Αφηρημένο

μεταλλάξεις βλαστικής σειράς του

FH

, το γονίδιο που κωδικοποιεί για την TCA τρικαρβοξυλικού οξέος (TCA) ένζυμο κύκλο φουμαρικό Υδρατάση, συνδέονται με μια κληρονομική μορφή καρκίνου που αναφέρονται ως Κληρονομική Leiomyomatosis και καρκίνο νεφρών (HLRCC). Τα άτομα με HLRCC προδιάθεση για την ανάπτυξη ιδιαίτερα κακοήθη και θανατηφόρος νεφροκυτταρικό καρκίνωμα (RCC). Οι μηχανισμοί της ογκογένεσης προτεινόμενης έχουν επικεντρωθεί σε μεγάλο βαθμό στις βιοχημικές συνέπειες της απώλειας της ενζυματικής δραστικότητας FH. Ενώ η απώλεια του ογκοκατασταλτικό γονίδιο

von Hippel Lindau

(

VHL

) πιστεύεται ότι είναι ένα αρχικό γεγονός για την πλειοψηφία των Συντονιστικά Κέντρα Διάσωσης, ένας ρόλος για

FH

σε σποραδική νεφρικού καρκίνου δεν έχει διερευνηθεί. Εδώ αναφέρουμε ότι FH mRNA και η έκφραση πρωτεΐνης μειώνονται σε καρκίνο του νεφρού σαφή κύτταρο, η πιο κοινή ιστολογική παραλλαγή του καρκίνου του νεφρού. Επιπλέον, έχουμε καταδείξει ότι μειώνεται

FH

οδηγεί στη συσσώρευση της υποξίας επαγώγιμου παράγοντα 2α (HIF-2α), έναν παράγοντα μεταγραφής που είναι γνωστό ότι προάγουν τη νεφρική καρκινογένεση. Τέλος, αποδεικνύουμε ότι η υπερέκφραση του FH σε νεφρικά καρκινικά κύτταρα αναστέλλει την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή. Αυτά τα δεδομένα παρέχουν νέες γνώσεις σχετικά με τις λειτουργίες ογκοκατασταλτικό της FH στο σποραδικό καρκίνο του νεφρού

Παράθεση:. Sudarshan S, Shanmugasundaram Κ, Naylor SL, Lin S, Livi CB, O’Neill CF, et al. (2011) μειωμένη έκφραση του Φουμαρικού Υδρατάση σε Clear κυττάρων των νεφρών Καρκίνος Μεσολαβεί HIF-2α συσσώρευση και προάγει τη μετανάστευση και την εισβολή. PLoS ONE 6 (6): e21037. doi: 10.1371 /journal.pone.0021037

Επιμέλεια: Marcelo Γ Bonini, Πανεπιστήμιο του Ιλινόις στο Σικάγο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 18 Ιανουαρίου 2011? Αποδεκτές: 17 του Μαΐου, 2011? Δημοσιεύθηκε: 14, Ιουνίου, 2011

Copyright: © 2011 Sudarshan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Cancer Therapy και Ερευνητικό Κέντρο (CTRC) στο Πανεπιστήμιο του Τέξας Health Science Center (Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας P30 CA054174-17). SS υποστηρίζεται από ΝΙΗ K08 CA138774, Voelcker Ταμείο Βραβείο Νέου Ερευνητή, Γ.Π.Α. Ίδρυμα /Astellas Rising βραβείο αστεριών, και ένα ιδιαίτερο δώρο από τον κ Charles Butt και τους υπαλλήλους της Εβρ. SLN υποστηρίζεται από το CTRC και ΝΙΗ U01 CA86402. LZS υποστηρίζεται από ΝΙΗ R01 CA079683. KB υποστηρίζεται από Βετεράνων Βραβείο Διοίκησης Career Development (CDA-2) και ΝΙΗ R01 NCI CA131272. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Το 2010, πάνω από 57.000 άνδρες και γυναίκες θα διαγνωστεί με νεφροκυτταρικό καρκίνωμα (RCC) και 13.000 άτομα θα πεθάνουν από την ασθένεια αυτή [1]. Παρά το γεγονός ότι η επιβίωση για τους ασθενείς με εντοπισμένη νόσο είναι υψηλή, οι ασθενείς με προχωρημένη νόσο αντιμετωπίζουν μια κακή πρόγνωση παρά πρόσφατα εισαχθεί παράγοντες στόχους. Αν και η απώλεια του

von Hippel Lindau

(

VHL

) ογκοκατασταλτικό γονίδιο πιστεύεται ότι είναι ένα αρχικό γεγονός για την πλειοψηφία των Συντονιστικά Κέντρα Διάσωσης [2], λίγα είναι γνωστά για μετέπειτα γενετική γεγονότα και τους αντίστοιχες επιπτώσεις στην ογκογένεση. Διαλεύκανση αυτών των οδών θα προσδιορίσει νέων θεραπευτικών στόχων, καθώς και τη διευκόλυνση της ανάπτυξης βιοδεικτών που μπορεί να έχει τόσο διαγνωστική και προγνωστική σημασία.

βλαστικές μεταλλάξεις του

FH

συνδέονται με μια κληρονομική μορφή καρκίνου του νεφρού που αναφέρονται ως Κληρονομική Leiomyomatosis και καρκίνο νεφρών (HLRCC) [3], [4].

