Αφηρημένο

Ιστορικό

Η οικογένεια tensin των ενδοκυττάριων πρωτεϊνών (Tensin1, -2, -3 και -4) πιστεύεται ότι λειτουργούν ως σύνδεσμοι μεταξύ της εξωκυττάριας μήτρας και του κυτταροσκελετού, και έτσι μεσολαβήσει σηματοδότησης για το σχήμα των κυττάρων και την κινητικότητα. Δυσλειτουργία της έκφρασης tensin έχει προηγουμένως ενοχοποιηθεί στον ανθρώπινο καρκίνο. Εδώ, έχουμε για πρώτη φορά αξιολόγησε τη σημασία των τεσσάρων Tensins σε μια μελέτη του ανθρώπινου καρκινώματος νεφρικών κυττάρων (RCC), καθώς και ανιχνεύθηκαν τη βιολογική λειτουργία του Tensin3.

Principal Εκτίμηση

Έκφραση Tensin2 και Tensin3 σε επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης ήταν σε μεγάλο βαθμό απούσα σε ένα πάνελ διαφόρων ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών. Ποσοτική ανάλυση RT-PCR αποκάλυψε mRNA έκφραση και των τεσσάρων γονιδίων tensin να ρυθμίζεται προς τα κάτω σημαντικά σε ανθρώπινους όγκους νεφρού (μείωση 50-100% έναντι φυσιολογικό νεφρό φλοιό?

P

& lt? 0.001). Επιπλέον, οι εκφράσεις mRNA του Tensins κυρίως συσχετίζεται θετικά με το άλλο και αρνητικά με το βαθμό του όγκου, αλλά όχι το μέγεθος του όγκου. Ανοσοϊστοχημική ανάλυση αποκάλυψε Tensin3 να είναι παρόντες στο κυτταρόπλασμα του σωληνοειδούς επιθηλίου σε φυσιολογικά τμήματα ανθρώπινου νεφρού, ενώ η έκφραση ήταν πιο αδύναμη ή απούσα στο 41% ​​των όγκων του νεφρού. Ένα υποσύνολο των τμημάτων του όγκου έδειξε μια προνομιακή έκφραση μεμβράνη πλάσματος Tensin3, η οποία σε ασθενείς σαφή κυττάρων RCC συσχετίστηκε με μεγαλύτερη επιβίωση. Σταθερή έκφραση Tensin3 σε κύτταρα ΗΕΚ 293 ανέστειλε σημαντικά τόσο την κυτταρική μετανάστευση και την εισβολή της μήτρας, μια λειτουργία ανεξάρτητης δραστηριότητας υποτιθέμενη φωσφατάση σε Tensin3. Αντίθετα, siRNA νοκ ντάουν της ενδογενούς Tensin3 σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα αύξησε σημαντικά τη μετανάστευσή τους.

Συμπεράσματα

Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι οι Tensins μπορεί να αντιπροσωπεύει μια νέα ομάδα καταστολείς μετάσταση στα νεφρά, την απώλεια της γεγονός που οδηγεί σε μεγαλύτερη κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων και την επακόλουθη μετάσταση. Επιπλέον, ογκογένεση στον ανθρώπινο νεφρό μπορεί να διευκολυνθεί από μια γενική ρύθμιση προς τα κάτω του Tensins. Ως εκ τούτου, αντι-μεταστατική θεραπείες μπορούν να επωφεληθούν από την αποκατάσταση ή τη διατήρηση της έκφρασης tensin σε πρωτογενείς όγκους

Παράθεση:. Martuszewska D, Ljungberg Β, Johansson Μ, Landberg G, Oslakovic C, ΟβηΙΡβοκ B, et al. (2009) Tensin3 είναι ένας αρνητικός ρυθμιστής των κυττάρων Μετανάστευση και τα τέσσερα tensin Οικογένεια μέλη είναι μειωτικά στον ανθρώπινο καρκίνο του νεφρού. PLoS ONE 4 (2): e4350. doi: 10.1371 /journal.pone.0004350

Επιμέλεια: Jörg Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Γερμανία

Ελήφθη: 20, Αυγούστου, 2008? Αποδεκτές: 15 Δεκεμβρίου, 2008? Δημοσιεύθηκε: 4 Φεβ 2009

Copyright: © 2009 Martuszewska et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Σουηδική έρευνα Συμβουλίου (Vetenskapsrådet), το Ίδρυμα Καρκίνου, Alfred Osterlund Trust, Πανεπιστήμιο Malmö Νοσοκομείο Trust, Πανεπιστήμιο Malmö Αντικαρκινικό Νοσοκομείο Εμπιστοσύνη, Γκρέτα και Johan Kock Trust, Crafoord εμπιστοσύνη, και η Royal Society φυσιογραφικούς στο Lund. Ο.Μ. υποστηρίχθηκε από μια υποτροφία από το Anna-Greta Crafoord Trust. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Οι Tensins αποτελούν μία οικογένεια ενδοκυττάριων πρωτεϊνών που έρχονται στο προσκήνιο ως νέα ρυθμιστές της κυτταρικής κινητικότητας και της ανάπτυξης. Η οικογένεια tensin αποτελείται από τέσσερα μέλη: Tensin1, Tensin2, Tensin3 και Tensin4 (TNS1, TNS2, tNS3, TNS4) η κάθε μία με διακριτά πρότυπα έκφρασης στο ανθρώπινο σώμα [1], [2]. Βασισμένη σε κοινές περιοχές τους, οι Tensins έχουν τη δυνατότητα να αλληλεπιδρούν με τη μεμβράνη του πλάσματος (C1 τομέα), καθώς και να προσκολλάται σε τυροσίνες (SH2 και ΡΤΒ περιοχή) σε ιντεγκρίνες [3] και κινάσες τυροσίνης υποδοχέα (RTKs) [1].

