Αφηρημένο

Η ρύθμιση προς τα κάτω των microRNA-196b (miR-196b) έχει αναφερθεί, αλλά η συμβολή της στην του τραχήλου της μήτρας εξέλιξης του καρκίνου μένει να διερευνηθεί. Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε κατ ‘αρχάς ότι το miR-196b κάτω ρύθμιση ήταν σημαντικά σχετίζεται με χειρότερη ελεύθερη νόσου επιβίωση (DFS) για τους ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας που έλαβαν θεραπεία με συνδυασμό χημειο-ακτινοβολία. Δεύτερον, χρησιμοποιώντας ένα τρι-τροπική προσέγγιση για την αναγνώριση στόχου, διαπιστώσαμε ότι ομοιοκυτίου-Β7 (HOXB7) ήταν

καλόπιστους

στόχος για miR-196β, και με τη σειρά του, αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) ήταν κατάντη μεταγραφή ρυθμίζεται από HOXB7. Ανασύσταση του miR-196b έκφραση με παροδική επιμόλυνση είχε σαν αποτέλεσμα μειωμένη ανάπτυξη των κυττάρων, κλωνογονικότητας, τη μετανάστευση και εισβολή

in vitro

, καθώς και μειωμένη αγγειογένεση όγκων και όγκων του πολλαπλασιασμού των κυττάρων

in vivo

. Να συμπίπτει, siRNA knockdown του HOXB7 ή VEGF phenocopied τα βιολογικά αποτελέσματα του miR-196b υπερ-έκφραση. Τα ευρήματά μας έδειξαν ότι η miR-196b /HOXB7 /VEGF οδός παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας? ως εκ τούτου, με στόχο αυτό το μονοπάτι θα μπορούσε να είναι μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική στρατηγική για τη μελλοντική διαχείριση της ασθένειας αυτής

Παράθεση:. Πώς C, Hui ABY, Alajez NM, Shi W, Μπούτρος PC, Clarke ΒΑ, et al. (2013) microRNA-196β ρυθμίζει την ομοιοκυτίου Β7-αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα του Άξονα στον Καρκίνο του Τραχήλου της Μήτρας. PLoS ONE 8 (7): e67846. doi: 10.1371 /journal.pone.0067846

Επιμέλεια: Rolf Müller, Πανεπιστήμιο Philipps, Γερμανία

Ελήφθη: 11 Ιαν 2013? Αποδεκτές: 21η Μάη, 2013? Δημοσιεύθηκε: 4 Ιουλ 2013

Copyright: © 2013 Πώς et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τα ταμεία της από το Ινστιτούτο του Οντάριο για την Έρευνα του Καρκίνου (Αριθμός Grant: 10Nov-399). Christine Πώς είναι CIHR Στρατηγική Κατάρτισης Fellow στο Αριστεία στην ακτινοβολία Έρευνα για το Πρόγραμμα του 21ου αιώνα (EIRR21), και υποστηρίζεται από το Ταμείο Υποτροφιών Lawrence, Ila και William Gifford. Υποστήριξη παρέχεται επίσης από την Campbell Οικογένεια Ινστιτούτο για την Έρευνα του Καρκίνου και του Υπουργείου Υγείας και τη Μακροχρόνια Σχεδιασμού. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Παγκοσμίως, ο καρκίνος του τραχήλου της μήτρας είναι ο τρίτος πιο συχνά διαγιγνώσκεται κακοήθεια και η τέταρτη κύρια αιτία θνησιμότητας από καρκίνο στις γυναίκες, με κατ ‘εκτίμηση 530.000 νέες περιπτώσεις και 275.000 θανάτους κάθε χρόνο [1]. Αν και του τραχήλου της μήτρας ποσοστά εμφάνισης καρκίνου και θνησιμότητας έχουν μειωθεί κατά τα τελευταία τριάντα χρόνια στις Ηνωμένες Πολιτείες [2], το ποσοστό επιβίωσης 5 ετών παρέμεινε κάτω του 40% για τους ασθενείς που έχουν διαγνωστεί με σταδίου ΙΙΙ ή IV της νόσου [3]. Οι νέες γνώσεις που απαιτούνται για την καλύτερη κατανόηση των μηχανισμών που συμβάλλουν στην εξέλιξη της νόσου, με σκοπό το σχεδιασμό βελτιωμένων θεραπειών για ασθενείς με τοπικά προχωρημένο καρκίνο του τραχήλου της μήτρας.

μικρο-RNAs (miRNAs) είναι μικρή, μη-κωδικοποίησης RNA που ρυθμίζουν γονιδιακή έκφραση μετα-μεταγραφικά [4], [5], και η έκφραση παρεκκλίνουσα miRNA έχει δειχθεί ότι είναι σημαντική σε πολλές ανθρώπινες κακοήθειες [6]. Οι στόχοι Gene που συμβάλλουν στην εξέλιξη του όγκου έχουν περιγραφεί για αρκετά miRNAs [7], [8], [9]? Ωστόσο, η βιολογική λειτουργία της πλειοψηφίας των miRNAs παραμένει άγνωστη. Μία από τις μεγαλύτερες προκλήσεις για την ταυτοποίηση στόχου miRNA είναι η ικανότητα των miRNAs να δεσμεύσει τους στόχους του mRNA με ατελή συμπληρωματικότητα? ως εκ τούτου, μια ενιαία miRNA μπορεί δυνητικά να ρυθμίσει αρκετές εκατοντάδες ή χιλιάδες γονίδια [10]. Δυστυχώς, η επί του παρόντος διαθέσιμη

in silico

miRNA αλγορίθμων πρόβλεψης στόχο έχουν υψηλή ψευδώς ανακάλυψη και ψευδώς αρνητικά ποσοστά [11], [12]? η υποχρεωτική έτσι πειραματική επιβεβαίωση των στόχων των miRNAs.