FH

κωδικοποιεί το τρικαρβοξυλικό οξύ κύκλος υδρατάσης ένζυμο φουμαρικό άλας (που αναφέρεται επίσης ως φουμαράση), το οποίο καταλύει την ενυδάτωση του fumarate για το σχηματισμό μηλικό. Τα άτομα με προδιάθεση HLRCC στην ανάπτυξη της λειομυωμάτων του δέρματος και τη μήτρα εκτός από την άκρως κακοήθη και θανατηφόρα RCC. Οι μηχανισμοί της ογκογένεσης προτεινόμενης έχουν επικεντρωθεί σε μεγάλο βαθμό στις βιοχημικές συνέπειες της απώλειας της ενζυματικής δραστικότητας FH. Έχει προταθεί ότι η απώλεια της FH οδηγεί σε συσσώρευση φουμαρικό και προωθεί μια pseudohypoxic κατάσταση στην οποία μονοπάτια απόκριση υποξίας ενεργοποιούνται ανωμάλως παρά ορθοξικές συνθήκες [5]. Φουμαρικό έχει δειχθεί ότι αναστέλλει προλίνη υδροξυλίωση της υποξίας επαγώγιμου παράγοντες HIF-1α και HIF-2α οποία καταλύεται από μια οικογένεια ενζύμων που αναφέρονται ως οι υδροξυλάσες HIF προλυλ (διδάκτορες) [5]. Σε unhydroxylated μορφή τους, HIFαs αποφύγει την αναγνώριση από το Ε3 ουμπικουιτίνης λιγάση VHL (το οποίο στοχεύει αυτές τις πρωτεΐνες για αποικοδόμηση proteosomal) και επομένως σταθεροποιημένη [6], [7], [8], [9]. Υπό αυτές τις συνθήκες είτε HIF-1α ή HIF-2α είναι σε θέση να ετεροδιμερίζονται με τον συστατικώς εκφρασμένη πρωτεΐνη HIF-1β, που αναφέρεται επίσης ως ARNT (ανασκοπήθηκε πρόσφατα [10]). Αυτό heterocomplex είναι σε θέση να μεταγραφικά ενεργοποιούν διάφορα γονίδια συμπεριλαμβανομένων των

VEGF

και άλλους παράγοντες ανάπτυξης που μπορεί να είναι προ-ογκογόνο όταν απορυθμίζεται. Ψευδό έχει επίσης ενοχοποιηθεί στη συνηθέστερη παραλλαγή του RCC, σαφείς καρκίνωμα (ccRCC), στην οποία η απώλεια του

VHL

είναι μια κοινή γενετική συμβάν [11]. Όπως ήταν αναμενόμενο, τα αυξημένα επίπεδα του HIF-1α και /ή HIF-2α σημειώνεται σε νεφρική καρκίνους σαφής κυττάρου [12], [13]. Είναι ενδιαφέρον ότι, πολλές γραμμές αποδείξεως δεικνύουν ότι HIF-2α σε αντίθεση με HIF-1α, είναι κρίσιμη για το σχηματισμό ή /και την πρόοδο [14] RCC, [15], [16].

Ενώ

VHL

απώλεια είναι σαφώς κρίσιμη για σταθεροποίηση HIF-2α, εναλλάσσονται μηχανισμούς, εκτός από την πρόληψη της υποβάθμισης, μπορεί να παίζει ένα ρόλο στη διατήρηση του HIF-2α σε καρκίνο του νεφρού. Προηγούμενη εργασία με Αποκλεισμός

et al.

Καθιέρωσε ένα ρόλο για αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) που παράγεται από οξειδάσες NADPH στη διατήρηση έκφραση πρωτεΐνης HIF-2α μέσω ενός μηχανισμού mRNA μεταφραστική ΑΚΤ εξαρτώμενη σε VHL με ανεπάρκεια κυττάρων [17] . Επιπλέον, mTOR σηματοδότησης συγκρότημα 2 (mTORC2), ένα γνωστό ενεργοποιητή της σηματοδότησης ΑΚΤ, έχει δειχθεί ότι προάγει τη συσσώρευση HIF-2α σε ποσοστό

VHL

null κύτταρα νεφρικού καρκινώματος [18]. Πιο πρόσφατα, η θεραπεία των κυττάρων RCC με έναν αναστολέα διπλή ΡΙ3Κ /mTOR κατέστειλε την έκφραση του HIF-2α [19]. Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν την ιδέα ότι η συνεχιζόμενη σύνθεση HIF-2α είναι κρίσιμη για τη διατήρηση αυτού του ογκογόνου παράγοντα μεταγραφής σε νεφρικά καρκινικά κύτταρα.

FH

μεταλλάξεις έχουν κατά κύριο λόγο έχουν συνδεθεί με θηλώδες τύπου II καρκίνο του νεφρού , μια ιστολογική παραλλαγή που αντιπροσωπεύει λιγότερο από το 10% όλων των καρκίνων του νεφρού [20].

FH

μεταλλάξεις δεν έχουν εντοπιστεί σε σποραδικές καρκίνο του νεφρού σαφές κυττάρων. Ωστόσο, μια πρόσφατη έκθεση έχει συνδεθεί

FH

στην ανάπτυξη του νεφρικού καρκίνου σαφές κυττάρων σε έναν ασθενή με βλαστική μετάλλαξη του

FH

[21]. Μέχρι σήμερα, η έκφραση και η λειτουργία του

FH

στο ccRCC δεν έχει εξεταστεί. Ως εκ τούτου, διερευνήσαμε το ρόλο της FH σε σποραδικές καρκίνο του νεφρού σαφές κυττάρων.

Αποτελέσματα

Μειωμένη έκφραση της FH σε σαφή κυττάρων

νεφρικό καρκίνωμα

έκφραση FH σε ccRCC δεν έχει ακόμη πρέπει να διερευνηθούν. Επομένως, εξετάσαμε πρώτα την πρωτεΐνη έκφραση FH σε ένα πάνελ ανθρώπινων νεφρικών όγκων σαφής κυττάρων και ταιριαστού ασθενούς φυσιολογική νεφρική παρέγχυμα. ανάλυση ανοσοκηλίδος των προϊόντων λύσης ιστών επέδειξε αξιοσημείωτη μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης FH στους όγκους σε σύγκριση με φυσιολογικά γειτονικό ιστό (Σχήμα 1Α). Για την επιβεβαίωση των ευρημάτων μας, πραγματοποιήσαμε ανοσοϊστοχημική χρώση για FH στο όγκου /φυσιολογικό ζεύγη ασθενή ταιριάζουν. Αυτά τα αποτελέσματα συσχετίζονται με ανοσοστύπωμα τα αποτελέσματά μας σε αυτή χρώση για FH ήταν μικρότερη σε όγκους σε σχέση με τον έλεγχο νεφρικό ιστό (Εικόνα 1Β). Στη συνέχεια εξετάσαμε τα επίπεδα πρωτεΐνης FH σε ένα πάνελ καθιερωμένων κυτταρικών σειρών ccRCC (786-O, Α498, RCC4, και ACHN). Όλα τα καλλιεργημένα κύτταρα απέδειξαν μειωμένα επίπεδα πρωτεΐνης FH σχέση με το φυσιολογικό νεφρό (Σχήμα 1 C). Στη συνέχεια εξετάστηκαν τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της

