Αφηρημένο

Ο καρκίνος που σχετίζεται με ινοβλάστες (CAF) διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της εξέλιξης του καρκίνου, αλλά η μοριακή καθοριστικός ότι κυβερνά ο όγκος ρυθμιστικού ρόλου των ΚΠΑ παραμένει άγνωστη. Χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο μελανώματος ποντικού στο οποίο εξωγενή κύτταρα μελανώματος μεταμοσχεύθηκαν επί του δέρματος των δύο γραμμών ποντικών όπου η γενετική ενεργοποίηση ή απενεργοποίηση του Notch 1 σηματοδότησης ειδικά συμβαίνει σε ινοβλάστες στρωματικά φυσικό ξενιστή, αποδείξαμε ότι η δραστικότητα μονοπάτι Notch 1 θα μπορούσε να καθορίσει ο όγκος προαγωγής ή καταστολής όγκου φαινότυπο σε CAF. CAF που φέρει αυξημένα δραστηριότητα Notch 1 ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη του μελανώματος και της εισβολής, ενώ εκείνοι με μηδενική Notch1 προωθείται εισβολής του μελανώματος. Αυτά τα ευρήματα προσδιορίσει το μονοπάτι Notch 1 ως μοριακός καθοριστικός που ελέγχει το ρυθμιστικό ρόλο του CAF σε ανάπτυξη του δέρματος μελανώματος και εισβολή, αποκαλύπτοντας Notch1 σηματοδότησης ως δυνητικό θεραπευτικό στόχο για το μελάνωμα και ενδεχομένως άλλων συμπαγών όγκων

Παράθεση:. Shao H , Κονγκ R, Ferrari ML, Radtke F, Capobianco AJ, Liu ZJ (2015) Notch1 Pathway Δραστηριότητα Καθορίζει το ρυθμιστικό ρόλο του Καρκίνου-Associated ινοβλάστες σε μελανώματος την ανάπτυξη και την εισβολή. PLoS ONE 10 (11): e0142815. doi: 10.1371 /journal.pone.0142815

Συντάκτης: Claudia Daniela andl, Πανεπιστήμιο Vanderbilt, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 18 του Αύγ 2015? Αποδεκτές: 27, Οκτώβρη 2015? Δημοσιεύθηκε: 12 του Νοέμβρη, 2015

Copyright: © 2015 Shao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από Bankhead-Coley Cancer Research Program (Βραβείο # 09BN-11), Καρκίνος Σύλλογος Γυναικών και εσωτερικών κεφαλαίων από το Πανεπιστήμιο του Μαϊάμι έως το Ω .. Liu

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

CAF είναι στρωματικά ινοβλάστες διαμένουν εντός και πλησίον της μάζας του όγκου. Προέρχονται κυρίως από ενεργοποιημένα τοπικές αδρανείς ινοβλάστες και προσλαμβάνονται κυκλοφορούν μεσεγχυματικών μυελού των οστών τα βλαστικά κύτταρα (MSC) [1,2]. CAF εμπλέκονται στη ρύθμιση της προόδου των όγκων με την πρόκληση διαλυτούς παράγοντες, εξωκυτταρικό πλέγμα (ECM) [3] και εξωσώματα [4]. Η συμβολή τους στην πρωτοβάθμια και δευτεροβάθμια κακοήθειες [5,6], καθώς και τη συμμετοχή στην αντίσταση των ναρκωτικών και υποτροπής του όγκου [7,8] κάνει CAF πιθανοί στόχοι για θεραπευτικές παρεμβάσεις στο μικροπεριβάλλον του όγκου (TME). Παρά τις εκτεταμένες ενδείξεις που υποστηρίζουν τον κρίσιμο ρόλο των όγκων-ρύθμιση του ΚΠΑ, πώς ο ρόλος καθορίζεται παραμένει ένα μυστήριο. Εμείς και άλλοι προηγουμένως παρατηρηθεί ότι η δραστικότητα μονοπάτι Notch 1 συσχετίζεται αντίστροφα με εκείνη των ινοβλαστών. δραστηριότητα Notch μονοπάτι είναι χαμηλή σε πολλαπλασιαζόμενα ινοβλάστες, ενώ η υψηλή σε αδρανείς ινοβλάστες [9]. Απώλεια

Notch 1

σε εμβρυϊκούς ινοβλάστες ποντικού (MEF) οδήγησε σε ταχύτερο ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων και την κινητικότητα, ενώ η ενεργοποίηση Notch 1 καθυστερημένη ανάπτυξη των κυττάρων και την κινητικότητα των ανθρώπινων ινοβλαστών [9]. Σταθερά, η ενεργοποίηση Notch επαγόμενη διακοπή του κυτταρικού κύκλου και την απόπτωση σε MEF [10]. Σε καρκινικά μοντέλα ξενομοσχεύματος ποντικού, συν-εμφυτευμένα πειραματική ανθρώπινους δερματικούς ινοβλάστες που μεταφέρουν υψηλή Notch1 δραστηριότητα ανέστειλε την ανάπτυξη του μελανώματος και της αγγειογένεσης [11], αποδεικνύοντας ότι η ενεργοποίηση Notch 1 παρέχει ογκο-κατασταλτική φαινότυπο σε πειραματική CAF. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν έναν κρίσιμο ρόλο για τη σηματοδότηση Notch στην διέπουν τη λειτουργία των ινοβλαστών. Ωστόσο, οι ινοβλάστες διερευνηθεί σε αυτές τις προηγούμενες μελέτες δεν είναι πραγματικές ή φυσικές CAF. Εδώ χρησιμοποιήσαμε νέα μοντέλα του ποντικιού για να διερευνήσει το ρόλο του Notch 1 σηματοδότησης για τον καθορισμό του ρυθμιστικού ρόλου του φυσικού ξενιστή ΚΠΑ στην ανάπτυξη του μελανώματος και την εισβολή.