κάτω ρύθμιση του miR-196b στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας έχει αναφερθεί στο παρελθόν [13], αλλά ο ρόλος της στην εξέλιξη του όγκου σε αυτή τη νόσο δεν έχει διερευνηθεί προηγουμένως. Εδώ, αναφέρουμε τα κάτω ρύθμιση miR-196b σε πρωτογενή ανθρώπινα τραχήλου της μήτρας καρκινικούς ιστούς και κυτταρικές σειρές. Επιπλέον, προσδιορίσαμε τον παράγοντα μεταγραφής HOXB7 ως νέο, άμεσο και συγκεκριμένο στόχο του miR-196β, το οποίο με τη σειρά του, ρυθμίζει VEGF σε καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Το πιο σημαντικό, miR-196b κάτω ρύθμιση σχετίστηκε με χειρότερη DFS σε ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με χημειο-ακτινοβολία, τονίζοντας τη βιολογική σημασία του miR-196b στο τραχήλου της εξέλιξης του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από τους ασθενείς, σύμφωνα με ένα πρωτόκολλο που εγκρίθηκε για αυτή τη μελέτη από το Διοικητικό συμβούλιο Δεοντολογίας Έρευνας Πανεπιστήμιο Δίκτυο Υγείας. Πειράματα με ζώα διεξήχθησαν αυστηρά σύμφωνα με το πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από την επιτροπή Animal Care (ACC) του Ινστιτούτου Οντάριο Καρκίνου, Πανεπιστήμιο Δίκτυο Υγείας (Πρωτόκολλο ζώων Χρήση: 342,18).

Γραμμές κυττάρων και διαμολύνσεις

Ανθρώπινα τραχήλου καρκινικές κυτταρικές σειρές (ME-180, SiHa, και ΗΤ-3) ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATTC), και αναπτύχθηκαν σε α-ΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS στους 37 ° C, 5% CO

2. Όλα τα κύτταρα επικυρώνεται κάθε έξι μήνες στο Κέντρο Εφαρμοσμένης Γονιδιωματική (Νοσοκομείο για Άρρωστα Παιδιά, Toronto, Canada) χρησιμοποιώντας το AmpF /STR Identifier Ενίσχυση PCR Kit (Applied Biosystems), και αποφασισμένος να είναι απαλλαγμένο από

Mycoplasma

μόλυνση χρησιμοποιώντας το MycoAlert Mycoplasma Detection Kit (Lonza). κύτταρα ΜΕ-180 και SiHa επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας το 2000 (Invitrogen) προς τα εμπρός πρωτόκολλο διαμόλυνσης LipofectAMINE, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Προ-miR Αρνητικός μάρτυρας # 1 (NC), Pre-miR-196b (Ambion), όλα τα αστέρια Αρνητικός μάρτυρας (siNEG), siHOXB7 και siVEGF (Qiagen) ήταν όλα επιμολύνθηκαν σε μια τελική συγκέντρωση 30 nmol /L.

miRNA Έκφραση προφίλ κυτταρικών γραμμών

Ολικό RNA απομονώθηκε από SiHa, ME-180 και του τραχήλου της μήτρας καρκινικές κυτταρικές σειρές ΗΤ3 χρησιμοποιώντας το mirVana miRNA κιτ απομόνωσης (Ambion) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. FirstChoice® ολικό RNA: Ανθρώπινα φυσιολογικό τράχηλο Tissue (Ambion) από 3 διαφορετικούς δότες ιστών χρησιμοποιήθηκε ως κανονική σύγκρισης. Τα επίπεδα έκφρασης του 377 miRNAs και 3 snoRNAs (έλεγχοι) αναλύθηκαν στην αυχενική καρκινικές κυτταρικές γραμμές και κανονικά τραχήλου ιστούς χρησιμοποιώντας την πυκνότητα Array TaqMan® Low (TLDA) Ανθρώπινη microRNA Panel (Applied Biosystems), με την Applied Biosystems 7900HT Real-Time PCR σύστημα, όπως έχουμε περιγράψει στο παρελθόν [14].

miRNA έκφραση προφίλ των ιστών του ασθενούς

Flash κατάψυξης βιοψίες ελήφθησαν από ασθενείς με τοπικά προχωρημένο καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, που είχαν προγραμματιστεί να λάβουν πρωτοβάθμια επεξεργασία με πρότυπο χημειο-ακτινοβολία, που αποτελείται από ακτινοθεραπεία εξωτερικής δέσμης στην πρωτογενή τραχηλικό όγκο και πυελική λεμφαδένες (45 έως 50 Gy σύνολο, σε 1,8-προς-2-Gy καθημερινά κλάσματα με 18-έως-25-MV φωτόνια), σε συνδυασμό με εβδομαδιαίες δόσεις σισπλατίνης (40 mg /m

2 συνολικά 5 δόσεις). ΦΥΓΩ (Διεθνής Ομοσπονδία των Γυναικολόγων και Μαιευτήρων) στάσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας έναν συνδυασμό: προεπεξεργασίας αξιολόγησης υπό αναισθησία, αξονική τομογραφία (CT) της κοιλιάς και της λεκάνης, ακτινογραφία θώρακος, και η μαγνητική τομογραφία (MRI) της πυέλου. MRI χρησιμοποιήθηκε επίσης για να προσδιορισθεί η κατάσταση των λεμφαδένων? πυελική και παρα-αορτική λεμφαδένες είχαν ταξινομηθεί ως θετικά για μεταστατική νόσο εάν η διάσταση MRI βραχύ άξονα ήταν & gt? 1 cm και διφορούμενη αν ήταν 8 έως 10 mm. Μετά βιοψίας, τα δείγματα τοποθετήθηκαν σε βέλτιστη θερμοκρασία κοπής (OCT) μέσο αποθήκευσης για ιστοπαθολογική εξέταση, τότε φλας-καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο. H & amp? E-τομές ιστών κόπηκαν από τον Οκτώβριο-ενσωματωμένο υλικό και αξιολογούνται από ένα γυναικολογικό παθολόγο (Β Clarke). Συνολική περιεκτικότητα των κυττάρων (στρώμα και καρκινικά κύτταρα) υπολογίστηκε για όλα τα δείγματα ιστού χρησιμοποιώντας ένα οπτικό μικροσκόπιο, και μόνο τα δείγματα που περιέχουν & gt? Καρκινικών κυττάρων 70% ελήφθησαν υπόψη για περαιτέρω ανάλυση (n = 79). Τα κλινικά χαρακτηριστικά αυτών των 79 ασθενών που παρέχονται στον Πίνακα 1. Ο μέσος χρόνος παρακολούθησης για αυτή την ομάδα ήταν 3 χρόνια. Flash-κατεψυγμένα φυσιολογικό τράχηλο ιστούς που λαμβάνονται από 11 ασθενείς οι οποίοι υποβλήθηκαν σε υστερεκτομή για καλοήθη αίτια υπηρέτησε ως κανονική σύγκρισης.

