Αφηρημένο

Ιστορικό

Η θεραπεία του μεταστατικού καρκίνου του προστάτη (PCA) με ενιαία παράγοντες έδειξε μόνο μέτρια αποτελεσματικότητα. Υποθέσαμε διπλή αναστολή των διαφορετικά μονοπάτια στο PCa αποτέλεσμα βελτιωμένη αναστολή όγκου. Οι οικογένεια Src κινασών (SFK) και τους άξονες του αυξητικού παράγοντα-1 (IGF-1) σηματοδότησης που μοιάζει με ινσουλίνη ενεργοποιούνται ανωμάλως στα δύο πρωτογενή προστάτη και οστικές μεταστάσεις και ρυθμίζουν διακριτές και επικαλυπτόμενες λειτουργίες σε εξέλιξη PCa. Εξετάσαμε τις επιδράσεις κατά του όγκου των συνδυασμένων αναστολή αυτών των οδών.

Υλικά και Μέθοδοι

Src andIGF-1 υποδοχέα (IGF-1 R) αναστολή επιτεύχθηκε

in vitro από

σύντομο φουρκέτα (sh) RNA και

in vitro

και

in vivo από

αναστολείς μικρού μορίου (dasatinib και BMS-754807, κατά SFK και IGF-1 R /υποδοχέα ινσουλίνης (IR), αντίστοιχα).

Αποτελέσματα

In vitro

, η αναστολή του IGF-1 σηματοδότηση επηρεαστεί η επιβίωση των κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό. SFK αποκλεισμός είχε μόνη μέτρια αποτελέσματα στον πολλαπλασιασμό, αλλά ενίσχυσε σημαντικά τον αποκλεισμό IGF-1R. Αυτά τα ευρήματα συσχετίζονται με μια ισχυρή αναστολή της IGF-1 επαγόμενη φωσφορυλίωση Akt1 με dasatinib, ενώ Akt2 φωσφορυλίωση ήταν SFK ανεξάρτητη και αναστέλλεται μόνο με BMS-754807. Ετσι, πλήρης αναστολή των δύο Akt γονιδίων, δεν θεωρείται από μόνη της είτε με φάρμακο, είναι πιθανό ένας σημαντικός μηχανισμός για τη μειωμένη επιβίωση των κυττάρων του προστάτη. Επιπλέον, το dasatinib και BMS-754807 παρεμπόδισε

in vivo

ανάπτυξη του πρωτογενούς ξενομοσχεύματος ανθρώπινου MDA PCa 133, με την αντίστοιχη αναστολή της Akt σε όγκους. Επίσης, τόσο ορθοτοπική και intratibial ανάπτυξη του όγκου PC-3 κύτταρα πιο ισχυρά αναστέλλεται από τη διπλή της SKF και της IGF-1 R αποκλεισμό /IR σε σύγκριση με είτε μόνη οδός, με αντίστοιχη μείωση των δεικτών οστικού μεταβολισμού.

Συμπεράσματα

Διπλή IGF-1 R /IR και SFK αναστολή μπορεί να είναι μια λογική θεραπευτική προσέγγιση σε προστάτη αναστέλλοντας τόσο ανεξάρτητη και συμπληρωματικές διαδικασίες ζωτικής σημασίας για την ανάπτυξη του όγκου

Παράθεση:. Dayyani F, Parikh NU, Βαρκάρης AS , Τραγούδι JH, Moorthy S, Chatterji T, et al. (2012) Συνδυασμένη Αναστολή της IGF-1 R /IR και Src κινάσες της οικογένειας Βελτιώνει Αποτελέσματα κατά του όγκου στον καρκίνο του προστάτη με τη μείωση Ενεργός επιβίωσης Pathways. PLoS ONE 7 (12): e51189. doi: 10.1371 /journal.pone.0051189

Επιμέλεια: Kaustubh Ντάτα του Πανεπιστημίου της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 3 Ιούλ 2012? Αποδεκτές: 30 Οκτώβρη 2012? Δημοσιεύθηκε: 26, Δεκ 2012

Copyright: © 2012 Dayyani et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. F.D. υποστηρίχθηκε από Ηνωμένες Πολιτείες Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας επιχορήγησης Τ32 CA009666? F.D., G.E.G., J.C.A. και C.J.L. υποστηρίχθηκαν από 1 P50 CA140388-01? F.D., G.E.G. και C.J.L. Επίσης, υποστηρίζεται από μια επιχορήγηση από το Ίδρυμα Καρκίνος του προστάτη. Το έργο αυτό υποστηρίζεται επίσης από το ΝΙΗ μέσω Cancer Center Επιχορήγηση για τη στήριξη MD Anderson, το 5 P30 CA016672-35. S.N.M. υποστηρίχθηκε από την επιχορήγηση του καρκίνου του προστάτη ερευνητικών προγραμμάτων σε UTMDACC. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και έχουν τα ακόλουθα συγκρούσεις. Δηλώνουν ότι J.C. και Μ.Ο. απασχολούνται από την Bristol-Myers Squibb. Αυτό δεν αλλάζει την προσκόλλησή τους σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Ο μεταστατικός καρκίνος του προστάτη (PCA) αντιστοιχεί κατ ‘εκτίμηση 28.000 θανάτους το 2012 [1]. Σε προχωρημένο, ευνουχισμού ανθεκτικό μεταστατικό προστάτη (CRPC), υπάρχουν μερικές επιλογές θεραπείας. Υπάρχουν μόνο 3 FDA-εγκριθεί χημειοθεραπευτικούς παράγοντες για CRPC: ντοσεταξέλη και καμπαζιταξέλης [2], [3], και τα δύο εκ των οποίων δείχνουν μόνο μια μέτρια πλεονέκτημα επιβίωσης για τους άνδρες με CRPC, και πιο πρόσφατα, το οξικό CYP17 αναστολέα αμπιρατερόνη, έχουν εγκριθεί για χρήση μετά την αποτυχία docetaxel (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT00638690), βελτιώνοντας τη συνολική επιβίωση κατά 3,9 μήνες [4]. Για ελάχιστα συμπτωματική μεταστατικό CRPC, μια τυχαιοποιημένη φάσης 3 μελέτη έδειξε πλεονέκτημα επιβίωσης με το εμβόλιο Sipuleucel-T [5] Τα προαναφερόμενα, δηλαδή ενώ τα ελπιδοφόρα παράγοντες βελτίωση της επιβίωσης των ασθενών με προστάτη, επιπρόσθετα θεραπευτικά μέσα είναι σαφώς απαραίτητη για προχωρημένη νόσο σταδίου [6].