Υλικά και Μέθοδοι

Ποντίκια

Notch1

ΙοχΡ /ΙοχΡ

ποντίκια περιγράφεται [12].

ROSA

LSL-N1IC + /+

(# 008159) και

Fsp1

.

Cre

+/-

(# 012641) ποντίκια αγοράστηκαν από το Εργαστήριο Jackson (Bar Harbor, ΜΕ). Όλα αυτά τα ποντίκια έχουν ένα υπόβαθρο C57BL6. Το κέρδος-Of-Function Notch1 (GOF

Notch 1:.

Fsp1

Cre

+/-

?

ROSA

LSL-N1IC + /+

) και απώλειας λειτουργίας Notch 1 (LOF

Notch 1:.

Fsp1

Cre

+ /-

?

Notch1

ΙοχΡ /ΙοχΡ + /+) γραμμές που δημιουργούνται από τη διέλευση

ROSA

LSL-N1IC + /+

και

Notch1

ΙοχΡ /ΙοχΡ + /+

με

Fsp1

.

Cre

+/-

ποντίκια, και στη συνέχεια διασχίζοντας

Fsp1

Cre

+/-

?.

ROSA

LSL-N1IC +/-

με

ROSA

LSL-N1IC + /+

ποντίκια και

Fsp1

.

Cre

+/-

?

Notch1

ΙοχΡ /ΙοχΡ +/- με

Notch1

ΙοχΡ /ΙοχΡ + /+

ποντίκια, αντίστοιχα. GOF

Ctrl (

FSP1

Cre

– /-

?. ROSA

LSL-N1IC + /+) και LOF

Ctrl (

FSP1

Cre

– /-

?. Notch1

ΙοχΡ /ΙοχΡ + /+ ) ποντίκια χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Οι ποντικοί διατηρήθηκαν στις εγκαταστάσεις ζώου DVR υπό πρότυπες συνθήκες. Τα ποντίκια αναισθητοποιήθηκαν για όλες τις χειρουργικές διαδικασίες με μείγμα κεταμίνης /ξυλαζίνης (100/10 mg /kg, ΙΡ), και διαδικασίες απεικόνισης από την εισπνοή 3% ισοφλουράνιο αέριο, και θυσιάστηκαν σε θάλαμο CO2. Ιδρυματική φροντίδα των ζώων και τη χρήση της ουσίας στο Πανεπιστήμιο του Μαϊάμι ενέκρινε όλες τις διαδικασίες των ζώων.

μοντέλο δέρματος Ποντίκι του μελανώματος

ποντικού κύτταρα μελανώματος, Β16-Ρ10 (ATCC

®, CRL-67345

TM), σταθερά μετάγονται με λουσιφεράση 2 (Luc2) /φακοϊό, καλλιεργήθηκαν με πλήρες DMEM. Για τα πειράματα μοσχευμάτων όγκου, 5 x 10

5 Luc2

+ /Β16-F10 κύτταρα αιωρούνται σε 0,1 ml φυσιολογικού ορού εμβολιάστηκαν (

s

.

γ

.

)

στο ραχιαίο δέρμα των 6 εβδομάδων GOF

Notch1 εναντίον GOF

Ctrl και 8 εβδομάδων LOF

Notch1 εναντίον LOF

ctrl ποντίκια. B-16-F10 προέρχονται από C57BL6 του ποντικιού και μπορεί να είναι ξενομοσχεύτηκε στις δημιουργήθηκε GOF, LOF και ελέγχου ποντίκια που έχουν ένα υπόβαθρο C57BL6. Οι ποντικοί θυσιάστηκαν την εβδομάδα 3 μετά τη μεταμόσχευση. Εκτομή όγκων ζυγίστηκαν. ανάπτυξη μελανώματος αξιολογήθηκε με βάση το βάρος του όγκου και θετικότητα του Κί67 δείκτη πολλαπλασιασμού των κυττάρων μετρήθηκε με ανοσοφθορισμό σε κύτταρα όγκου, ενώ το μελάνωμα τοπική εισβολή αξιολογήθηκε με ιστολογική αξιολόγηση των τμημάτων ιστού από εκτομή του μελανώματος.

Ιστολογία, ανοσοφθορισμού (IF)

κηλίδος Western

Η &? Ε και IF διεξήχθησαν όπως περιγράφεται [11]. Αντισώματα αναγνωρίζουν ενεργοποιηθεί Notch1, Hes1, Ki67, Luc (ab8925, ab71559, ab15580, ab81823, Abcam, Cambridge, ΜΑ), Hey-1, και FSP1 (GTX42614, GTX89197, GeneTex, Irvine, CA). Οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ). Ποσοτικούς προσδιορισμούς είναι μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD) των μετρήσεων από 5 χαμηλού πεδίου ισχύος (LPF) ανά δείγμα όγκου για την H & amp? Χρώση Ε, και 5 πεδίο υψηλής ισχύος (HPF) ανά τμήμα και 5 τμήμα /όγκου για χρώση ΑΝ. Για στύπωμα Western, δείγματα ιστού δέρματος ομογενοποιήθηκαν σε ένα ρυθμιστικό RIPA (50 mM Tris-Cl, 150 mM χλωριούχο νάτριο 1,0% ΝΡ-40, 0.5% δεοξυχολικό νάτριο, 0.1% SDS, ρΗ 8,0, 1 mM EDTA και κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης ( Roche)). Το εναιώρημα ιστού περιστράφηκε σε 4 ° C για 30 λεπτά. Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν μετά από φυγοκέντρηση στις 13.000 rpm για 15 λεπτά. Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας Pierce