Επιπλέον, Tensins 1-3, αλλά όχι -4, περιέχουν ένα φωσφατάση ζεύγος τομέα (ΡΤΡάση) -C2 που είναι ομόλογη με αυτή του ΡΤΕΝ ογκοκατασταλτικό πρωτεΐνη [4], [5]. Ωστόσο, το δυναμικό δραστικότητα των λιπιδίων ΡΤΡάσης του Tensins 1-3, καθώς και υποτιθέμενο αλληλεπιδράσεις τους με το ακτίνης κυτταροσκελετό, μένει να καθοριστεί. Tensin1 ήταν το πρώτο μέλος εντοπιστεί, και εντοπίζεται σε εστιακές συμφύσεις σε κύτταρα [6]. Εντοπίσαμε Tensin2 (επίσης γνωστή ως C1-TEN, TENC1) ως δεσμευτικό εταίρο για τον Axl RTK μέσω της περιοχής του SH2-PTB [1]. Tensin3 έχει σχεδόν την ίδια οργάνωση τομέα με C1-TEN, και αλληλεπιδρά με τον υποδοχέα EGF [7]. Tensin4 είναι βραχύτερη πρωτεΐνη που δεν αναμένεται να αλληλεπιδρά με τον κυτταροσκελετό, ενώ περιέχει το SH2-ΡΤΒ domains παρόμοια με τις άλλες Tensins [8].

Η λειτουργική συνέπεια των αλληλεπιδράσεων tensin υποδηλώνει ρύθμιση της σηματοδότησης υποδοχέα μεμβράνης η οποία συνδυάζεται με τον έλεγχο της δυναμικής του κυτταροσκελετού. Αυτό επομένως έχει συνέπειες για κυτταρική κινητικότητα στο μεταστατικό διαδικασία. Για παράδειγμα, σε κύτταρα καρκίνου του μαστού, Tensin3 δείχθηκε να αγκυροβολεί ιντεγκρίνες στην κυτταροσκελετού, καθιστώντας το κύτταρο λιγότερο κινητικό και με τον τρόπο αυτό λιγότερο ικανά μεταστάσεις [9]. Αντιστρόφως, η διέγερση με επιδερμικό αυξητικό παράγοντα (EGF) ρυθμίζει προς τα πάνω Tensin4, η οποία είναι μια βραχύτερη πρωτεΐνη που θα μπορούσε να στερούνται τις περιοχές πρόσδεσης ακτίνης αλλά η οποία εξακολουθεί να αλληλεπιδρά με ιντεγκρίνες. Αυτή η κινητοποίηση του Tensin4 οδηγεί σε μετατόπιση της Tensin3 από την ιντεγκρίνη, αποσταθεροποιώντας έτσι τον κυτταρικό σκελετό και την ενίσχυση κυτταρική κινητικότητα. Έχουμε αναφέρει ότι η έκφραση Tensin2 σε νεφρικά κύτταρα αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την επιβίωση και τη μετανάστευση, η ταυτόχρονη με μια επιλεκτική καταστολή της Akt μονοπάτι σηματοδότησης [5]. Τέλος, μια αλληλεπίδραση προφανώς κοινά σε όλες τις τέσσερις Tensins είναι ότι με την πρωτεΐνη καταστολέα DLC-1 όγκου, η οποία μπορεί να είναι ένας μεσολαβητής για τα πιθανά αποτελέσματα κατά των όγκων του Tensins [10] – [12]

. οι Ηνωμένες Πολιτείες, οι 54.390 νέες περιπτώσεις καρκίνου του νεφρού προβλέπεται να συμβεί το 2008, προκαλώντας κατ ‘εκτίμηση 13.010 θάνατοι [13]. Νεφρική καρκίνωμα (RCC) είναι ένας καρκίνος που προέρχονται από νεφρική επιθήλιο και τους λογαριασμούς για το 85% των καρκίνων του νεφρού και των συναφών θνησιμότητα. RCC μπορεί να υποδιαιρεθεί περαιτέρω σε διάφορους υποτύπους: συμβατική ή διαυγοκυτταρικό RCC (ccRCC), η οποία εκπροσωπεί τη μεγάλη πλειοψηφία των περιπτώσεων RCC, που ακολουθείται από θηλώδες (pRCC) και χρωμόφοβο (chRCC). Επίσης περιλαμβάνονται σε αυτή τη μελέτη είναι oncocytoma, το οποίο είναι ένα μη-RCC, καλοήθη τύπο όγκου. Κάθε ένας από αυτούς τους τύπους όγκων έχει μια ξεχωριστή παθογένεση. Για παράδειγμα, τα δύο τρίτα των περιπτώσεων ccRCC συνδέονται με ένα ελάττωμα στο γονίδιο νοη Hippel-Lindau (VHL) ογκοκατασταλτικό [14].

Ωστόσο, ο μετασχηματισμός των επιθηλιακών κυττάρων που συμβαίνει σε κοινά σε αυτούς τους τύπους όγκων περιλαμβάνει πολλαπλές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένων των μεταλλάξεων που επιτρέπουν συνθήκες ευνοϊκές για την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων, τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση. Επιπλέον, η ενισχυμένη καρκίνος κυτταρική κινητικότητα είναι ένα κύριο χαρακτηριστικό στο πρώιμο μεταστατική διαδικασία. Ως ένα τέταρτο των ασθενών RCC παρόν με τοπικά επεμβατικές ή μεταστατική νόσο, είναι επιτακτική ανάγκη να εντοπίσει τους παράγοντες και τους μηχανισμούς που διέπουν τη μεταστατική διαδικασία.

Ο νεφρός είναι το όργανο όπου τα περισσότερα Tensins προτίμηση εκφράζεται [1], [6], [7]. Η διαγραφή του

Tensin2

γονίδιο φάνηκε να είναι πίσω από ένα μοντέλο ποντικού νεφρωσικού συνδρόμου [15], και τα ποντίκια knockout για το σχηματισμό Tensins -1 και -3 έκθεμα νεφρό σωληνοειδές κύστη και νεφρική ανεπάρκεια [16], [17 ]. Ως εκ τούτου, υπάρχει μια διακριτή ανάγκη για τη διερεύνηση των Tensins για έκφραση και οι λειτουργίες τους στον ανθρώπινο νεφρό και σε φυσιολογικά και νοσηρές καταστάσεις. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνήσει το ρόλο του όλη την οικογένεια tensin σε ανθρώπινο RCC.

Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων

Οι ακόλουθες ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου καλλιεργήθηκαν και προετοιμασμένοι για qRT-PCR και ανάλυση κηλίδας Western: μαστού (MCF-7, MDA-ΜΒ231), προστάτη (DU145, PC3, PNT-1Α), ορθοκολικό αδενοκαρκίνωμα (SW480), τραχηλικού καρκινώματος (HeLa S3), οστεοσάρκωμα (U20S), μελάνωμα (WM9, WM266-4, WM793), μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (H358, H2087, H226, H727) και το λέμφωμα κυττάρων Β (U629, U2932). Διάφορες ανθρώπινες κυτταρικές σειρές μη καρκινικό αναλύθηκαν επίσης: ενδοθηλιακή κυτταρική γραμμή (EAhy926), δερματικούς ινοβλάστες (ΟΕ52), νεφρού εγγύς σωληνοειδή κύτταρα (HK-2), επιθηλιακά κύτταρα του μαστού (MCF-10Α). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, 20 mM γλουταμίνη, 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη σε 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 στον αέρα.

ασθενείς

στη μελέτη συμμετείχαν 260 ασθενείς με ιστοπαθολογικά επαληθεύεται νεφροκυτταρικό καρκίνωμα (RCC) μετά από νεφρεκτομή πραγματοποιείται στο Τμήμα Ουρολογίας, Umeå University Hospital, μεταξύ 1982-2003. Η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημίου της Umea και από το Διοικητικό Συμβούλιο αναθεώρηση Θεσμικών και κάθε ασθενής συμμετείχε μετά την παροχή εν επιγνώσει συναίνεση. Τα κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά των ασθενών συνοψίζονται στον Πίνακα 1.

Η

διαδικασίες ανασυγκρότησης περιλάμβανε μια φυσική εξέταση, ακτινογραφία θώρακα, υπερηχογράφημα και αξονική τομογραφία της κοιλιάς. Οι όγκοι οργανώθηκαν σύμφωνα με το σύστημα ταξινόμησης ΤΝΜ 2002 [18] και ιστοπαθολογική ταξινόμηση έγινε σύμφωνα με Skinner

et al.

[19]. Ο τύπος RCC ορίστηκε σύμφωνα με την συναίνεση συνέδριο Χαϊδελβέργη [20]. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε επί των χειρουργικών δειγμάτων ή /και αξονική τομογραφία. Το μέγεθος του όγκου κυμαινόταν από 0,6 cm έως 25 cm (διάμεσος: 7,0 cm). Η φλεβική εισβολή ορίστηκε ως εισβολή όγκου σε μεγάλες νεφρική φλέβες, επαληθεύεται μικροσκοπικά σε τομές ιστού από την νεφρική αφαλός. Ασθενής καθεστώς παρακολούθησης εκτιμήθηκε τουλάχιστον σε ετήσια βάση από τη συνήθη κλινική παρακολούθηση στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο της Umea ή επικοινωνώντας απευθείας με τους ασθενείς. Κατά τη διάρκεια της περιόδου παρακολούθησης, μεταξύ των 260 ασθενών, 139 είχαν πεθάνει από τη νόσο, 61 πέθαναν από άλλες αιτίες, 7 ήταν ζωντανοί με ασθένεια, και 53 ήταν ζωντανοί και απαλλαγμένη από τη νόσο. Tumor και νεφρικό φλοιό ιστού ελήφθησαν δείγματα αμέσως μετά την νεφρεκτομή. Δείγματα από μη κακοήθη ιστοπαθολογικά νεφρικό φλοιό ιστός απομακρυσμένο από τη ζώνη όγκου ελήφθησαν επίσης από 48 ασθενείς και χρησιμοποιούνται για την συγκριτική αξιολόγηση.

Ηλεκτροφόρηση και δυτική

κηλίδα

Τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό λύσης (1% ΝΡ -40, 1% δεοξυχολικό, 5 mM EDTA, 1 mM EGTA σε PBS, ρΗ 7,4) και διαχωρίστηκαν σε 5% και 8% πολυακρυλαμιδίου πηκτές SDS υπό αναγωγικές συνθήκες και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη PVDF. Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε 3% ζελατίνη ψαριού σε 0,1 Μ Tris-HCl, ρΗ 8.0, 1.5 Μ NaCl και 0.5% Tween 20 (ρυθμιστικό διάλυμα πλύσεως), ανιχνεύθηκαν με ένα πρωτεύον αντίσωμα έναντι Tensin2 (1:1000 αραίωση) και Tensin3 (1:1000 ), αντίστοιχα, για 1 ώρα, πλύθηκε με ρυθμιστικό διάλυμα έκπλυσης που ακολουθείται από επώαση για 1 ώρα με το δευτερογενές αντίσωμα που συνδέεται με είτε ραφανιδική υπεροξειδάση (HRP) ή αλκαλική φωσφατάση (ΑΡ). Στη συνέχεια, οι μεμβράνες οπτικοποιήθηκαν με μια μέθοδο χημειοφωταύγειας (HRP) ή με την αναγωγή του άλατος τετραζολίου 4-νιτροκυανό (ΝΒΤ) παρουσία 5-βρωμο-4 χλωρο-3-ινδολ φωσφορικού (BCIP) σε 0.1 Μ Τρις- HCl, 0.05 Μ MgCl

2, 0.1 Μ NaCl, ρΗ 9,5 (ΑΡ).

Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν για ανίχνευση Tensin2 και Tensin3 ήταν και οι δύο in-house πολυκλωνικά αντισώματα κουνελιού που δημιουργούνται έναντι πεπτιδίων που αντιστοιχούν στο άκρο C της κάθε πρωτεΐνης. Το ακατέργαστο αντιοροί καθαρίστηκαν διαδοχικά, πρώτα με χρωματογραφία συγγένειας σε πρωτεΐνη Α και στήλες G Sepharose και μετέπειτα περαιτέρω καθαρισμό συγγένειας χρησιμοποιώντας την ακινητοποιημένη πεπτιδικά αντιγόνα, όπως περιγράφηκε προηγουμένως για αντι-Tensin2 [5]. Αντι-Tensin3 αντισώματα ελέγχθηκαν για ειδικότητα χρησιμοποιώντας προϊόντα λύσης κυττάρου που εκφράζει πλήρους μήκους ανασυνδυασμένο Tensin3, καθώς και αποκλεισμός με την Tensin3 C-τερματικό πεπτίδιο αντιγόνο (Σχήμα S1). Μια εμπορική πολυκλωνικό κουνελιού αντι-Tensin3 αντίσωμα (Sigma) χρησιμοποιήθηκε για κηλίδες Western των σταθερά επιμολυσμένων κυτταρολυμάτων Tensin3. Βέλτιστη αραιώσεις προσδιορίστηκαν για western αποτύπωση.