Πρόσφατες πρόοδοι στην κατανόηση των οδών σηματοδότησης που διέπουν την ανάπτυξη των κυττάρων του προστάτη στα οστά έχουν οδηγήσει σε πολυάριθμες κλινικές δοκιμές με στοχευμένες θεραπείες. Μια από τις πιο υποσχόμενες στόχους σε PCa είναι οι οικογένεια Src κινασών (SFKs), μια οικογένεια κινασών τυροσίνης πρωτεΐνης μη-υποδοχέα, η έκφραση και συγκεκριμένες δραστηριότητες των οποίων αυξήθηκε σε πολλαπλούς τύπους ανθρώπινων όγκων [7]. Προκλινικά δεδομένα σε PCa δείχνουν ότι η αναστολή της SFKs μειώνει τον πολλαπλασιασμό και, πιο έντονα, εισβολή και τη μετανάστευση [8], [9]. Επιπλέον, η δραστικότητα της Src είναι σημαντικό στο μικροπεριβάλλον, που επηρεάζουν τη λειτουργία των οστεοκλαστών. Έτσι, Src αναστολείς μπλοκ, στις αλληλεπιδράσεις μέρος, όγκου /μικροπεριβάλλον που οδηγούν στο «φαύλο κύκλο» της οστικής μετάστασης [10]. Σε μελέτες που χρησιμοποιούν

in vivo

ορθοτοπική πειράματα ποντικού, η αναστολή της SFKs μειώθηκε τόσο την ανάπτυξη του όγκου του προστάτη και την ανάπτυξη των μεταστάσεων λεμφαδένα [11]. Βασίζονται εν μέρει σε αυτά τα ευρήματα και μερικά ελπιδοφόρα αποτελέσματα από μια μελέτη φάσης 1/2 [12], το dasatinib, ένα μικρό μόριο αναστολέα πολυ-κινάσης με επιλεκτικότητα forSFK /Abl [8], έχει δοκιμαστεί σε συνδυασμό με ντοσεταξέλη σε μία τυχαιοποιημένη φάσης 3 δίκη για ασθενείς με CRPC (ClinicalTrials.gov ID: NCT00744497).

οι αναλύσεις της μελέτης φάσης 1/2 δείχνουν αναστολή SFK συν docetaxel δεν παράγουν σημαντικές κλινικές αποκρίσεις στην πλειοψηφία των ασθενών, αλλά ήταν εξαιρετικά ελπιδοφόρα για ένα υποσύνολο ασθενών [13]. Ετσι, προσδιορίζοντας επιπλέον οδών σηματοδότησης που συμβάλλουν στην μεταστατική ανάπτυξη του προστάτη και μπορεί να αυξήσει τις επιδράσεις της αναστολής Src είναι πιθανό να αποδώσει πολλά υποσχόμενη συνδυασμούς αναστολέων που θα είναι πιο αποτελεσματική για τη θεραπεία του προστάτη.

Μια τέτοια οδός απορυθμισμένη σε PCA είναι μεσολαβεί ο υποδοχέας ινσουλινοειδούς αυξητικού παράγοντα-1 (IGF-1 R). IGF-1R εμπλέκεται στον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των πολλών τύπων όγκων [14] και υπερεκφράζεται σε PCa [15]. IGF-1 R σηματοδότηση έχει συνδεθεί προς PCA κινδύνου, και ένα από τα προσδέματά της, IGF-2, είναι επίσης υπερεκφράζεται σε μεταστάσεις προστάτη οστών [16], όπου προωθεί τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των κυττάρων προστάτη [17], [18], [ ,,,0],19], [20], [21]. Μελέτες με μονοκλωνικά αντισώματα έναντι του IGF-1 R έχουν εμπλέξει αυτό τον υποδοχέα ως σημαντική στην εξέλιξη της PCA σε ευαίσθητο σε ανδρογόνο καθώς και τα μοντέλα όγκων ανθεκτικών [22]. Αν και IGF-1 R σηματοδότηση διαμεσολαβείται εν μέρει από το μονοπάτι Src, άλλων οδών κατάντη σηματοδότησης του IGF-1 R είναι Src ανεξάρτητη και δεν επηρεάζεται από την αναστολή των Src [14]? Αυτές οι πρόσθετες οδοί έχουν δειχθεί πρόσφατα ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην επιβίωση των κυττάρων του προστάτη [23]. Ενεργοποίηση Src και IGF-1 R ενεργοποιεί επίσης Akt, ένα βασικό τελεστή της ΡΙ3Κ /Akt /mTOR μονοπάτι, το οποίο είναι με παρεκκλίνοντα ενεργοποιείται στην πλειονότητα των κακοηθειών, την προώθηση της ανάπτυξης των κυττάρων, πολλαπλασιασμό και επιβίωση [24], [25] .Ωστόσο, εάν αυτές οι αναστολείς είναι εξίσου αποτελεσματικές στην αναστολή Akt1, 2 και 3 λειτουργεί δεν είναι γνωστή, και αν ο συνδυασμός τους που παράγονται καλύτερα αποτελέσματα στην αναστολή αυτής της οδού επιβίωση ήταν ένας στόχος αυτής της εργασίας. Εδώ, εξετάσαμε τις μεμονωμένες και συνδυασμένες επιδράσεις του dasatinib, ενός αναστολέα της SKF, και BMS-754807, ένας ισχυρός και αναστρέψιμο αναστολέα μικρού μορίου του IGF-1 R [26] και τον υποδοχέα ινσουλίνης (IR) με δράση έναντι διαφόρων συμπαγών όγκων

in vitro

καθώς και σε πολλαπλά μοντέλα ξενομοσχεύματος [26]. Ως αναστολείς έχουν εκτός στόχου επιδράσεις, μοριακή knockdown αυτών των οδών χρησιμοποιήθηκε επίσης. Έχουμε αποδείξει ότι η αναστολή αυτών των οδών αποδίδει συμπληρωματικές βιολογικές επιδράσεις

in vitro

και

in vivo

και ότι, με την παρουσία του IGF-1, η αναστολή των δύο οδών απαιτείται για να αναστέλλει ισχυρώς φωσφορυλίωση της Akt και κατάντη μεσολαβητών της επιβίωσης των καρκινικών κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταροκαλλιέργειες

PC-3 και LNCaP κύτταρα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection. Αντιπροσωπεύουν τόσο αδενο- και μικρές-κυττάρων παραλλαγές του προστάτη [27]. PC3-MM2 [28] και PC3-LG κύτταρα [29] ευγενικά από τον Dr. Ησαΐας Fidler (Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson Cancer Κέντρο). PC-3 άγριου τύπου κύτταρα και τα σταθερά διαμολυνθέντα διατηρήθηκαν σε DMEM F-12 μέσο (Hyclone) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS? Hyclone) και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Gibco). LNCaP κύτταρα φυσικού τύπου και τα σταθερά διαμολυνθέντα διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 (Hyclone) συμπληρωμένο με 10% FBS και 1% πενικιλίνη /στρεπτομυκίνη. BMS-754807 παρασχέθηκε από την Bristol-Myers Squibb, και το dasatinib χορηγήθηκε ευγενώς από το Δρ John C. Araujo (MD Anderson). ταυτότητας των κυττάρων και διαλογή μυκόπλασμα εκτελέστηκε κάθε έξι μήνες, σύμφωνα με τις κατευθυντήριες οδηγίες.

Σταθερά επιμολυσμένα

Ready-to-επιμόλυνση μικρή φουρκέτα (sh) RNA-GFP-πουρομυκίνης κατασκευάσματα κατά της ανθρώπινης IGF1-R (# SR302344) και Src (# SR304574) αγοράστηκαν από ΟηΟεηε Technologies. Μια καθολική ομελέτα αρνητικός μάρτυρας shRNA (# SR30004) που παρέχονται από τον κατασκευαστή. Κύτταρα επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Fugene 6 (Roche) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Σταθεροί κλώνοι επιλέχθηκαν με πουρομυκίνη. knockdown Target επαληθεύτηκε 3-4 εβδομάδες μετά την επιμόλυνση με κηλίδες Western, όπως περιγράφεται παρακάτω.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

Τα κύτταρα (3 χ 10

4per φρεάτιο) καλλιεργήθηκαν σε 6 φρεατίων πιάτα για μέχρι και 96 ώρες με και χωρίς dasatinib (100 nM) ή BMS-754807 (0,5-5 μΜ). Για κύτταρο μετρώντας σε διάφορα χρονικά σημεία, τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με PBS (Gibco), επωάστηκαν με TrypLE αντιδραστήριο διαστάσεως (Gibco), και μετρήθηκαν με ένα αυτοματοποιημένο αναλυτή κυτταρικής βιωσιμότητας (Vi-Cell XR? Beckman Coulter). Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

αννεξίνης V χρώση

Η χρώση των αποπτωτικών κυττάρων εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ ανίχνευσης αννεξίνη V-ΡΕ (Βϋ Pharmingen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες, ακολουθούμενη από χρώση με αννεξίνη V-ΡΕ. Τα κύτταρα αναλύθηκαν σε ένα BD FACS Canto κυτταρόμετρο ροής, χρησιμοποιώντας το λογισμικό Diva FACS (BD Biosciences).

Κύκλος

Κυττάρων

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες, συλλέχθηκαν και πλύθηκαν μία φορά σε PBS, κατόπιν επαναιωρήθηκαν σε παγωμένο 70% αιθανόλη και φυλάσσονται στους -20 ° C για 1 ώρα. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν και πάλι σε PBS και υποβλήθηκε σε επεξεργασία για 45 λεπτά με ϋΝΑση ελεύθερο ΚΝάσης (Invitrogen) στους 37 ° C. ιωδιούχο προπίδιο προστέθηκε σε μία τελική συγκέντρωση 1 μg /mL, και τα κύτταρα επωάστηκαν για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η ανάλυση έγινε σε BD FACS Canto κυτταρομετρητή ροής, χρησιμοποιώντας το λογισμικό Diva FACS.

Ζώα

Swiss nu-ηυ /Ncr γυμνά ποντίκια είχαν αγοραστεί από την περιοχή παραγωγής ζώων του Τμήματος Πειραματικής Ακτινοθεραπευτική Ογκολογία στο MD Anderson. Όλα τα ποντίκια στεγάστηκαν και διατηρήθηκαν κάτω από ειδικές συνθήκες άνευ παθογόνων σύμφωνα με τις οδηγίες φροντίδας ζώων και την Επιτροπή Χρήση MD Anderson του. Η φροντίδα των ζώων και τη χρήση επιτροπής MD Anderson Θεσμικών (IACUC) αναθεωρείται αυτή τη μελέτη και ειδικότερα ενέκρινε.

ξενομοσχεύματος όγκους

Η υποδόρια μοσχεύματα του MDA προστάτη 133 (ένα ξενομόσχευμα από ευνουχισμού ανθεκτικό ασθενή που προέρχεται από μια μετάσταση στα οστά που εκφράζει AR και PSA και αναπτύσσεται μόνο σε ποντίκια και όχι σε κυτταρική καλλιέργεια) δημιουργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30]. Εν συντομία, τα θραύσματα των όγκων εμφυτεύθηκαν υποδορίως σε σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (SCID) ποντικούς σε μέγεθος μικρότερο από 1 mm

3. Οι όγκοι αφέθηκαν να αναπτυχθούν έως ότου έφθασαν το μέγεθος των 3 mm

3, και στη συνέχεια τα ποντίκια (η = 4 για κάθε ομάδα) υποβλήθηκαν σε αγωγή καθημερινά με dasatinib και BMS-754807, μόνα τους και σε συνδυασμό, για 26 ημέρες. Οι όγκοι μετρήθηκαν δύο φορές την εβδομάδα, και ο όγκος υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο

V = W

2 × L /2

. Την ημέρα 26, οι ποντικοί υποβλήθηκαν σε ευθανασία, οι όγκοι συλλέχθηκαν, και προϊόντα λύσης πρωτεΐνης παρασκευάστηκαν όπως αναφέρεται παρακάτω για κηλίδες Western.