TM BCA Protein Assay Kit (# 23225). κηλίδα Western διεξήχθη όπως περιγράφεται [11]. Έκφραση μεταλλαγμένων N1

IC (muN1

IC, 59Kd) και τη διαγραφή του Notch 1 στο δέρμα ποντικών εντοπίστηκαν από δύο διαφορετικά αντι-Notch 1 αντισώματα, αντίστοιχα (ab8925 και ab52627, Abcam).

βιοφωταύγεια απεικόνιση IVIS

D-λουσιφερίνης εγχύθηκε ενδοπεριτοναϊκώς 15 λεπτά πριν από την απεικόνιση (150 mg /kg). Σε ολόκληρο το σώμα αναισθητοποιημένων ποντικών σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας IVIS 200B (PerkinElmer, Waltham, ΜΑ) με τη σύλληψη 1 λεπτό, μέσο ενδοχείαση. σήμα βιοφωταύγεια ήταν ποσοτικά και αναφέρθηκε ως το συνολικό εκπομπή φωτός εντός της περιοχής ενδιαφέροντος (φωτόνιο /s).

Lentivirus και μεταγωγή των κυττάρων

Luc2

+ /φορέα λεντοϊού δομήθηκε με εισαγωγή

Luc2

cDNA σε

pLenti6

(Invitrogene) φορέα. Παραγωγή φακοϊό και μεταγωγή των κυττάρων διεξήχθησαν όπως περιγράφεται [13].

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα αναλύθηκαν στατιστικά με τη χρήση δύο ουρών του Student

t-test

και εξέφρασε ως η μέση τιμή ± SD. Οι τιμές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές όταν

σ

& lt? 0,05

Αποτελέσματα

ενεργοποίηση Notch 1 στο ΚΠΑ καταστέλλει την ανάπτυξη του μελανώματος

Η έκφραση των ινοβλαστών-ειδική πρωτεΐνη. -1 (FSP1, που ονομάζεται επίσης S100A4) είναι γενικά περιορίζεται σε ινοβλάστες [14,15].

FSP1

.

Cre

ποντικοί χρησιμοποιήθηκαν επιτυχώς για τη δημιουργία null αλληλόμορφα σε ινοβλάστες για τον τύπο ΤΟΡβ υποδοχείς II [16], οι υποδοχείς ΕΡ4 [17], και ΡΤΕΝ [18]. Δημιουργήσαμε το 1

ου ζευγάρι GOF

Notch1 εναντίον GOF

ctrl ποντίκια. GOF

Notch1 ποντίκια ήταν βιώσιμα μέχρι που απασχολούνται σε πειράματα μοσχευμάτων δέρματος μελάνωμα εντός δύο μηνών. εμφάνιση του σώματος και ιστών του δέρματος τους ιστολογία, συμπεριλαμβανομένης χόριο, όπου οι ινοβλάστες του δέρματος κατοικούν κυρίως, εμφανίστηκε φυσιολογικά (S1 Α Σχήμα).

Για να εξεταστεί ο ρόλος των ΚΠΑ με υψηλή Notch1 δραστηριότητα στη ρύθμιση της ανάπτυξης μελανώματος, 5 x 10

5 Luc2 + κυττάρων /Β16-F10 εμβολιάστηκαν επάνω στο δέρμα του GOF

Notch1 εναντίον GOF

ctrl ποντίκια. Σε αυτό το μοντέλο, τα κυτταρικά συστατικά του ολόκληρου του στρώματος του όγκου, συμπεριλαμβανομένων των CAF, που αποτελείται από φυσικά κύτταρα-ξενιστές. μετάσταση όγκου παρακολουθήθηκε από ολόκληρο το σώμα IVIS σάρωση κατά την εβδομάδα 3 εμβολιασμοί μετά όγκου. όγκοι του δέρματος αποκόπηκαν, στάθμιση και υποβλήθηκαν σε ανοσοϊστοχημική ανάλυση μετά τη σάρωση IVIS.

Αν χρώση τομών του δέρματος απεικόνισε περιορίζεται και η αυξημένη έκφραση του Ν1

IC σε πυρήνες FSP1

+ ινοβλάστες του GOF

ποντίκια Notch 1 σε σύγκριση με GOF

Πίν ποντίκια (Σχήμα 1Α), αλλά όχι σε παρακείμενες μυϊκές κυττάρων του δέρματος (κυρίως μυϊκά κύτταρα παρουσιάζονται αυτοφθορισμό δεν υπάρχουν ακόμη πυρηνικός σήματα ήταν ανιχνεύσιμα). Ομοίως, η έκφραση Hey1 αυξήθηκε σε πυρήνες FSP1

+ δέρμα ινοβλάστες του GOF

Notch 1 ποντίκια σε σχέση με GOF

ctrl ποντίκια (S1B σχήμα). Επιπλέον, η έκφραση του διαγονιδίου-κωδικοποιημένα μεταλλαγμένη πρωτεΐνη Ν1

IC (muN1

IC: PEST domain-περικοπεί N1

IC, 59 Kd, (

ROSA

LSL -N1IC + /+

, το Εργαστήριο Jackson: # 008159)) στο δέρμα του GOF

Notch1 ποντίκια επιβεβαιώθηκε με κηλίδωση Western (Σχήμα 1Β). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν αποτελεσματική Cre μεσολάβηση ειδική έκφραση της Ν1

IC και Notch ενεργοποίησης της οδού σε ινοβλάστες του δέρματος.