Η

Δύο τμήματα πάχους 50 micron κόπηκαν από τις ΥΧΕ-ενσωματωμένο flash-κατεψυγμένα ιστούς και τοποθετείται σε μια άνευ νουκλεάσης μικροσωλήνα. Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το Norgen Ολικό RNA Purification Kit (Norgen Biotek), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. έκφραση Παγκόσμια miRNA μετρήθηκε στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας και του τραχήλου της κανονικής τους ιστούς με την TaqMan® χαμηλής πυκνότητας Array (TLDA) Ανθρώπινη microRNA A v2.0 Array (Applied Biosystems) με τη χρήση του Applied Biosystems 7900HT Real-Time PCR System, όπως ήδη περιγράφηκε [14 ].

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR Ανάλυση των miRNAs και mRNAs

το ολικό RNA απομονώθηκε από τις κυτταρικές γραμμές χρησιμοποιώντας το Total RNA Purification Kit (Norgen Biotek), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η έκφραση του miR-196b μετρήθηκε με ποσοτική πραγματικού χρόνου αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR qRT-) χρησιμοποιώντας το πρότυπο Δοκιμασία TaqMan microRNA (Applied Biosystems). Εν συντομία, το RNA μεταγράφηκε αντίστροφα πρώτα χρησιμοποιώντας τον TaqMan microRNA Αντίστροφη Μεταγραφή (RT) Kit και ενός εκκινητή stem-loop ειδικών για miR-196b (Applied Biosystems) [15]. Το 2

-ΔΔCt μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό των σχετικών επιπέδων του miR-196β έκφραση, χρησιμοποιώντας RNU44 ως γονίδιο αναφοράς [16].

Τα προϊόντα RT ενισχύθηκαν με miR-196b-ειδικούς εκκινητές, όπως περιγράψαμε προηγουμένως [14]. Τα επίπεδα έκφρασης του προηγουμένως περιγράφεται (c-myc, BCL2, HOXA9, MEIS1), και τους στόχους υποψήφιος mRNA για miR-196β (ANKHD1, CTDSP2, FGFR1, HDAC, HOXA7, HOXB7, KRT8, PUM2, SLC9A6, SMC3, SMG7, SR140), και HOXB7 (VEGF, Κυ70, Κυ80, ϋΝΑ-ΡΚ, FGF2, ΜΜΡ2, WNT5a, PDGFA, THBS2) μετρήθηκαν επίσης με qRT-PCR. Ένα μικρογραμμάριο του συνολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας Superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ποσοτική RT-PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) και εκκινητές PCR (Πίνακας S1) σχεδιάστηκε χρησιμοποιώντας Primer 3 Input. Το 2

-ΔΔCt μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό των σχετικών επιπέδων της έκφρασης γονιδίου, με GAPDH ως γονίδιο αναφοράς [16].

Κυττάρων βιωσιμότητα, τον πολλαπλασιασμό και Σχηματισμού Αποικίας Δοκιμασίες

Η βιωσιμότητα των επιμολυσμένων κυττάρων αξιολογήθηκε με την δοκιμασία αποκλεισμού του μπλε της Τρυπάνης. κύτταρα ΜΕ-180 και SiHa επιμολύνθηκαν εις τριπλούν με 30 nmol /L προ-miR-196β, NC, siHOXB7, siVEGF, ή siNEG και επωάστηκαν στους 37 ° C, 5% CO

2. Στις 48 και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, χρωματίστηκαν με Trypan blue και μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας αιμοκυτταρόμετρο. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εξετάσθηκε με τη χρήση της Δοκιμασίας CellTiter 96 μη ραδιενεργού κυτταρικού πολλαπλασιασμού (MTS προσδιορισμού) (Promega Biosciences), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για δοκιμασίες σχηματισμού αποικίας, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 30 nmol /L προ-miR-196β, Pre-miR Αρνητικός μάρτυρας # 1, siHOXB7, siVEGF, ή siNEG και επωάστηκαν στους 37 ° C, 5% CO

2. Στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα εκ νέου σπάρθηκαν σε χαμηλή πυκνότητα σε τρυβλία 6 φρεατίων εις τριπλούν. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C, 5% CO

2 για 10-12 ημέρες, στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες σε 50% μεθανόλη. Ο αριθμός των αποικιών που περιέχουν τουλάχιστον 50 κύτταρα μετρήθηκε, και το κλάσμα που επιβίωσαν υπολογίστηκε με σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με αρνητικό μάρτυρα.

