Αφηρημένο

Ιστορικό

Η κατανόηση των οδηγών για την μετάσταση στον καρκίνο του ανθρώπου είναι σημαντικό για τις δυνατότητες ανάπτυξης των θεραπειών για την αντιμετώπιση μεταστάσεων. Ο ρόλος της απώλειας του TGFβ δραστηριοτήτων ογκοκατασταλτικών στη μεταστατική διαδικασία είναι ουσιαστικά άγνωστη.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Αξιοποιώντας

in vitro

και

in vivo

τεχνικές, έχουμε δείξει ότι η απώλεια του TGFβ ογκοκατασταλτικών σηματοδότηση είναι απαραίτητη για να επιτρέψει το τελευταίο βήμα της μεταστατικής διαδικασίας – αποικισμό του μεταστατικού χώρο. Αυτή η εργασία αποδεικνύει για πρώτη φορά ότι η ανασύσταση του υποδοχέα ΤΟΡβ οδηγεί σε μειωμένη μεταστατικό αποικισμό. Επιπλέον, έχουμε εντοπίσει ένα νέο ΤΟΡβ /ΡΚΑ ογκοκατασταλτικό μονοπάτι που δρα άμεσα σε ένα γνωστό μηχανισμό κυτταρικής επιβίωσης που αντιδρά στο στρες με την survivin /ΧΙΑΡ εξαρτώμενη αναστολή των κασπασών που επηρεάζουν την απόπτωση. Η σύνδεση μεταξύ του transduceome σηματοδότησης και ελέγχου της μετάστασης μέσω της επαγωγής κυτταρικού θανάτου ΤΟΡβ /ΡΚΑ φάνηκε από την αποκατάσταση του υποδοχέα ΤΟΡβ με επανενεργοποίηση της οδού TGFβ /ΡΚΑ σε ανεπάρκεια υποδοχέα μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου που οδηγεί σε κύτταρα έλεγχο της παρεκκλίνουσας κυτταρικής επιβίωσης.

Συμπέρασμα /Σημασία

Αυτό επηρεάζει το έργο κατανόηση των πιθανών μηχανισμών που είναι κρίσιμης σημασίας για την ανάπτυξη και τη συντήρηση των μεταστάσεων, καθώς και την κατανόηση ενός νέου λειτουργία TGFβ ως μεταστατικό καταστολέα. Αυτά τα αποτελέσματα εγείρουν την πιθανότητα ότι η αναγέννηση των εξασθενημένων σηματοδότησης ΤΟΓβ θα ήταν ένας αποτελεσματικός στόχος για τη θεραπεία της μετάστασης. Η εργασία μας δείχνει την κλινική δυναμικό για την ανάπτυξη θεραπεία αντι-μετάσταση βασίζεται στην αναστολή αυτού του πολύ σημαντικού παρεκκλίνουσα μηχανισμός επιβίωσης των κυττάρων από την πολύπλευρη TGFβ /PKA που προκαλείται transduceome οδού. Ανάπτυξη αποτελεσματικών θεραπειών για μεταστατική νόσο είναι επιτακτική ανάγκη, δεδομένου μεταστάσεις είναι η κύρια αιτία θανάτου σε συμπαγείς όγκους

Παράθεση:. Chowdhury S, Howell GM, Rajput Α, Teggart CA, Brattain LE, Weber HR, et al. (2011) Αναγνώριση ενός Μυθιστόρημα TGFβ /PKA Σηματοδοσίας Transduceome στη διαμεσολάβηση Ελέγχου των κυττάρων επιβίωσης και μετάσταση στον καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 6 (5): e19335. doi: 10.1371 /journal.pone.0019335

Επιμέλεια: Ντχιάνι Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 18, Φεβρουαρίου 2011? Αποδεκτές: 27 Μαρ, 2011? Δημοσιεύθηκε: May 3, 2011

