εκκινητή και συνθήκες θερμικού κύκλου που περιγράφεται στον Πίνακα S2 στους Πίνακες S1. Ως επικύρωση της μεθοδολογίας που εφαρμόζεται για το προσδιορισμό του γονότυπου των

NLRP3-

42 bp-VNTR, αναλύσεις αλληλουχίας διεξήχθησαν σε 10% των τυχαία επιλεγμένων δειγμάτων της μελέτης, στο Ramaciotti Κέντρο, UNSW, Αυστραλία.

Στατιστική ανάλυση.

Το αταίριαστο Φοιτητών

t-test

χρησιμοποιήθηκε για να αναλύσει τα κλινικά χαρακτηριστικά. Η μέθοδος άμεση καταμέτρηση χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθούν οι συχνότητες γονοτύπου και αλληλόμορφο. Απόκλιση από Hardy-Weinberg ισορροπία (HWE) ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας την καλοσύνη-of-fit chi-square test (χ

2). Προσδιορισμός της ανισορροπίας σύνδεσης (LD) βασίστηκε σε δοκιμή αναλογία πιθανότητας με την οποία η σημασία της παρατηρούμενης λόγο πιθανότητας βρίσκεται υπολογίζοντας την μηδενική κατανομή αυτής της αναλογίας υπό την υπόθεση ισορροπίας σύνδεσης, χρησιμοποιώντας μια διαδικασία μετάθεση [18]. Απλότυπου συμπέρασμα πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια του Μεγιστοποίηση Προσδοκία αλγόριθμος (ΕΜ) για multi-locus γονοτυπικά δεδομένα [19]. Οι αναλογίες πιθανοτήτων (OR) και τα διαστήματα εμπιστοσύνης 95% (CI) υπολογίστηκαν με τη βοήθεια της ακριβούς δοκιμής πιθανότητας του Fisher της (δίπλευρη

σ

-τιμές). Προκειμένου να διορθωθούν για συγχυτικούς παράγοντες, μια δυαδική λογιστική παλινδρόμηση (LR) ρυθμίζεται από

H. pylori

κατάσταση και το φύλο έγινε.

P

-τιμές & lt? 0,05 θεωρήθηκαν ως στατιστικά σημαντικές. Φίλτρα ποιότητας για τον αποκλεισμό των πολυμορφισμών από τη στατιστική ανάλυση που περιλαμβάνεται καλέσετε ποσοστά κάτω από 95% και απόκλιση από HWE. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη βοήθεια της έκδοσης προγραμμάτων Arlequin 3.1 [20], GraphPad Prism version 5.02 (GraphPad Software Inc? San Diego, USA) και SPSS έκδοση 19.0.0. (SPSS Inc? Chicago, USA)

γονιδιακή έκφραση των μορίων που συμμετέχουν στον υποδοχέα σηματοδότησης Pathway

καλλιέργειας θηλαστικών κυττάρων NOD-όπως

Η ανθρώπινη μονοκυτταρική λευχαιμία γραμμή ΤΗΡ-1 (κωδικός: ΤΙΒ-202). (American Type Culture Συλλογή? Manassas, USA), καλλιεργήθηκε σε RPMI 1640 μέσο συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο βόειο εμβρυϊκό ορό (FBS) (Invitrogen? Mulgrave, Αυστραλία), 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο (Invitrogen), 2500 mg /L διττανθρακικό νάτριο (Invitrogen ) και διάλυμα 100 μg /mL πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη (Invitrogen). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε 25-cm

2 φιάλες καλλιέργειας ιστού (Greiner-Bio-On? Frickenhausen, Germany).. Στους 37 ° C με 5% CO

2

βακτηριακή καλλιέργεια

Το

H pylori

στέλεχος GC026 (

CagA

+,

Cage

+,

CAGL

+,

cagT

+ ,

Vaca

s1 m1 +,

ΜΠΑΜΠΑ

+,

oipA

+,

DUPA

+ και

Saba

+) απομονώθηκε από ένας ασθενής GC στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο της Μαλαισίας, Κουάλα Λουμπούρ [21], [22]. Η