Α. Εκπρόσωπος εικόνες δείχνουν την έκφραση του Ν1

IC σε πυρήνες (αιχμές βελών επισήμανε) της FSP1

+ δέρμα ινοβλάστες του GOF

Notch1 εναντίον GOF

ctrl ποντίκια. Β Έκφραση διαγονιδίου κωδικοποιημένα muN1

IC (59 Kd) στο δέρμα του GOF

Notch1 ποντίκια εντοπίστηκε με κηλίδωση Western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. ανάπτυξη C. Το μελάνωμα είναι καθυστερημένος στην GOF

Notch 1 ποντίκια (n = 8 /ομάδα). Οι πέντε αντιπροσωπευτικές εικόνες από εκτομή όγκων /ομάδα εμφανίζεται. Δ Ουσιαστικά λιγότερο Ki67

+ καρκινικά κύτταρα (Luc2

+) ανά HPF σε μελάνωμα από GOF

Notch1 από GOF

ctrl ποντίκια. δραστηριότητα Ε υπερπλαστική των κυττάρων μελανώματος (Κί67

+) είναι ιδιαίτερα χαμηλό στην περιοχή (με σήμανση) δίπλα στο CAF (FSP1

+) στο GOF

Notch1 ποντίκια. Ποσοτικοποίησης είναι μετρήσεις από 5 HPF ανά τμήμα και 5 τμήμα /όγκου. Τα δεδομένα αναλύθηκαν στατιστικά χρησιμοποιώντας δύο-tailed του Student

t-test

και εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD.

Η

ανάπτυξη μελανώματος σε GOF

Notch1 ποντίκια ήταν σημαντικά καθυστερημένος σε σύγκριση με εκείνη του GOF

ctrl ποντίκια (Σχήμα 1C). Με συνέπεια, υπήρχαν σημαντικά λιγότερο Ki67

+ καρκινικά κύτταρα (Luc2

+) σε ιστούς μελανώματος από GOF

Notch1 ό, τι από GOF

ctrl ποντίκια (Σχήμα 1D). Πολλαπλασιαστική δράση (Ki67 θετικότητα) κυττάρων μελανώματος ήταν ιδιαίτερα ασθενέστερη όταν δίπλα στο CAF (Σχήμα 1 Ε), γεγονός που υποδηλώνει ότι CAF μεταφέρουν υψηλή Notch 1 δραστηριότητα σε GOF

Notch 1 ποντίκια μπορούσαν απελευθερώνουν παράγοντα (ες) κατασταλτικός όγκου. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ενεργοποίηση Notch1 παρέχει όγκου-κατασταλτικό φαινότυπο στα CAF.

ενεργοποίηση Notch 1 στο ΚΠΑ καταστέλλει μελάνωμα εισβολής

Από εξαπλώνεται κύτταρα μελανώματος πρέπει να αλληλεπιδρούν με ινοβλάστες που βρίσκονται στο χόριο του δέρματος (και σε η γειτνίαση των εμφυτευμένων μελάνωμα), ινοβλάστες ενδέχεται να έχουν σημαντική επίπτωση στην διάδοση του μελανώματος. Μελετήσαμε περαιτέρω την επίδραση του ΚΠΑ στην εισβολή μελανώματος και μετάσταση στο GOF

Notch1 ποντίκια. Μελάνωμα τοπική εισβολή αξιολογήθηκε με ιστολογική αξιολόγηση των τμημάτων ιστού από εκτομή του μελανώματος. H & amp? Ε χρώση εκτομή ιστών μελανώματος φαίνεται ότι το 83,3% του μελανώματος είχαν τοπική εισβολή σε παρακείμενους ιστούς του δέρματος στην GOF

Ctrl ποντίκια σε σύγκριση με 22,2% το GOF

Notch 1 ποντίκια (Σχήμα 2Α). Ωστόσο, IVIS σάρωση του σε ολόκληρο το σώμα και συλλέχθηκαν τα όργανα, συμπεριλαμβανομένου του πνεύμονα, ήπαρ, σπλήνα, νεφρό και του μηριαίου οστού, δεν απέδωσαν μετρήσιμη σημάτων φωταύγειας (τα δεδομένα δεν φαίνονται), τα οποία δείχνουν ότι δεν μακρινή μετάσταση συνέβη κατά τη στιγμή της δοκιμασίας μας. ΕΑΝ αποκάλυψε ότι CAF στην κάψουλα του όγκου εμφανίζεται κάτω πολλαπλασιαστική δραστηριότητα (λιγότερο Ki67

+ /FSP1

+ κύτταρα) σε GOF

Notch 1 σε σχέση με GOF

ctrl ποντίκια (Σχήμα 2Β & amp? 2C). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι το ΚΠΑ στην GOF

Notch1 ποντίκια είναι λιγότερο ευνοϊκό για την εισβολή του μελανώματος.

Α.

Αριστερά

: μειώθηκε εισβολή όγκου σε GOF

Notch 1 σε σύγκριση με GOF

ctrl ποντίκια.