κυτταρική μετανάστευση και εισβολή Δοκιμασίες

BD Biocoat Matrigel εισβολής Chambers και Έλεγχος Ένθετα (BD Biosciences) χρησιμοποιήθηκαν για τη μετανάστευση και εισβολή δοκιμασία των επιμολυσμένων κυττάρων. Επιμελητήρια περιείχε μια μεμβράνη από τερεφθαλικό πολυαιθυλένιο με 8 μm πόρους. κύτταρα ΜΕ-180 και SiHa επιμολύνθηκαν με 30 nmol /L προ-miR-196β, NC, siHOXB7, siVEGF, ή siNEG και επωάστηκαν στους 37 ° C, 5% CO

2. Στις 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, 1.5 × 10

5 κύτταρα επανα-σπείρονται μέσα σε κάθε θάλαμο με μέσο που περιέχει χαμηλή ορού (1% FBS). Οι θάλαμοι τοποθετήθηκαν σε μια πλάκα 24 φρεατίων, με υψηλή ορό (20% FBS) μέσο σε κάθε κατώτερο θάλαμο να χρησιμεύσει ως χημειο-προσελκυστικό. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C, 5% CO

2 για 48 ώρες, στη συνέχεια οι μεμβράνες πλύθηκαν, χρωματίστηκαν, και συναρμολογείται επί slides. Ένα οπτικό μικροσκόπιο χρησιμοποιήθηκε για να μετρήσει τον αριθμό των μεταναστεύει ή εισβάλλοντας κυττάρων. Σχετική μετανάστευση υπολογίστηκε με σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με τον αρνητικό μάρτυρα. Ποσοστό εισβολή υπολογίστηκε ως ο αριθμός των κυττάρων που εισέβαλαν μέσω του ενθέτου Matrigel, διαιρείται με τον αριθμό των κυττάρων που μετανάστευσαν μέσω του ενθέτου ελέγχου.

Κύκλου Κυττάρου Ανάλυση

Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου διεξήχθη επί κύτταρα μΕ-180 και SiHa μετά την επιμόλυνση με 30 nmol /L προ-miR-196β ή NC, για τη μέτρηση του κλάσματος των κυττάρων στην υπο-G

1 φάση του κυτταρικού κύκλου. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν δύο φορές σε ρυθμιστικό διάλυμα FACS (PBS /0.5% BSA), αιωρούνται εκ νέου εντός 1 mL ρυθμιστικού διαλύματος FACS, στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν σε 1 mL παγωμένου 70% αιθανόλη. Μετά από 1 ώρα επώασης σε πάγο, τα κύτταρα πλύθηκαν πάλι και επανα-εναιωρήθηκαν σε 500 μι FACS ρυθμιστικό που περιέχει 40 μg /mL RNase Α (Sigma) και /mL ιωδιούχου προπιδίου 50 μα, στη συνέχεια επωάστηκαν στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Τα κύτταρα αναλύθηκαν στην BD FACScalibur (Becton Dickinson) χρησιμοποιώντας το FL-2Α και κανάλια FL-2W. Η κυτταρομετρία ροής δεδομένων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας FlowJo 7,5 λογισμικού (Tree Star).

In vivo πειράματα

έξι έως 8 εβδομάδων με σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (SCID) χρησιμοποιήθηκαν θηλυκά ποντίκια για ξενομόσχευμα πειράματα, σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές της Επιτροπής Animal Care, Οντάριο Ινστιτούτο Καρκίνου, Πανεπιστήμιο Δίκτυο Υγείας. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με προ-miR-196β ή NC και επωάστηκαν στους 37 ° C, 5% CO

2. Στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και 5 × 10

5 βιώσιμα κύτταρα αραιώθηκαν σε 100 μι μέσου ανάπτυξης. Τα κύτταρα εγχύθηκαν ενδομυϊκώς στο αριστερό γαστροκνήμιο μυ θηλυκών SCID ποντικών. Tumor συν διάμετρος πόδι μετρήθηκε δύο φορές την εβδομάδα και τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία όταν επιτεύχθηκε 15 mm. Οι όγκοι αφαιρέθηκαν σε 25 ημέρες μετά την εμφύτευση και αμέσως σταθεροποιήθηκαν σε 10% ρυθμισμένη φορμαλίνη για 24 ώρες, τοποθετούνται σε 70% αιθανόλη για 24 ώρες, ενσωματωμένο σε παραφίνη, και τεμαχίστηκαν (5 μΜ) για ανοσοχρώση. Εκτός από αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε) χρώση, συστάδας διαφοροποιήσεως 31 (CD31) χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της αγγειογένεσης όγκου, Ki-67 για τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, και τελικής δεοξυνουκλεοτιδυλοτρανσφεράσης μεσολάβηση dUTP nick τέλος επισήμανση (TUNEL) για απόπτωση .

Tri-τροπική προσέγγιση για miRNA Αναγνώριση Target

στόχων mRNA Υποψήφιος του miR-196b προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας προηγουμένως περιγραφείσες τρι-τροπική προσέγγιση [8] που συνδυάζει: i) όλες οι προβλεπόμενες στόχους της miR-196b από πέντε

in silico

miRNA βάσεις δεδομένων πρόβλεψη-στόχο (TargetScan, PicTar, GenMir

++, miRBase, miRDB)? ii) mRNAs τα επάνω ρυθμισμένο τουλάχιστον 2 φορές σε τραχήλου καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς τράχηλο, χρησιμοποιώντας δύο ανεξάρτητες δημοσίως διαθέσιμα σύνολα δεδομένων μικροσυστοιχιών [17], [18]? και iii) mRNAs τα κάτω ρυθμισμένα τουλάχιστον 0,5 φορές και στα δύο 24 και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση με 30 nmol /L προ-miR-196β, όπου τα επίπεδα μεταγραφής μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας όλο το Ανθρώπινο Γονιδίωμα 4 × 44 K One-Color Array (Agilent).

