Abstract

Μεταβολή των καρκινικών κυττάρων προς μεσεγχυματικά φαινότυπος έχει δειχθεί ότι ενισχύει την επιθετικότητα του όγκου, αυξάνοντας τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων. Εδώ, αναφέρουμε την επίδραση της τρικλοζάν, ένας ευρέως χρησιμοποιούμενος αντιβακτηριακό παράγοντα που βρίσκεται σε πολλά καθημερινά προϊόντα, στην ενίσχυση της επιθηλιακής προς μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) σε επιθετικές anoikis ανθεκτικά Η460 ανθρώπου κύτταρα καρκίνου πνεύμονα. EMT έχει καιρό γνωστό ότι αυξάνουν τις ικανότητες των κυττάρων για την αύξηση της μετανάστευσης, εισβολή, και την επιβίωση σε σύστημα κυκλοφορίας. Η παρούσα μελέτη αποκαλύπτει ότι η θεραπεία των καρκινικών κυττάρων με τρικλοζάνη στις φυσιολογικώς σχετικών συγκεντρώσεων αύξησε σημαντικά τον αριθμό αποικιών των καρκινικών κυττάρων αξιολογήθηκε με δοκιμασία σχηματισμού όγκου. Επίσης, η μεσεγχυματικά-όπως μορφολογία και μείωση στην κυττάρου-προς-κύτταρο προσκόλληση παρατηρήθηκαν σε κύτταρα triclosan φάρμακο. Σημαντικά, ανάλυση στυπώματος western αποκάλυψε ότι triclosan-επεξεργασμένα κύτταρα εμφάνισαν μειωμένη Ε-καδερίνης, ενώ τα επίπεδα δεικτών EMT, δηλαδή Ν-cadherin, βιμεντίνη, σαλιγκάρι και γυμνοσάλιαγκα βρέθηκαν να είναι σημαντικά πάνω ρυθμισμένα. Επιπλέον, ΕΜΤ επάγεται από triclosan κατεργασία συνοδεύτηκε από την ενεργοποίηση της κινάσης εστιακής προσκόλλησης /ΑΤΡ εξαρτώμενη κινάση τυροσίνης (FAK /Akt) και Ras που συνδέονται με C3 υπόστρωμα τοξίνη botulinum 1 (Rac1), η οποία ενίσχυσε την ικανότητα των κυττάρων να μεταναστεύουν και εισβάλλουν . Συμπερασματικά, αποδείξαμε για πρώτη φορά ότι το triclosan μπορεί να ενισχύσει τα καρκινικά κύτταρα επιβίωσης σε μονοκατοικία κατάσταση και την κινητικότητα μέσω της διαδικασίας της EMT. Όπως αναφέρονται ικανότητες που απαιτούνται για την επιτυχία στην μετάσταση, η παρούσα μελέτη παρέχει το νέο τοξικολογικές πληροφορίες και ενθαρρύνει τη συνειδητοποίηση της χρήσης triclosan σε ασθενείς με καρκίνο

Παράθεση:. Winitthana Τ, Lawanprasert S, Chanvorachote P (2014) Triclosan ενισχύει επιθηλιακά-To-μεσεγχυματικά μετάβαση σε Anoikis-ανθεκτικά κύτταρα Ανθρώπινα καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 9 (10): e110851. doi: 10.1371 /journal.pone.0110851

Επιμέλεια: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 21 Ιούλη, 2014? Αποδεκτές: 24, Σεπ, 2014? Δημοσιεύθηκε: 16 Οκτωβρίου 2014

Copyright: © 2014 Winitthana et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. Η έρευνα υποστηρίχθηκε από το Ταμείο Ταϊλάνδη Έρευνας (στο PC) (https://www.trf.or.th), Ratchadaphiseksomphot Κληροδοτήματος του Πανεπιστημίου Chulalongkorn ( RES560530132-ΥΕ), η 90η επέτειος της Chulalongkorn Ταμείου Πανεπιστήμιο (Ratchadapiseksomphot Κληροδότημα Ταμείο), και η Υποτροφία του Πανεπιστημίου Chulalongkorn Πτυχιούχος να εορτασμό της 72η επετείου της Αυτού Μεγαλειότητας του βασιλιά Bhumibol Adulyadej (https://www.grad.chula.ac.th/eng /υποτροφίες). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Το γνωστό αντι-βακτηριακή triclosan παράγοντας ευρέος φάσματος (2,4,4 ‘-τριχλωρο-2’-υδροξυδιφαινυλαιθέρα? TCS) (Σχήμα 1Α) έχει χρησιμοποιηθεί εμπορικά σε μια ποικιλία προϊόντων σε αναστέλλουν την ανάπτυξη των βακτηρίων, μυκήτων και μούχλας [1], [2]. TCS έχει χρησιμοποιηθεί σύμφωνα με τον κανονισμό του Οργανισμού Τροφίμων και Φαρμάκων (στα καλλυντικά, αποσμητικά, σαπούνια χεριών, οδοντόπαστες), καθώς και την Υπηρεσία Περιβαλλοντικής Προστασίας (στα υλικά συντηρητικό ενσωματωθεί σε οικιακά πλαστικά και κλωστοϋφαντουργικά προϊόντα) [2], [3]. Οι συγκεντρώσεις που χρησιμοποιούνται ΣΤΛ σε διάφορα προϊόντα μπορεί να διαφέρουν? Ωστόσο, τα επίπεδα της σε περισσότερα προϊόντα προσωπικής φροντίδας κυμαίνονται από 0.1-2% [1], [3]. Το γεγονός ότι τα σημαντικά επίπεδα TCS είναι ανιχνεύσιμα στο πλάσμα του TCS-εκτεθειμένα στον άνθρωπο στη συγκέντρωση που κυμαίνεται από 0.02 και 20 μg /ml (0.069 και 69 μΜ) οδηγεί στην πιθανή σύλληψη ότι αυτός ο παράγοντας μπορεί ενδεχομένως να επηρεάσει την ανθρώπινη φυσιολογία [4 ].