Copyright: © 2011 Chowdhury et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας χορηγεί CA72001 και CA38173 να MGB. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι μία από τις πιο κοινές κακοήθειες με υψηλά ποσοστά εμφάνισης σε παγκόσμιο επίπεδο [1] και είναι η δεύτερη κατά σειρά αιτία θανάτου που σχετίζονται με τον καρκίνο μεταξύ των ενηλίκων στις Ηνωμένες Πολιτείες [2]. CRC μπορεί να θεραπευτεί με χειρουργική επέμβαση και πολυτροπικές θεραπεία σε περίπου τα μισά από τα άτομα με αυτή τη νόσο (Στάδια Ι-ΙΙΙ). Ωστόσο, η μετάσταση σε απομακρυσμένα όργανα (στάδιο IV) είναι η πιο συχνή αιτία της αποτυχίας [2] θεραπείας. Πρόσφατες εργασίες έχει τονίσει τη σημασία της ανάπτυξης της ακατάλληλης κυτταρικής επιβίωσης σηματοδότησης για τα διάφορα στάδια της μεταστατικής διαδικασίας. Ιδιαίτερα αξιοσημείωτο στο πλαίσιο της επιβίωσης σηματοδότησης στη μεταστατική διαδικασία είναι η σημασία της παρεκκλίνουσας κυτταρικής επιβίωσης για την επιτυχή αποικισμό σε θέσεις μεταστατικού σε άπω όργανα [3]. Σημαντικά, μοριακοί μηχανισμοί που εμπλέκονται στην πρώιμη φάση της μετάστασης κρίσιμες για διάγνωση και θεραπεία δεν είναι καλά κατανοητοί [1]. Αρκετοί βασικοί παράγοντες συμπεριλαμβανομένης της Bcl-2, αναστολέας-of-απόπτωσης (ΙΑΡ) πρωτεΐνες ΧΙΑΡ και survivin, και το φωσφοϊνοσιτιδίου 3-κινάσης (ΡΙ3Κ) – έχουν ΑΚΤ /ΡΚΒ που μεταδίδουν αντι-αποπτωτικών σημάτων στην προώθηση της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων έχουν εμπλακεί σε μετάσταση [4], [5].

ογκοκατασταλτικά γονίδια (ΕΠΠΕ) συμβάλλουν στην επαγωγή της απόπτωσης σε απάντηση στο στρες. Η αποτυχία να επάγει απόπτωση σε απόκριση σε διάφορους τύπους κυτταρικής βλάβης έχει αναγνωριστεί προ πολλού ότι συμβάλλει στην ογκογένεση. Ένα παράδειγμα της απώλειας TSG συμβάλλουν στο σχηματισμό και την εξέλιξη του καρκίνου είναι ΤΟΡβ σηματοδότησης [2]. Η οδός σηματοδότησης ΤΟΡβ έχει συμβάλλοντας τόσο αρνητικά και θετικά στη ρύθμιση αναστολή της ανάπτυξης, πολλαπλασιασμού, αντιγραφή, εισβολή, μετάσταση, την απόπτωση, το ανοσοποιητικό επιτήρησης και της αγγειογένεσης σε ένα τρόπο που εξαρτάται από το πλαίσιο [6]. Τα ΤΟΡβ ανασταλτικές /όγκου αποκρίσεις καταστολέα μειώθηκε με αύξηση της μετάβασης και σε κακοήθειες προχωρημένο στάδιο συχνά κατεστραμμένα κατά τρόπο που να υποστηρίζει εισβολή και τη μετάσταση [6]. Ενώ διαφθορά των απαντήσεων ΤΟΡβ για τη στήριξη της μετάστασης συνεπάγεται την παρουσία λειτουργικών υποδοχέων σε αυτά τα κύτταρα, είναι εξίσου σαφές ότι υπάρχουν ουσιαστικοί αριθμοί των μοντέλων που κυμαίνονται από διαγονιδιακά ποντίκια για την ανθρώπινη ξενομοσχεύματα καρκίνου υποδεικνύοντας ότι η απώλεια ή εξασθένηση της έκφρασης του υποδοχέα σε ένα ευρύ ποικιλία τύπων όγκων οδηγεί σε αυξημένη κακοήθεια [7], [8], [9], [10]. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι μερικοί υποομάδες των καρκίνων έχουν ακολουθήσει ένα μονοπάτι προς την κακοήθη πρόοδο που αφορούν την απώλεια της έκφρασης του υποδοχέα ΤΟΡβ, ενώ άλλοι έχουν, σε μια ακόμη απροσδιόριστο τρόπο, σφετερίστηκε TGFβ σηματοδότησης στην οδήγηση κακοήθη εξέλιξη. Υπάρχουν αρκετά παραδείγματα αποσιώπησης υποδοχέα ΤΟΡβ σε κλινικά δείγματα που δείχνει ότι ΤΟΡβ υποδοχέα RI ή /και RII (ορίζεται TGFβRI και ΤΟΡβΚΙΙ αντίστοιχα) ρύθμιση προς τα κάτω είναι πρώιμα γεγονότα στην ογκογένεση και ότι η απώλεια της έκφρασης του υποδοχέα με επιγενετικό σίγηση συσχετίζεται με κακοήθη εξέλιξη σε υποομάδες αρκετών τύπων καρκίνου [11], [12].