H. pylori

στέλεχος 26695 (

CagA

+ και

Vaca

s1m1 +) απομονώθηκε από έναν ασθενή με γαστρίτιδα [23] (κωδικός ATCC 700392). Τόσο

H. pylori

στελέχη αναπτύχθηκαν για δύο ημέρες σε τρυβλία άγαρ αίματος αλόγου (Blood Agar Base No.2 συμπληρωμένο με 6% αποστειρωμένο αίμα απινωδογονομένο αλόγου (Oxoid, Heidelberg West, Vic., Australia) στους 37 ° C σε αναερόβιο δοχείο που περιέχει ένα κιτ παραγωγής αερίου (Oxoid) για την παροχή ενός μικροαερόβιο ατμόσφαιρα 6% O

2, 10% CO

2 και 84% Ν

2.

δοκιμασία μόλυνση.

κύτταρα ΤΗΡ-1 σπάρθηκαν σε πλάκα καλλιέργειας 6 φρεατίων σε συγκέντρωση 5 × 10

5 κύτταρα /ml και στη συνέχεια διαφοροποιούνται σε μακροφάγα με οξικό φορβόλης myrastate (Sigma-Aldrich) για 72 ώρες [24]. πριν από την βακτηριακή λοίμωξη, τα κύτταρα των θηλαστικών επωάστηκαν σε μέσο ελεύθερο αντιβιοτικών. η

H. pylori

στελέχη GC026 και 26695 στη συνέχεια προστέθηκαν στο μέσο σε μια πολλαπλότητα μόλυνσης 1 και επωάστηκαν για 6 ώρες στους 37 ° C και

2 5% CO. προστίθεται η βακτηριακή συγκέντρωση προσδιορίστηκε με βάση μια πρότυπη καμπύλη και η οπτική πυκνότητα (OD) στα 595 αναγνώσεις nm χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο αναγνώστη μικροπλακών της Bio-Rad 550 (Bio-Rad). Η πραγματική συγκέντρωση προστιθέμενη επιβεβαιώθηκε μετρώντας μονάδες σχηματισμού αποικιών (CFU) αναπτύχθηκαν σε πλάκες άγαρ αίματος αλόγου μετά σειριακή αραίωση του βακτηριακού εναιωρήματος.

Συστοιχίες

εκχύλιση RNA, cDNA παρασκευή και PCR.

Μετά την λοίμωξη, μη αμφισβήτηση και

H. pylori

-challenged κύτταρα ΤΗΡ-1 χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση του mRNA χρησιμοποιώντας το Qiagen RNeasy Mini Kit όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή (Qiagen). Για την ανάλυση του γονιδίου έκφρασης από 84 μόρια που εμπλέκονται στην οδό σηματοδότησης NLR, cDNA συντέθηκε από 0.8 μg ολικού RNA με τη χρήση της RT

2 First Strand cDNA Kit (Qiagen) και αναλύθηκαν περαιτέρω χρησιμοποιώντας το ανθρώπινο Inflammasome RT

2 Profiler PCR array (PAH-097R) (Qiagen), όπως συνιστάται από τον κατασκευαστή. προφίλ γονιδιακής έκφρασης ελήφθησαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα του

H. pylori

GC026 μολυσμένα,

H. pylori

26695-μολυσμένα και τα αντίστοιχα μη-μολυσμένα (ελέγχου) δείγματα. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το ανακυκλωτή Rotor-Gene Q (Corbett Επιστήμες της Ζωής? Ντόνκαστερ, Αυστραλία).

Για την ανάλυση των δεδομένων γονιδιακής έκφρασης, η ΔΔ Ct-με βάση τη μέθοδο της σχετικής ποσοτικοποίηση υλοποιήθηκε με τη χρήση του Web-based RT

2 Profiler PCR Array Ανάλυση δεδομένων έκδοση 3.5 (https://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php). Τουλάχιστον δύο φορές αλλαγές (≥2, ≤0.5) και