Δεξιά

: δύο αντιπροσωπευτικά H & amp? Ε εικόνες των τμημάτων του όγκου (n = 8 /ομάδα). διακεκομμένες γραμμές δείχνουν τα όρια του όγκου. Τα βέλη δείχνουν την εισβολή καρκινικών κυττάρων. Ποσοστό της εισβολής βασίζεται στα αποτελέσματα της H & amp? Ε χρώση σε πεδία χαμηλής ισχύος (LPF) του κάθε τμήματος όγκου. B. Οι ινοβλάστες στην κάψουλα μελανώματος έχουν χαμηλότερα πολλαπλασιαστική δραστηριότητα (λιγότερο Ki67

+ /FSP1

+ κύτταρα) σε GOF

Notch 1 σε σχέση με GOF

ctrl ποντίκια. Γ Ποσοτικοποίηση των Κί67

+ ινοβλάστες /HPF στην κάψουλα μελάνωμα του GOF

Notch 1 (μαύρη γραμμή) έναντι GOF

Ctrl (λευκή γραμμή) ποντίκια. Τα αποτελέσματα είναι μετρήσεις από 5 HPF ανά τμήμα και 5 τμήμα /όγκου. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το

t-test

και εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD.

Η

Null

Notch1

στο CAF δεν επηρεάζει την ανάπτυξη του μελανώματος δίπλευρη Μαθητή

Για να μελετήσει το ρόλο των ΚΠΑ με μηδενική Notch1 στη ρύθμιση της ανάπτυξης μελανώματος και της εισβολής, δημιουργήσαμε τις 2

ου ζευγάρι LOF

Notch1 εναντίον LOF

ctrl ποντίκια. LOF

Notch1 ποντίκια ήταν επίσης βιώσιμες διάρκεια των πειραμάτων μόσχευμα δέρματος μελανώματος και την εμφάνιση του σώματος και ιστών του δέρματος ιστολογία τους φάνηκε κανονική (S2A σχήμα).

N1

IC και Hes1 ήταν ανιχνεύσιμα σε FSP1

+ δέρμα ινοβλάστες του LOF

Notch1 ποντίκια, ενώ ελαφρώς ανιχνεύσιμη στο δέρμα του LOF

ctrl ποντίκια (Σχήμα 3Α, S2B σχήμα). N1

IC ήταν επίσης μη ανιχνεύσιμο σε ινοβλάστες σε κάψουλα μελανώματος σε LOF

ποντίκια Notch1 (κύτταρα μελανώματος εκφράζουν υψηλά επίπεδα N1

IC όπως έχει ήδη αναφερθεί [13], που λειτουργεί ως εσωτερικός έλεγχος για Ν1

IC έκφρασης), αλλά οριακά ανιχνεύσιμη στο LOF

ctrl ποντίκια (Σχήμα 3Β). Αυτά τα στοιχεία δείχνουν το αδρανοποιημένο κατάσταση του Notch1 σηματοδότησης που προκαλείται από

Notch1

διαγραφή σε ινοβλάστες του LOF

Notch1 ποντίκια εναντίον καθεστώς βασικό επίπεδο της Notch 1 σηματοδότησης σε ινοβλάστες του LOF

ctrl ποντίκια. Επιπλέον, ανάλυση Western κηλίδωση επικυρωθεί επιτυχή διαγραφή των Notch 1 στο δέρμα ινοβλάστες του LOF

Notch1 ποντίκια. Έκφραση της πλήρους μήκους Notch 1 (271Kd) ήταν μη ανιχνεύσιμη σε LOF

Notch1 ποντίκια, αν και υπήρξε μικρή παρουσία N1

IC (120 kD) (Σχήμα 3C). Τα οριακά επίπεδα N1

IC στο δέρμα του LOF

Ctrl ποντίκια που αποδίδεται στην παρουσία Ν1

IC σε μη ινοβλαστών σε ιστούς του δέρματος.

Α. Μη ανιχνεύσιμο εναντίον οριακά ανιχνεύσιμη έκφραση Ν1

IC στο δέρμα ινοβλάστες του LOF

Notch1 εναντίον LOF

ctrl ποντίκια. Αιχμές βελών δείχνουν την πυρηνική χρώση των N1

IC σε ινοβλάστες. B. Μη ανιχνεύσιμο εναντίον ανιχνεύσιμη N1

IC όπως επισημαίνεται από αιχμές βελών σε ινοβλάστες σε κάψουλα μελανώματος σε LOF

Notch1 εναντίον LOF

ctrl ποντίκια. C. Μη ανιχνεύσιμο πλήρους μήκους της πρωτεΐνης Notch 1 (271Kd) και μικρή ποσότητα Ν1

IC (120 Kd, η οποία πιθανόν παρουσιάζονται σε μη ινοβλάστες) στον ιστό του δέρματος του LOF

Notch1 ποντίκια εκτέθηκε με ανάλυση Western κηλίδωση . β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. ανάπτυξη D. Το μελάνωμα είναι συγκρίσιμη σε LOF

Notch1 και LOF

ctrl ποντίκια (n = 8 /ομάδα). Οι πέντε αντιπροσωπευτικές εικόνες των όγκων /ομάδα έδειξε. Ε Αριθμοί Κί67

+ κύτταρα του όγκου είναι συγκρίσιμη σε LOF

Notch 1 (μαύρη γραμμή) και LOF

Ctrl (λευκή γραμμή) ποντίκια. Ποσοτικοποίησης είναι μετρήσεις από 5 HPF ανά τμήμα και 5 τμήμα /όγκου. Τα δεδομένα αναλύθηκαν στατιστικά χρησιμοποιώντας δύο-tailed του Student

t-test

και εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD.