Έχουμε δείξει ότι TGFβ σηματοδότησης σε ένα μοντέλο πρώιμο στάδιο μη μεταστατικό καρκίνωμα του παχέος εντέρου οδηγεί σε κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα καρκίνου κόλου σε απάντηση στο στρες σε συνδυασμό με αδρανοποίηση του Pakt και αναστολή της έκφρασης της πρωτεΐνης survivin ΙΑΡ [13]. Ο σχηματισμός συμπλόκου μεταξύ survivin και άλλης πρωτεΐνης ΙΑΡ ΧΙΑΡ στο κυτταρόπλασμα σε απάντηση στο στρες επιτρέπει τη σταθεροποίηση των ΧΙΑΡ και αναστολή τελεστών και executioner κασπάσης στόχους της να αναστέλλει κυτταρικό θάνατο [14]. Ως εκ τούτου, δεδομένου του κυρίαρχος ρόλος της PI3K σηματοδότησης /AKT στους μηχανισμούς επιβίωσης των κυττάρων και τη σύνδεση των ΧΙΑΡ και survivin στην εξέλιξη του καρκίνου [5], που έθεσε ευθέως ότι η απώλεια της TGFβ σηματοδότησης μπορεί να συμβάλει στην αυξημένη έκφραση ΧΙΑΡ /survivin και κατά συνέπεια την απώλεια της TGFβ σηματοδότησης μπορεί να είναι το κλειδί για μια παρεκκλίνουσα μηχανισμός επιβίωσης που επιτρέπει την μεταστατική ανάπτυξη σε περιοχές περιφερικό όργανο σε αντίθεση με την τρέχουσα άποψη ότι TGFβ ΕΠΠΕ είναι πρωτίστως ένα φύλακα για την πρόληψη της ογκογένεσης.

TGFβ σηματοδότησης έχει αποδειχθεί για να ενεργοποιήσετε οΑΜΡ εξαρτάται πρωτεΐνη κινάσης Α (ΡΚΑ) [15]. PKA διαδραματίζει κυρίαρχο ρόλο στην ενσωμάτωση των πολλαπλών δικτύων μεταγωγής σήματος [16] όπως είναι η ικανότητα να διαταράξει το συγκρότημα /survivin ΧΙΑΡ μέσω φωσφορυλίωσης της survivin σε Ser

20 [17].