ορθοτοπική προστάτη /intratibial ενέσεις

ενδοπροστατική ένεση PC3 λουσιφεράσης που εκφράζουν -LG κύτταρα έγινε όπως προγενέστερα είχαν δημοσιευθεί από την ομάδα μας [31]. Εν συντομία, 40 Swiss ηυ-ηυ /Ncr γυμνά ποντίκια (ηλικίας 8-12 εβδομάδων) αναισθητοποιήθηκαν με 2% ισοφλουράνιο σε ένα θάλαμο ισοφλουράνιο-οξυγόνου και στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε ύπτια θέση. Μία μέση τομή έγινε στο κάτω μέρος της κοιλιάς, και ο προστάτης εξετέθησαν όπως περιγράφεται από Park et al. [32]. Πενήντα μικρολίτρα HBSS που περιέχει PC3-LG (συνολικά, 5 × 10

5 κύτταρα) ορθοτοπικά εγχύθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [31] σε ένα πλευρικό λοβό του προστάτη. Το τραύμα κλείστηκε με μεταλλικά χειρουργικά κλιπ. Δέκα ημέρες μετά την ένεση ξενομοσχεύματος, η μεταμόσχευση του όγκου προσδιορίστηκε με

in vivo

βιοφωταύγειας απεικόνισης (σύστημα IVISTM 100? Xenogen Co.) με τους ποντικούς του 2% αναισθησία ισοφλουράνης εισπνοής. Επελέγησαν Τριάντα δύο ποντίκια που δείχνει δραστικότητα λουσιφεράσης κοντά στην μέση τιμή και τυχαιοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα πρόγραμμα το Excel ® (Microsoft) σε 4 ομάδες (η = 8 για κάθε ομάδα): έλεγχος φορέα, BMS-754807 μόνο (12,5 mg /kg σωματικού βάρους /ημέρα), dasatinib μόνο (12,5 mg /kg βάρους σώματος /ημέρα), και ένας συνδυασμός των BMS-754807 (6,25 mg /kg βάρους σώματος /ημέρα) και dasatinib (12,5 mg /kg σωματικού βάρους /ημέρα). Αυτές οι συγκεντρώσεις ήταν σκόπιμα επιλεγεί σε επίπεδα στα οποία δεν αναμενόταν δραστηριότητα μονοθεραπεία. Όλα τα φάρμακα χορηγήθηκαν με στοματικό καθετήρα 6 ημέρες /εβδομάδα. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία 4 εβδομάδες μετά την έγχυση των κυττάρων. Πρωτογενής όγκων στον προστάτη αποκόπηκαν και ζυγίστηκαν

Intratibial ένεση κυττάρων PC3-MM2 διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28].? Εν συντομία, γυμνοί ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν όπως παραπάνω, και 2,5 χ 10

5 κύτταρα ενέθηκαν μέσα στην κνήμη όπως περιγράφεται [28]. Δώδεκα ημέρες μετά την ένεση, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με αλατούχο διάλυμα (η = 10) dasatinib (n = 9), BMS-754807 (n = 9), ή και τα δύο (n = 8) στις δοσολογίες που περιγράφονται ανωτέρω. Τέσσερις εβδομάδες μετά την έναρξη της θεραπείας, οι ποντικοί υποβλήθηκαν σε ευθανασία. Ακτινογραφίες ελήφθησαν όλων των ποντικών, και από 4 ποντίκια σε κάθε ομάδα, ο κνήμες συλλέχθηκαν και παρασκευάστηκε και υπολογιστική τομογραφία διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [32], [33].

καταστροφή οστού μετά intratibial ένεση κυττάρων PC3-MM2 σε γυμνά ποντίκια βαθμολογήθηκε με βάση τις ακόλουθες βαθμολογίες: 0 = ελάχιστες αλλαγές? 1 = λυτική βλάβες των οστών, φλοιό άθικτο? 2 = καταστροφή Cortex, καμία σημαντική διόγκωση μαλακών ιστών? 3 = καταστροφή Cortex, σημαντική συμμετοχή των μαλακών ιστών.

ανοσοαποτύπωσης

Ανοσοκηλίδωση διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34]. Εν συντομία, τα κύτταρα λύθηκαν και αποσαφηνιστούν, και οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν μέσω 8% SDS-PAGE, ακολουθούμενη από μεταφορά σε μεμβράνες polyvinylidenedifluoride (Millipore). Οι μεμβράνες επωάστηκαν με αντισώματα έναντι Src, Yes, Fyn, Lyn, IGF-1 R, Akt, Erk1 /2, και S6 (όλα αγοράστηκαν από την Cell Signaling) και LC3 (Sigma), που ακολουθείται από συζευγμένη με υπεροξειδάση χρόνου δευτερογενή αντισώματα (Bio -Rad).

Ανοσοκαταβύθιση

για τον προσδιορισμό φωσφορυλίωσης του Akt1 και 2 ειδικά, PC-3 κύτταρα στερήθηκαν τον ορό μέχρι και 48 ώρες και στη συνέχεια επωάστηκαν για 2 ώρες με dasatinib (100 ηΜ), BMS-754807 (5 μΜ), ή και τα δύο, που ακολουθείται από 15 λεπτά με διέγερση με 50 ng /mL rhIGF-1 (R &? D Systems). Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν, και 500 μg πρωτεΐνης χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοκαταβύθιση, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [35]. Τα δείγματα επωάστηκαν με ειδικά αντισώματα έναντι Akt1 ή Akt2 (Cell Signaling) όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Μετά την ανοσοκαταβύθιση, 50 μι πρωτεΐνης Προστέθηκαν σφαιρίδια αγαρόζης, και τα δείγματα επωάστηκαν και πάλι για 2 ώρες στους 4 ° C. Τα δείγματα στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στα 5000 rpm για 2 λεπτά. Το υπερκείμενο απορρίφθηκε, και το κάθε δείγμα πλύθηκε με 500 μί ανοσοσυμπλέγματος ρυθμιστικό πλύσης δοκιμασίας κινάσης και φυγοκεντρείται 3 φορές. Στη συνέχεια, 30 μλ SDS χρωστικής προστέθηκαν στα καταβυθισθέν πρωτεΐνες, και τα δείγματα αναλύθηκαν για κηλίδες Western και επωάστηκαν με φωσφο-Ακί (Cell Signaling) ακολουθώντας το πρωτόκολλο που περιγράφεται παραπάνω.