πραγματικού χρόνου ποσοτική αντίστροφη μεταγραφή-ΡΟΚ (qRT-PCR)

Για ανάλυση qRT-PCR του καρκίνου του νεφρού δείγματα ασθενών, τη βιώσιμη περιοχή του κάθε όγκου ιστός χρησιμοποιήθηκε για να ληφθεί υψηλής ποιότητας RNA, εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Στοκχόλμη, Σουηδία). Από καλλιεργημένα κύτταρα, ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας CellDirect ™ One-Step qRT-PCR Kit (Invitrogen, Lidingö, Σουηδία). Οι συγκεντρώσεις RNA προσδιορίστηκαν ποσοτικά με φασματοφωτομετρική μέτρηση σε μήκος κύματος 260 nm (DU640 φασματοφωτόμετρο, Beckman Coulter, Bromma, Σουηδία) και η ακεραιότητα του RNA επαληθεύεται με αιθίδιο χρώση με βρωμιούχο των 28S και 18S rRNA μετά από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης.

One-βήμα multiplex πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR χρησιμοποιήθηκε, όπου ενίσχυση και του γονιδίου ενδιαφέροντος και το γονίδιο της ενδογενούς ελέγχου διεξήχθησαν μαζί στο ίδιο σωληνάριο αντίδρασης. Gene-ειδικούς εκκινητές και ανιχνευτές Taqman αγοράστηκαν από την Applied Biosystems (Applera Σουηδία, Στοκχόλμη, Σουηδία). Για κάθε δείγμα, 40 ng ολικού RNA αναμίχθηκαν με μια αντίστροφη μεταγραφάση και ένζυμο πολυμεράσης κύριο μείγμα, και TaqMan® MGB ανιχνευτές και εκκινητές προστέθηκαν σε αυτό το μίγμα σε ένα τελικό όγκο 25 μΙ. Η αντίδραση qRT-PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα σύστημα ΑΒΙ PRISM 7900HT (Applera Σουηδία, Στοκχόλμη, Σουηδία), χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες συνθήκες κύκλου: αντίστροφη μεταγραφή για 15 λεπτά στους 50 ° C? 2 λεπτά στους 95 ° C, και 40 κύκλοι των: 95 ° C για 15 sec και 60 ° C για 60 sec. Κάθε μέτρηση διεξήχθη εις διπλούν και ο κύκλος κατωφλίου (C

t) προσδιορίστηκε για κάθε καμπύλη ενίσχυσης.

Για να δημιουργηθούν πρότυπες καμπύλες για την ποσοτική ανάλυση του κάθε γονιδίου, μια κυτταρική γραμμή επελέγη ότι ήταν μια αξιόπιστη και επαλήθευσε πηγή του mRNA για το συγκεκριμένο γονίδιο. πρότυπο RNA παραλείφθηκε σε αρνητικούς μάρτυρες, και λήφθηκε μία πρότυπη καμπύλη από διαδοχικές αραιώσεις του συνολικού RNA από τη σχετική κυτταρική γραμμή για όλα τα πειράματα και κάθε γονίδιο ενδιαφέροντος. Για κάθε δείγμα, ο μέσος όρος των τιμών εις διπλούν Ct μετετράπη σε ng RNA από ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης χρησιμοποιώντας μία σχετική τυπική μέθοδος καμπύλη χρησιμοποιώντας το πακέτο Excel (Microsoft, Redmond, Washington). Κάθε προσδιορισμένη τιμή RNA στη συνέχεια κανονικοποιούνται για το ενδογενές περιεχόμενο γονίδιο αναφοράς του ιδίου δείγματος. Από μια οθόνη των 11 γονιδίων καθαριότητας υποψήφιο, τον ανθρώπινο β2-μικροσφαιρίνη (

Β2Μ

) και αφυδρογονάση της 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (

GAPDH

) γονίδια προσδιορίζεται εμπειρικά από εμάς να είναι η πιο ισχυρή ενδογενή γονίδια ελέγχου για ανθρώπινο νεφρό ιστών και ανθρώπινες κυτταρικές σειρές, αντίστοιχα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τα αποτελέσματα που λήφθηκαν αυθαίρετα εκφράζονται ως ng tensin RNA /ng ενδογενές RNA ελέγχου.

Northern ανάλυση κηλίδας

Ανθρώπινο πολλαπλού ιστού Northern (ΜΤΝ) blots (BD Biosciences, Στοκχόλμη, Σουηδία), που περιέχει 2 μg poly Α + RNA κάθε από οκτώ κυτταρικές γραμμές καρκίνου, ανιχνεύθηκαν ως προς την έκφραση του mRNA Tensin2. Ένα 1.6 kb αλληλουχία 3-τερματική cDNA κοινή σε όλες τις παραλλαγές ματίσματος του Tensin2 χρησιμοποιήθηκε ως

32Ρ-σημασμένο ανιχνευτή. Η αλληλουχία cDNA της ανθρώπινης β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως ανιχνευτής ελέγχου. Ραδιοεπισήμανση με [

32Ρ] dCTP επιτεύχθηκε μέσω του συστήματος επισήμανσης DNA Rediprime II (GE Healthcare, Ουψάλα, Σουηδία). Η υβριδοποίηση διεξήχθη όλη τη νύχτα στους 42 ° C σε ρυθμιστικό διάλυμα υβριδοποίησης ULTRAhyb (Ambion, Στοκχόλμη, Σουηδία), ακολουθούμενη από υψηλό πλύσεις αυστηρότητας. Οι μεμβράνες εκτέθηκαν σε μια οθόνη Phosphor-Imager τουλάχιστον όλη την νύκτα πριν από την vizualization.