Οι μοριακοί μηχανισμοί που εμπλέκονται στην ΤΟΡβ μεσολάβηση μειορρύθμιση του ΙΑΡ ερευνήθηκαν προκειμένου να προσδιοριστούν τα αποτελέσματα της σηματοδότησης του υποδοχέα ΤΟΡβ σε μετάσταση σε μία μεταστατική ορθοτοπικό μοντέλο του καρκινώματος του παχέος εντέρου. Μπορούμε τώρα να αναφέρουν την ταυτοποίηση ενός νέου TGFβ /PKA /ΑΚΑΡ μεσολάβηση transduceome που συγκλίνει σε λειτουργία ΧΙΑΡ στον έλεγχο της ανώμαλης κυτταρικής επιβίωσης. Επιπλέον, έχουμε δείξει ότι διάσωση του υποδοχέα ΤΟΡβ σε άκρως μεταστατικά κύτταρα με επιγενετικές αποσιώπηση των υποδοχέων TGFβ οδηγεί σε μειωμένη μεταστάσεων σε έναν ΤΟΡβ /ΡΚΑ μονοπάτι σηματοδότησης μηχανισμός που εξαρτώνται σε ένα εξαιρετικά μεταστατικό ορθοτοπική μοντέλα καρκίνου του παχέος εντέρου σε βιολογικό περιβάλλον. Διάσωση συγκεκριμένες πτυχές ογκοκατασταλτικών του μονοπατιού σηματοδότησης ΤΟΡβ μπορεί να παρέχει θεραπευτικά οφέλη χωρίς να προωθούν την κυτταρική επιβίωση και μεταστατική επιδράσεις του ΤΟΡβ. Εάν αυτές οι TGFβ αποτελέσματα ογκοκατασταλτικό μπορεί να μιμηθεί σε όγκους προχωρημένο στάδιο, θα μπορούσε τελικά να επιτευχθεί θεραπευτική αξία κατά μεταστατικό CRC.