(Α) Η χημική δομή του TCS. (Β) Πολυκύτταροι συνάθροιση anoikis ανθεκτικά Η460 κύτταρα. μπαρ κλίμακα είναι 1.000 μm. (C-D) Μετά την επεξεργασία με TCS (0-10 μΜ) για 24 ώρες, το ποσοστό βιωσιμότητας των κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ και το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων ανιχνεύθηκε με χρώση Hoechst33342, αντίστοιχα. Οι τιμές είναι μέσοι των τριών ανεξάρτητων δειγμάτων εις τριπλούν ± SE. *

P

& lt? 0,05 έναντι μη επεξεργασμένο έλεγχο. (Ε) Μετά την ενδείκνυται η θεραπεία, η πυρηνική μορφολογία των κυττάρων ανιχνεύθηκε με /ΡΙ συν-χρώση ανιχνεύσεως Hoechst33342 και οπτικοποιούνται κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού. μπαρ κλίμακα είναι 50 μm. (F) Κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TCS (0-7,5 μΜ) για 24, 48 ή 72 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τις μέσες τιμές των τριών ανεξάρτητων δειγμάτων εις τριπλούν ± SE. *

P

& lt? 0,05 έναντι μη επεξεργασμένο έλεγχο σε κάθε προκαθορισμένο χρόνο. (G-Η) κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με TCS (0-7,5 μΜ) για 48 ώρες. κυτταρικού κύκλου του TCS-κατεργασμένων κυττάρων προσδιορίστηκε με χρώση ΡΙ και κυτταρομετρία ροής. *

P

& lt?. 0,05 έναντι μη επεξεργασμένο έλεγχο

Η

Εστιάζοντας σε καρκίνο, up-to-ενημερωμένες πληροφορίες έχει επισημάνει ότι TCS έχει ασήμαντες επιπτώσεις στην καρκινογένεση και την άμεση γονιδιακή μετάλλαξη [2], [5], [6]. Ωστόσο, λαμβάνοντας υπόψη ότι η TCS είναι μια ουσία που οι άνθρωποι μπορούν να εκτεθούν σε για μεγάλο χρονικό διάστημα στη ζωή τους, είναι σημαντικό να κατανοήσουμε πλήρως τις πιθανές επιπτώσεις αυτού του παράγοντα όχι μόνο για την καρκινογένεση, αλλά και την πιθανή επίπτωση στην καρκινικών κυττάρων συμπεριφορές. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η μετάβαση του κυτταρικού φαινοτύπου από επιθηλιακά σε μεσεγχυματικά ονομάζεται επιθηλιακών-to-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) είναι ένας κρίσιμος παράγοντας για τη διευκόλυνση της μετάστασης των πολλών μορφών καρκίνου [7] – [9]. EMT έχει λάβει σημαντική προσοχή στην σχετιζόμενη με τον καρκίνο έρευνες και EMT έχει αναγνωριστεί ως ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα του βλαστική ικανότητα του καρκίνου, καθώς και επιθετικότητα [10]. EMT διαδικασία έχει ως αποτέλεσμα την αλλοίωση του κυττάρου συμπεριφορών που, στις περισσότερες περιπτώσεις, ενισχύει την ικανότητα μετάστασης, συμπεριλαμβανομένων ενίσχυσε τη μετανάστευση των κυττάρων από πρωτογενή όγκο του, και αυξημένη αντοχή σε απόπτωση [11] – [13].

τα περισσότερα στοιχεία έχουν προτείνει ότι η υπο πληθυσμός των καρκινικών κυττάρων που εμφανίζουν ανθεκτικά anoikis ιδιότητα είναι η πλειονότητα των κυττάρων που υφίστανται επιτυχή μετάσταση [14] – [18]. ανθεκτικά κύτταρα Anoikis είναι επίσης γνωστά ως κυκλοφορούντων κυττάρων όγκου (ΚΜΑ) [19]. Στην κλινική πρακτική, CTCs έχουν θεωρηθεί ότι είναι μια δυνητική βιοδείκτης που αντανακλά τον καρκίνο επιθετικότητα πολλών τύπων καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του μαστού, του προστάτη, του παχέος εντέρου, της ουροδόχου κύστης, γαστρικό, ήπατος και του πνεύμονα [20] – [24]. Η παρουσία και η ποσότητα των CTCs στο περιφερικό αίμα δείχνονται να συσχετίζονται καλά με κακή πρόγνωση σε ασθενείς με καρκίνο [19], [20]. Ο πληθυσμός της ΚΜΑ παρουσιάζουν ετερογενή φαινοτύπων κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των επιθηλιακών, μεσεγχυματικών, και αυτοί οι φαινότυποι σε μια μεταβατική κατάσταση από επιθηλιακά σε μεσεγχυματικά [20], [24] – [27]. Καθώς η διαδικασία της EMT ως αποτέλεσμα των φαινοτύπων μεσεγχυματικών με δυναμικότητες αύξηση μετάσταση, συμπεριλαμβανομένης της αντοχής anoikis και επεμβατική ικανότητα των κυττάρων [14], [20], [23] παράγοντες ή ερεθίσματα που διευκολύνουν αυτή την EMT στην ΚΜΑ μπορεί να μεταβάλλει τις φαινοτύπους του πληθυσμού ΚΜΑ και επηρεάζουν τα δυναμικά μετάστασης των κυττάρων. Καθώς CTCs βρέθηκε στη συστηματική κυκλοφορία [19], [24], [28], τα κύτταρα είναι πιθανό να εκτεθεί σε διάφορες χημικές ουσίες που υπάρχουν στο αίμα. Με βάση μια τέτοια ανησυχία, αρκετές ενώσεις έχουν διερευνηθεί και αναφερθεί ότι έχει μια ιδιότητα ΕΜΤ-επαγωγής όπως ΤΟΡ-β [29], [30], του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα [31], [32], η σελεκοξίμπη [33] gefitinib [ ,,,0],34] και το εξασθενές χρώμιο [35].