FH

σε καρκινικό ιστό σε σύγκριση με τον ασθενή συμφωνημένα φυσιολογικό νεφρικό ιστό σε δείγματα από το Cooperative Human Tissue Network (NCI). Ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR, έδειξαν μειωμένη

FH

επίπεδα του mRNA σε ιστό όγκου, σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό (Εικόνα 2). Ανάλυση των επιπέδων του mRNA αποκαλύπτει ότι πάνω από το 70% των δειγμάτων του όγκου, έδειξαν μειωμένη

FH

επίπεδα του mRNA σε σχέση με την κανονική συμφωνημένα νεφρικό παρέγχυμα. Επιπλέον, 15/32 δείγματα των ασθενών (47%) παρουσίασαν μείωση μεγαλύτερη από διπλάσια σε

FH

επίπεδα mRNA σε δείγματα όγκων σε σχέση με το φυσιολογικό έλεγχο. Συνολικά, η μέση μείωση σε ποσοστό

FH

επίπεδα mRNA ήταν 2,9 φορές. Αυτή η διαφορά προσδιορίστηκε να είναι στατιστικά σημαντική. Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν μειωμένη έκφραση του

FH

στα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης σε ccRCC.

Α) πρωτεΐνη απομονώθηκε από σαφή δείγματα κυττάρων (CC) του όγκου (Τ) πέραν συμφωνημένα φυσιολογική νεφρική παρέγχυμα (Ν). Οι πρωτεΐνες ανοσοστυπώθηκαν για τα επίπεδα της πρωτεΐνης FH. GAPDH ανοσοστύπωμα περιλαμβάνεται ως μάρτυρας φόρτωσης. Β) Η ανοσοϊστοχημική χρώση για FH διεξήχθη σε όγκο /κανονική ζεύγη ασθενή-συμφωνημένα. Εικόνες ελήφθησαν με ένα αντικειμενικό φακό 40 ×. Γ) τα επίπεδα πρωτεΐνης FH στις γραμμές RCC σχέση με το φυσιολογικό νεφρό. Ακτίνη περιλαμβάνεται ως μάρτυρας φόρτωσης.

Η

επίπεδα του mRNA της

FH

προσδιορίστηκαν σε ένα ξεχωριστό σύνολο των δειγμάτων του όγκου σε σχέση με τον ασθενή συμφωνημένα φυσιολογική νεφρική παρεγχύματος με πραγματικού χρόνου RT-PCR ( p = 0,004). Τα επίπεδα έκφρασης κανονικοποιούνται σε 18 s rRNA επίπεδα πριν από την συγκριτική ανάλυση.

Η

FH διαμορφώνει HIF-2α επίπεδα

Υψηλά επίπεδα fumarate σε FH με ανεπάρκεια RCC παίζουν ένα ρόλο στη σταθεροποίηση HIF έκφραση -2α πρωτεΐνη μέσω της αναστολής της δραστικότητας υδροξυλάσης προλίνης εμποδίζοντας έτσι την αναγνώριση VHL. Με βάση αυτά τα δεδομένα, υποθέσαμε ότι η απώλεια της FH θα πρέπει να έχει καμία επίδραση στα επίπεδα της πρωτεΐνης HIF στο

VHL

null κυτταρικές σειρές. Ωστόσο, βρήκαμε ότι siRNA μεσολάβηση knockdown του FH οδήγησε σε περαιτέρω αύξηση του HIF-2α επίπεδα πρωτεΐνης σε δύο γραμμές ccRCC ποια είναι

VHL

null (786-O και Α498) (Σχήμα 3Α). Προς στήριξη αυτών των ευρημάτων, παροδική υπερέκφραση του FLAG-tagged FH (FH-FLAG) μειώνεται HIF-2α επίπεδα σε 786-Ο κύτταρα (Εικόνα 3Β). Μαζί, αυτό υποδηλώνει ότι FH ρυθμίζει HIF-2α έκφραση της πρωτεΐνης απουσία VHL.

Α)

VHL

null 786-O και Α498 κύτταρα εγκαρσίως με siRNA με FH και τον έλεγχο αγωνίζομαι ( sinc). Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, λύματα πρωτείνης αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση για τις υποδεικνυόμενες πρωτεΐνες. Β) 786-O κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με το φορέα ελέγχου (CV) και φορέα που περιέχει FLAG ετικέτα FH. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, λύματα πρωτείνης αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση για τις υποδεικνυόμενες πρωτεΐνες. FLAG ανοσοκηλίδος δεικνύει επιτυχή έκφραση του διαγονιδίου. Γ) () κύτταρα Αριστερό 786-O ήταν σταθερά επιμολυσμένα με το βιογραφικό και FH-FLAG. Μετά την επιλογή σε πουρομυκίνη, μεμονωμένοι κλώνοι κυττάρων συλλέχθηκαν και εξετάστηκαν για έκφραση FLAG. επίπεδα HIF-2α μετρήθηκαν σε FH-FLAG κλώνους έκφρασης σε σχέση με τα επιμολυσμένα κύτταρα CV. Πυκνότητας των ζωνών ποσοτικά εμφανίζεται στα δεξιά. Οι μέσες τιμές σχετικής +/- τυπική απόκλιση ελήφθησαν με το λογισμικό ImageJ από ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Για να διευκρινιστεί περαιτέρω ο μηχανισμός με τον οποίο FH ρυθμίζουν την έκφραση της πρωτεΐνης του HIF-2α, δημιουργήσαμε σταθερές κυτταρικές σειρές που υπερεκφράζουν FH-FLAG σε 786-Ο κύτταρα VHL ανεπάρκεια. Εντοπίσαμε 3 κλώνοι που εκφράζεται σταθερά το μόρφωμα FH-FLAG. Όλα τα 3 κλώνων επέδειξε μειωμένη HIF-2α επίπεδα σε σύγκριση με το φορέα αναφοράς μορφομετατραπέντα κύτταρα (Σχήμα 3C). Εμείς αρχικά κατά πόσον είχαν μεταγραφικά μεσολάβηση τα αποτελέσματα επί HIF-2α, ωστόσο δεν είχαμε ανιχνεύσει μειώσεις HIF-2α επιπέδων mRNA με FH υπερέκφραση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