Αποτελέσματα

TGFβ ενεργοποιεί PKA στα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου

Μια επικριτική έκθεση από το εργαστήριο Simeone σημειωθεί ότι TGFβ σηματοδότησης ενεργοποιεί PKA στα κύτταρα Μν1Ι_υ και μεσολαβεί έλεγχο της ανασταλτικής απαντήσεις ανάπτυξης TGFβ [15]. ΤΟΡβ ενεργοποίηση του ΡΚΑ επιτεύχθηκε με τη μεσολάβηση ενός μηχανισμού ανεξάρτητη από Smad-εξαρτώμενη, κυκλικού ΑΜΡ (cAMP). Αυτό εγείρει την πιθανότητα ότι ο TGFβ σηματοδότηση με τη μεσολάβηση του ελέγχου της ανώμαλης κυτταρικής επιβίωσης που παρατηρείται σε πρώιμο στάδιο TGFβ-ευαίσθητο μοντέλο καρκινώματος FET του παχέος εντέρου μπορεί να περιλαμβάνει την ενεργοποίηση της PKA. Υποθέσαμε ότι TGFβ ενεργοποιεί PKA στα FET κύτταρα σε ένα ανεξάρτητο, Smad εξαρτάται μηχανισμό cAMP. Για το σκοπό αυτό, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία FET με ΤΟΡβ (5 ng /ml) για καθορισμένους χρόνους, και μία δοκιμασία πρωτεϊνικής κινάσης πραγματοποιήθηκε για τη μέτρηση της δραστικότητας ΡΚΑ (Σχήμα 1Α). Μετά την αγωγή ΤΟΡβ, δραστηριότητα ΡΚΑ αυξήθηκε κατά περίπου 2-φορές μέσα σε 15 λεπτά και 4 φορές σε 1 ώρα. Παρατηρήθηκε ότι TGFβ διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση ΡΚΑ καταργήθηκε πλήρως παρακάτω προεπεξεργασία των κυττάρων με Η89 (15 μΜ), ένα φαρμακολογικό αναστολέα ΡΚΑ [15]. ΤΟΡβ διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση του ΡΚΑ ήταν επίσης εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση (Εικόνα 1Β) με μέγιστη δραστικότητα σε FET κύτταρα παρατηρούνται σε 5 ng /ml ΤΟΡβ. Για να επιβεβαιωθεί ότι η ενεργοποίηση του ΡΚΑ ήταν κατάντη της Smad ενεργοποίηση από ΤΟΡβ, παρατηρήσαμε ότι προκατεργασία με Η89 δεν είχε επίδραση επί της φωσφορυλίωσης των Smad2 από ΤΟΡβ χρησιμοποιώντας ανάλυση ανοσοκηλίδος (Σχήμα S1). Έχουμε αναπτύξει σταθερή PKA καταλυτική υπομονάδα α shRNA νοκ ντάουν στον FET κύτταρα (που ορίζονται FET PKACatα KD) για να επικυρώσετε την απόκριση Η89 γενετικά (Εικόνα S2). επεξεργασία TGFβ για τους συγκεκριμένους χρόνους δεν ήταν σε θέση να ενεργοποιήσει PKA στα νοκ ντάουν κύτταρα σε αντίθεση με την ισχυρή ενεργοποίηση των γονικών κυττάρων FET (Σχήμα 1C). Η ενεργοποίηση του ΡΚΑ από ΤΟΡβ έχει δειχθεί ότι είναι ανεξάρτητος cAMP σε κύτταρα Μν1Ι_υ [15]. Κλασική ενεργοποίηση ΡΚΑ περιλαμβάνει cAMP πρόσδεσης στις ρυθμιστικές υπομονάδες του ΡΚΑ για να προκαλέσει διάσπαση των καταλυτικών υπομονάδων. Ένας εναλλακτικός μηχανισμός ενεργοποίησης ΡΚΑ περιλαμβάνει την σύνδεση των ΙκΒ με καταλυτικές υπομονάδες ΡΚΑ, διατηρώντας έτσι μια ανενεργή κατάσταση του ΡΚΑ. Κατά την αποικοδόμηση της ΙκΒ, υπάρχει ενεργοποίηση του ΡΚΑ ανεξάρτητη από την ενεργοποίηση cAMP [18]. Προσδιορίσαμε εάν η ενεργοποίηση του ΡΚΑ από TGFβ εξαρτάται από την ενεργοποίηση cAMP σε FET κύτταρα με κατεργασία κυττάρων με ΤΟΡβ και μέτρηση των επιπέδων cAMP χρησιμοποιώντας μια μη-ραδιενεργά ενζύμου cAMP ανοσοδοκιμασία (Σχήμα 1 D). Παρατηρήθηκε ότι TGFβ δεν ήταν σε θέση να αυξήσει την παραγωγή cAMP σε αντίθεση με τη θεραπεία Forskolin οποία παρείχε μια σημαντική αύξηση στα επίπεδα cAMP, όπως αναμένεται. Στη συνέχεια, εξετάσαμε την ΙκΒ πρωτεΐνη μετά από αγωγή TGFβ για καθορισμένους χρόνους για να καθοριστεί εάν η ενεργοποίηση του ΡΚΑ από TGFβ οφειλόταν σε αποικοδόμηση ΙκΒ (Σχήμα S3). Τα επίπεδα ΙκΒ παρέμεινε αμετάβλητο μετά τη θεραπεία TGFβ. Ως εκ τούτου, ΡΚΑ ενεργοποιείται με TGFβ σε ένα στρατόπεδο και ΙκΒ ανεξάρτητο τρόπο σε κύτταρα FET σε συμφωνία με την έκθεση Zhang et al (2004). Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η λειτουργική σημασία του ΤΟΡβ μεσολάβηση ενεργοποίησης ΡΚΑ, παράγοντα μεταγραφής CREB δοκιμάστηκε, η οποία έχει ταυτοποιηθεί ως άμεσο στόχο του cAMP-ΡΚΑ οδού [15] σηματοδότησης. Παρατηρήσαμε ότι TGFβ ήταν ικανή να διεγείρει τη φωσφορυλίωση του CREB (Σχήμα 1 Ε) χωρίς μεταβολή στα συνολικά επίπεδα CREB (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Προκατεργασία των κυττάρων με Η89, ακολουθούμενη από έκθεση TGFβ μείωσε σημαντικά την φωσφορυλίωση του CREB. Zhang et al (2004) τόνισε το ρόλο του ενεργού Smad3 σε TGFβ μεσολάβηση ενεργοποίησης PKA. Έχουμε αναπτύξει σταθερή νοκ ντάουν shRNA Smad3 σε FET κύτταρα (που ορίζονται FET Smad3KD) (Σχήμα S4). επεξεργασία TGFβ σε αυτά τα Smad3 νοκ ντάουν κύτταρα δεν ήταν σε θέση να ενεργοποιήσει PKA (Σχήμα 1 F) που δείχνει την εξάρτηση του TGFβ μεσολάβηση ενεργοποίησης PKA για Smad3 όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [15].