P

-τιμές & lt?. 0.05 θεωρήθηκαν ως στατιστικά σημαντικές

SDS-PAGE και κηλίδωση Western

ΤΗΡ -1 κύτταρα ήταν seeded, διαφοροποιημένα και μολύνθηκαν σε ΜΟΙ 1, όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Οι πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό RIPA, διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα νάτριο ηλεκτροφόρηση πηκτής 12% δωδεκυλ θειικού πολυακρυλαμιδίου, και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδίνιο μεθανόλη-αγωγή με τη χρήση του συστήματος μεταφοράς κύτταρο Trans-blot (Bio-Rad). Οι μεμβράνες ανοσοσημασμένων με κουνελιού αντι-ανθρώπου πολυκλωνικά αντισώματα έναντι NLRX1 (1:200) ή αντι-ανθρώπινα μονοκλωνικά αντισώματα ποντικού έναντι β-ακτίνης (1:1000) (Santa Cruz). Κατσίκας αντι-κουνελιού και αντι-ποντικού IgG αντισώματα συζευγμένο με HRP (1:2000? Bio-Rad) χρησιμοποιήθηκαν σαν δεύτερα αντισώματα, αντίστοιχα. Μεμβράνες ανιχνεύθηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο Pierce ECL Western Blotting Substrate (Thermo Scientific? Scoresby, Αυστραλία).

Αποτελέσματα

Κλινικά Χαρακτηριστικά

Τα κλινικά χαρακτηριστικά των συμμετεχόντων στη μελέτη συμπεριλαμβανομένου του φύλου,

H. pylori

κατάστασης της λοίμωξης και η διάμεση ηλικία φαίνονται στον Πίνακα S3 στους Πίνακες S1. Αρσενικό φύλο βρέθηκε να είναι πιο κυρίαρχη σε ασθενείς με GC σε σχέση με τους ελέγχους FD, που δείχνει μια θετική συσχέτιση με την ανάπτυξη του GC σε αυτήν την εθνοτική κινεζική πληθυσμό (OR: 2,15, 95% CI: 1,29 – 3,58,

P

-τιμή: 0,0036).

Η. pylori

μόλυνση βρέθηκε να είναι παρούσα σε 68.7% των ατόμων σε αυτή τη μελέτη (73/87 ασθενείς GC και 140/223 FD ελέγχους). Σύγκριση του επιπολασμού του

H. pylori

λοίμωξης σε ασθενείς με GC και ελέγχους FD έδειξε ότι

H. pylori

λοίμωξης ήταν ένας παράγοντας κινδύνου για την ανάπτυξη του GC (OR: 2,38, 95% CI: 1,41 – 3,99,

P

-τιμή: & lt? 0,0001). Ακόμα κι αν υποκείμενα σε αυτή τη μελέτη ήταν συμφωνημένα σύμφωνα με την 5-ετών ηλικίες, η μέση ηλικία των ασθενών GC (65,3 ετών) ήταν σημαντικά υψηλότερη από εκείνη των ελέγχων FD (54,3 ετών) (

P

-τιμή: & lt ?. 0.0001)

πολυμορφισμοί σε γονίδια που εμπλέκονται στην NOD-όπως Receptor σηματοδότηση Pathway σχετίζονται με τον καρκίνο του γαστρικού στην Ethnic κινεζική άτομα

Πενήντα ένα πολυμορφισμών στα γονίδια που εμπλέκονται στην οδό σηματοδότησης NLR ήταν γονότυπος σε 310 κινεζικής καταγωγής άτομα (87 περιπτώσεις GC και 223 FD έλεγχοι). Ο ρυθμός κλήση όλων των επιλεγμένων πολυμορφισμοί ήταν 97-100% σε αυτή τη μελέτη. Όλες οι πολυμορφισμοί στο μονοπάτι σηματοδότησης NLR βρέθηκαν να είναι σε HWE στην ομάδα ελέγχου δείχνει μη σημαντική χ

2 τιμές εκτός από

CARD8

-rs12984929 (χ

2: 35.98),

CARD8-

rs4802445 (χ

2: 5,87) και

CARD8-

rs6509368 (χ

2: 5,43). Είκοσι μία πολυμορφισμούς στο

NLRP3

(n = 5),

NLRP12

(n = 3),

NLRX1

(n = 3),

ASC

(n = 4) και

CASP1

(n = 6) βρέθηκαν να είναι μη-πολυμορφικοί σε αυτόν τον κινεζικής καταγωγής πληθυσμό (Πίνακας S1 στο πίνακες S1).