Οι ιστολογικές μελέτες

η &? Ε και χρώση TUNEL διεξήχθησαν σε MDA PCa 133 όγκους ξενομοσχεύματος μετά την εκφύτευση όπως περιγράφηκε προηγουμένως [36], [37]. Σε κάθε ομάδα, εξετάστηκαν 5 διαφορετικά πεδία υψηλής ισχύος (HPF), ο αριθμός των TUNEL θετικών κυττάρων μετρήθηκε, και υπολογίσθηκε ο μέσος αριθμός των TUNEL θετικών κυττάρων /HPF. Hoechst χρωστική χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση των πυρήνων των κυττάρων.

ELISA

Ο ποσοτικός προσδιορισμός της αλκαλικής φωσφατάσης ποντικού και Ν-τελοπεπτιδίου στον ορό ποντικού διεξήχθη με χρήση των αντίστοιχων κιτ ELISA (ΠΖΑ ELISA) σύμφωνα με τον κατασκευαστή οδηγίες. Όλες οι τυπικές καμπύλες είχε R2 της ≥0.990. Οι θετικοί μάρτυρες για κάθε δοκιμή δόθηκαν από τον κατασκευαστή.

Στατιστικά

Για στατιστικές συγκρίσεις των συνεχών παραμέτρων, η Φοιτητών

t-test

χρησιμοποιήθηκε και για διακριτές τιμές, το chi-square test χρησιμοποιήθηκε? α & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

αναστολή του IGF-1R επηρεάζει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την απόπτωση

Δοκιμάσαμε το σκεπτικό μας για συνδυασμένη αναστολή της Src και IGF-1R. μονοπάτια με προσδιορισμό των επιδράσεων στην ανάπτυξη και την απόπτωση στη συνέχεια μεταγωγή σήματος, ακολουθούμενη από επιδράσεις στην ανάπτυξη του όγκου σε διάφορες σχετικές ζωικά μοντέλα. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 10% FBS, επαρκής για να οδηγήσει σε ενεργοποιημένα IGF-1 R. Υπό αυτές τις συνθήκες, η αναστολή της Src και IGF-1 R με το συνδυασμό του dasatinib και BMS-754807 μείωσε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και στα δύο κύτταρα PC-3 και LNCaP, όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α. Πρώτον, επιβεβαιώθηκε η έκφραση του SFKs Src, Yes, Fyn και Lyn σε όλα τα κύτταρα του προστάτη που εξετάστηκαν (Εικ. S1 Α). Για να καθοριστεί αν οι αναστολείς κατά κύριο λόγο επηρεάζονται Src και IGF-1R, σταθερή shRNA μεσολάβηση knockdowns έγιναν για

SRC

και

IGF-1R

, αντίστοιχα. Α & gt? 90% knockdown των αντίστοιχων ενζύμων σηματοδότησης επιτεύχθηκε (Εικ S1B.). SFK αναστολή με dasatinib μείωση του πολλαπλασιασμού των PC-3 κύτταρα, σύμφωνα με προηγούμενα ευρήματα [11]? knockdown του

IGF-1 R

μειωμένο πολλαπλασιασμό κατά 96 ώρες περισσότερο από dasatinib έκαναν (

P

& lt? 0,05? S1c), και ο συνδυασμός της αναστολής SFK και

IGF-1 R

μειώθηκε νοκ ντάουν περαιτέρω πολλαπλασιασμό (

P

& lt? 0,05). Αυτά τα ευρήματα επιβεβαιώθηκαν με MTS δοκιμασία μιας καλλιέργειας 96 ωρών (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η αναστολή του πολλαπλασιασμού που παρατηρείται με BMS-754807 ήταν εντονότερη στις δύο κυτταρικές σειρές παρά με shIGF-1 R, υποδηλώνοντας ότι ο φαινότυπος που παρατηρείται με BMS-754807 είναι πιθανό να οφείλεται, εν μέρει, στην ικανότητα της BMS-754807 να αναστέλλουν τον υποδοχέα ινσουλίνης (IR), καθώς και [26] .Για να εξετάσει ειδικά τις επιδράσεις της BMS-754807 επί IGF-1 διέγερση του IGF-1 R, προσδιορίσαμε την επίδραση αυξανόμενων δόσεων του αναστολέα επί διάσπαση PARP. Όπως φαίνεται στο Σχήμα S1D, διάσπαση PARP ήταν δοσοεξαρτώμενη. Εξετάσαμε επίσης τη χρονική εξάρτηση της αναστολής της ανάπτυξης. Με την παρουσία του BMS-754807, κινητική ανάπτυξη ανεστάλησαν σε ένα εξαρτώμενο από το χρόνο τρόπο σε σχέση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα S1E). Αυτά τα αποτελέσματα είναι σύμφωνα με BMS-754807 που επηρεάζουν την ανάπτυξη των κυττάρων μέσω αυξημένη απόπτωση

(Α) PC-3 ή LNCaP κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 96 ώρες με ή χωρίς dasatinib. (DSA? 100 ηΜ) και BMS-754807 ( BMS-807? αριθμοί των κυττάρων 2 μΜ για PC-3 και 0,5 μΜ για τα κύτταρα LNCaP), μόνα τους και σε συνδυασμό, και προσδιορίστηκαν όπως περιγράφεται στις μεθόδους. (Β) κύτταρα PC-3 και LNCaP επωάστηκαν για 24 ώρες με ή χωρίς DSA (100 ηΜ) και BMS-754807 (5 μΜ για PC-3 και 1 μΜ για τα κύτταρα LNCaP), μόνα τους και σε συνδυασμό, και του κυτταρικού κύκλου χρώση μετά από 24 ώρες πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ιωδιούχου προπιδίου. (C) κύτταρα PC-3 επωάστηκαν για 48 ώρες με ή χωρίς DSA (100 ηΜ) και BMS-754807 (2 μΜ), μόνα τους και σε συνδυασμό, και το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής αννεξίνης-ν χρώση. (D) Αριστερά: χρώση του κυτταρικού κύκλου με ιωδιούχο προπίδιο σε PC-3-shIGF-1 R κύτταρα. Δεξιά: PC-3-shIGF-1R κύτταρα ελέγχου και επωάστηκαν για 48 ώρες με ή χωρίς DSA (100 ηΜ), και το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του χρώσης αννεξίνης-ν. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. *

P

& lt? 0,05? N.S. δεν είναι σημαντική.