Η

Για να διερευνήσουν το ρόλο των ΚΠΑ με χαμηλή ή καμία Notch1 δραστηριότητα στη ρύθμιση την εξέλιξη του μελανώματος, 5 x 10

5 Luc2

+ /Β16-F10 κύτταρα εμβολιάστηκαν (

s

.

γ

.) στο ραχιαίο δέρμα των 8 εβδομάδων LOF

Notch1 εναντίον LOF

ctrl ποντίκια. Μελάνωμα δερματικό μόσχευμα και τη μέτρηση της ανάπτυξης του όγκου, εισβολή και μετάσταση διεξήχθησαν ταυτόσημα όπως περιγράφεται ανωτέρω. Τα μεγέθη των μοσχευμάτων όγκου εκτομή από LOF

Notch1 είναι συγκρίσιμη με εκείνη από LOF

ctrl ποντίκια (Σχήμα 3D). Συνέπεια, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στους αριθμούς των Ki67

+ καρκινικά κύτταρα (Luc2

+) μέσα στους ιστούς του μελανώματος (Σχήμα 3Ε) σε LOF

Notch1 εναντίον LOF

ctrl ποντίκια. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ΚΠΑ σε LOF

Notch1 ποντίκια έχει μικρή επίδραση στην ανάπτυξη μελανώματος.

CAF προωθεί την εισβολή μελανώματος σε LOF

Notch1 ποντίκια

Αντίθετα, μεταμοσχευμένα μελάνωμα είχε αυξηθεί τοπικά ποσοστά εισβολή στο LOF

Notch 1 (75%), τα ποντίκια σε σχέση με LOF

Ctrl (30%) ποντίκια (Σχήμα 4Α), όπως αξιολογήθηκε με ιστολογική εξέταση των τμημάτων ιστού της εκτομή του όγκου, υποδεικνύοντας ότι CAF προώθηση εισβολή μελανώματος σε LOF

Notch1 ποντίκια. Συνέπεια, οι ινοβλάστες που περιβάλλει τον όγκο σε LOF

Notch1 ποντίκια παρουσίασαν ισχυρότερη δράση (πάνω Ki67

+ /FSP1

+ κύτταρα) από ότι σε LOF

ctrl ποντίκια (Σχήμα 4Β), γεγονός που υποδηλώνει ότι CAF είναι πιο ενεργό και μπορεί να ευνοήσει την εισβολή μελανώματος σε LOF

Notch1 ποντίκια. Δεν αποτελεί έκπληξη, όχι μακρινή μετάσταση ήταν ανιχνεύσιμη στις δύο σειρές ποντικών (τα στοιχεία δεν φαίνονται), δεδομένου ότι η συχνότητα εμφάνισης της αυθόρμητης μετάστασης μεταμοσχευμένων κυττάρων Β16 είναι πολύ χαμηλή στην συγγενικό μοντέλο μελανώματος ποντικού. Συνήθως χρειάζεται εκτομή του πρωτογενούς όγκου ώστε για τον σχηματισμό των απομακρυσμένων μεταστάσεων να συμβεί [19]. Εναλλακτικά, μπορεί να είναι ανεπαρκής για την πλήρη διάρκεια της μετάστασης να ολοκληρωθεί εντός του χρονικού πλαισίου (3 εβδομάδων) των πειραμάτων μας. Συνολικά, τα αποτελέσματα μας αποδεικνύουν ότι η διαγραφή του

Notch1

στο ΚΠΑ ενισχύει κανονιστικό επιπτώσεις τους στην εισβολή του μελανώματος.

Α.

Αριστερά

: Αυξημένη εισβολή μελανώματος στο δέρμα του LOF

Notch1 εναντίον LOF

ctrl ποντίκια (n = 8 /ομάδα).

Δεξιά

: δύο αντιπροσωπευτικά H & amp? Οι Ε εικόνες των τμημάτων του όγκου ανά ομάδα εμφανίζεται. διακεκομμένες γραμμές δείχνουν τα όρια του όγκου. Τα βέλη δείχνουν την εισβολή καρκινικών κυττάρων. Ποσοστό εισβολής βασίζεται στα αποτελέσματα της Η &? Χρώση Ε σε LPF κάθε τμήματος του όγκου. Β Null Notch1 CAF που περιβάλλουν όγκων παρουσιάζουν υψηλότερη πολλαπλασιαστική δράση ως πιο Ki67

+ /FSP1

+ κύτταρα είναι ανιχνεύσιμα σε LOF

Notch 1 σε σχέση με LOF

ctrl ποντίκια. Γ Ποσοτικοποίηση των Κί67

+ ινοβλάστες /HPF σε κάψουλα μελάνωμα του LOF

Notch 1 (μαύρη γραμμή) έναντι LOF

Ctrl (λευκή γραμμή) ποντίκια. Ποσοτικοποίησης είναι μετρήσεις από 5 HPF ανά τμήμα και 5 τμήμα /όγκου. Τα δεδομένα αναλύθηκαν στατιστικά χρησιμοποιώντας δύο-tailed του Student

t-test

και εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD.