αλληλόμορφων και γονότυπο συχνότητες καθώς και οι ΕΑΠ και το 95% CI για τις υπόλοιπες 27 πολυμορφισμούς που φαίνονται στον πίνακα 1 και τον πίνακα S4 στους πίνακες S1. Η

CARD8

-rs11672725 ΤΤ γονότυπο έδειξαν μια ισχυρή συσχέτιση με GC στο διμεταβλητή στατιστική ανάλυση (OR: CI 4,80, 95%: 1,39 – 16,58). Εκτός από την

CARD8

-rs11672725, άλλα τέσσερα πολυμορφισμοί έδειξαν οριακά αποτελέσματα στο διμεταβλητή ανάλυση (

NLRP3

-rs10754558,

NLRP3

-rs4612666,

NLRP12

-rs199475867 και

NLRX1

-rs10790286) (Πίνακας 1). Περαιτέρω πολυμεταβλητή στατιστική ανάλυση, τη ρύθμιση για

H. pylori

μόλυνση και το άρρεν φύλο, έδειξε ότι το

CARD8

-rs11672725 ΤΤ γονότυπο παρέμεινε ένα παράγοντα κινδύνου για GC σε αυτήν την εθνοτική κινεζική πληθυσμό (Πίνακας 2).

Η

αναλύσεις απλότυπος που βασίζονται σε μια ισχυρή προσέγγιση για να τεμαχίσει την αρχιτεκτονική των πολύπλοκων ασθενειών. Στην παρούσα μελέτη, το EM αλγόριθμος προσδιορίζονται 25 απλότυπους με συχνότητα & gt? 0,01 σε περιπτώσεις GC (Πίνακας S5 στους Πίνακες S1). Χρησιμοποιώντας τη μείζονα απλότυπο στην ομάδα ελέγχου ως απλότυπος αναφοράς, δύο

CARD8-NLRP12

(ΗΑΡ1 και Hap8), ένα

NLRP3

(Hap3) και τρεις

NLRX1-CASP1

(Hap21, 23 και 24) απλοτύπων βρέθηκαν να αυξάνουν τον κίνδυνο GC σε αυτήν την εθνοτική κινεζική πληθυσμό. Είναι ενδιαφέρον, ΗΑΡ1 φιλοξενεί το

CARD8

-rs11672725 Τ αλληλόμορφου, και Hap21 και Hap23 φιλοξενούν το

NLRX1

-rs10790286 C αλληλόμορφο, το οποίο δείχνει συνέπεια με τα αποτελέσματα που προκύπτουν από το αλληλόμορφο και τον γονότυπο αναλύσεις.

πολυμορφισμοί σε γονίδια που εμπλέκονται στην NOD-όπως Receptor σηματοδότηση Pathway σχετίζονται με

Helicobacter Pylori

μόλυνση στο Ethnic κινεζική άτομα

Δεδομένου ότι

H. pylori

είναι γνωστό ότι είναι ένας σημαντικός παράγοντας κινδύνου που συνδέεται με GC, περαιτέρω αναλύσεις για να αξιολογηθεί η συσχέτιση μεταξύ των γενετικών πολυμορφισμών που εμπλέκονται στο μονοπάτι σηματοδότησης NLR και

H. pylori

λοίμωξη. Είναι ενδιαφέρον, οι εθνοτικές μελέτη κινεζική-μαρτύρων μας έδειξε ότι

NLRX1

-rs10790286,

NLRP12

-rs2866112,

NLRP12

-rs4419163 και

ASC

-rs8056505 συσχετίστηκαν με σημαντικά αυξημένο κίνδυνο

H. pylori

λοίμωξης στα άτομα αυτά (Πίνακας S6 στους Πίνακες S1). Πολυμεταβλητή στατιστική ανάλυση επιβεβαίωσε ότι

NLRP12

-rs2866112 συσχετίστηκε με αυξημένο κίνδυνο

H. pylori

σε Κινέζους ιδιώτες (OR: 2,13, 95% CI: 1,22 – 3,71)

Κοινή Επίδραση του

Helicobacter pylori

Λοίμωξη και γενετικών πολυμορφισμών αυξάνει σημαντικά τον κίνδυνο γαστρικού καρκίνου σε. Ethnic κινεζική άτομα