Αν και η παρουσία ορισμένων συγκεντρώσεων ΣΤΛ έχει αναφερθεί στην ανθρώπινη κυκλοφορίες, οι πληροφορίες σχετικά με τις επιπτώσεις ενός τέτοιου παράγοντα στη διαδικασία EMT της ΚΜΑ είναι ακόμη σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Η παρούσα μελέτη στοχεύει να διερευνήσει τις επιπτώσεις καθώς και τις πιθανές επιπτώσεις αυτής της ένωσης για την επιθετική του πληθυσμού των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα. Καλύτερη αντιλήψεις που προέρχονται από τη μελέτη αυτή μπορεί να συμβάλει στην ασφαλέστερη χρήση του TCS και να παρέχουν νέες προσεγγίσεις αξιολόγησης για τοξικότητα σχετιζόμενη με τον καρκίνο.

Υλικά και Μέθοδοι

1. Κύτταρα και αντιδραστήρια

ΝΟΙ-Η460 αποκτήθηκε από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Τα καρκινικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 2 mM L-γλουταμίνη, 100 IU /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη (τεχνολογίες Life, MD, USA) σε 37 ° C με 5% CO

2 υγροποιημένο επωαστήρα. Triclosan ελήφθη από την Sigma (St. Louis, ΜΟ, USA). TCS αραιώθηκε με στείρο μέσο για να επιτευχθούν οι συγκεντρώσεις που εργάζονται με 0.1% DMSO σε τελικό διάλυμα. Όσον αφορά τις πηγές των αντιδραστηρίων, Hoechst33342, ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ), phalloidin ισοθειοκυανική τετραμεθυλροδαμίνη Β, αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) και διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) αγοράστηκαν από την Sigma (St. Louis, ΜΟ, USA). 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ) αγοράστηκαν από την Gibco (τεχνολογίες Life, MD, USA). Matrigel ελήφθη από BD Biosciences, Inc. (Woburn, ΜΑ, USA). BCA κιτ δοκιμασίας και SuperSignal δυτικά χημειοφωταύγειας pico ελήφθη από Thermo Scientific, Inc. (Rockford, IL, USA). Κουνέλι μονοκλωνικά αντισώματα για την Ε-καντερίνη, Ν-cadherin, βιμεντίνη, γυμνοσάλιαγκας, σαλιγκάρι, Akt, φωσφορυλιωμένο Akt (S473), κινάσης εστιακής προσκόλλησης (ΡΑΚ), φωσφορυλιωμένη FAK (Y397), β-ακτίνη, συζευγμένο με υπεροξειδάση αντι-IgG κουνελιού και συζευγμένο με υπεροξειδάση IgG αντι-ποντικού ελήφθησαν από την Cell Signaling (Denvers, ΜΑ, USA). Mouse μονοκλωνικά αντισώματα για Active Rac1-GTP και Active Rho-GTP ελήφθησαν από NewEast Biosciences (Malvern, ΡΑ, USA). Immobilon Western υπόστρωμα χημειοφωταύγειας HRP ελήφθη από την Millipore, Corp (Billerica, ΜΑ, USA) και Thermo Fisher Scientific Inc. (Rockford, IL, USA).

2. ανθεκτικά κύτταρα Anoikis

Anoikis καλλιέργεια ανθεκτικών κυττάρων διεξάγεται σύμφωνα με τη μέθοδο του Sakuma et al. [36] και Khongmanee et al. [37] με μικρές τροποποιήσεις. Εν συντομία, η οποία επισυνάπτεται Η460 κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν όταν τα κύτταρα έφθασαν 80-90% συρροή με 0,05% θρυψίνη /0,02% EDTA. Στη συνέχεια, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ultralow προσάρτηση πλάκας 6-φρεατίων (Corning Costar, ΜΑ, USA) σε ΚΡΜΙ-1640 ενώ άλλες συνθήκες όπως περιγράφονται για καλλιέργεια προσάρτηση διατηρήθηκαν. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πυκνότητα 2 × 10

5 κύτταρα /ml για 48 ώρες. Αιωρούμενα κύτταρα στη συνέχεια συλλέγονται και παρασκευάζονται σε εναιώρημα μεμονωμένων κυττάρων μέχρι την 1η κατεργασία mM EDTA. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν με πλήρες RPMI-1640. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας αυτοματοποιημένο μετρητή κυττάρων. Βιώσιμα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω πειράματα.

3. δοκιμασία Κυτταρική βιωσιμότητα και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων δοκιμασία

Cells βιωσιμότητα προσδιορίστηκε με δοκιμασία ΜΤΤ. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 1 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο πάνω σε πλάκα 96 φρεατίων όλη τη νύκτα. Μετά από αυτό υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις του TCS για 24 ώρες. Μετά τη θεραπεία, το μέσο στη συνέχεια αντικαταστάθηκε με διάλυμα ΜΤΤ (5,0 mg /ml σε PBS) και επωάστηκαν στους 37 ° C για 4 ώρες. Στη συνέχεια, το μέσο αντικαταστάθηκε με 100 μΙ DMSO για την διαλυτοποίηση του προϊόντος φορμαζάνης και η ένταση του προϊόντος φορμαζάνης μετρήθηκε στα 570 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλάκας (Anthros, Durham, NC, USA). Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκφράστηκε ως το ποσοστό που υπολογίζεται από την οπτική πυκνότητα των επεξεργασμένων κυττάρων σε σχέση με τα ελεγχόμενα κύτταρα. Εν τω μεταξύ, η κυτταρική πολλαπλασιαστική δράση προσδιορίστηκε επίσης χρησιμοποιώντας ΜΤΤ δοκιμασία. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 2 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκα 96 φρεατίων και επωάζονται όλη τη νύκτα. Μετά από αυτό, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις του TCS για 0, 24, 48, και 72 ώρες. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ όπως περιγράφεται στην εκτίμηση της βιωσιμότητας του κυττάρου.