Ανοσοϊστοχημική ανάλυση Tensin3 σε ανθρώπινους όγκους νεφρού

Για την κατασκευή του μικροσυστοιχίες ιστού (TMAs), τομές RCC συλλέχθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω, και διαλογή με πρωτογενή αξιολόγηση αιματοξυλίνη /ηωσίνη-χρώση διαφάνειες πριν την παρασκευή ΤΜΑ όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21]. Εν συντομία, δύο πυρήνες διαμέτρου ιστού 0,6 χιλιοστά συλλέχθηκαν από κάθε μπλοκ όγκου και τοποθετημένα σε ένα μπλοκ δέκτη χρησιμοποιώντας ένα εγχειρίδιο arrayer ιστού (Beecher Inc., η Sun Prairie, WI). TMA τομές σε πάχος 4 μm αποπαραφινοποιήθηκαν και μικροκύματα αγωγή για ανάκτηση αντιγόνου σύμφωνα με τυπικές διαδικασίες. Η ποιότητα και η ευρωστία του RCC TMA έχει ελεγχθεί για άλλους παράγοντες και αναφέρθηκε από εμάς στο παρελθόν [22]. Το αντι-Tensin3 αντίσωμα κουνελιού πολυκλωνικό που χρησιμοποιούνται για ΤΜΑ ανοσοχρώση περιγράφεται παραπάνω και ελέγχθηκε για την εξειδίκευση από την ανάλυση των ψευδώς και Tensin3 επιμολυσμένα κύτταρα καθώς επίσης από το κλείδωμα αντιγόνο (Σχήμα S1). Για ανοσοκηλίδωση, το αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε σε βέλτιστα προσδιορίζονται αραίωση 1:300. Διεξήχθη ανίχνευση με υπεροξειδάση χρένου χρησιμοποιώντας το Dako EnVision και TechMate 500 συστήματα, και αντικηλίδωση με αιματοξυλίνη και ηωσίνη. TMA τομές από 148 ασθενείς αναλύθηκαν και χρώση ομαδοποιούνται σε καμία, χαμηλής, μέσης ή υψηλής έκφρασης Tensin3, καθώς και επιπρόσθετα για την παρουσία ή απουσία χρώσης στην πλασματική μεμβράνη (ΡΜ). Όλα TMAs αξιολογήθηκαν ανεξάρτητα από δύο παρατηρητές

Δημιουργία ανασυνδυασμένων Tensin3 κυττάρων που εκφράζουν

Η πλήρης αλληλουχία cDNA για Tensin3. (1409 αμινοξέα?. Προσχώρηση NCBI δεν NM_022748) κλωνοποιήθηκε σε pcDNA3 θηλαστικού φορέα έκφρασης (Gibco Invitrogen, Lidingö, Σουηδία) για σταθερή έκφραση σε ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά (ΗΕΚ) κύτταρα 293, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [5]. κύτταρα που φέρουν πλασμίδιο επιλέχθηκαν για ανάπτυξη με την παρουσία του αναλόγου νεομυκίνης G418 (400 μg /ml). Παράλληλα, οι κλώνοι ψευδο-επιμολυσμένα κυττάρων αναπτύχθηκαν επίσης φέρουν κενό φορέα μόνο, καθώς και μεταλλαγμένων κλώνων που περιέχει υποτιθέμενη ΡΤΡάσης-νεκρός μεταλλαγμένο Tensin3 (tNS3 Mut) cDNA. Αυτός ο μεταλλάκτης δημιουργήθηκε στην υποθετική ενεργή θέση ΡΤΡάσης του Tensin3 με κυστεΐνη στη θέση 107 υποκαθίσταται από σερίνη. Μετάλλαξη του άγριου τύπου Tensin3 cDNA σε φορέα pcDNA3 διεξήχθη με QuikChange τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση (Stratagene, Amsterdam, The Netherlands) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές (ενεργοποιημένο νουκλεοτίδιο υπογραμμισμένες): 5′-CATGTGGTCGTCATTCACAGCAGGGGCGGGAAAGGAC-3 ‘(νοηματικό ) και 5’-GTCCTTTCCCGCCCCTGCTGTGAATGACGACCACATG-3 ‘(antisense).

προσδιορισμούς πολλαπλασιασμού κυττάρων

ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε με δύο τρόπους. Η πρώτη ήταν η μέτρηση της μιτοχονδριακής δραστικότητας ως αντανάκλαση του αριθμού βιώσιμων κυττάρων, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Εν συντομία, ξεχωριστή κλώνοι κυττάρων σταθερά επιμολυσμένων ψευδο 293, τα κύτταρα άγριου τύπου Tensin3 (tNS3 wt) και μεταλλαγμένων κυττάρων Tensin3 ΡΤΡάσης (tNS3 Mut) σπάρθηκαν αραιά σε 0,5 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο σε μία πλάκα μικροτίτλου 96-φρεατίων, σε μέσο που περιέχει 0.5% ορό (ημέρα -1). Την επόμενη ημέρα (ημέρα 0), το μέσο αντικαταστάθηκε με το εν λόγω περιέχει 5% ορό, και τα κύτταρα περαιτέρω επωάστηκαν για έως και 7 ημέρες. Σε κάθε διαδοχική ημέρα, οι αριθμοί των βιώσιμων κυττάρων μετρήθηκε με μετατροπή τους κατά τη διάρκεια 3 h της ένωσης τετραζολίου [3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -5- (3-καρβοξυμεθοξυφαινυλ) -2- (4- σουλφοφαινυλ) -2Η-τετραζόλιο (MTS, Sigma) σε ένα διαλυτό προϊόν φορμαζάνης που μετρήθηκε φασματοφωτομετρικά στα 490 nm. Τετραπλούν φρεάτια χρησιμοποιήθηκαν για κάθε μέτρηση.

Η δεύτερη μέθοδος για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ήταν ποσοτικοποίηση απόλυτους αριθμούς κυττάρων για να δημιουργήσει ένα καμπύλη ανάπτυξης πάνω από 5 ημέρες. Ξεχωριστή κλώνοι κυττάρων σταθερά επιμολυσμένων ψευδο 293, τα κύτταρα άγριου τύπου Tensin3 (tNS3 wt) και μεταλλαγμένων κυττάρων Tensin3 ΡΤΡάσης (tNS3 Mut) σπάρθηκαν σε 1 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο σε 48 φρεατίων, σε μέσο που περιέχει 0.5% ορού (ημέρα -1). Την επόμενη ημέρα (ημέρα 0), το μέσο αντικαταστάθηκε με το εν λόγω περιέχει 5% ορό, και τα κύτταρα επωάστηκαν επί περαιτέρω 5 ημέρες. Σε κάθε διαδοχική ημέρα, αριθμός κυττάρων ανά φρεάτιο προσδιορίστηκε με θρυψινοποίηση των κυττάρων από τα φρεάτια και απαρίθμηση σε θάλαμο αιμοκυτταρόμετρο. Για κάθε κλώνο, ο αριθμός των κυττάρων προσδιορίστηκε από τη μέση μετρούν από εννέα πεδία. Και στα δύο πειράματα, στατιστικές διαφορές μεταξύ κυτταρικών τύπων σε κάθε ημέρα προσδιορίστηκαν με ANOVA με-hoc υστέρων διόρθωση Bonferroni.