Περαιτέρω αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν για την αξιολόγηση όχι μόνο την παρουσία ή την απουσία των επιλεγμένων πολυμορφισμών, αλλά και

H. pylori

κατάσταση σε σχέση με τον κίνδυνο της GC, σε μια προσπάθεια να διαπιστώσει την ύπαρξη βιολογικής αλληλεπίδρασης με τη μορφή συνεργείας ή ανταγωνισμού. Εντυπωσιακά, τα άτομα που φέρουν δέκα από τα επιλεγμένα πολυμορφισμών (

CARD8

-rs10405717,

NLRP3

-rs12079994,

NLRP3

-rs3806265,

NLRP3

-rs4612666,

NLRP12

-rs2866112,

NLRP12

-rs4419163,

NLRX1

-rs10790286,

CASP1

-rs2282659,

CASP1

-rs530537 και

CASP1

-rs61751523) και έχουν μολυνθεί με

H. pylori

παρατηρήθηκαν να είναι σε μεγαλύτερο κίνδυνο του GC, την πλειονότητα αυτών των ΙΑΠ είναι στο εύρος 4.0-5.0 (Πίνακας 3). Σε αντίθεση, απουσία του

H. pylori

λοίμωξη,

CARD8

-rs2043211 μείωσε σημαντικά τον κίνδυνο της GC (OR: 0,19, 95% CI: 0,06 – 0,63).

Η

Helicobacter Pylori

επηρεάζει την έκφραση των Αρκετές μόρια που εμπλέκονται στην NOD-όπως Receptor σηματοδότηση Pathway

Για να χαρακτηριστεί περαιτέρω η επίδραση του

H. pylori

για μόρια που εμπλέκονται στην οδό σηματοδότησης NLR, εκτιμήσαμε την έκφραση γονιδίων που κωδικοποιούν 84 ΕΜΑΜ, άλλα συστατικά inflammasome, αρνητικών ρυθμιστών, προ-φλεγμονώδεις κυτοκίνες, προ-φλεγμονώδη κασπάσες και μορίων που εμπλέκονται στην κατάντη σηματοδότηση, σε ΤΗΡ-1 προερχόμενο από μακροφάγα μετά από έκθεση σε δύο διαφορετικές

H. pylori

στελέχη (GC026 και 26695). Σε

H. pylori

GC026-αμφισβήτηση κύτταρα ΤΗΡ1, 49 γονίδια διαφορικά εκφραζόμενα σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Πίνακας S7 στους Πίνακες S1 και το Σχήμα S1 στα σχήματα S1). Από αυτά, στατιστικά σημαντική προς τα πάνω ρύθμιση και ρύθμιση προς τα κάτω τουλάχιστον δύο φορές βρέθηκε σε 17 και 28 γονιδίων, αντίστοιχα (Πίνακες 4 και 5). Τριάντα πέντε γονίδια εκφράζονται διαφορικά μεταξύ της ομάδας ελέγχου και της ομάδας που εκτίθενται σε

H. pylori

26695 (Πίνακας S7 στους πίνακες S1 και S2 σχήμα στα σχήματα S1). Από αυτούς, στατιστικά σημαντική προς τα πάνω ρύθμιση και ρύθμιση προς τα κάτω τουλάχιστον δύο φορές βρέθηκε σε 5 και 23 γονίδια, αντίστοιχα (Πίνακες 4 και 5).

Η

Helicobacter pylori

στελέχη συνδεδεμένων με γαστρικός καρκίνος και γαστρίτιδα οδηγήσει σε διαφορετικά επίπεδα έκφρασης των κυτταροκινών και χημειοκινών

Δεδομένου ότι η φλεγμονή είναι ένα σήμα κατατεθέν της γαστρικής καρκινογένεσης, αναλύσαμε περαιτέρω την έκφραση των προ-φλεγμονωδών κυτταροκινών και χημειοκινών κατά την έκθεση σε δύο

H. pylori

στελέχη. Η έκφραση των εννέα γονιδίων που κωδικοποιούν προ-φλεγμονωδών κυτοκινών (