Η

PC-3 και LNCaP κύτταρα, η θεραπεία με το συνδυασμό του dasatinib και BMS-754807 αύξησε αναστολή του κυτταρικού κύκλου και κυτταρικό θάνατο, σε σχέση με είτε αναστολέα μόνο (Σχ. 1Β). Κατά την εξέταση της συγκεκριμένης συμβολής του κάθε ένωσης, βρήκαμε ότι η επώαση των δύο κυτταρικές σειρές με BMS-754807 αύξησε το ποσοστό των SubG

1 κύτταρα (Σχ. 1Β), που συσχετίζεται με ένα υψηλότερο κλάσμα αννεξίνης-ν-θετικά κύτταρα στο 48 ώρες (όταν ο κυτταρικός θάνατος ήταν beginning- (Εικ. 1 C), καθώς και αντίστοιχες με διάσπαση PARP (Εικ. S1F). Αντίθετα, δεν αυξάνει σε SubG

1 κλάσμα και αννεξίνης-ν-θετικά κύτταρα παρατηρήθηκαν με την προσθήκη dasatinib μόνο. ​​για διαλογή πιθανή πρόκληση αυτοφαγία, ελέγξαμε επίσης αν τα φάρμακα προκαλούμενη μετατροπή της LC3-Ι σε LC3-ΙΙ, μια διαδικασία ενδεικτική αυτοφαγικά δραστηριότητα. Όπως φαίνεται στο Σχ. S1G, ούτε φάρμακο (μόνο του ή σε συνδυασμός) παρήγαγε σημαντικές ποσότητες LC3-ΙΙ, υποδηλώνοντας αυτοφαγία δεν είναι μια σημαντική αιτία του θανάτου των κυττάρων.

Δεδομένου ότι μόνο BMS-754807 επαγόμενη απόπτωση, μπορούμε στη συνέχεια διεξήχθη ένα παρόμοιο πείραμα με το PC-3 κύτταρα shIGF-1R να καθοριστεί εάν μειωμένη έκφραση του IGF-1R ειδικά αυξημένη απόπτωση. Πράγματι, όπως φαίνεται στο Σχ. 1D, knockdown του

IGF-1 R

σε κύτταρα PC-3 αύξησαν το ποσοστό του SubG

1, καθώς και αννεξίνης-ν-θετικά κύτταρα σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου shRNA. Knockdown του

SRC

είχε μικρή επίδραση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Ο συνδυασμός του dasatinib και BMS-754807 καταλήγει σε πιο ισχυρή αναστολή της Akt από ό, τι είτε φάρμακο μόνο

Στη συνέχεια εξετάσαμε εάν συνδυασμένη αναστολή των SFKs και IGF-1 R επηρεάζονται οδών σηματοδότησης διαφορετικά από ό, τι κάθε παράγοντα ξεχωριστά. Εξετάσαμε το πρώτο δυναμικό κατάντη ενδιάμεσα από αυτά τα μονοπάτια, Erk1 /2 και της Akt. Πραγματοποιήθηκαν πειράματα με την παρουσία και απουσία του IGF-1, επειδή IGF-1 είναι άφθονο στο μικροπεριβάλλον του CRPC ασθενών. Σε συνθήκες άνευ ορού (για να καταστείλει την αρχική τιμή ενεργοποίησης IGF-1 R), επιβεβαιώσαμε αναστολή στόχου με τα δύο φάρμακα μετά IGF-1 διέγερσης (Σχ. 2Α). Erk1 /2 έκφραση ή φωσφορυλίωση δεν επηρεάστηκε ούτε από αναστολέας μόνος ή όταν χρησιμοποιείται σε συνδυασμό (Εικ. S2). Σε αντίθεση, η ενεργοποίηση Akt μερικώς αναστέλλεται από κάθε αναστολέα μόνο και αναστέλλεται πλήρως από το συνδυασμό. Για την καλύτερη κατανόηση του μηχανισμού αναστολής Akt, αποδείξαμε πρώτη έκφραση του Akt1 και 2 (Σχ. 2Β, C), αλλά όχι Akt3 (τα δεδομένα δεν φαίνονται), σε ανιχνεύσιμα επίπεδα σε κύτταρα PC-3. Σε περίπτωση απουσίας του IGF-1, Akt2, αλλά δεν Akt1, μερικώς ενεργοποιημένη (Σχ. 2Β, C). Με την παρουσία του IGF-1, Akt1 ενεργοποιείται και φωσφορυλίωση Akt2 περαιτέρω αυξήσεις. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2B, & gt? 80% της φωσφορυλίωσης Akt1 αναστέλλεται από dasatinib, ενώ το dasatinib είναι αναποτελεσματική στην αναστολή του IGF-1 που προκαλείται από Akt2 φωσφορυλίωση (Σχήμα 2C.). Σε αντίθεση, BMS-754807 μερικώς, αλλά όχι πλήρως, μειωμένη τόσο φωσφορυλίωση τόσο Akt1 και 2 παρουσία του IGF-1. Ο διπλός αποκλεισμός του IGF-1 R και SFK με συνδυασμένες BMS-754807 και dasatinib αναστέλλει πλήρως ανιχνεύσιμη Akt1 και 2 φωσφορυλίωση παρουσία του IGF-1 (Σχ. 2Β, C). Για να διερευνήσουν επιπτώσεις σε κατάντη στόχου της Akt, εξετάστηκε φωσφορυλίωση S6. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα της αναστολής Akt, μερική αναστολή της φωσφορυλίωσης S6 παρατηρήθηκε τόσο με dasatinib και BMS-754807 και μόνο, και πλήρης αναστολή παρατηρήθηκε με το συνδυασμό (Σχ. 2D), γεγονός που υποδηλώνει ότι η αναστολή λειτουργιών Akt απαιτεί τόσο dasatinib και BMS- 754.807. Έτσι, ο συνδυασμός του dasatinib και BMS-754807 μειώνει την επιβίωση εν μέρει, λόγω της πλήρους αναστολής της Akt.