4. δοκιμασία πυρηνική χρώση

αποπτωτικών και νεκρωτικό κυτταρικό θάνατο προσδιορίστηκαν από Hoechst33342 και PI συν-χρώση. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 1 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο πάνω σε πλάκα 96 φρεατίων και επωάζονται όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με TCS για 24 ώρες. Μετά ειδικές επεξεργασίες, τα κύτταρα επωάστηκαν με 10 μg /ml του Hoechst33342 και 5 μg /ml ΡΙ για 30 λεπτά στους 37 ° C. Τα αποπτωτικά κύτταρα που έχουν συμπυκνωμένη χρωματίνη ή /και είναι κατακερματισμένοι πυρήνες και νεκρωτικές κύτταρα ΡΙ-θετικής έγιναν ορατά και σκόραρε κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Olympus IX51 με DP70, Olypus America Inc., Valley Center, PA, USA).

5. κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Μετά την κατεργασία των κυττάρων με TCS για 48 ώρες, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και σταθεροποιήθηκαν με 70% απόλυτης αιθανόλης στους -20 ° C όλη τη νύκτα. τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με ψυχρό PBS και επωάστηκαν σε διάλυμα που περιείχε ΡΙ 0,1% Triton-X, 1 μg /ml RNase και 1 mg /ml ιωδιούχου προπιδίου στους 37 ° C για 30 λεπτά. DNA σε ολόκληρα κύτταρα βάφτηκαν με ΡΙ και του κυτταρικού κύκλου προφίλ αναλύθηκε χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής (FACSort, Becton Dickinson, Rutherford, NJ, USA).

6. Colony δοκιμασία σχηματισμού

Κατά την επεξεργασία με TCS, ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη εξετάστηκε μέσω ανάλυσης σχηματισμού αποικίας σύμφωνα με την μέθοδο των Koleske et al. [38] με μικρές τροποποιήσεις. Εν συντομία, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TCS σε μη τοξικές συγκεντρώσεις για 24 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 1 mM EDTA για την παρασκευή εναιώρημα μεμονωμένων κυττάρων. Τα κύτταρα αιωρήθηκαν σε RPMI-1640 που περιείχε 10% FBS και 0,33% αγαρόζη, τότε 250 μΙ που περιείχε 1 χ 10

3 κύτταρα ενσωματώθηκαν ως δεύτερο στρώμα σε μια 24 φρεατίων πλάκα πάνω από ένα στρώμα 500 μΙ βάσης που περιέχει 10% FBS και 0.5% αγαρόζης. Τα κύτταρα τροφοδοτήθηκαν κάθε 3 ημέρες με την προσθήκη 250 μΐ πλήρους μέσου. Μετά από 7 και 10 ημέρες, οι προκύπτουσες αποικίες φωτογραφήθηκαν σε μεγέθυνση × 4. τον αριθμό των αποικιών και το μέγεθος των αποικιών προσδιορίστηκαν στο 10

ης ημέρας του πολιτισμού.

7. ΤΊΙοροάίβ χαρακτηρισμό

τΊΙοροάίβ χαρακτηρίστηκε από phalloidin-ροδαμίνης δοκιμασία χρώσης όπως περιγράφεται στο Kowitdamrong et al. [39]. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TCS σε μη τοξικές συγκεντρώσεις για 24 ώρες σε κατάσταση αποσπώνται και σπάρθηκαν σε πυκνότητα 2 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο πάνω σε πλάκα 96 φρεατίων για 4 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS, μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη σε PBS για 10 λεπτά στους 37 ° C, διαπερατά με 0,1% Τπίοη-Χ100 σε PBS για 4 λεπτά, και αποκλείστηκαν με 0,2% BSA για 30 λεπτά. Μετά από αυτό, τα κύτταρα επωάστηκαν με 1:100 φαλλοϊδίνης-ροδαμίνης σε PBS για 15 λεπτά και πλύθηκαν με PBS 3 φορές. ΤΊΙοροάίβ στη συνέχεια απεικονίζεται με ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Olympus IX51 με DP70).

8. δοκιμασία Μετανάστευση

Η μετανάστευση προσδιορίστηκε με δοκιμασία θαλάμου Boyden όπως προηγουμένως όπως περιγράφεται στο Kowitdamrong et al. [39]. Τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με TCS σε μη τοξικές συγκεντρώσεις για 24 ώρες σε αποκολληθούν κατάσταση. Στη συνέχεια, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 5 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο πάνω σε μία άνω πλάκα 24-φρεατίων του φίλτρου transwell (8-μΜ πόρου) σε μέσο που περιέχει 0.1% ορό και 500 μΐ πλήρους μέσου ήταν προστίθεται στον κάτω θάλαμο. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα που δεν μετανάστευσαν στην επάνω πλευρά της μεμβράνης του απομακρύνθηκαν με βαμβάκι-μάκτρο καθαρισμού. Τα κύτταρα που μετανάστευσαν στην κάτω πλευρά της μεμβράνης βάφτηκαν με 10 μg /ml Hoechst33342 για 30 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια ορατά και σκόραρε κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Olympus IX51 με DP70).

9. Εισβολή δοκιμασία

Η δοκιμασία εισβολή διεξήχθη χρησιμοποιώντας θαλάμους 24 Transwell όπως προηγουμένως όπως περιγράφεται στο Kowitdamrong et al. [39]. Transwells επικαλύφθηκαν με 50 μΙ 0,5% matrigel στην άνω επιφάνεια του θαλάμου και επωάζεται όλη τη νύκτα στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή. Μετά τη θεραπεία με TCS σε μη τοξικές συγκεντρώσεις για 24 ώρες σε αποσπασμένους κατάσταση, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 5 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο πάνω στον άνω θάλαμο σε μέσο που περιέχει 0.1% μΐ πλήρους μέσου ορού και 500 ήταν προστίθεται στον κάτω θάλαμο. Μετά από 24 ώρες, τα μη εισέβαλαν κύτταρα της άνω μεμβράνης απομακρύνθηκαν με βαμβάκι-μάκτρο καθαρισμού. Εισβολή κύτταρα στην βασεοπλευρική πλευρά μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν με ψυχρή απόλυτη μεθανόλη για 10 λεπτά και χρωματίστηκαν με 10 μg /mL Hoechst33342 για 30 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια ορατά και σκόραρε κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Olympus IX51 με DP70).