IFNB1

,

IL1B

,

IL12B

,

IL6

,

IL33

και

TNF

) και χημειοκινών (

CXCL1

,

CXCL2, CCL5

) ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα στην ΤΗΡ-1 κύτταρα που προκλήθηκαν με τα δύο

H. pylori

GC026 και 26.695 στελέχη (Πίνακας 4). Περαιτέρω, μια έντονη ανοσολογική απόκριση (

CXCL1

,

CXCL2

,

CCL5

,

IL6

,

IL12B

,

TNF

και

IFNB1

) κινήθηκε εναντίον

H. pylori

GC026 (Εικόνα 1Α). Είναι ενδιαφέρον, μια σειρά γονιδίων που κωδικοποιούν χημειοκινών (

CCL2

και

CCL7

) και κυτοκίνες (

IL18

,

TNFSF11

και

CD40LG

) ήταν κάτω-ρυθμίζονται σε

H. pylori

-challenged κύτταρα ΤΗΡ-1 (Πίνακας 5).

Α) Gene έκφραση κυτοκινών και χημειοκινών σε

H. pylori

-challenged κύτταρα ΤΗΡ-1, Β) Gene έκφραση του NOD-όπως υποδοχέων σε

H. pylori

-challenged κύτταρα ΤΗΡ-1, C)

NFKB1

έκφραση στο

H. pylori

-challenged κύτταρα ΤΗΡ-1 και D)

PTGS2

και

BIRC3

έκφραση στο

H. pylori

-challenged κύτταρα ΤΗΡ-1. Διπλώστε αλλαγή (2∧ (-Delta Δέλτα Ct)) είναι η κανονικοποιημένη έκφραση του γονιδίου (2∧ (-Delta Ct)) σε ΤΗΡ-1 κύτταρα που προκλήθηκαν με

H. pylori

(GC026 και 26695) διαιρούμενο την έκφραση κανονικοποιημένη γονίδιο (2∧ (-Delta Ct)) στις αντίστοιχες ομάδας ελέγχου τους. Διπλώστε ρύθμιση αντιπροσωπεύει φορές αλλαγή οδηγεί σε μια βιολογικά ουσιαστικό τρόπο. Διπλώστε αλλαγή τιμές μεγαλύτερες από ένα δείχνουν προς τα πάνω ρύθμιση, και η πτυχή ρύθμιση είναι ίση με την πολλαπλή μεταβολή. τιμές Fold-αλλαγή λιγότερο από ένα δείχνουν προς τα κάτω ρύθμιση, και η πτυχή ρύθμιση είναι η αρνητική αντίστροφο της πολλαπλής μεταβολής. Διπλώστε-διαφορά σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου που δείχνει μια *

P

-τιμή & lt? 0,05 και **

P

-τιμή & lt? 0,01.

P

-τιμές ελήφθησαν με t-test του Student.

Η

Helicobacter Pylori

λοίμωξη αποτελέσματα σε Up-ρύθμιση του

NFKB1

με ταυτόχρονη σημαντική προς τα κάτω τον κανονισμό του

NLRP12

και

NLRX1

η

Δεκατρείς γονίδια που κωδικοποιούν ΕΜΑΜ αξιολογήθηκαν σε αυτή τη μελέτη, συμπεριλαμβανομένων μέλη της υποκατηγορίας IPAF (ΝΑΙΡ, NLRC4), NLRPs ( NLRP1, NLRP3-6, NLRP9, NLRP12) και ΝΟϋδ (NOD2, NLRC5, NLRX1 και CIITA) (Σχήμα 1Β). Η έκφραση των γονιδίων που κωδικοποιούν τα πέντε ΕΜΑΜ ήταν σημαντικά ρυθμίζεται σε H. pylori προκληθέντες κύτταρα (NLRC4, NLRC5, NLRP9, NLRP12 και NLRX1) (Πίνακας 5). Από αυτούς, NLRP12 (πάσο ρύθμιση: 0.03, p-value: 0,016298) και NLRX1 (πάσο ρύθμιση: 0,02, p-value: 0.01762) ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε H. pylori GC026-πρόκληση κύτταρα. Ως τεχνική επικύρωσης, περαιτέρω αναλύσεις κηλίδος Western διερεύνηση της έκφρασης NLRX1, διεξήχθησαν. Σταθερά, μειωμένα επίπεδα NLRX1 βρέθηκαν σε ΤΗΡ-1 κύτταρα που προκλήθηκαν με τα δύο H. pylori GC026 και 26695 (Υποστήριξη Πληροφορίες Εικόνα S3).