Δοκιμασία αναφοράς λουσιφεράσης

άγριου τύπου ή μεταλλαγμένο θραύσματα της 3′-αμετάφραστη περιοχή (UTR) του HOXB7 περιέχει την προβλεπόμενη θέση σύνδεσης (θέση 220-226) για miR-196b μεμονωμένα ενισχύθηκαν με AmpliTaq Gold DNA Polymerase (Applied Biosystems) χρησιμοποιώντας τους εκκινητές που παρατίθενται στον πίνακα S1. Τα PCR προϊόντα καθαρίστηκαν, στη συνέχεια κλωνοποιούνται καθοδικά του πυγολαμπίδας

λουσιφεράσης

γονιδίου στο φορέα pMIR-REPORT (Ambion) στο

Spe

Ι και

Hind θέσεις περιορισμού

III , για την παραγωγή του pMIR-HOXB7 ή pMIR-HOXB7-mut φορέα. κύτταρα ΜΕ-180 και SiHa συν-επιμολύνθηκαν με 100 nmol /L προ-miR-196β ή NC, και 100 ng του φορέα ρεπόρτερ ενδιαφέροντος. Ως μάρτυρας αναφοράς, 50 ng του φορέα pRL-SV (Promega) που περιέχει το

λουσιφεράση της Renilla

γονίδιο επίσης επιμολυσμένα με κάθε κατάσταση. Firefly και λουσιφεράσης Renilla μετρήθηκαν στις 24 ώρες μετά την επιμόλυνση χρησιμοποιώντας το σύστημα δοκιμασίας Dual-Glo λουσιφεράσης (Promega) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

ανοσοαποτύπωσης

Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν είτε με 100 nmol /L προ-miR-196β ή NC, και εκχυλίσματα ολικής πρωτεΐνης συλλέχθηκαν σε πάγο μετά από 48 και 72 ώρες. Οι πρωτεΐνες που ενδιαφέρουν ανιχνεύθηκαν με κουνελιού αντι-HOXB7 (1:500 αραίωση? Invitrogen) ή ποντικού αντι-GAPDH (1:10,000 αραίωση? Sigma), και ανιχνεύθηκαν με δευτερογενή αντισώματα IRDye φθορισμού (1:20,000 αραίωση, LI-COR). GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα ανοσοστυπώματα σαρώθηκαν και ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το Infrared System Imaging Οδύσσεια (LI-COR).

Δοκιμασία ενζυμο-συνδεδεμένες ανοσορροφητικές (ELISA)

Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 30 nmol /L siHOXB7 ή siNEG, και το επίπεδο της εκκρινόμενης VEGF μετρήθηκε στα 48 και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, χρησιμοποιώντας το ανθρώπινο VEGF Duoset ELISA (R &? D Systems). σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή

5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνης Θεραπεία

ΜΕ-180 και SiHa και σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων και επωάζονται όλη τη νύκτα στους 37 ° C, 5% CO

2. Μέσα που περιέχει 2 μΜ 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-αζα-DCT) (Sigma-Aldrich) προστέθηκε σε κύτταρα, 1 και 3 ημέρες μετά την σπορά, αντίστοιχα. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 4 ημέρες μετά την σπορά και το ολικό RNA απομονώθηκε για ανάλυση qRT-PCR του miR-196b έκφραση.

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα πειράματα έχουν διεξαχθεί τουλάχιστον τρεις ανεξάρτητες φορές, και ο τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου (SEM). λειτουργία t-test του Student (αταίριαστα, two-tailed) στο Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA) χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει δύο ομάδες θεραπείας. Γραφήματα χαράχθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA). Η μέθοδος Kaplan-Meier χρησιμοποιήθηκε για την μονοπαραγοντική ανάλυση, και η δοκιμασία log-rank χρησιμοποιήθηκε για να εξεταστούν οι συσχετίσεις μεταξύ της έκφρασης του miR-19b και DFS, όπου η έκφραση διχοτομήθηκε κατά τη μέση τιμή. Η σχέση μεταξύ του μεγέθους του όγκου και της έκφρασης του miR-196b διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας συσχέτισης του Pearson. Συσχετίσεις μεταξύ miR-196b έκφρασης είτε με το στάδιο της νόσου ή κομβικά κατάσταση αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA.

Αποτελέσματα

miR-196b ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται στην Πρωτοβάθμια καρκίνο του τραχήλου ιστούς και κυτταρικές γραμμές και συνδέθηκε έντονα με DFS

η έκφραση του miR-196b μειώθηκε σημαντικά κατά σχεδόν 4 φορές σε 79 πρωτοβάθμια τραχήλου της μήτρας καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με 11 κανονική τράχηλο ιστούς (

P

& lt? 0.001? Σχ. 1Α). Είναι σημαντικό ότι, οι ασθενείς με χαμηλότερα από διάμεση επίπεδο έκφρασης miR-196b κατά τη στιγμή της διάγνωσης βιώσει χειρότερα DFS σε σύγκριση με εκείνους με υψηλότερα miR-196b έκφρασης (

P

= 0,02? Αναλογία κινδύνου = 0,39? Εικ. 1Β). miR-196b έκφραση δεν συσχετίστηκε σημαντικά με το μέγεθος του όγκου (

P

= 0,12), το στάδιο της νόσου (

P

= 0,14), ή κομβικά κατάσταση (

P

= 0.60 ). Παγκόσμια έκφραση miRNA διαμόρφωση της γενικής εικόνας διεξάγεται σε τρία τραχήλου καρκινικών κυτταρικών γραμμών (ME-180, SiHa και ΗΤ-3) επιβεβαίωσε επίσης την προς τα κάτω ρύθμιση του miR-196b στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Από τις 55 miRNAs που είχαν απελευθερωθεί τουλάχιστον 2 φορές σε όλες τις τρεις κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με 3 φυσιολογικό τράχηλο ιστούς, miR-196b ήταν ανάμεσα στα πιο σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται miRNAs (Εικ. 1Γ), σύμφωνα με μια προηγουμένως δημοσιευθεί προφίλ έκφρασης των miRNAs μελέτη [13].