10. Western blot ανάλυση

Μετά ειδικές επεξεργασίες, τα κύτταρα επωάστηκαν σε ένα ρυθμιστικό λύσης που περιέχει 20 mM Tris-HCl (ρΗ 7.5), 1.5% Triton Χ-100, 150 mM χλωριούχο νάτριο, 10% γλυκερόλη, 1 mM νάτριο ορθοβαναδικό, 50 mM φθοριούχο νάτριο, 1 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο, και ένα εμπορικό μίγμα αναστολέα πρωτεάσης (Roche Applied Science, Indianapolis, ΙΝ, USA) επί 2 ώρες επί πάγου. Τα κυτταρολύματα συλλέχθηκαν και το περιεχόμενο πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Bradford (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης από κάθε δείγμα μετουσιώθηκαν με θέρμανση στους 95 ° C για 5 λεπτά με ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης και ακολούθως φορτώθηκε σε ηλεκτροφόρηση SDS-πολυακρυλαμιδίου 7.5% για την ανίχνευση των δεικτών ΕΜΤ και την έκφραση Ε-καδερίνης ή 10% SDS-πολυακρυλαμιδίου ηλεκτροφόρηση πήγματος για την ανίχνευση της έκφρασης μεταναστευτικών σχετίζονται πρωτεΐνης. Μετά το διαχωρισμό, οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν επάνω σε 0.45 μΜ μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Οι μεταφερόμενες μεμβράνες εμποδίστηκαν σε 5% άπαχο ξηρό γάλα σε TBST (25 mM Tris-HCL (ρΗ 7,5), 125 mM NaCl, 0.05% Tween 20) για 1 ώρα, και στη συνέχεια επωάζεται με ένα ειδικό πρωτογενές αντίσωμα (1: 1000 αραίωση) επί μία νύκτα στους 4 ° C. Οι μεμβράνες πλύθηκαν τρεις φορές με TBST για 5 λεπτά και επωάστηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα υπεροξειδάση αρμορακίας συζευγμένη ισότυπου-ειδικού (1:2,000 αραίωση) για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Οι μεμβράνες πλύθηκαν τρεις φορές με TBST για 5 λεπτά και τα ανοσοσύμπλοκα ανιχνεύθηκαν με ενίσχυση με υπόστρωμα χημιφωταύγειας και ποσοτικά με τη χρήση του λογισμικού αναλυτή /PC πυκνομετρία (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

11. Η στατιστική ανάλυση

Τα στοιχεία ελήφθησαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα και παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± τυπικό σφάλμα (SE). Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση μονόδρομης ANOVA και hoc τεστ μετά (τεστ της Τουρκίας) σε επίπεδο σημαντικότητας

P

-τιμές & lt? 0,05. SPSS 17.0 χρησιμοποιήθηκε για όλες τις στατιστικές αναλύσεις.

Αποτελέσματα

1. Επιδράσεις του TCS για anoikis ανθεκτικά κύτταρα Η460

Anoikis ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως μοντέλο για τη μελέτη ΚΜΑ [36], [37], [40]. Anoikis ανθεκτικά κύτταρα καρκίνου πνεύμονος δημιουργήθηκαν όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Διαπιστώθηκε ότι τα κύτταρα αποκολληθούν Η460 σχηματίζονται αυθόρμητα πολυκύτταρους συσσωματώματα μετά από καλλιέργεια για 48 ώρες (Εικόνα 1Β). Για να αποσαφηνιστεί η πιθανή επίδραση του TCS επί CTC καρκινικά κύτταρα πνεύμονα, κυτταροτοξική δράση της ένωσης επί των κυττάρων αρχικά χαρακτηρίστηκε. TCS στις συγκεντρώσεις που κυμαίνονται από 0.069 και 69 μΜ βρέθηκε στο πλάσμα του TCS-εκτεθειμένα άτομα [4]. Ως εκ τούτου, τα anoikis ανθεκτικά κύτταρα επωάστηκαν με TCS σε συγκεντρώσεις 0-10 μΜ για 24 ώρες και η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε με ανάλυση ΜΤΤ. Το Σχήμα 1 C δείχνει ότι η θεραπεία TCS μειώθηκε σημαντικά την επιβίωση των κυττάρων στη δόση των 10 μΜ, με περίπου το 80% των κυττάρων που παραμένουν βιώσιμα, ενώ η θεραπεία των κυττάρων με TCS σε 0-7,5 μΜ δεν προκάλεσε σημαντική τοξική επίδραση. δοκιμασία χρώσης /ΡΙ Hoechst33342 επιβεβαίωσε ότι η απόπτωση και νέκρωση δεν ήταν ανιχνεύσιμες στα TCS-κατεργασμένων κυττάρων στο 0-7,5 μΜ. Τα αποπτωτικά κύτταρα με αποσπασματικές ή συμπυκνωμένους πυρήνες ανιχνεύτηκαν μόνο στα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 10 μΜ TCS (Σχήματα 1D και Ε). Ως εκ τούτου, οι συγκεντρώσεις των TCS σε 0-7,5 μΜ χρησιμοποιήθηκαν για επόμενα πειράματα.

Έχοντας δείξει την τοξική επίδραση του TCS επί anoikis ανθεκτικών κυττάρων, ερευνήσαμε την επόμενη τις επιδράσεις της TCS επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και του κυτταρικού κύκλου. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με μη-τοξικές συγκεντρώσεις του TCS για 0-72 ώρες και ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. απάντηση πολλαπλασιασμό των ανθεκτικών anoikis κύτταρα να TCS φάνηκε στο σχήμα 1F. TCS-επεξεργασμένα κύτταρα δεν έδειξε σημαντική διαφορά από την άποψη του κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε σύγκριση με τα μη κατεργασμένα κύτταρα ελέγχου. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώθηκαν με ανάλυση του κυτταρικού κύκλου χρησιμοποιώντας ΡΙ και κυτταρομετρία ροής. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία TCS δεν προκάλεσε σημαντικές επιδράσεις επί του κυτταρικού κύκλου (Σχήματα 1 G και 1 Η). Μαζί, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι ΣΤΛ διέθετε κανένα πολλαπλασιαστικό αποτέλεσμα σε ανθεκτικά anoikis κύτταρα Η460 σε κανονικές συνθήκες καλλιέργειας.