Δεδομένου ότι η NF-κΒ ρυθμίζεται αρνητικά από NLRP12 και NLRX1, έχουμε περαιτέρω σύγκριση η έκφραση του

NFKB1

και

RELA

μεταξύ

H. pylori

GC026- και 26695-πρόκληση κύτταρα. Αξίζει να σημειωθεί ότι, αν και

RELA

έδειξαν μειωμένα επίπεδα σε ΤΗΡ-1 κύτταρα που εκτίθενται σε τόσο

H. ρύθμιση του πυλωρού

στελέχη (πάσο: 0.49,

p

-τιμή: 0.044673 και διπλώστε ρύθμιση: 0.26,

p

-τιμή:. 0.131017 για

H pylori

GC026 και 26695, αντίστοιχα), στατιστικά σημαντική προς τα πάνω ρύθμιση του

NFKB1

παρατηρήθηκε μόνο στο

H. (Κανονισμός φορές: 2.50,

p

-τιμή: 0,006825) πυλωρού

GC026-πρόκληση κύτταρα. (Σχήμα 1C)

Helicobacter Pylori

αυξάνει την έκφραση του

PTGS2

και

BIRC3

η

η έκφραση των άλλων μορίων που εμπλέκονται όχι μόνο στην NLR μονοπάτι σηματοδότησης αλλά και στην καρκινογένεση αναλύθηκε επίσης με τη σύγκριση των ΤΗΡ-1 κυττάρων απαντήσεις σε τόσο em

H. pylori

στελέχη. Είναι ενδιαφέρον ότι,

PTGS2

ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε ΤΗΡ-1 κύτταρα κατά την έκθεση σε τόσο

H. pylori

στελέχη,

H. pylori

GC026-πρόκληση κύτταρα (πάσο ρύθμιση: 54.03,

p

-τιμή: 0,0247) που δείχνει σημαντικά υψηλότερα επίπεδα έκφρασης σε σύγκριση με

H. pylori

26695-πρόκληση κύτταρα (πάσο ρύθμιση: 19.56,

p

-τιμή: 0,016089) (Σχήμα 1δ). Περαιτέρω, ένα δεύτερο γονίδιο που εμπλέκεται στην καρκινογένεση,

BIRC3

, ήταν αποκλειστικά επάνω ρυθμισμένη σε

H. (Κανονισμός φορές: 12.28,

p

-τιμή: 0,001638) πυλωρού

GC026-πρόκληση κύτταρα. (Σχήμα 1D)

Συζήτηση

GC θεωρείται πλέον μία πολυπαραγοντική διαδικασία, στην οποία οι βακτηριακές, περιβαλλοντικούς και υποδοχής γενετικής παράγοντες που εμπλέκονται στα διάφορα στάδια της παθοφυσιολογίας του καρκίνου. Επί του παρόντος, είναι καθιερωμένο ότι ο καρκίνος προκύπτει σε χρόνια φλεγμονή των ιστών, και αυτό είναι ιδιαίτερα αξιοσημείωτο στην γαστρεντερική οδό [4]. Ως χρόνια φλεγμονή του γαστρικού βλεννογόνου είναι συνέπεια του

H. pylori

μόλυνση και αυτό βακτήριο αρχικά στόχαστρο PRRs, διερευνήσαμε το ρόλο των μορίων που εμπλέκονται στην οδό σηματοδότησης NLR σε

H. pylori

μόλυνση και συναφή GC.

Για τις γνώσεις μας, αυτή είναι η πρώτη απόδειξη ότι οι πολυμορφισμοί εμπλέκονται στην οδό σηματοδότησης NLR σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο GC σε έναν ανθρώπινο πληθυσμό. pylori

λοίμωξη. pylori

στελέχη. Πίνακας S1. Πίνακας S2. Πίνακας S3. Πίνακας S4. Πίνακας S5. Πίνακας S6. Πίνακας S7.