Α) miR-196b επίπεδα έκφρασης μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας qRT-PCR σε 79 δείγματα πρωτογενούς καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, σε σύγκριση με 11 φυσιολογικού τράχηλου επιθηλιακά ελέγχους ιστού. Β) Kaplan-Meier ανάλυση του DFS σε ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Κόκκινο, οι ασθενείς με υψηλότερα από την διάμεση επίπεδο έκφρασης miR-196b (n = 39)? μπλε, οι ασθενείς με χαμηλότερα από διάμεση miR-196b έκφρασης (n = 39)? ένας ασθενής απομακρύνθηκε από την ανάλυση επιβίωσης λόγω ελλιπών πληροφοριών επιβίωσης. Γ) Τα βασικά επίπεδα του miR-196b σε τρεις τραχήλου καρκινικές κυτταρικές σειρές (SiHa, ME-180, και ΗΤ-3), σε σύγκριση με φυσιολογικό τράχηλο επιθηλιακών ιστών, προσδιορίστηκε με qRT-PCR. **

P

& lt?. 0.01

Η

Για να διερευνήσουν κατά πόσον miR-196b κάτω ρύθμιση ήταν επιγενετικώς καθορίζεται, εκτός από την χρωμοσωματική απώλεια [19] κύτταρα, ME-180 και SiHa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον παράγοντα απομεθυλίωσης 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-αζα-DCT). Αυτή η αγωγή είχε ως αποτέλεσμα μόνο μία ελάχιστη αύξηση του miR-196b έκφραση, υποδεικνύοντας ότι η μεθυλίωση προαγωγού ήταν απίθανο να είναι ένας κύριος μηχανισμός για miR-196b υπό-έκφραση (Εικ. S1 Α). Επιπλέον, η εξέταση των δημοσίως διαθέσιμα σύνολα δεδομένων μικροσυστοιχιών της γονιδιακής έκφρασης σε πρωτογενή τραχήλου της μήτρας καρκινικούς ιστούς δεν αποκάλυψε οποιεσδήποτε σημαντικές αλλαγές στην έκφραση των Dicer, drosha, DGCR8, Exportin-5, ή οποιαδήποτε υπομονάδες της RNA πολυμεράσης ΙΙ, τα οποία είναι όλα εμπλέκονται στην miRNA βιογένεση και επεξεργασία (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

miR-196b Υπερ-έκφραση μειώνεται σημαντικά τηλέφωνα Βιωσιμότητα, κλωνογενοποιήσεως, διάδοσης και εισβολή

Για να εκτιμηθεί η βιολογική σημασία του miR-196b κάτω ρύθμιση , τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 30 nmol /L NC ή προ-miR-196b. Up-ρύθμιση της έκφρασης miR-196b διατηρήθηκε για μέχρι 72 ώρες μετά την επιμόλυνση (Σχ. S1B). Η επιμόλυνση με προ-miR-196b οδήγησε σε σημαντικά μειωμένη κυτταρική βιωσιμότητα σε σύγκριση με τους ελέγχους στις 48 και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση (ME-180:25% στις 48 ώρες? 41% σε 72 ώρες, SiHa: 29% στις 48 ώρες? 54 % σε 72 h) (Σχ. 2Α). Επιπλέον, miR-196b υπερέκφραση οδήγησε σε σημαντικές μειώσεις στις κλωνογονικότητας (ME-180:57% σε σύγκριση με NC, SiHa: 64% σε σύγκριση με NC) (Εικόνα 2Β)., Τον πολλαπλασιασμό (ME-180:36% στις 48 ώρες , το 35% σε 72 ώρες, SiHa: 22% στις 48 ώρες? 21% σε 72 h) (Εικ 2C), και τη μετανάστευση (32% σε σύγκριση με NC), συν εισβολή (32%

vs

.. 63% για NC) (Σχ. 2D). Τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με προ-miR-196b έδειξε ένα μικρό, αλλά όχι στατιστικά σημαντική, αύξηση του ποσοστού των κυττάρων στην υπο G

1 πληθυσμού, συνοδεύεται από μια μικρή μείωση του G

0-G

1 πληθυσμό (Σχ. S1c).

Α) κύτταρα Σχετική βιωσιμότητα του μΕ-180 και SiHa αξιολογήθηκαν στις 48 και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση με προ-miR-196b (30 nmol /L), σε σύγκριση με Αρνητικός μάρτυρας προ-miR (30 nmol /L), με τη χρήση της Τρυπάνης Μπλε δοκιμασίας. κύτταρα Β) κλωνογονικότητας της ΜΕ-180 και SiHa αξιολογήθηκαν δια διαμολύνσεως με 30 nmol /L προ-miR 196β ή αρνητικού ελέγχου προ-miR. Στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν τότε μετρήθηκαν και επανα-σπείρονται σε χαμηλή πυκνότητα σε τρυβλία 6 φρεατίων. Μετά από 10 ημέρες επώασης, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν και ο αριθμός των αποικιών (& gt? 50 κύτταρα) μετρήθηκαν. κύτταρα C) Σχετική πολλαπλασιασμό ME-180 και SiHa εξετάστηκαν σε 24, 48, και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση με προ-miR-196b (30 nmol /L), σε σύγκριση με τον αρνητικό μάρτυρα προ-miR (30 nmol /L) , χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία MTS. D) Αντιπροσωπευτικές εικόνες (αριστερά) και ιστογράμματα (δεξιά) που απεικονίζει τη μεταναστευτική ικανότητα (επάνω) και διεισδυτικότητα (κάτω) του ΜΕ-180 κύτταρα τα οποία μορφομετατράπηκαν με 30 nmol /L προ-miR 196β ή αρνητικού ελέγχου προ-Mir, συλλέχθηκαν σε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, τότε υπολογίζονται και την εκ νέου εμβολιάστηκαν σε θαλάμους εισβολή. Η μετανάστευση κυττάρων (επάνω) και εισβολή (κάτω), που εκτιμάται σε 48 ώρες μετά την σπορά σε θαλάμους Transwell. Όλα τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SEM από 3 ανεξάρτητα πειράματα. NC, προ-miR αρνητικού μάρτυρα? *

P

& lt? 0,05? **

P

& lt?. 0.01

Η

miR-196b Πάνω Έκφραση Καταστολής όγκου αγγειογένεση και όγκου κυτταρικού πολλαπλασιασμού in vivo