Η

Συζήτηση

Επεκτάσεις Β16-Ρ10 κύτταρα στο δέρμα του GOF

Notch 1 και LOF

Notch 1 ποντικοί προσφέρουν μοναδικά συγγενή μοντέλα μελανώματος ποντικού για την αποκρυπτογράφηση του ρόλου του Notch 1 σηματοδότησης σε διέπουν τη λειτουργία του όγκου ρύθμισης του CAF σε ΤΜΕ στην οποία τα ολόκληρο κυτταρικά συστατικά του στρώματος του όγκου που αποτελείται από φυσικά κύτταρα-ξενιστές . Τα αποτελέσματά μας ορίζεται Notch1 σηματοδότησης ως μοριακός διακόπτης που ελέγχει τη λειτουργία του όγκου ρύθμισης του ΚΠΑ. Μετατρέποντας αυτό το διακόπτη μοριακού ON και OFF μπορούν αντιστρόφως προσδίδουν όγκο κατασταλτική και όγκου-προώθηση ιδιότητες για CAF. Ως εκ τούτου, σηματοδότηση Notch μπορεί να χειριστεί για να εφαρμόσουν θεραπεία σηματοδότηση κατευθυνόμενη Notch για το μελάνωμα, και ενδεχομένως άλλους στερεούς όγκους. Με τον τρόπο αυτό ανοίγει ένα νέο δρόμο με στόχο TME είτε reprograming και τη μετατροπή CAF από «υποστηρικτές του όγκου» σε «καταστολείς των όγκων», μέσω θεραπευτική ενεργοποίηση του Notch 1 μονοπατιού ή εκμεταλλεύονται άμεσα Notch κατάντη μεσολαβητή (s), δηλαδή WISP1 [11]. Αν και υπάρχουν πολλές επιλογές για την ενεργοποίηση του Notch 1 μονοπατιού στο ΚΠΑ, όπως η χρήση προσέγγιση της γονιδιακής θεραπείας ή νέα μέθοδος επεξεργασίας γονιδιώματος, CRISPR /Cas9 ή CRISPR /Cpf1, να εισαγάγει

Ν1

IC

, ή εφαρμόζοντας μονοπάτι Notch ενεργοποίησης ένωση, η οποία μπορεί να ταυτοποιηθεί μέσω μιας μεθόδου παρόμοιας διαλογής υψηλής απόδοσης [20], ενεργοποιώντας Notch 1 σηματοδότηση συγκεκριμένα στην CAF, ενώ όχι ταυτόχρονα αυξάνοντας τη δραστικότητα Notch σε κύτταρα μελανώματος, θέτουν σε θεραπευτική πρόκληση, όπως η βιολογική λειτουργία της σηματοδότησης Notch είναι κύτταρο μεταβλητής [21], και η υψηλή δραστικότητα Notch είναι ογκογόνο να μελάνωμα [13]. Δεν είναι σαφές πώς σηματοδότηση Notch ρυθμίζεται διαφορετικά σε CAF και κύτταρα μελανώματος σε ένα μόνο μικροπεριβάλλον. Παραμένει επίσης ασαφές αν Notch /συνδέτες συμμετέχουν στην επικοινωνία των κυττάρων-κυττάρων μεταξύ των κυττάρων ινοβλαστών-μελανώματος. Δεδομένου ότι ένα σημαντικό κλάσμα του CAF στον ιστό του όγκου προέρχονται από μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα (MSC), μία εναλλακτική στρατηγική είναι να αναπτυχθούν θεραπείες που βασίζονται σε κύτταρα με στοχευμένη χορήγηση θεραπευτικών κυττάρων, δηλαδή αυτόλογα MSC προερχόμενο ινοβλάστες προ-μηχανικής ‘

ex vivo

«είτε να μεταφέρουν υψηλή Notch1 δραστηριότητα χρησιμοποιώντας μεθόδους που περιγράφονται παραπάνω ή υπερεκφράζουν WISP1, στον ιστό του όγκου. Ινοβλάστες που εκφράζουν υψηλά δραστηριότητα Notch τείνουν να υποστούν διακοπή του κυτταρικού κύκλου [9,10]. Αυτός ο χαρακτήρας καθιστά MSCD-SF μεταφέρουν υψηλή δραστικότητα Notch πιο ελκυστική ως θεραπευτικά κύτταρα, επειδή δεν θα επεκταθεί ακαταμάχητη μετά παλιννόστησης τους στον ιστό του όγκου και τελικά εκκαθαρίζονται από κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος. Ως εκ τούτου, μπορούν να εφαρμοστούν κατ ‘επανάληψη σε ασθενείς για την ενίσχυση της θεραπευτικής αποτελεσματικότητας.

Σε αντίθεση με τα ανασταλτικά αποτελέσματα του ΚΠΑ στο GOF

Notch1 ποντίκια και από την αύξηση του μελανώματος και της εισβολής, CAF σε LOF

Notch1 ποντίκια προώθηση των τοπικών εισβολή, αλλά όχι την ανάπτυξη του δέρματος του μελανώματος. Ο μηχανισμός για την εν λόγω διακριτή αποτελέσματα του ΚΠΑ στο GOF

Notch1 ποντίκια εναντίον LOF

Notch1 ποντίκια παραμένει ασαφής. Ενδεχομένως, τα της ανάπτυξης και της εισβολής ιδιότητες του μελανώματος ρυθμίζονται από διαφορετικές διαλυτές παράγοντες και μικροπεριβάλλοντος συνθήματα που δημιουργήθηκε από CAF. Διαγραφή του