2. TCS την προώθηση της ανάπτυξης των κυττάρων σε αγκυροβόλιο τρόπο ανεξάρτητο

Επειδή ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων έχει δειχθεί ότι αυξάνουν τη μετάσταση, έχουμε την επόμενη διερευνήθηκε η επίδραση του TCS στην ανάπτυξη καρκινικών κυττάρων σε τέτοια κατάσταση. Με τον τρόπο αυτό, anoikis ανθεκτικά κύτταρα Η460 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TCS για 24 ώρες πριν από την υποβλήθηκαν σε δοκιμασία σχηματισμού αποικίας. Τα κύτταρα στη συνέχεια σπείρονται σε στρώμα αγαρόζης για την πρόληψη της αλληλεπίδρασης κυττάρου-κυττάρου και προσκόλληση. αριθμός αποικιών και μέγεθος αποικιών ελήφθησαν με φωτογράφηση και μετρώντας μετά τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 7 και 10 ημέρες. Ο σχηματισμός αποικιών δείχθηκε στο Σχήμα 2Α. αριθμός αποικιών και το μέγεθος αποικίας κάθε θεραπείας υπολογίστηκαν ως ένα ποσοστό της ομάδας ελέγχου και δείχνεται στο Σχήμα 2Β και C, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι TCS στις συγκεντρώσεις των 5 και 7.5 μΜ αύξησε σημαντικά τον σχηματισμό αποικίας των anoikis ανθεκτικών κυττάρων Η460. Ωστόσο, TCS και στις δύο συγκεντρώσεις μείωσε σημαντικά το μέγεθος της αποικίας σε σχέση με εκείνη των μη επεξεργασμένων ομάδα ελέγχου. Τέτοιες παρατηρήσεις έδειξαν ότι TCS προωθείται αγκύρωση ανεξάρτητη επιβίωση των κυττάρων, αλλά μείωσε το ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων σε αποσπαστούν κατάσταση. Τα αποτελέσματά μας αποτελείται με τα προηγούμενα ευρήματα ότι η αύξηση της αγκύρωσης ανεξάρτητη επιβίωση με χαμηλή ικανότητα πολλαπλασιασμού έχει παρατηρηθεί στα καρκινικά κύτταρα που υφίστανται ΕΜΤ [11], [12], [41], [42].

(Α) τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με TCS (0-7,5 μΜ) για 24 ώρες και υποβάλλεται σε προσδιορισμού σχηματισμού αποικίας μαλακού άγαρ, όπως περιγράφεται στο «Υλικά και Μέθοδοι». Αντιπροσωπευτικά πεδία από τρία ανεξάρτητα πειράματα φωτογραφήθηκαν μετά τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 7 και 10 ημέρες. μπαρ κλίμακα είναι 1.000 μm. (Β-Γ) τον αριθμό των αποικιών και των αποικιών μέγεθος προσδιορίστηκαν με αναλυτή εικόνα στο 10

ης ημέρας του πολιτισμού. Οι τιμές είναι μέσοι των τριών ανεξάρτητων δειγμάτων εις τριπλούν ± SE. *

P

& lt?. 0,05 έναντι μη επεξεργασμένο έλεγχο

Η

3. TCS αναστολή της αλληλεπίδρασης κυττάρου-κυττάρου

Απώλεια προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου βρέθηκε στα κύτταρα κατά την διάρκεια της διαδικασίας της ΕΜΤ ως αποτέλεσμα από καντερίνη μεταγωγής [7], [8]. Για να εξεταστεί η επίδραση του TCS επί κυττάρου-κυττάρου προσκόλληση του anoikis ανθεκτικών Η460 κύτταρα, εμείς σπείρονται κύτταρα σε 24-φρεατίων χαμηλής αποδίδουν πλάκα σε πυκνότητα 1,5 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο και τους αντιμετωπίζονται με μη τοξικές συγκεντρώσεις του TCS. Η αλληλεπίδραση κυττάρου-κυττάρου παρατηρήθηκε σε σχηματισμό κυτταρικής συσσωμάτωσης και φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης. Συγκεντρωτικά μέγεθος και τον αριθμό προσδιορίστηκαν και υπολογίστηκε σε σχέση με τον έλεγχο μη επεξεργασμένων. Το Σχήμα 3Α δείχνει ότι η θεραπεία TCS μεταβάλλονται σημαντικά τη συνολική συμπεριφορά των κυττάρων σε εναιώρημα μεμονωμένων κυττάρων. Η προσθήκη του TCS είχε ως αποτέλεσμα τη σημαντική μείωση τόσο του αριθμού και του μεγέθους των πολυκύτταρων συσσωματώματα με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 3Β και C). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι TCS προωθείται απώλεια του κυττάρου-κυττάρου προσκόλληση του anoikis ανθεκτικών κυττάρων Η460 που είναι ένα κυρίαρχο χαρακτηριστικό των κυττάρων που υφίστανται EMT.