Τα κύτταρα επιμολυσμένα με προ-miR-196b δεν έδειξε στατιστικά σημαντική διαφορά στην ανάπτυξη του όγκου σε ποντίκια, σε σύγκριση με NC-επεξεργασμένα κύτταρα (Εικ. S2). Σε 25 ημέρες μετά την εμφύτευση ωστόσο, CD31 ανοσοχρώση ωστόσο παρατηρήθηκε να μειωθεί στο 69% σε όγκους προ-miR-196b σε σύγκριση με το ελέγχει όγκους (Σχ. S3, κορυφή). Επιπλέον, αυτή η συσχετίστηκε με μια μέτρια ακόμη σημαντική μείωση της Ki-67 έκφραση (46%

vs

. 53% για κύτταρα κατεργασμένα με NC) (Εικ. S3, μέση), και ένα μικρό, αλλά όχι στατιστικά σημαντική αύξηση των TUNEL χρώση (Εικ. S3, κάτω). Ως εκ τούτου, τα δεδομένα μας πρότεινε ότι οι προ-miR-196b συνέβαλε στη μείωση των πολλαπλασιασμό των κυττάρων της αγγειογένεσης και του όγκου.

miR-196b στοχεύει άμεσα HOXB7

Η ρύθμιση προς τα κάτω του miR-196b σε τραχήλου της μήτρας καρκινικούς ιστούς και κυτταρικές γραμμές, και οι σημαντικές φαινοτυπικές επιδράσεις των miR-196b υπερ-έκφραση τόσο

in vitro

και

in vivo

, έδειξε ότι miR-196b φαίνεται να είναι ένας σημαντικός μεσολαβητής του τραχήλου της μήτρας εξέλιξης του καρκίνου . Έτσι, μια τρι-τροπική στρατηγική [8] ​​χρησιμοποιήθηκε για τον εντοπισμό πιθανών στόχων mRNA που θα μπορούσαν να ευθύνονται για αυτές τις φαινοτυπικές αλλαγές (Εικ. S4). Η μέθοδος αυτή προσδιορίζονται 15 επικαλυπτόμενες υποψήφιων στόχων (ANKHD1, CALM3, CLK2, CTDSP2, FGFR1, HDAC, HOXA7, HOXB7, KRT8, τα κεραμικά φρένα, PUM2, SLC9A6, SMC3, SMG7, SR140). Για επιβεβαίωση στόχου, κύτταρα ΜΕ-180 μορφομετατράπηκαν με προ-miR-196β ή NC, και τα επίπεδα μεταγραφής στις 24 ώρες μετά την επιμόλυνση μετρήθηκαν με qRT-PCR για 12 υποψήφιων στόχων (κατάλληλο εκκινητές δεν θα μπορούσε να σχεδιαστεί για τα άλλα 3 μεταγραφές ), συν 4 προηγουμένως περιγράφονται οι στόχοι του miR-196b (c-myc, BCL2, HOXA9, MEIS1). Κανένα από τα προηγούμενα περιγραφείσες στόχοι ήταν σημαντικά μεταβληθεί μετά miR-196b υπερ-έκφραση (Εικ S5A). Μόνο 5 από τους 12 δοκιμαστεί υποψήφιων στόχων ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται μετά miR-196b υπερ-έκφραση (Εικ S5B.)? HOXB7 επιλέχθηκε για περαιτέρω λειτουργική αξιολόγηση καθώς ήταν ο υποψήφιος στόχος που έδειξαν το μεγαλύτερο επίπεδο ρύθμισης προς τα κάτω (40% σε σύγκριση με ελέγχους). Επιπλέον, HOXB7 είναι μέλος του

Hox

συστάδα γονιδίων, μία οικογένεια γονιδίων τα οποία έχουν αναφερθεί να απορυθμίζεται σε διάφορες κακοήθειες [20], και η οικογένεια miR-196 είναι γνωστή για τη στόχευση του θηλαστικού

Hox

γονίδια [21].

Ένα λουσιφεράσης δοκιμασία σύνδεσης επιβεβαίωσε ότι το miR-196b άμεσα και ειδικά αλληλεπίδραση με το 3′-UTR της HOXB7. Σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου που επιμολύνθηκαν με pMIR-REPORT, κύτταρα επιμολυσμένα με pMIR-HOXB7 επέδειξαν μειωμένη δραστικότητα λουσιφεράσης (ME-180:68%, SiHa: 71%), όταν συν-επιμολυσμένα με προ-miR-196b (Σχήμα 3Α).. Αυτή η ανασταλτική δράση ήταν πλήρως καταργείται με pMIR-HOXB7-mut, που περιείχε μια μετάλλαξη στην θέση σύνδεσης miR-196b. Επιπλέον, η επιμόλυνση με προ-miR-196b οδήγησε σε σημαντικά μειωμένη μεταγραφή HOXB7 mRNA (ME-180:49% στις 48 ώρες, 62% σε 72 h? SiHa: 55% στις 48 ώρες, 69% σε 72 h) (Σχ . 3Β), και πρωτεΐνες (74% σε 48 h?. 80% σε 72 h) (Σχ 3C) επίπεδα στις 48 και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. φαινόταν να είναι μια μεγαλύτερη αλλαγή φορές στην HOXB7 στο επίπεδο του mRNA σε σύγκριση με την πρωτεΐνη, η οποία δεν αποτελεί έκπληξη δεδομένου ότι miRNAs αλληλεπιδρούν άμεσα με μεταγραφές mRNA και όχι πρωτεΐνες εκεί. Επιπλέον, η μετάφραση της πρωτεΐνης μπορεί να επηρεαστεί από έναν αριθμό μηχανισμών που συμβαίνουν ανάντη, όπως η πυρηνική εξαγωγή του RNA μεταγράφων και την πρόσληψη των ριβοσωματικών υπομονάδων.