απώλεια FH ενεργοποιεί ΑΚΤ σηματοδότηση

Πρόσφατες εκθέσεις έχουν εμπλακεί σηματοδότησης PI3K /AKT στη διατήρηση της πρωτεϊνικής έκφρασης του HIF-2α σε

VHL

null κύτταρα μέσω ενός μεταφραστικού μηχανισμού [17], [18], [19], [22] _ENREF_17. Με βάση αυτές τις εκθέσεις, εξετάσαμε σηματοδότησης AKT με FH διαμόρφωσης. Βρήκαμε ότι siRNA μεσολάβηση knockdown του

FH

στις δύο 786-O και Α498 κύτταρα έχει ως αποτέλεσμα την αυξημένη φωσφορυλίωση της ΑΚΤ σε σερίνη 473 του ΑΚΤ (Σχήμα 4Α). Αντίστοιχα, η υπερέκφραση του FH μείωσε φωσφο-ΑΚΤ επίπεδα σε 786-Ο κύτταρα (Σχήμα 4Β) υποδηλώνοντας ότι τα επίπεδα FH αντιστρόφως συσχετίζονται με σηματοδότηση ΑΚΤ. Εξετάσαμε την επόμενη τις επιδράσεις της αναστολής της ΡΙ3Κ στην έκφραση FH-εξαρτώμενη πρωτεΐνη HIF-2α. Συνεπής με τα προηγούμενα ευρήματά μας, FH σηματοδότησης νοκ ντάουν ενεργοποιηθεί ΑΚΤ και την αύξηση της HIF-2α επίπεδα σε σύγκριση με αγωνίζομαι επιμολυσμένα κύτταρα (sinc) (Σχήμα 4C). Ωστόσο, της ταυτόχρονης θεραπείας των επιμολυσμένων κυττάρων με τον αναστολέα της ΡΙ3Κ LY-294002 μπλοκάρει την αύξηση του HIF-2α σχετίζεται με FH knockdown (Σχήμα 4C). Μαζί, αυτό υποδηλώνει ότι FH διατηρεί την έκφραση της πρωτεΐνης του HIF-2α μέσω των μηχανισμών που εξαρτώνται από την PI3K και σηματοδότησης ΑΚΤ.

Α)

VHL

null 786-O και Α498 κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA με FH και αγωνίζομαι ελέγχου (sinc). Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, λύματα πρωτείνης αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση για ολική ΑΚΤ και Ser473 φωσφο-ΑΚΤ. Β) 786-O κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με το φορέα ελέγχου (CV) και φορέα που περιέχει FLAG ετικέτα FH. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, λύματα πρωτείνης αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση για τις υποδεικνυόμενες πρωτεΐνες. C) κύτταρα 786-Ο διαμολύνθηκαν με την υποδεικνυόμενη siRNA. Εικοσιτέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, τα μέσα ενημέρωσης των κυττάρων αντικαταστάθηκε με μέσα που περιέχουν αναστολέα της ΡΙ3Κ LY-294002 (6,25 μΜ). Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν 24 ώρες αργότερα και προϊόντα λύσης πρωτεΐνης υποβλήθηκαν σε Ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως για τις υποδεικνυόμενες πρωτεΐνες.

Η

έκφραση FH διαμεσολαβεί κυτταρική μετανάστευση και εισβολή

Οι βιολογικές συνέπειες της FH υπερέκφραση σε RCC κύτταρα επόμενη εξετάστηκαν.

FH

null όγκοι είναι άκρως διεισδυτική και συχνά μεταστατικούς όγκους [20], και HIF-2α έχει προηγουμένως εμπλακεί σε αυτή την κυτταρική διαδικασία [23]. Συνεπώς, διερευνήσαμε το ρόλο της FH στην κυτταρική μετανάστευση και εισβολή σε ccRCC. Βρίσκουμε ότι knockdown του HIF-2α με siRNA σε κύτταρα RCC 786-O μειώνεται κυτταρική κινητικότητα, όπως προσδιορίζεται με δοκιμασία επούλωσης της πληγής σε σύγκριση με ανακατώσει επιμολυσμένα κύτταρα (Σχήματα 5Α και 5Β). Ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων αυτών παρέχονται στο Σχήμα 5C. Ενώ σχεδόν το 80% του κενού της πληγής έκλεισε στα κύτταρα ελέγχου επιμολύνθηκαν με 12 ώρες, το 50% του κενού της πληγής παρέμεινε στην knockdown κυττάρων HIF-2α. Λαμβάνοντας υπόψη αυτά τα δεδομένα, εξετάσαμε την επούλωση των πληγών σε FH υπερεκφράζουν υποκλώνους 786-Ο, σε σύγκριση με τον φορέα ελέγχου επιμολυσμένα κύτταρα. Και οι δύο κλώνοι που υπερεκφράζουν FH είχε μειωθεί σημαντικά το κλείσιμο της πληγής σε σύγκριση με τον φορέα ελέγχου επιμολυσμένα κύτταρα, υποδηλώνοντας ότι η απώλεια του FH συμβάλλει στη μετανάστευση σε RCC (Σχήμα 6Α). Σε κύτταρα επιμολυσμένα φορέα ελέγχου, το διάκενο πλάτος τραύμα ήταν σχεδόν πλήρως κλείσει από 10 ώρες. Σε αντίθεση, FH κύτταρα που υπερεκφράζουν κλείσει το χάσμα του τραύματος με μόνο το μισό από 10 ώρες υποδεικνύοντας μειωμένη κυτταρική μετανάστευση ήταν αποτέλεσμα υπερέκφρασης FH. Αυτά τα αποτελέσματα εμφανίζονται γραφικά (Σχήμα 6Β). Για περαιτέρω επιβεβαίωση αυτών των δεδομένων, εξετάσαμε την κυτταρική μετανάστευση χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία θάλαμο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό ως χημειοελκυστικό. 786-Ο κύτταρα ελέγχου φορέα ήταν σημαντικά μεγαλύτερη από ό, τι τα μεταναστευτικά FH υπερεκφράζουν κλώνους (Σχήμα 6C). Τέλος, η υπερέκφραση του FH σε κύτταρα RCC μειωμένη επεμβατική ικανότητά τους όπως προσδιορίζεται με δοκιμασία Matrigel εισβολής (Σχήμα 6D). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι η απώλεια της έκφρασης FH ενισχύει τη μεταναστευτική και επεμβατική ικανότητα των κυττάρων του RCC.