κύτταρα FET αντιμετωπίζονται με TGFβ (5 ng /ml ) ενεργοποιείται ΡΚΑ σε έναν χρόνο (Α) και συγκέντρωση (Β) εξαρτώμενο τρόπο. ΡΚΑ αναστολέα Η89 (15 μΜ) χρησιμοποιήθηκε για να αναστέλλουν την ενεργοποίηση ΡΚΑ. Φορσκολίνη (10 μΜ) χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Σύγκριση των γονικών FET και κυττάρων FET PKACatα KD προς ΤGFβ διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση ΡΚΑ (C). Knockdown καταλυτικού α-υπομονάδα καταργηθεί η ενεργοποίηση ΡΚΑ από ΤΟΡβ. ΡΚΑ ενεργοποίηση από ΤΟΡβ είναι ανεξάρτητη της γενιάς cAMP όπως προσδιορίζεται από cAMP δοκιμασία (D). ΤΟΡβ οδηγεί στην ενεργοποίηση CREB σε FET κύτταρα (Ε). Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης για κηλίδες Western. ΡΚΑ ενεργοποίηση με TGFβ είναι Smad3 εξαρτώμενη όπως προσδιορίζεται από knockdown του Smad3 σε FET κύτταρα (F). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± S.E.M (n = 3). Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές ανεξάρτητα.

Η

TGFβ /PKA σηματοδότηση που διαμεσολαβείται ΧΙΑΡ ρύθμιση προς τα κάτω

ΧΙΑΡ και survivin είναι καλά χαρακτηρισμένα μέλη της οικογένειας ΙΑΡ τεκμηριωμένη πρόσφατα ως μεταστατικός γονίδια [5]. συντονισμένη ρόλος τους στην προώθηση της επιβίωσης των κυττάρων και τη μετάσταση παρέχει ένα ισχυρό σκεπτικό για τη στόχευση της έκφρασης ή /και της δραστηριότητας αυτών των ΙΑΡ σε προχωρημένα στάδια του καρκίνου. Μια πρώιμη εκδήλωση που σχετίζεται με ενεργοποίηση ΡΚΑ είναι φωσφορυλίωση της survivin σε Ser