(Α) PC-3 κύτταρα στερήθηκαν ορού για 72 ώρες και στη συνέχεια προ-επωάστηκαν για 2 ώρες με BMS-754807 είτε 2 μΜ ή 5 μΜ, με dasatinib στα 100 ηΜ, ή και με τα δύο παράγοντες. Μετά από 2 ώρες, τα κύτταρα διεγέρθηκαν με 50 ng /mL ανασυνδυασμένης ανθρώπινης IGF-1 (rhIGF-1) για 3 λεπτά. Στη συνέχεια, η πρωτεΐνη συλλέχθηκαν και η (φωσφο) -proteins IGF-1 R, Src, και Akt προσδιορίστηκαν με κηλίδα western (WB). Βινκουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β και C) κύτταρα PC-3 διεγέρθηκαν με DSA (100 ηΜ) και BMS-754807 (5 μΜ) όπως παραπάνω, και στη συνέχεια τα κύτταρα συλλέχθηκαν και ανοσοκαταβυθίστηκαν για Akt1 (Β) ή Akt2 (C), ακολουθούμενη από ανοσοστύπωμα για φωσφο-Akt. (D) κύτταρα PC-3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως στο (Α), και στύπωμα Western εκτελέστηκε για S6 και φωσφο-S6.

Η

Θεραπεία της πρωτογενούς ξενομοσχεύματος ανθρώπινων όγκων με dasatinib και BMS-754807 είναι αποτελεσματική

in vivo

και επάγει απόπτωση καρκινικών

Για να προσδιοριστεί η επίδραση της συνδυασμένης αναστολής της Src και IGF-1 R σε μία άμεση ξενομοσχεύματος ανθρώπινων κυττάρων προστάτη που αναπτύσσονται σε μοντέλα ποντικών, πρέπει πρώτα αγωγή ποντικούς που φέρουν το πρωτογενή ανθρώπινα ξενομοσχεύματος ΜϋΑ PCa 133 όγκους (ευνουχισμού ανθεκτικά, AR θετική) με dasatinib και BMS-754807 μόνο και σε συνδυασμό (η = 4 για κάθε ομάδα). Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Α, στις 3 εβδομάδες, υπήρξε μια αύξηση στο μέγεθος του όγκου στην ομάδα ελέγχου, καθώς και τις ομάδες του ίδιου φαρμάκου, ενώ ο ρυθμός ανάπτυξης όγκου ήταν σημαντικά μειωμένη στην ομάδα συνδυασμού. Αυτή η επίδραση ήταν ακόμα πιο έντονη την ημέρα 26, κατά τον οποίο χρόνο θανατώθηκαν οι ποντικοί.

(Α) MDA PCa 133 (που προέρχεται από οστικές μεταστάσεις) κύτταρα εμφυτεύθηκαν υποδορίως σε γυμνούς ποντικούς όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Μόλις οι όγκοι έφθασαν έναν όγκο 3 mm

3, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με dasatinib και BMS-754807 μόνο και σε συνδυασμό (η = 4 για κάθε ομάδα). Οι όγκοι μετρήθηκαν δύο φορές την εβδομάδα. Ορατή είναι η σχετική αύξηση του μεγέθους του όγκου συναρτήσει του χρόνου σε κάθε ομάδα. *

P

& lt? 0,05. (Β) Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία 16 ημέρες μετά την έναρξη της θεραπείας, οι όγκοι συλλέχθηκαν, και κηλίδες Western έγιναν για τις υποδεικνυόμενες (συνολική και φωσφο) -proteins. Ορατή είναι αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα από έναν όγκο σε κάθε ομάδα θεραπείας. (Γ) Ποσοτικοποίηση της χρώσης TUNEL για την ανίχνευση της απόπτωσης. Ορατή είναι η μέση (± SEM) αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων ανά πεδίο υψηλής ισχύος (HPF) σε κάθε ομάδα.

Η

ανοσοστυπώματα σε φλας-κατεψυγμένο όγκοι συλλέχθηκαν από τους ποντικούς μόνο παράγοντα που έλαβαν καταδειχθεί η αναστολή της φωσφορυλίωση της src με dasatinib και φωσφορυλίωσης του IGF-1R με BMS-754807, αποδεικνύοντας ότι αυτά τα φάρμακα χτύπησε κύρια τους στόχους τους. Ακριβώς όπως παρατηρήσαμε στο

in vitro

μελέτες, Akt και φωσφορυλίωση S6 ανεστάλη μόνο εν μέρει από κάθε φάρμακο μόνο. Αντίθετα, ισχυρή αναστολή της φωσφορυλίωσης Akt και S6 παρατηρήθηκε στην ομάδα συνδυασμού (Σχ. 3Β). Περαιτέρω, η απόπτωση αυξήθηκε, όπως προσδιορίζεται με χρώση TUNEL των όγκων BMS-754807-αγωγή και την περαιτέρω αυξήθηκε στην ομάδα συνδυασμού (

P

= 0,01? Εικ. 3C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η συνδυασμένη αναστολή της Src και IGF-1 R είναι αποτελεσματική σε πρωτογενή ανθρώπινα ξενομοσχεύματα, διαμεσολαβείται εν μέρει από σχεδόν πλήρη αναστολή της φωσφορυλίωσης Akt.