786-Ο κύτταρα RCC επιμολύνθηκαν με έλεγχο σκαρφάλωμα siRNA (sinc) ή siRNA σε HIF-2α. Τα αποτελέσματα κηλίδωση Western εκχυλισμάτων ολικού κυττάρου καταδειχθεί σε πάνελ Α Β) τραύματος δοκιμασία επούλωσης διεξήχθη σε επιμολυσμένα κύτταρα. Οι εικόνες που λαμβάνονται σειριακά στον υποδεικνυόμενο χρονικό σημείο μετά την επαγωγή «πληγή». Αποτελέσματα Τα γραφικά εμφανίζονται στον πίνακα C. Οι αστερίσκοι (*) δηλώνουν στατιστική σημαντικότητα με ρ & lt? 0,05 σε σχέση με αγωνίζομαι ελέγχου επιμολυσμένα κύτταρα

Η

Α) πληγή επούλωση εικόνες δοκιμασία στα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία.. Β) τραύματος πλάτος απόσταση στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία. Γ) τμήμα δοκιμασία μετανάστευσης κυττάρων των υποδεικνυόμενων κλώνων. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού με 10% FBS χρησιμοποιήθηκε ως χημειοελκυστικό. Μετανάστευσαν μετρήσεις κυττάρων των κλώνων σε 48 ώρες από την αρχική σπορά. Οι αστερίσκοι (*) υποδεικνύουν στατιστική σημαντικότητα με ρ & lt? 0,05 σε σχέση με τον έλεγχο φορέα επιμολυσμένων κυττάρων. Δ) δοκιμασία εισβολή Matrigel με 10% FBS media ως χημειοελκυστικό. Οι αστερίσκοι (*) δηλώνουν στατιστική σημαντικότητα με ρ & lt?. 0.05 σε σχέση με τον έλεγχο φορέα επιμολυσμένα κύτταρα

Η

Συζήτηση

Στην έκθεση αυτή, που αποδεικνύουν για πρώτη φορά μειωμένη έκφραση FH στο mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης σε σαφή κύτταρο νεφρικού καρκινώματος, η πιο κοινή ιστολογική παραλλαγή που αντιπροσωπεύει το μεγαλύτερο μέρος των καρκίνων του νεφρού. Τα ευρήματα αυτά είναι σημαντικά, όπως προηγούμενες μελέτες δεν εντόπισε

FH

μεταλλάξεις στις γραμμές RCC όπως και τα πρωτογενή δείγματα RCC [24]. Οι μηχανισμοί με τους οποίους τα επίπεδα του mRNA της

FH

μειώνονται βρίσκονται υπό τρέχουσα έρευνα. Υπερμεθυλίωση μπορεί να είναι ένας μηχανισμός με τον οποίο

FH

έκφραση καταστέλλεται. Νουλάϊμι

et al.

Δεν εντόπισε υπερμεθυλίωση σε ένα νησί CpG του

FH

προαγωγό σε ένα πίνακα του θηλώδους Συντονιστικά Κέντρα Διάσωσης [25]. Ωστόσο, υπάρχουν μελέτες μέχρι σήμερα έχουν εξεταστεί

FH

κατάσταση μεθυλίωσης σε ccRCC. Ενώ υπερμεθυλίωση είναι ένα μέσο γονιδιακής αποσιώπησης ογκοκατασταλτικό, αναπληρωτής μηχανισμοί μπορούν επίσης να ευθύνονται για τη μειωμένη έκφραση του

FH

έχουμε εντοπίσει. Πρόσφατα, το ενδιαφέρον επικεντρώθηκε στο ρόλο του microRNA (miRNA) στη ρύθμιση των γονιδίων, όπου οι εκθέσεις δείχνουν ότι τα γονίδια που εμπλέκονται στην οξειδωτική φωσφορυλίωση μπορεί να υπόκειται σε ρύθμιση από miRNAs [26]. Σαφώς, οι δυνατότητες αυτές απαιτούν περαιτέρω διερεύνηση δοθεί η βιολογική σημασία των ευρημάτων μας.

Έχουμε αποδείξει στο παρελθόν ότι η επαναφορά του άγριου τύπου

FH

σε ένα

FH

ανεπάρκεια όγκου κυτταρική γραμμή καταλήγει σε μία σημαντική μείωση στην πυρηνική HIF-1α επίπεδα [27]. Επιπλέον, siRNA μεσολαβεί knockdown του FH έχει αποδειχθεί ότι αυξάνει HIF-1α επίπεδα σε κύτταρα καρκινώματος πνεύμονα Α549 που εκφράζουν VHL [5]. Τα ευρήματα από τις μελέτες αυτές, καθώς και άλλες βιοχημικές μελέτες, δείχνουν ότι η αρχή μηχανισμός με τον οποίο συμβαίνει αυτό είναι μέσω της σταθεροποίησης πρωτεΐνη HIF μέσω αναστολής της προλυλ υδροξυλάσης δραστηριότητα, ως αποτέλεσμα της απώλειας FH. Ως εκ τούτου, τα ευρήματα αυτά θα υποθέσει ότι η επίδραση της FH σε HIF θα είναι εμφανής μόνο με την παρουσία του VHL. Ωστόσο, τα ευρήματά μας είναι αρκετά μυθιστόρημα στο ότι δείχνουν ότι FH μπορούν να διαμορφώσουν HIF-2α ανεξάρτητα από VHL. Οι VHL-ανεξάρτητες οδούς οι οποίες μεσολαβούν αποικοδόμηση HIF έχουν αναφερθεί. Ειδικότερα, Hsp90 και RACK1 έχουν προηγουμένως δειχθεί ότι ρυθμίζουν HIF-1α αποικοδόμηση [28]. Ως εκ τούτου, είναι πιθανό ότι ένας παρόμοιος μηχανισμός μεσολαβεί αποικοδόμηση HIF-2α, καθώς και. Παρά τη σταθεροποίηση μέσω αναστολής της αποικοδόμησης των πρωτεϊνών, υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις ότι εναλλακτικές οδούς παίζουν ρόλο στη διατήρηση της HIF-2α επίπεδα πρωτεΐνης εν απουσία VHL. Αποκλεισμός

et al.