μετανάστευση των κυττάρων και κυτταρικής μήτρας προσδιορισμούς εισβολής

Ένα τροποποιημένο σύστημα προσδιορισμού θαλάμου Boyden χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της μετανάστευσης /haptotaxis του Tensin3-επιμολυσμένα κύτταρα όπως περιγράφεται προηγουμένως [5]. Εν συντομία, κυτταρική καλλιέργεια ένθετα με 8 μm μεμβράνες μεγέθους πόρων (Nunclon, Roskilde, Denmark) προεπικαλυμμένα με ινονεκτίνη (10 μg /ml? Sigma, Stockholm, Sweden) στην κάτω πλευρά. Εισάγει τοποθετήθηκαν σε φρεάτια πλακών 24 φρεατίων που περιέχουν πλήρες μέσον ανάπτυξης, και 10

5 κύτταρα σπάρθηκαν σε κάθε ένθετο εσωτερικό σε πλήρες μέσο. Διπλότυπο ένθετα χρησιμοποιήθηκαν για κάθε ξεχωριστή γραμμή κυττάρων που αναλύθηκαν. Τα κύτταρα αφέθηκαν να μεταναστεύσουν στους 37 ° C σε επωαστή καλλιέργειας κυττάρων για 18 ώρες. Στη συνέχεια, ένθετα απομακρύνονται και μεσαίου μέσα αναρροφάται. Όλα τα κύτταρα αφήνονται επί της άνω επιφάνειας της μεμβράνης σκούπισε και ένθετο μεμβράνες εν συντομία ξεπλένονται, σταθεροποιήθηκαν σε 10% φορμαλίνη και χρωματίζονται με κρυσταλλικό ιώδες διάλυμα κατά Gram (Fluka, Στοκχόλμη, Σουηδία). Κύτταρα από ένα ελάχιστο τρία πεδία υψηλής ισχύος ανά ένθετο μετρήθηκαν υπό οπτικό μικροσκόπιο (Olympus, Solna, Σουηδία). Οι στατιστικές συγκρίσεις μεταξύ μετανάστευσης μεμονωμένων κλώνων κυττάρου έγιναν από ANOVA με Bonferroni post-hoc διόρθωση.

Για δοκιμασίες μήτρα εισβολή, ο ποσοτικός προσδιορισμός haptotaxis ανωτέρω τροποποιήθηκε έτσι ώστε αντί της φιμπρονεκτίνης, το μίγμα μήτρα βασικής μεμβράνης Matrigel ( BD Biosciences, Bedford, ΜΑ) χρησιμοποιήθηκε για να καλύψει το άνω πλευρά του ένθετα κυτταρικής καλλιέργειας με 8 μm πόρους. Ξεχωριστή κλώνοι κυττάρων Mock και Tensin3-επιμολυσμένα 293 σπάρθηκαν σε εσωτερικό θάλαμο σε μέσο που περιέχει 0,5% ορό, ενώ τα φρεάτια πλακών 24 φρεατίων περιείχε πλήρες μέσο ανάπτυξης, δημιουργώντας έτσι μία διαβάθμιση ορού. Διπλότυπο ένθετα χρησιμοποιήθηκαν για κάθε ξεχωριστή γραμμή κυττάρων που αναλύθηκαν. Τα κύτταρα αφέθηκαν να εισβάλουν στο πλέγμα και να μεταναστεύσουν μέσω στην άλλη πλευρά της μεμβράνης πάνω από 30 ώρες στους 37 ° C. Στη συνέχεια, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν, χρωματίστηκαν και μετρήθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω.

Νοκ ντάουν της Tensin3 από siRNA αποσιώπηση

Η κυτταρική γραμμή μελανώματος επιλέχθηκε WM793 για γονιδιακή σίγηση Tensin3 όπως εκφράζονται τα υψηλότερα ποσά των Tensin3 από όλα τα καρκινικές κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν (Σχήμα 1Β). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων 24 ώρες πριν την διαμόλυνση siRNA. Τα κύτταρα ξεχωριστά επιμολυσμένα με 5 nM κάθε τρεις διαφορετικές κατασκευές Tensin3 siRNA, siRNA I, II (ON-TARGET συν siRNA Αντιδραστήρια? Dharmacon, Täby, Σουηδία) και ΙΙΙ (HP επικυρωθεί siRNA? Qiagen, Solna, Σουηδία). Οι αρνητικοί έλεγχοι συμπεριλαμβάνονται μείγμα διαμόλυνσης μόνο και ένα μη-φίμωση siRNA που έδειξε να έχει μικρή επίδραση στην παγκόσμια γονιδιακή έκφραση (Allstars? Qiagen, Solna, Σουηδία). Το siRNA αναμίχθηκε με Lipofectamine 2000 και OptiMEM Ι στον ορό ελεύθερο μέσο (Invitrogen, Lidingö, Σουηδία), και το μίγμα επιμόλυνσης επωάζεται με κύτταρα για 24 ώρες. Μετά την περίοδο αυτή, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, μετρήθηκαν και υποβλήθηκαν σε μετανάστευση /haptotaxis δοκιμασία ακριβώς όπως περιγράφηκε παραπάνω, εκτός του ότι 0,5 × 10