Για να εξεταστεί ορθοτοπική αναστολή όγκου, PC-3 LG κύτταρα (επιλεγεί για ανδρογόνων υποδοχέων τους [AR] -αρνητική κατάσταση και ισχυρή ανάπτυξη σε ορθοτοπική μοντέλα) εγχύθηκαν εντός των προστατών των γυμνών ποντικών και κατεργάστηκε όπως περιγράφεται στο τμήμα των Μεθόδων. Τέσσερις εβδομάδες μετά την ένεση των κυττάρων, τα ποντίκια θανατώθηκαν και οι όγκοι εκτμήθηκαν και ζυγίστηκαν (Εικ. S3A). Αντιπροσωπευτικά όγκοι από τις ομάδες αγωγής 4 (σύνολο η = 8 για κάθε ομάδα) που φαίνεται στο Σχ. S3b. Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στο βάρος όγκου μεταξύ του ελέγχου, dasatinib, και BMS-754807 ομάδες στις συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν (όπως αναμενόταν), αλλά τα ποντίκια που έλαβαν το συνδυασμό των φαρμάκων είχαν σημαντικά μικρότερους όγκους (

P

& lt ? 0,03? Σχ S3 Α, Β)

το dasatinib και BMS-754807 αναστέλλουν PC3-MM2-προκαλούμενη καταστροφή των οστών και τη μείωση των δεικτών οστικού μεταβολισμού

in vivo

Η

Για να.. διερευνήσει κατά πόσον dasatinib και BMS-754807 μείωσε προστάτη που προκαλείται από τον κύκλο εργασιών των οστών, που εγχέεται κύτταρα PC3-MM2 ενδοκνημιακά σε γυμνά ποντίκια. Δύο εβδομάδες μετά την ένεση, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή για 4 εβδομάδες με είτε μόνο του είτε σε συνδυασμό φαρμάκου (έλεγχος, η = 10? Dasatinib, η = 9? BMS-754807, η = 9? Συνδυασμός, η = 8). Κατά το χρόνο αυτό, ελήφθησαν ακτινογραφίες και τα ποντίκια αφαιμάχθησαν ακόλουθη ευθανασία. Τα εμπλεκόμενα οστά συλλέχθηκαν για αξονική τομογραφία. PCa κυττάρων που προκαλείται από την ανάπτυξη του όγκου και καταστροφή του οστού, όπως μετράται σε απλό ακτινογραφίες, βαθμολογήθηκε σε τυφλό τρόπο, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Ότι, όπως αναμενόταν, η θεραπεία με dasatinib μόνη παρουσίασε κάποια αναστολή της καταστροφής των οστών, ο συνδυασμός του dasatinib και BMS-754807 πιο αποτελεσματικά ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου intratibial στο οστούν (Εικ. 4Α, Β). Ωστόσο, μόνο ο συνδυασμός των φαρμάκων μείωσε σημαντικά τα επίπεδα ορού των δεικτών του οστικού (Σχ. 4C, D), υποδεικνύοντας διαμόρφωση τόσο των κυττάρων του προστάτη και οστικές μικροπεριβάλλον τους, παρεμβαίνοντας έτσι με τον φαύλο κύκλο [10]. Ότι η τροποποίηση του ποντικού Ν-τελοπεπτιδίου, ένα υποκατάστατο για την δραστηριότητα των οστεοκλαστών, είναι ενδεικτική της αναστολής της κυτταρικής σειράς οστεολυτικές PC3-MM2, η παρατηρούμενη μείωση στην ποντικού αλκαλικής φωσφατάσης (που αντιπροσωπεύει δραστηριότητα των οστεοβλαστών) τονίζει την αλληλεξάρτηση αυτών των κυττάρων κατά τη διαδικασία της οστικού μεταβολισμού. Dasatinib μόνος έχει δειχθεί ότι επάγει την ωρίμανση των οστεοβλαστών [38]? έτσι πιθανώς αυξάνοντας RANKL έκκριση, η οποία με τη σειρά της ενεργοποιεί κανονικά οστεοκλάστες. Ωστόσο, όπως φαίνεται στην Src – /- ποντικό [39], Src είναι επίσης ένας σημαντικός ρυθμιστής της λειτουργίας των οστεοκλαστών, και αυτό επιβεβαιώνεται από τη διατήρηση των οστών σε dasatinib-alone κατεργασμένων κυττάρων (Σχήμα 4Β).. Ωστόσο, τα μοντέλα που χρησιμοποιήθηκαν, το dasatinib ως μοναδικός παράγοντας στη χαμηλότερη συγκέντρωση που χρησιμοποιείται είναι ανεπαρκής για την αναστολή της ανάπτυξης του όγκου, γεγονός που υποδηλώνει ότι κάτω από αυτές τις συνθήκες, η έκφραση RANKL ενεργοποιεί τουλάχιστον εν μέρει τη λειτουργία των οστεοκλαστών, αλλά ότι η προσθήκη του BMS-754807 στο dasatinib πιθανόν αναστέλλει την ωρίμανση των οστεοβλαστών, την περαιτέρω μείωση της δραστηριότητας των οστεοκλαστών. Το αποτέλεσμα αυτό φαίνεται να συμβαίνει σε κάθε μοντέλο, και ως εκ τούτου είναι μια συνεπής χαρακτηριστικό αυτού του συνδυασμού φαρμάκων.

Bone καταστρεπτική κύτταρα PC3-MM2 εγχύθηκαν ενδοκνημιακά σε γυμνούς ποντικούς. Μετά τη θεραπεία με dasatinib, BMS-754807 μόνο και σε συνδυασμό, οι ποντικοί υποβλήθηκαν σε ευθανασία, και οι ακτίνες Χ και υπολογιστικής τομογραφίας (CT) σάρωση των μακρών οστών έγιναν (έλεγχος, η = 10? Dasatinib, η = 9? BMS-754807 , n = 9? συνδυασμός, η = 8). Συλλέχθηκε αίμα για τους δείκτες οστικού μεταβολισμού ορού. (Α) Ο βαθμός της καταστροφής των οστών τυφλά βαθμολογούνται σε μια ημιποσοτική μόδα που βασίζεται σε ακτίνες Χ από όλους τους ποντικούς. Το γράφημα εμφανίζει το ποσοστό των υψηλού βαθμού αλλοιώσεις (δηλαδή, 2 ή 3) σε κάθε ομάδα θεραπείας. *

P

& lt? 0.05 συνδυασμό εναντίον μόνο dasatinib. (Β) Αντιπροσωπευτική σαρώσεις CT (επάνω) και ακτίνες Χ (κάτω) από τα ποντίκια σε κάθε ομάδα. Βέλη και οι αριθμοί δείχνουν την περιοχή της βλάβης και το βαθμό της καταστροφής των οστών. (C και D) Τα επίπεδα ορού της αλκαλικής φωσφατάση ποντικού (C) και Ν-τελοπεπτίδιο (D) προσδιορίστηκαν με ELISA. Μπαρ δείχνει SEM.