Απέδειξαν ότι η αυξημένη κυτταρική αντιδραστικά είδη οξυγόνου, που προκαλούνται από Ρ22-phOx οξειδάσες Nox βασίζονται, διατηρούν HIF-2α επίπεδα πρωτεΐνης σε κύτταρα RCC μέσω ΑΚΤ /4E-BP1 mRNA μεταφραστική εξαρτώμενος μηχανισμός [17] , [22]. Αντίστοιχα, η φωσφορυλίωση των ΑΚΤ και 4Ε-ΒΡ1 βελτιώνονται σε ανθρώπινο RCC ιστό σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό παρεγχυματικά [22]. Πιο πρόσφατα, Toschi

et al.

Βρέθηκε ότι η ενεργοποίηση ΑΚΤ, μέσω σηματοδότησης μέσω του mTOR σηματοδότησης συγκρότημα 2 (mTORC2), για να διατηρηθεί HIF-2α σε μηδενικά κύτταρα VHL [18]. ενεργοποίησης ΑΚΤ αποτελεί κοινό κόμβο σηματοδότησης στον καρκίνο και αναπληρωματικών μηχανισμών μπορεί να οδηγήσει σε ενεργοποίηση ΑΚΤ στο RCC συμπεριλαμβανομένης της απώλειας της FH.

Ο μηχανισμός με τον οποίο σηματοδότησης AKT ενεργοποιείται από την απώλεια FH είναι κάτω από την τρέχουσα έρευνα. Έχουμε αποδείξει προηγουμένως ότι η απώλεια της FH σε νεφρικά επιθηλιακά κύτταρα έχει σαν αποτέλεσμα αυξημένη κυτταρική οξειδωτική καταπόνηση [27]. Ως εκ τούτου, ROS μπορεί να είναι ένας παράγοντας που συμβάλλει στα υψηλά επίπεδα HIF-2α κατά FH νοκ ντάουν. Εναλλακτικά, οι επιπτώσεις της απώλειας FH μπορεί να είναι άσχετη με το ρόλο του στον κύκλο TCA. Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι FH υπάρχει επίσης σε μια μιτοχονδριακών, κυτοσολικά μορφή. Προς το παρόν, πολύ λίγα είναι γνωστά σχετικά με τη λειτουργία αυτής της μορφής FH. Ωστόσο, πρόσφατα στοιχεία που παρέχονται από O’Flaherty

et al.

Δείχνει ότι η απώλεια των μιτοχονδριακών FH μπορεί να συμβάλει στη σταθεροποίηση HIF [29]. Επιπλέον, κυτοσολικά FH έχει ενοχοποιηθεί στην απόκριση βλάβη του DNA [30]. Μετά βλάβη του DNA, κυτοσολικά FH έχει δειχθεί ότι μετατοπίζεται στον πυρήνα. Ο μηχανισμός με τον οποίο FH συμμετέχει στην απόκριση βλάβης DNA παραμένει ασαφής. Ωστόσο, υπάρχει βεβαίως η δυνατότητα που FH και οι μεταβολίτες αλληλεπιδρά με μπορεί να ρυθμίζει τη λειτουργία άλλων πρωτεϊνών, πιθανώς εντός του πυρήνα. Είναι ενδιαφέρον ότι, η ΑΚΤ έχει επίσης δειχθεί ότι λειτουργεί στον πυρήνα [31]. Λαμβάνοντας υπόψη τα στοιχεία μας, καθώς επίσης και αυτές τις πρόσφατες εκθέσεις, με στόχο ΑΚΤ μεσολάβηση μονοπατιών σηματοδότησης, είτε στο επίπεδο της ΑΚΤ ή ανάντη, μπορεί να αποδειχθεί θεραπευτικό όφελος για καρκίνο του νεφρού. Αυτό είναι σε συμφωνία με τα τελευταία δεδομένα που να αποδεικνύουν το

in vitro

και

in vivo

αποτελεσματικότητα ενός αναστολέα της διπλής PI3K /mTOR στην RCC [19].

Είναι ενδιαφέρον, υπάρχει προηγούμενο για μεταβολές του ενζύμου του κύκλου TCA στον καρκίνο. Πολλαπλές άλλα γονίδια που κωδικοποιούν ένζυμα του κύκλου τρικαρβοξυλικού (TCA) θεωρείται ογκοκατασταλτικών γονιδίων συμπεριλαμβανομένης

SDHB

,

SDHC

, και

SDHD

(Ηλεκτρικό αφυδρογονάσης Β υπομονάδες, C, Δ) [32], [33], [34].

SDH

μεταλλάξεις υπομονάδας έχουν συνδεθεί με φαιοχρωμοκύττωμα και παραγαγγλιώματος και πιο πρόσφατα με γαστρεντερικών στρωματικών όγκων (GIST) [35]. Εκτός από τις μεταλλάξεις, οι αλλοιώσεις της έκφρασης των γονιδίων αυτών έχουν συνδεθεί με κακοήθεια. Dahia

et al.

Απέδειξαν μειωμένη έκφραση του ηλεκτρικού αφυδρογονάσης υπομονάδας Β (SDHB) σε ένα υποσύνολο του φαιοχρωμοκυττωμάτων [36]. Πιο πρόσφατα, μειωμένη έκφραση των SDHB εντοπίστηκε σε μεγάλο ποσοστό των GISTs χωρίς μεταλλάξεις στο

SDHB

ή άλλα γονίδια συνήθως μεταλλάσσεται σε GISTs συμπεριλαμβανομένων των

KIT

και

PDGFRA

[35] . Με βάση αυτά τα δεδομένα, ένας δυνητικός ενοποιητικό θέμα μπορεί να είναι ότι τα ελαττώματα στην οξειδωτική φωσφορυλίωση, είτε μέσω αλλαγών μετάλλαξη ή έκφραση, έχει ένα ρόλο στην ογκογένεση. Πρόσφατα, ο Τσεν

et al.