Notch1

στο ΚΠΑ μπορεί να οδηγήσει σε αλλαγή από ένα σύνολο διαλυτών παραγόντων και μικροπεριβάλλον συνθήματα, τα οποία κατά προτίμηση ή επαρκώς επηρεάζει την εισβολή του μελανώματος, αλλά δεν είναι ιδιοκτησία της ανάπτυξης. Από την άλλη πλευρά, διαλυτά παράγοντες και μικροπεριβάλλοντος συνθήματα που δημιουργήθηκε από CAF, οι οποίες καθορίζουν το μελάνωμα ιδιοκτησία της ανάπτυξης, δεν μπορεί να αναστραφεί ακριβώς ανάμεσα GOF

Notch1 και LOF

Notch1 ποντίκια. Το μονοπάτι Notch 1 είναι υπερ-ενεργοποιείται μέσω της έκφρασης της Ν1

IC μετάλλαξη στο ΚΠΑ του GOF

Notch1 ποντίκια, το οποίο είναι διαφορετικό από το κανονικό, συνδέτη που προκαλείται από την ενεργοποίηση Notch1 όπου διαγραφή του Notch1 μπορεί αντιστρόφως καθρέφτη. Αυτό θα μπορούσε να εξηγήσει γιατί CAF σε GOF

Notch1 ποντίκια καθυστερημένη ανάπτυξη του μελανώματος, ενώ CAF σε LOF

Notch1 ποντίκια δεν προωθούν την ανάπτυξη μελανώματος. Εναλλακτικά, άλλες ισομορφές Notch μπορεί να αντισταθμίσει την απώλεια Notch 1 στο ΚΠΑ του LOF

Notch1 ποντίκια. Οι μελλοντικές μελέτες δικαιολογείται να εξετάσει την πλήρη προφίλ των διαλυτών παραγόντων και μικροπεριβάλλοντος συνθήματα προσδιορίζονται από διαφορετικές CAF (CAF από GOF

Notch1 ποντίκια εναντίον CAF από GOF

Ctrl ποντίκια και CAF από LOF

Notch1 ποντίκια εναντίον CAF από LOF

Ctrl ποντίκια).

Μια άλλη ενδιαφέρουσα, αλλά ανεξήγητο εύρημα είναι οι διακριτές αυθόρμητη ποσοστά εισβολής των κυττάρων Β16-F10 μπολιάζονται με GOF

Ctrl (83,3%) έναντι LOF

Ctrl ( 30%) ποντίκια, πιθανώς λόγω των διαφορετικών γενετικά υπόβαθρα των δύο γραμμών των ποντικών. MSC προερχόμενο ινοβλάστες από αυτές τις δύο γραμμές ποντικών ελέγχου εμφανίζουν επίσης διαφορετικούς φαινοτύπους όγκου ρύθμισης

in vitro

. Ινοβλάστες από GOF

Ctrl ποντίκια που προκαλείται από τα κύτταρα του μελανώματος να σχηματίσουν σφαιροειδή ενώ εκείνοι από LOF

Ctrl ποντίκια δεν το έκανε (αδημοσίευτη παρατήρηση).

Εν ολίγοις, έχουμε αποκαλύψει το μονοπάτι Notch 1 ως μοριακό ορίζουσα ότι οι έλεγχοι ο ρυθμιστικός ρόλος του ΚΠΑ στην ανάπτυξη του μελανώματος και την εισβολή. Η μελέτη μας υπογραμμίζει η οδός Notch 1 ως δυνητικό θεραπευτικό στόχο να χειραγωγηθεί να επαναπρογραμματίσει και να μετατρέψει CAF να δρουν ως καταστολείς όγκων. Τα ευρήματα αυτά δικαιολογούν μελλοντική μελέτη για τη διαλεύκανση μοριακών μηχανισμών για τον ρόλο των όγκων-ρύθμιση Notch 1-προσδιορίζεται CAF.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Εικ.

Α, Εκπρόσωπος φωτογραφίες εμφάνιση GOFNotch1 και GOFCtrl. ιστολογία ιστού του δέρματος φαίνεται φυσιολογικό, όπως εξετάζεται από την H & amp? Ε κατά την εβδομάδα 6. Β, αυξημένα έκφραση Hey1 στο δέρμα ινοβλάστες του GOFNotch1 ποντίκια σε σύγκριση με τα ποντίκια GOFCtrl. Αιχμές βελών δείχνουν πυρηνικά εντοπισμένη Hey1 σε ινοβλάστες. Αντίσωμα αναγνωρίζει Hey-1 αγοράστηκε από GeneTex (GTX42614)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0142815.s001

(PDF)

S2 Εικ.

Α, Εκπρόσωπος φωτογραφίες εμφάνιση LOFNotch1 και LOFCtrl. ιστολογία ιστού του δέρματος φαίνεται φυσιολογικό, όπως εξετάζεται από την H & amp? Ε κατά την εβδομάδα 6. Β, η έκφραση Hes1 είναι μη ανιχνεύσιμο σε ινοβλάστες που βρίσκονται σε κάψουλα του μελανώματος σε ποντίκια LOFNotch1 αλλά ελαφρώς ανιχνεύσιμη σε κάψουλα των ποντικών με μελάνωμα LOFCtrl. Αιχμές βελών δείχνουν πυρηνικά εντοπισμένη Hes1 σε ινοβλάστες. Αντίσωμα αναγνωρίζει Hes1 αγοράστηκε από Abcam (ab71559)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0142815.s002

(PDF)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Δρ Omaida C . Velazquez (University of Miami) για τις χρήσιμες συνεργασίες, διαβουλεύσεις και συζητήσεις.