5 WM793 κύτταρα ανά ένθεμα χρησιμοποιήθηκαν, και τη μετανάστευση αφέθηκε να συμβεί πάνω από 16 ώρες.

(Α) ανάλυση κηλίδος Northern του Tensin2 (TNS2) mRNA σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές. Ένα ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές ΜΤΝ στύπωμα ανιχνεύτηκε σε υψηλή αυστηρότητα με ραδιοεπισημασμένο cDNA ειδικό για Tensin2. Οι λωρίδες έχουν ως εξής: 1, προμυελοκυτταρικής λευχαιμίας HL-60? 2, HeLa S3? 3, χρόνια μυελογενή λευχαιμία Κ-562? 4, λεμφοβλαστική λευχαιμία MOLT-4? 5, του Burkitt λέμφωμα Raji? 6, ορθοκολικό αδενοκαρκίνωμα SW 480? 7, Α549 καρκινώματος πνεύμονα και 8, το μελάνωμα G-361. Η ίδια μεμβράνη διερευνήθηκε επίσης για την ανθρώπινη β-ακτίνη (χαμηλότερη πάνελ) για να δείξει ίση φόρτωση RNA. Ένας εκπρόσωπος κηλίδα εμφανίζεται δύο ανεξάρτητων υβριδισμών. εκφράσεις (Β) mRNA της Tensin2 και Tensin3 αναλύονται από qRT-PCR. Μια ομάδα ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών, καθώς και τα ανθρώπινα φυσιολογικά επιθηλιακά και ενδοθηλιακά κυτταρικές σειρές σαρώθηκαν για έκφραση Tensin2 (TNS2) (αριστερός άξονας, άδειο ράβδοι) και Tensin3 (tNS3) έκφραση (δεξιός άξονας, μαύρες μπάρες). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως σχετική έκφραση δίνεται μετά από κανονικοποίηση των γονιδίων που παρουσιάζουν ενδιαφέρον για το γονίδιο αναφοράς

GAPDH

(ng γονίδιο του γονιδίου αναφοράς ενδιαφέροντος /ng). (C, D) Η έκφραση πρωτεϊνών Tensin2 και Tensin3 σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές. Λύματα ολόκληρων κυττάρων υποβλήθηκαν σε 8% SDS-PAGE και δυτική ανίχνευση με στύπωση των πρωτεϊνών Tensin2 και Tensin3. Οι λωρίδες έχουν ως εξής: 1, κύτταρα ΗΕΚ 293 σταθερά επιμολυσμένα με Tensin2 (C)? 1, τα κύτταρα ΗΕΚ 293 σταθερά επιμολυσμένα με Tensin3 (D) 2, νεφρικό καρκίνωμα SKRC-52? 3, HeLa S3? 4, ορθοκολικό αδενοκαρκίνωμα SW 480? 5, αδενοκαρκινώματος μαστού MCF-7? 6, DU145 καρκίνου του προστάτη? 7, μελάνωμα WM793? . 8, το καρκίνωμα του πνεύμονα H727

Η

Η στατιστική ανάλυση

Όλα τα κλινικά δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το πακέτο λογισμικού SPSS (έκδοση 16.0.2 για Macintosh? SPSS Institute, Chicago, IL). Οι μέσες διαφορές των μη κανονικά κατανεμημένα δεδομένα αναλύθηκαν με τη δοκιμή Mann-Whitney. Η δοκιμή Kruskal-Wallis χρησιμοποιήθηκε για σύγκριση μεταξύ περισσοτέρων των δύο ομάδων. Οι συσχετίσεις αξιολογήθηκαν από Spearman rank test συσχέτισης. Οι καμπύλες επιβίωσης εκτιμήθηκαν με τα Kaplan-Meier μέθοδο και την επιβίωση φορές συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας το τεστ log-rank.

στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και εισβολή προσδιορισμούς, οι στατιστικές συγκρίσεις μεταξύ διαφορετικών κλώνων κυττάρων ή θεραπείες διεξήχθησαν με ANOVA με Bonferroni post-hoc διόρθωση. Όλες οι στατιστικές δοκιμασίες ήταν δύο όψεων και ένα

P

αξία μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

έκφραση tensin είναι ανύπαρκτη στα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα γραμμές

Θα προβληθεί για πρώτη φορά μια ομάδα ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών για έκφραση tensin. Μια επιλογή από διαφορετικές κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου υποβλήθηκε σε διαλογή με ανάλυση στυπώματος Northern για την έκφραση του Tensin2 mRNA. Η αναμενόμενη ζώνη στα 5 kb για Tensin2, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως ανθρωπίνων οργάνων [1], ήταν μόλις ανιχνεύσιμη σε μόνο 2 από 8 κυτταρικές σειρές: HeLa και SW480 (Σχήμα 1Α). Συνεχίσαμε να εκτελέσει ποσοτική RT-PCR για να διερευνήσει περαιτέρω τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της Tensin2 και Tensin3 σε μια μεγαλύτερη ποικιλία ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών και συγκρίθηκαν απευθείας με το RNA που εξάγεται από ολόκληρο εκχυλίσματα ανθρώπινου νεφρού ιστού. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, Tensin2 mRNA ήταν απούσα στην πλειονότητα των κυτταρικών γραμμών. Μόνο η κυτταρική σειρά ορθοκολικού αδενοκαρκινώματος SW480 εκφράζεται Tensin2 mRNA σε ανιχνεύσιμα επίπεδα, η οποία παρατηρήθηκε επίσης στο στύπωμα Northern (Σχήμα 1Α). Σημαντικά, τόσο Tensin2 και την έκφραση Tensin3 ήταν χαμηλότερες σε εκχύλισμα όγκου του νεφρού ενός ενιαίου ασθενούς RCC όπως συγκρίνει με παρακείμενο φυσιολογικό ομόλογό του (ταιριάζουν). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η έκφραση Tensin3 είναι υψηλότερη και ευρύτερο από αυτό του Tensin2 μεταξύ των κυτταρικών σειρών ερευνηθεί, αλλά ότι και τα δύο γονίδια φαίνεται να ρυθμίζεται προς τα κάτω σε RCC. Εξετάσαμε επίσης Tensin1 και Tensin4 mRNA στο ίδιο πάνελ των δειγμάτων και βρήκε έκφραση αυτών Tensins να είναι σε μεγάλο βαθμό μη ανιχνεύσιμη ή εντελώς απών (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Πραγματοποιήσαμε ανοσοστύπωμα για να αναλυθεί η πρωτεΐνη έκφρασης Tensin2 και Tensin3 (Σχήμα 1 C, D). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα του mRNA, η έκφραση Tensin2 στο επίπεδο πρωτεΐνης (μοριακό βάρος 160 kDa) ήταν σχεδόν ανιχνεύθηκε σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές, ενώ Tensin3 (180 kDa) έκφραση ήταν ανιχνεύσιμη τουλάχιστον σε δύο κυτταρικές σειρές: μελανώματος κυτταρική γραμμή WM793 και γραμμή καρκινώματος πνεύμονα H727. Μαζί αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η έκφραση όλων των Tensins είναι σε μεγάλο βαθμό απούσα σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές όπως επίσης και να ρυθμίζεται προς τα κάτω σε ανθρώπινους όγκους νεφρού.