Πρότεινε ότι η κατανάλωση οξυγόνου μέσω μιτοχονδριακό μεταβολισμό μπορούν να ρυθμίζουν την ανάπτυξη του όγκου, περιορίζοντας τη διαθεσιμότητα του οξυγόνου για μη μιτοχονδριακή δραστηριότητες που είναι ανταποδοτικό για την ανάπτυξη του όγκου [37].

που παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον είναι το εύρημα μας ότι FH υπερέκφραση οδηγεί σε μειωμένη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων του RCC. Τα στοιχεία μας είναι σε συμφωνία με μια πρόσφατη έκθεση από την Κόστα

et al.

που έδειξε ότι

FH

νοκ ντάουν στην αθανατοποιημένη ποντίκι εμβρυϊκών ινοβλαστών (iMEFS) οδήγησε σε αυξημένη κινητικότητα σε σύγκριση με μη μεταδιηγερμένα iMEFS [38 ]. Επιπλέον, η αύξηση στην κινητικότητα ήταν HIF-1α εξαρτώμενη. Ο ρόλος του HIF-2α στις σπουδές τους δεν μπορεί να προσδιοριστεί, δεδομένου ότι δεν ήταν σε θέση να ανιχνεύσουν την έκφραση του HIF-2α στις FH ανεπάρκεια iMEFS. Οι μελέτες μας επικεντρώθηκε σε HIF-2α δώσει εκ των προτέρων μελέτες που ενοχοποιούν το ρόλο της στην νεφρική καρκινογένεση. Δεδομένου ότι HIF-2α knockdown σε κύτταρα RCC αναστέλλει τη μετανάστευση, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι οι επιδράσεις της FH υπερέκφρασης για τη μετανάστευση και εισβολή είναι, εν μέρει, με τη μεσολάβηση αποτελέσματα επί HIF-2α. HIF-2α έχει προηγουμένως εμπλακεί στην επεμβατική συμπεριφορά των κυττάρων του RCC. Επιπλέον οι επεμβατικές προώθηση ιδιότητες του HIF-2α μελετηθεί σε 786-Ο κύτταρα, τα ίδια κύτταρα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη. Hughes

et al.

Απέδειξαν ότι HIF-2α knockdown σε 786-O κύτταρα μείωσε την έκφραση πολλαπλών ιντεγκρινών που μπορούν να επιτελέσουν κυτταρική κινητικότητα και εισβολή [39]. Petrella

et al.

Εξέτασαν το ρόλο της απώλειας VHL στο κελί εισβολή [40]. Βρήκαν ότι η επαναφορά του άγριου τύπου

VHL

σε 786-Ο κύτταρα VHL ανεπάρκεια μειώνεται HIF-2α επίπεδα και κυτταρική εισβολή. Αντιθέτως, η εκ νέου έκφραση του HIF-2α σε

VHL

ανασυσταθεί 786-Ο κύτταρα που αποκαθίστανται επεμβατική δυναμικό. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ένα ρόλο για HIF-2α σε μετανάστευση RCC και εισβολή. Επιπρόσθετα, ο HIF-2α υπερέκφραση βρέθηκε να ενισχύσουν την ανάπτυξη του RCC ξενομοσχευμάτων ενώ η υπερέκφραση του HIF-1α βρέθηκε να αναστέλλει την ανάπτυξη ξενομοσχευμάτων [41]. Αντίστοιχα, ξεχωριστές μελέτες δείχνουν ότι HIF-2α, αλλά όχι HIF-1α, συμβάλλει στην ανάπτυξη του

VHL

null ξενομοσχεύματα όγκου [16], [42]. Ως εκ τούτου, τα δεδομένα μας να προστεθούν στον αυξανόμενο σώμα της στοιχεία που να αποδεικνύουν τα αποτελέσματα προαγωγής του καρκίνου της HIF-2α έκφραση σε RCC.

Παρά την πρόσφατη έγκριση των πολλαπλών παραγόντων για προχωρημένους καρκίνο του νεφρού, οι περισσότεροι ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο του νεφρού θα τελικά υποκύψει στην ασθένεια τους. Ως εκ τούτου, η ταυτοποίηση νέων οδών σηματοδότησης θα είναι κρίσιμη για την ανάπτυξη αποτελεσματικών θεραπευτικών. Υπάρχει τώρα αυξανόμενες ενδείξεις ότι η νεφρική καρκίνος είναι μεταξύ των όγκων που είναι αντιπροσωπευτικά του αναδυόμενου παραδείγματος στον καρκίνο βιολογία των μεταβολικών συνδέσεις με κακοήθεια. Τα ευρήματά μας με FH προτείνουν μια μεταβολική επαναπρογραμματισμό της νεφρικής καρκίνο σαφές κύτταρο που προάγει την έκφραση των ογκογόνο παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων των HIF-2α μέσω πολλαπλών μηχανισμών. Ξεσκεπάζοντας τους μηχανισμούς μέσω των οποίων ο μεταβολισμός του όγκου μεταβάλλεται και οι μεταγενέστεροι κυτταρική συνέπειες θα πρέπει να παρέχουν βαθιά γνώση της νεφρικής βιολογία του καρκίνου, καθώς και νέες θεραπευτικές στρατηγικές.

Υλικά και Μέθοδοι

Cells

Α498, 786-O, και τα κύτταρα ACHN ελήφθησαν από την American Type Culture Collection και διατηρήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου θερμο-απενεργοποιημένο βόειο στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2 ατμόσφαιρα. κύτταρα RCC4 προσεφέρθησαν ευγενώς από τον Π Ratcliffe (Oxford).

Χημικά

LY294002 αγοράστηκε από Sigma.

μορφώματα

Το FH-FLAG κατασκεύασμα έχει περιγραφεί προηγουμένως [27].