20 στο κυτταρόπλασμα, αλλά όχι στα μιτοχόνδρια [17]. Αυτή η φωσφορυλίωση της survivin έχει αποδειχθεί ότι διαταράσσουν την πρόσδεση διεπαφή για ΧΙΑΡ, οδηγώντας σε υποβάθμιση του ΧΙΑΡ. Τα δεδομένα μας, καθώς και προηγούμενες εκθέσεις δείχνουν ότι η απάντηση ενεργοποίηση PKA είναι ένα πρώιμο συμβάν μετά τη θεραπεία TGFβ και επιτυγχάνει μέγιστα επίπεδα μέσα σε 1 ώρα θεραπείας TGFβ. Υποθέσαμε ότι TGFβ προκαλεί απεμπλοκή της ανώμαλης κυτταρικής επιβίωσης με την τόνωση της PKA μεσολαβεί διακοπή του /συγκρότημα ΧΙΑΡ survivin. FET κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TGFβ για τους καθορισμένους χρόνους που ακολουθείται από προσδιορισμό της ΧΙΑΡ και survivin (Σχήμα 2Α και S5). επεξεργασία TGFβ μειωτικά τόσο ΧΙΑΡ και survivin στους καθορισμένους χρόνους. Όπως φωσφορυλίωση survivin έχει ήδη δειχθεί να συνδέονται με την ενεργοποίηση της ΡΚΑ, εστιάσαμε την προσοχή μας για τη ρύθμιση των ΧΙΑΡ. Η αποδόμηση του ΧΙΑΡ έχει αποκλειστεί από Η89 προεπεξεργασία πριν από την έκθεση TGFβ για καθορισμένους χρόνους (Εικόνα 2Β). Για να εξετασθεί η ειδικότητα της απόκρισης, συγκρίναμε την επίδραση των TGFβ σε κύτταρα FET PKACatα KD και γονικά κύτταρα FET (Σχήμα 2C). θεραπεία ΤΟΡβ δεν είχε καμία επίδραση στα επίπεδα της πρωτεΐνης ΧΙΑΡ σε κύτταρα FET PKACatα KD δείχνει την εξάρτηση από την καταλυτική υπομονάδα ΡΚΑ σε ΤΟΡβ μεσολάβηση απώλεια του ΧΙΑΡ πρωτεΐνης. Για να επιβεβαιωθεί η ειδικότητα των TGFβ /ΡΚΑ μονοπάτι σε αυτή την απόκριση, τα κύτταρα FET Smad3 KD υποβλήθηκαν σε αγωγή με ΤΟΡβ για τους συγκεκριμένους χρόνους και έκφραση ΧΙΑΡ πρωτεΐνης προσδιορίστηκε (Εικόνα 2D). Σύμφωνα με την εξάρτηση Smad3 του TGFβ μεσολάβηση ενεργοποίησης PKA, σταθερή shRNA νοκ ντάουν της Smad3 καταργηθεί ΧΙΑΡ αρνητική ρύθμιση. Ένας αναστολέας πρωτεασώματος (MG132) χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί εάν η απώλεια του ΧΙΑΡ εξηρτάτο από αποικοδόμηση του πρωτεασώματος (Σχήμα 2Ε). Παρατηρήθηκε ότι προκατεργασία των κυττάρων με FET MG132 (15 μΜ) για 1 ώρα πριν από την αγωγή TGFβ καταργούνται πλήρως την αποικοδόμηση ΧΙΑΡ υποδεικνύοντας ότι ΧΙΑΡ αποικοδομείται εντός του πρωτεασώματος. ΡΚΑ είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής της δραστηριότητας του πρωτεασώματος και ΡΚΑ έχει αποδειχθεί ότι συν-καθαριστεί με το πρωτεάσωμα [19], [20]. Υποθέσαμε ότι TGFβ /PKA μεσολάβηση ρύθμιση της δραστηριότητας του πρωτεασώματος μπορεί να παρέχει ένα άλλο στρώμα του ελέγχου της έκφρασης ΙΑΡ (πέρα από την PKA επαγόμενη φωσφορυλίωση της survivin σε Ser

20). Προηγούμενες εκθέσεις δείχνουν ότι PKA φωσφορυλιώνει την Rpt6 ΑΤΡ, η οποία ξεδιπλώνεται και μεταφέρει τα υποστρώματα σε πρωτεασώματος και αυτό φωσφορυλίωση ενισχύει τις χυμοθρυψίνη δραστηριότητες του πρωτεασώματος του πρωτεασώματος [21]. Για το σκοπό αυτό, προσδιορίσαμε αν ΤΟΡβ διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση ΡΚΑ είναι σε θέση να αυξήσει την δραστικότητα του πρωτεασώματος τύπου χυμοτρυψίνης χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία δραστικότητας του πρωτεασώματος. θεραπεία ΤΟΡβ του FET κύτταρα διεγείρονται επιλεκτικά την χυμοθρυψίνης ενεργότητα του πρωτεασώματος εντός 1 h (Σχήμα 2F). Η89 προεπεξεργασία πριν από την έκθεση TGFβ κατήργησε εντελώς το βασικό επίπεδο της δραστηριότητας που μοιάζει με χυμοθρυψίνη του πρωτεασώματος και κατήργησε εντελώς τα διεγερτικά αποτελέσματα του ΤΟΡβ στην πρωτεασώματος.