(Α) κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με TCS (0-7,5 μΜ) για 12 , 24 ή 48 ώρες σε αποσπασμένους αλληλεπίδραση κατάσταση και κυττάρου-κυττάρου φωτογραφήθηκε. μπαρ κλίμακα είναι 1.000 μm. (Β-Γ) Μετά τη θεραπεία με TCS (0-7,5 μΜ) για 24 ώρες σε μονοκατοικία κατάσταση, συνολικό μέγεθος και συνολικό αριθμό προσδιορίστηκαν με αναλυτή εικόνας. Τα δεδομένα του παρόντος μέσω των τριών ανεξάρτητων δειγμάτων εις τριπλούν ± SE. *

P

& lt?. 0,05 έναντι μη επεξεργασμένο έλεγχο

Η

4. TCS αύξηση της έκφρασης της EMT δεικτών

Είμαστε δίπλα διερευνήθηκε η επίδραση της θεραπείας με TCS σε δείκτες EMT, συμπεριλαμβανομένων Ν-cadherin, βιμεντίνη, σαλιγκάρι και γυμνοσάλιαγκα. Anoikis κύτταρα ανθεκτικά Η460 υποβλήθηκαν σε αγωγή με μη-τοξικές συγκεντρώσεις του TCS για 24 ώρες και δείκτες ΕΜΤ αξιολογήθηκαν με κηλίδωση Western. Τα Σχήματα 4Α και Β δείχνουν ότι το επίπεδο έκφρασης της Ε-καδερίνης μειώθηκε σημαντικά σε απόκριση σε θεραπεία TCS σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο. Επιπλέον, TCS ενίσχυσε σημαντικά την αύξηση του Ν-cadherin, βιμεντίνη, γυμνοσάλιαγκα, και σαλιγκάρι. Η έκφραση του σαλιγκαριού ενισχύθηκε σημαντικά με θεραπεία TCS στα 5 και 7,5 μΜ σε έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, ενώ η έκφραση του γυμνοσάλιαγκα ήταν μόνο σημαντικά επάγεται από την αγωγή με TCS σε 7,5 μΜ. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι TCS αυξημένη φαινότυποι ΕΜΤ σε αυτά τα κύτταρα.

(Α) Anoikis κύτταρα ανθεκτικά Η460 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TCS (0-7,5 μΜ) για 24 ώρες σε αποκολληθούν κατάσταση. Το επίπεδο της Ν-καδερίνης, E-cadherin, βιμεντίνη, γυμνοσάλιαγκα και σαλιγκάρι προσδιορίστηκαν με κηλίδωση Western. Οι κηλίδες ανιχνεύθηκαν και πάλι με β-ακτίνης για να επιβεβαιωθεί ίση φόρτωση. (Β) Τα σήματα ανοσοστυπώματος ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρία και μέση δεδομένα από ανεξάρτητα πειράματα κανονικοποιήθηκαν στα αποτελέσματα. Τα δεδομένα του παρόντος μέσω των τριών ανεξάρτητων δειγμάτων εις τριπλούν ± SE. *

P

& lt?. 0,05 έναντι μη επεξεργασμένο έλεγχο

Η

5. TCS-μεσολάβηση EMT ενίσχυση κύτταρα μετανάστευση και την εισβολή

Ένα σημαντικό χαρακτηριστικό των επιθετικών καρκινικών κυττάρων είναι υψηλή ικανότητά τους να μεταναστεύουν και να εισβάλλουν [43], [44]. EMT αναγνωρίζεται ως σημαντικός παράγοντας που διευκολύνει την κινητικότητα των κυττάρων [12], [45]. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TCS σε μη τοξικές συγκεντρώσεις για 24 ώρες και οι μετανάστευση και εισβολή συμπεριφορές των κυττάρων προσδιορίστηκαν όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Το σχήμα 5Α δείχνει ότι TCS-επεξεργασμένα κύτταρα εμφάνισαν αυξημένη πολικότητα και filopodia. Filopodia των TCS-επεξεργασμένα κύτταρα βάφτηκε με φαλλοειδίνη-ροδαμίνη, όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Β. TCS-επεξεργασμένα κύτταρα εμφάνισαν προεξοχές filopodia συσσώρευση στα σύνορα των κυττάρων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Επιπρόσθετα, η μετανάστευση και προσδιορισμός εισβολή αποκάλυψε ότι TCS αυξημένη κυτταρική μετανάστευση και εισβολή (Σχήματα 5C και D). Τα παραπάνω ευρήματα υποδεικνύουν ότι η επαγωγή EMT κατά την επεξεργασία TCS προώθησε το σχηματισμό τΊΙοροάίβ και ενίσχυσε μεταναστευτικών και επεμβατική ικανότητες των ανθεκτικών anoikis κυττάρων Η460.

(Α) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με TCS σε 0-7,5 μΜ για 24 ώρες και στη συνέχεια επισυνάπτεται σε συμβατικά τρυβλία καλλιέργειας για 4 ώρες. μορφολογία των κυττάρων ανιχνεύθηκε με μικροσκοπία αντίθεσης φάσης. μπαρ κλίμακα είναι 25 μm. (Β) Μετά την ενδεικνυόμενη θεραπεία, filopodia και βιώσιμα κύτταρα ανιχνεύθηκαν με φαλλοειδίνη-ροδαμίνη ή χρώση Hoechst33342, αντίστοιχα. Τα κύτταρα έγιναν ορατά κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού. προεξοχές filopodia από κάθε επεξεργασία υποδεικνύονται με βέλη. μπαρ κλίμακα είναι 5 μm. (C) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με TCS (0-7,5 μΜ) για 24 ώρες. δοκιμασία Transwell χρησιμοποιήθηκε για να ερευνήσει την κυτταρική μετανάστευση. Τα μεταναστευτικά κύτταρα στην βασεοπλευρική πλευρά μεμβράνης βάφτηκαν με Hoechst33342 και οπτικοποιήθηκαν υπό μικροσκοπία φθορισμού. μπαρ κλίμακα είναι 50 μm. Οι μέσοι αριθμοί των μεταναστευτικών κυττάρων σε κάθε πεδίο στο βασεοπλευρική πλευρά μεμβράνης χαράχθηκαν σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Οι τιμές είναι μέσοι των τριών ανεξάρτητων δειγμάτων εις τριπλούν ± SE. *