ανοσοαποτύπωσης

Όλες οι αναλύσεις ανοσοκηλίδος διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27] για ολόκληρο κυτταρολύματα παρασκευάζονται με τη χρήση ρυθμιστικού δοκιμασίας ραδιοανοσοκατακρήμνισης (50 mM Tris- HCl, 150 mM NaCl, 1% Triton Χ-100, 1% δεοξυχολικό νάτριο, και 0,1% δωδεκυλοθειικό νάτριο) συμπληρωμένο με αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ (Roche). Αντισώματα ελήφθησαν από τις ακόλουθες εμπορικές πηγές: GeneTex (FH-ανοσοαποτύπωση), Santa Cruz Biotechnology (FH-ανοσοϊστοχημεία), Novus (GAPDH, HIF-2α), Sigma (τουμπουλίνης, β-ακτίνη), Cell Signaling (συνολική ΑΚΤ και Ser473 φωσφο ΑΚΤ).

δείγμα ιστού ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

Biospecimens για ανάλυση RNA ελήφθησαν από το Δίκτυο Cooperative Human Tissue του NCI /ΝΙΗ. Το συνολικό RNA μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας το υψηλής χωρητικότητας cDNA Αρχείο σετ (Applied Biosystems). cDNA χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια ως πρότυπο με δοκιμασίες κατά παραγγελία 20 mix × δοκιμασία εκκινητών και ανιχνευτών Taqman Applied Biosystems. Σαράντα κύκλοι ενίσχυσης είχαν γίνει στον ανιχνευτή αλληλουχίας Applied Biosystems Prism 7900. Διπλώστε τιμές αλλαγή μεταξύ των όγκων και φυσιολογικά δείγματα υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τον Δ

C

t μέθοδο με την κανονικοποίηση με τα επίπεδα του 18S rRNA. Ως στατιστική δοκιμή χρησιμοποιήσαμε το Mann-Whitney ζεύγη μη παραμετρικό τεστ για να συγκρίνουν την έκφραση FH στον όγκο σε σχέση με την κανονική παρακείμενο ιστό (εφαρμόζεται GeneSpring, Agilent).

ανοσοαποτύπωσης και ανοσοϊστοχημείας των δειγμάτων ανθρώπινου όγκου

δείγματα όγκων και φυσιολογικό αντίστοιχων ιστών από ασθενείς με RCC ελήφθησαν από το Τμήμα Ουρολογίας στο Πανεπιστήμιο του Τέξας Health Science Center στο San Antonio. Οι όγκοι για αυτή τη μελέτη ήταν ιστολογικά ταξινομούνται ως διαυγές κυττάρων νεφρικού καρκινώματος από ένα γεννητικό και ουροποιητικό παθολογοανατόμο. Η συλλογή και διαχείριση των ανθρώπινων δειγμάτων πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με ένα πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review από το Πανεπιστήμιο του Τέξας Health Science Center στο San Antonio. Με βάση το πρωτόκολλο, τα δείγματα ελήφθησαν σε ένα deidentified τρόπο από ασθενείς που υποβάλλονται σε χειρουργική εκτομή για καρκίνο του νεφρού. Όπως ελήφθησαν και αναλύθηκαν δείγματα σε ένα ανώνυμο τρόπο, δεν απαιτείται η συναίνεση του ασθενούς.

πληγή επούλωση δοκιμασία

Τα κύτταρα αφέθηκαν να αναπτυχθούν σε σχεδόν συρροή σε τρυβλία 60 χιλιοστά. Μια ομοιόμορφη γρατσουνιά Στη συνέχεια, έγινε κάτω από το κέντρο της πλάκας χρησιμοποιώντας ένα άκρο μικροπιπέτας 200 μικρολίτρων, ακολουθούμενη από πλύση δύο φορές με PBS. Το ίδιο επισημασμένο πεδίο της πληγής μηδέν φωτογραφήθηκε χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φωτός της Olympus (4 × στόχος) στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία. Το πλάτος της πληγής μηδέν μετρήθηκε σε τρείς διαφορετικές περιοχές με την Q-Capture Pro λογισμικό. Ποσοτικά δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή +/- S.D. από τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα.

Μετανάστευση

δοκιμασία

786-O υποκλώνους κύτταρα (1 × 10

4) σπάρθηκαν σε 8 μΜ μέγεθος πόρων Thin-cert για 24 φρεατίων (Greiner Bio-One) σε ελεύθερα μέσα ενημέρωσης ορό. Επτακόσια πενήντα μικρολίτρα 10% μέσου FBS προστέθηκε στον κάτω θάλαμο ως χημειοελκυστικό. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα στην κορυφή της μεμβράνης αφαιρέθηκαν με ένα βαμβάκι. Τα κύτταρα τα οποία μετανάστευσαν στην κάτω πλευρά πλύθηκαν με PBS, μονιμοποιήθηκαν με 70% αιθανόλη και χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας 0.1% ιώδες κρυστάλλου για να απεικονίσει τα κύτταρα τα οποία μετανάστευσαν. Κύτταρα που μετανάστευσαν προσαρτημένο στην κατώτερη πλευρά της μεμβράνης μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φωτός σε μεγέθυνση 10x. Μετρά αντιπροσωπεύουν το μέσο αριθμό κυττάρων από δέκα μικροσκοπικά πεδία.

δοκιμασία Invasion

κυττάρων εισβολή προσδιορίσθηκε με δοκιμασία εισβολής (μεμβράνη επικαλυμμένη με ένα στρώμα πρωτεϊνών εξωκυτταρικής μήτρας Matrigel) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού εντός του άνω θαλάμου και εισέβαλαν προς το θάλαμο που περιέχει ένα πυθμένα 10% μέσου FBS ως χημειοελκυστικό. Οι μεμβράνες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με παρόμοιο τρόπο όπως η δοκιμασία μετανάστευσης.

RNA

παρεμβολή

Για FH και HIF-2α knockdown, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με αντιδραστήριο ομαδοποιήθηκαν siRNA (Thermo Fisher) με το σύστημα Amaxa Nucleofector σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν στις 48-72 ώρες μετά την επιμόλυνση. Ένα μη-στόχευση πισίνα αγωνίζομαι siRNA χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος (Thermo Fisher).

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Cynthia Galindo και Dawn Γκαρσία για τεχνική βοήθεια. Ευχαριστούμε την πρωτοβουλία Υπολογιστική Βιολογία (UTHSCSA /UTSA) για την παροχή πρόσβασης και την κατάρτιση στο λογισμικό ανάλυσης που χρησιμοποιείται.