επίπεδα Tensins 1-4 mRNA είναι σημαντικά χαμηλότερες σε νεφροκυτταρικό καρκίνωμα έναντι φυσιολογικό νεφρικό ιστό

Εφαρμόσαμε πολυπλεξίας ενός σταδίου qRT-PCR για να αξιολογήσει τα επίπεδα έκφρασης του mRNA και των τεσσάρων Tensins σε αυτή την κλινική μελέτη του συνολικού RNA που εκχυλίζεται από 223 RCC και 48 δείγματα ιστού φυσιολογικό νεφρό φλοιό. Τα κλινικά και παθολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών RCC στη μελέτη αυτή φαίνονται στον Πίνακα 1. Τα φυσιολογικά δείγματα ελήφθησαν από συμφωνημένα πηγές όγκου και η κατανομή των τύπων όγκων μεταξύ αυτών ήταν παρόμοια με εκείνη στο γενικό πληθυσμό, δηλαδή. 75% ήταν σαφών τύπου κυττάρου (Πίνακας 1). Από μια οθόνη 11 γονίδια υποψήφια καθαριότητα (Applera Σουηδία, Στοκχόλμη, Σουηδία), μπορούμε εμπειρικά προσδιορίζεται το

Β2Μ

γονίδιο να είναι η πιο συνεπής και ισχυρή εσωτερικό πρότυπο που θα χρησιμοποιηθεί για ανθρώπινη νεφρικό ιστό (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, η έκφραση του mRNA της Tensin2 από 223 RCC εκχυλίσματα ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ό, τι σε εκχυλίσματα από φυσιολογικό νεφρό φλοιού (48 περιπτώσεις?

σ

& lt? 0.001). Τα αποτελέσματα αντικατοπτρίζουν σε μεγάλο βαθμό από ccRCC, που αντιπροσώπευε την πλειοψηφία των περιπτώσεων? Ωστόσο, τα χαμηλότερα επίπεδα σε pRCC ήταν επίσης μεγάλη σημασία (

σ

& lt? 0.001). Επιπλέον, η ανάλυση της μόνο την υποομάδα των υλικών του όγκου που είχε συμφωνημένα κανονική τους ομολόγους απέδωσε επίσης σημαντικά χαμηλότερη Tensin2 και -3 έκφρασης στους ιστούς του όγκου (n = 48?

σ

& lt? 0.001). Επιπλέον, υπήρχε επίσης μια στατιστικά σημαντική μείωση στην έκφραση Tensin1 σε δείγματα όγκου (n = 134) σε σύγκριση με φυσιολογικούς (n = 21) (Σχήμα 2Β). Μια παρόμοια και πολύ σημαντική μείωση στην έκφραση Tensin3 mRNA παρατηρήθηκε επίσης (Σχήμα 2C). Αξιοσημείωτα, Tensins -1, -2 και -3 έκφραση ανιχνεύθηκε σε όλα τα δείγματα μετρήθηκαν. Αντίθετα, η έκφραση Tensin4 ήταν σε μεγάλο βαθμό απούσα στην πλειονότητα των δειγμάτων RCC που μετράται (n = 134), ενώ ήταν παρούσα σε όλα τα φυσιολογικά δείγματα νεφρού φλοιό (η = 21) (Σχήμα 2D). Τα ευρήματα αυτά, σε συνδυασμό με εκείνες που περιγράφονται παραπάνω, δείχνουν ότι μια γενική μείωση στην έκφραση του Tensins συμβαίνει σε RCC και ως εκ τούτου θα μπορούσε να είναι ευνοϊκή για την ανάπτυξη των όγκων RCC.

(A, C) τα επίπεδα mRNA του Tensin2 (TNS2) και Tensin3 (tNS3), αντίστοιχα, σε 223 ασθενείς με RCC ομαδοποιούνται ανάλογα με τον τύπο του όγκου, έναντι δείγματα φυσιολογικού νεφρού φλοιό από 48 ασθενείς. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως σχετική έκφραση (ng Tensin2 /Β2Μ ng και ng Tensin3 /ng B2M, αντίστοιχα). Tensin2 και Tensin3 έκφρασης σε σχέση με τον τύπο του όγκου, καθώς στην ομάδα ελέγχου φαίνονται μαζί με την μέση τιμή.

***

P

& lt? 0.001 κανονική εναντίον θηλώδες και για την κανονική εναντίον ccRCC. (B, D) Τα επίπεδα mRNA του Tensin1 (TNS1) και Tensin4 (TNS4), αντίστοιχα σε 134 περιπτώσεις RCC (όγκου) και 21 δείγματα νεφρικό φλοιό (κανονικό) μετά από κανονικοποίηση προς το γονίδιο (σχετική έκφραση) αναφοράς. είναι διάμεσες φαίνονται τόσο για Tensin1 και Tensin4 έκφραση σε φυσιολογικά και καρκινικά δείγματα. Στο πάνελ Α, η τιμή η = 123 υποδεικνύεται ως ο αριθμός των δειγμάτων του όγκου χωρίς Tensin4 έκφρασης.

***

P

& lt?. 0.001 κανονική εναντίον καρκινικών

αναλύει

Η συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης και κλινικές μεταβλητές tensin σε RCC ασθενείς

Πραγματοποιήσαμε συσχέτιση να αξιολογήσει ένα δυναμικό σχέση μεταξύ της έκφρασης mRNA σε tensin Συντονιστικά Κέντρα Διάσωσης και τα κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών. Οι πιο σχετικές συσχετίσεις συνοψίζονται στον Πίνακα 2. Πρώτον, η έκφραση του mRNA του Tensins 1-3 σε όγκους συσχετίζεται θετικά με το άλλο, αν και όχι με Tensin4 όπως ήταν σε μεγάλο βαθμό μη ανιχνεύσιμο σε δείγματα RCC. Καμία σημαντική συσχέτιση ήταν εμφανής μεταξύ των επιπέδων έκφρασης Tensins mRNA και κλινικές μεταβλητές όπως το μέγεθος του όγκου, του όγκου φλεβική διείσδυση, την περιφερειακή διείσδυση λεμφαδένων, την ηλικία ή το φύλο.