P

& lt? 0,05 έναντι μη επεξεργασμένο έλεγχο. (Δ) Μετά την επεξεργασία με TCS (0-7,5 μΜ) για 24 ώρες, η κυτταρική εισβολή αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας transwell επικαλυμμένα με Matrigel, όπως περιγράφεται στο «Υλικά και Μέθοδοι». Εισβολή κύτταρα στην βασεοπλευρική πλευρά μεμβράνης βάφτηκαν με Hoechst33342 και οπτικοποιήθηκαν υπό μικροσκοπία φθορισμού. μπαρ κλίμακα είναι 50 μm. Οι μέσοι αριθμοί των εισέβαλαν κυττάρων σε κάθε πεδίο κατά μήκος της μεμβράνης απεικονίσθηκαν σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Οι τιμές είναι μέσοι των τριών ανεξάρτητων δειγμάτων εις τριπλούν ± SE. *

P

& lt?. 0,05 έναντι μη επεξεργασμένο έλεγχο

Η

Επιπλέον, οι πρωτεΐνες τελεστές κατάντη οι οποίες είναι υπεύθυνες για την κινητικότητα των κυττάρων προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας western αποτύπωση. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με δεικνυόμενες συγκεντρώσεις του TCS για 24 ώρες και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western. Τα επίπεδα έκφρασης των αποδημητικών σχετίζονται πρωτεΐνες που περιλαμβάνουν ενεργοποιημένα FAK (φωσφορυλιωμένου ΡΑΚ, Tyr 397), ΡΑΚ, ενεργοποιημένα Akt (φωσφορυλιωμένο Akt, Ser 473), Akt, ενεργοποιημένα Rac1 (Rac1-GTP), και ενεργοποιημένου RhoA (RhoA-GTP) ήσαν διερευνώνται. Τα σχήματα 6Α και Β δείχνουν ότι η θεραπεία TCS αύξησε σημαντικά το επίπεδο της φωσφορυλιωμένης ΡΑΚ, ενεργοποιείται Akt, και την ενεργό Rac1-GTP. Ωστόσο, TCS διέθετε καμία σημαντική επίδραση στην ενεργοποιημένη επίπεδο RhoA. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι TCS επαγόμενη EMT προώθησε την κινητικότητα των anoikis ανθεκτικών κυττάρων Η460 μέσω της ενεργοποίησης του FAK /Akt μονοπάτι σηματοδότησης καθώς και την ενεργοποίηση Rac1.

ανθεκτικά (Α) Anoikis κύτταρα Η460 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TCS σε 0 -7,5 μΜ για 24 ώρες σε αποσπασμένους κατάσταση και στη συνέχεια να επισυνάπτονται σε συμβατικά πιάτα καλλιέργειας για 4 ώρες. Το επίπεδο της pFAK (Tyr 397), FAK, pAkt (Ser 473), Akt, ενεργοποιημένα Rac1 (Rac1-GTP) και ενεργοποιημένων RhoA (RhoA-GTP) προσδιορίστηκαν με κηλίδωση Western. Οι κηλίδες ανιχνεύθηκαν και πάλι με β-ακτίνης για να επιβεβαιωθεί ίση φόρτωση. (Β) Τα σήματα ανοσοστυπώματος ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρία και μέση δεδομένα από ανεξάρτητα πειράματα κανονικοποιήθηκαν στα αποτελέσματα. Οι τιμές είναι μέσοι των τριών τριπλών ανεξάρτητα δείγματα ± SE. *

P

& lt?. 0,05 έναντι μη επεξεργασμένο έλεγχο

Η

Συζήτηση

Ο καρκίνος του πνεύμονα έχει συγκεντρώσει τα περισσότερα προσοχή στον τομέα της έρευνας του καρκίνου αφού αυτό το είδος των καρκίνων θεωρείται ως σημαντική αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θνησιμότητα [46]. Πράγματι, το υψηλό ποσοστό μετάστασης σε ένα τέτοιο καρκίνο καθιστά το πιο απειλητικές για τη ζωή και στις περισσότερες περιπτώσεις μετάσταση ανιχνεύεται κατά τον χρόνο της πρώτη διάγνωση [47]. Επειδή η ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να κάνουν μετάσταση μπορεί να αυξηθεί με τη διαδικασία της ΕΜΤ [9], [12], [48], η παρούσα μελέτη αναφοράς το θετικό ρυθμιστικό αποτέλεσμα του TCS στην ΕΜΤ ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων αναδεικνύει την πιθανή νέα τοξικότητα που προκαλείται από την ένωση αυτή.

TCS έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για πάνω από 30 χρόνια σε προϊόντα φροντίδας της υγείας, καθώς και σε ιατρικές συσκευές. TCS είναι εύκολα και απορροφάται πλήρως μετά τη χορήγηση από το στόμα. TCS έχει ταυτοποιηθεί στα ούρα, πλάσμα, και το μητρικό γάλα στον άνθρωπο με ένα ευρύ φάσμα των επιπέδων ανάλογα με την ημερήσια πρόσληψη του ατόμου, η συγκέντρωση του στα προϊόντα, καθώς και η οδός και η συχνότητα χορήγησης [2], [3]. Τα χαμηλά και υψηλές συγκεντρώσεις TCS στο ανθρώπινο πλάσμα έχει αναφερθεί σε 0,02 και 20 μg /ml (0.069 και 69 μΜ), αντιστοίχως [4]. Προηγούμενες μελέτες ανέφεραν τις πιθανές επιπτώσεις της ΣΤΛ στην επαγωγή του ηπατοκυτταρικού αδενώματος και καρκινώματος σχηματισμούς στο μοντέλο τρωκτικών [2]. Πρόσφατα, Ma et al. (2013) βρήκαν ότι οι ΣΤΛ μειωμένη μεθυλίωση παγκόσμια DNA (GDM) σε κύτταρα HepG2 και πρότεινε τη μείωση ως πιθανός μηχανισμός TCS προώθηση όγκου σε τρωκτικά [49]. Από παγκόσμια υπομεθυλίωση του DNA συνδέεται με μη φυσιολογική γονιδιακή έκφραση, η απώλεια της αποτύπωσης, χρωμόσωμα αστάθεια και ανωμαλίες, έχει αποδειχθεί ότι διαδραματίζουν βασικό ρόλο στον έλεγχο της ΕΜΤ και τον καρκίνο της μετάστασης [50].