Α) δραστηριότητα Σχετική λουσιφεράσης του ME-180 ή SiHa κύτταρα στους 24 ώρες μετά την συν-επιμόλυνση με pMIR-REPORT, pMIR-HOXB7 ή pMIR-HOXB7-mut φορείς και προ-miR-196b ή NC (30 nmol /L). Β) Τα επίπεδα έκφρασης του mRNA Σχετική HOXB7 σε ME-180 ή SiHa κύτταρα μετά την επιμόλυνση (48, και 72 ώρες) με προ-miR-196b ή NC (30 nmol /L), όπως μετράται με qRT-PCR. Τα επίπεδα έκφρασης κανονικοποιήθηκαν στην έκφραση GAPDH. C) Αντιπροσωπευτική εικόνα Western blot (πάνω), και η σχετική ποσοτικοποίηση των επιπέδων της πρωτεΐνης HOXB7 (κάτω) μετά την επιμόλυνση (48, και 72 ώρες) με προ-miR-196b ή NC (30 nmol /L). Όλα τα στοιχεία αντιπροσωπεύονται την μέση ± SEM από 3 ανεξάρτητα πειράματα. OD, οπτική πυκνότητα? NC, προ-miR αρνητικού μάρτυρα? *

P

& lt? 0,05? **

P

& lt?. 0.01

Η

VEGF είναι ένας μεταγενέστερος στόχος των HOXB7

Από HOXB7 είναι ένας παράγοντας μεταγραφής, ήταν απαραίτητο να καθοριστεί ποια γονίδιο (s) ρυθμίζεται από HOXB7 μπορούσε να είναι χρήσιμη σε αυτό το πλαίσιο για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Ως εκ τούτου, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 30 nmol /L siHOXB7 ή siNEG, και τα επίπεδα mRNA των γνωστών στόχων HOXB7 όπως Κυ70, Κυ80, ϋΝΑ-ΡΚ, FGF2, ΜΜΡ2, WNT5a, PDGFA, thrombospoindin 2 (THBS2) και VEGF [22] , [23], [24], [25] μετρήθηκαν στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. VEGF κατέδειξε το υψηλότερο επίπεδο ρύθμισης προς τα κάτω (43%) μετά HOXB7 knockdown (Εικ. S6a). Να συμπίπτει, σημαντική μείωση σε VEGF mRNA (ME-180:63% στις 48 ώρες, 33% σε 72 h? SiHa: 69% στις 48 ώρες, 41% σε 72 h) (Εικ. 4Α) και εκκρινόμενη πρωτεΐνη (ME-180 :82% στις 48 ώρες, 77% σε 72 h? SiHa: 84% στις 48 ώρες, 75% σε 72 h) () επίπεδα Εικόνα 4Β παρατηρήθηκαν σε αμφότερες τις 48 και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση με siHOXB7, επιβεβαιώνοντας ότι ο VEGF. ήταν πράγματι σχετική προς τα κάτω στόχος HOXB7 σε αυτή τη νόσο. Επιπλέον, άλλες προ-αγγειογενετική γνωστών στόχων του HOXB7 (FGF2, ΜΜΡ2, WNT5a, PDGFA, THBS2) δεν μεταβλήθηκαν σημαντικά μετά HOXB7 knockdown (Εικ. S6a) ή miR-196b υπερέκφραση (Εικ. S6E), γεγονός που υποδηλώνει ότι μεσολαβεί HOXB7 αγγειογένεση

μέσω

VEGF σε αυτό το πλαίσιο.

Α) σχετική έκφραση του VEGF στο επίπεδο του mRNA μετά την επιμόλυνση του ME-180 ή κύτταρα SiHa με siHOXB7 ή siNEG (30 nmol /L), όπως προσδιορίζεται με qRT -PCR. Τα επίπεδα έκφρασης κανονικοποιήθηκαν στην έκφραση GAPDH. Β) Σχετικά επίπεδα της εκκρινόμενης πρωτεΐνης VEGF μετά από επιμόλυνση του ME-180 ή SiHa κύτταρα με siHOXB7 ή siNEG (30 nmol /L), όπως προσδιορίζεται με ELISA. Όλα τα στοιχεία αντιπροσωπεύονται την μέση ± SEM από 3 ανεξάρτητα πειράματα. siNEG, All Stars αρνητικού μάρτυρα? *

P

& lt? 0,05? **

P

& lt?. 0.01

Η

Νοκ ντάουν της HOXB7 ή VEGF ανακεφαλαιώνει τις βιολογικές επιδράσεις που παρατηρήθηκαν μετά από miR-196b Πάνω Έκφραση

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω αυτή την άρτι περιγράφονται μονοπάτι του miR-196b στόχευσης HOXB7 οποία με τη σειρά ρυθμίζονται VEGF, ME-180 και τα κύτταρα SiHa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με siHOXB7 ή siVEGF για να προσδιοριστεί εάν αυτές οι παρεμβάσεις θα μπορούσαν ανακεφαλαιώνουν τις επιδράσεις του miR-196b υπερ-έκφραση. Knockdown των επιπέδων HOXB7 και VEGF μεταγραφής και πρωτεΐνες διατηρήθηκαν για μέχρι και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση siRNA (Σχ. S6B, S6C, και S6D). Παρατηρήσαμε ότι η βιωσιμότητα των κυττάρων μειώθηκε σημαντικά μετά από επιμόλυνση με είτε siHOXB7 (ME-180:77% στις 48 ώρες, 66% σε 72 h? SiHa: 80% στις 48 ώρες, 70% σε 72 ώρες). (Σχήμα 5Α, αριστερά ) ή siVEGF (ME-180:78% στις 48 ώρες, 60% σε 72 h? SiHa: 77% στις 48 ώρες, 68% σε 72 h) (Σχήμα 5Α, δεξιά), παρόμοια με τα αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν μετά την επιμόλυνση με. προ-miR-196b (ME-180:25% στις 48 ώρες, 41% σε 72 h? SiHa: 29% στις 48 ώρες, 54% σε 72 h) (Εικ. 2Α). Κλωνογενοποιήσεως μειώθηκαν σημαντικά μετά είτε siHOXB7 (ME-180:69%? SiHa: 71%) (Σχήμα 5Β, αριστερά.) Ή siVEGF (ME-180:78%? SiHa: 75%) (Εικ. 5Β, δεξιά) επιμόλυνση, όπως παρατηρήθηκε προηγουμένως για προ-miR-196b επιμόλυνση (ME-180:57% σε σύγκριση με το NC? SiHa: 64% σε σύγκριση με το NC) (Σχήμα 2Β.).