ΤΟΡβ (5 ng /ml) για τη θεραπεία υποδεικνυόμενους χρόνους ρυθμίζει προς τα κάτω ΧΙΑΡ σε FET κύτταρα (Α) και αυτό το αποτέλεσμα διαμεσολαβείται από ΡΚΑ ως προκατεργασία με αναστολέα ΡΚΑ Η89 πριν από την έκθεση ΤΟΡβ ακυρώνει απώλεια ΧΙΑΡ (Β). Σταθερό shRNA knockdown καταλυτικών υπομονάδων ΡΚΑ σε FET κύτταρα οδηγεί σε κατάργηση της απώλειας ΧΙΑΡ (C). Σταθερό shRNA νοκ ντάουν της Smad3 οδηγεί στην κατάργηση της απώλειας ΧΙΑΡ σε FET κύτταρα (D). ΤΟΡβ (5 ng /ml) με τη μεσολάβηση ΧΙΑΡ προς τα κάτω ρύθμιση είναι μια εκδήλωση του πρωτεασώματος. Προεπεξεργασία με MG132 αναστολέα πρωτεασώματος (15 μΜ), καταργείται η απώλεια ΧΙΑΡ από TGFβ (Ε). ΤΟΡβ διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση του ΡΚΑ οδηγεί στην ενεργοποίηση της δραστηριότητας χυμοθρυψίνη εντός του πρωτεασώματος και αυτό το αποτέλεσμα καταργήθηκε με Η89 (F). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± S.E.M (n = 3). Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης για κηλίδες Western. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές ανεξάρτητα.

Η

Συλλογικά, αυτά τα στοιχεία οδηγούν στην υπόθεση ότι η σηματοδότηση TGFβ /PKA ρυθμίζει την έκφραση ΧΙΑΡ σε πολλαπλά επίπεδα με την ενεργοποίηση της PKA που οδηγεί σε φωσφορυλίωση των βασικών συστατικών του πρωτεασώματος ότι προώθηση της υποβάθμισης του πρωτεασώματος των ΧΙΑΡ.

ΑΚΑΡ ρυθμίζει TGFβ /PKA μεσολάβηση ΧΙΑΡ ρύθμιση προς τα κάτω

υπάρχει μια πληθώρα από A-κινάσης αγκύρωσης πρωτεΐνες (AKAPs) που κατακερματίσουν την PKA και άλλα ένζυμα στην περιοχή του ειδικά κυτταρικά οργανίδια για τη διεξαγωγή της λειτουργίας του ενζύμου. Υποθέσαμε ότι AKAPs είναι ένα κρίσιμο συστατικό σε TGFβ /PKA μεσολάβηση ΧΙΑΡ αρνητική ρύθμιση. Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι η υποκυτταρική εντόπιση του ΡΚΑ ρυθμιστικών υπομονάδων (PKARI και /ή PKARII) μεσολαβείται μέσω αλληλεπιδράσεων με AKAPs [22]. ΑΚΑΡ αναστολέα Ht31, ένα συνθετικό πεπτίδιο του θυρεοειδούς αγκύρωσης έχει αποδειχθεί ότι είναι ένας πολύ ισχυρός ανταγωνιστικός αναστολέας της αλληλεπίδρασης PKARII /ΑΚΑΡ, αποτρέποντας έτσι την αγκύρωση ΡΚΑ [23]. Για να εξασφαλιστεί ότι η Ht31 ήταν ειδικά στόχευση αλληλεπιδράσεις ΑΚΑΡ-ΡΚΑ, εκτελέσαμε προσδιορισμούς δραστικότητας ΡΚΑ επί FET κύτταρα για να προσδιοριστεί η έκταση της ενεργοποίησης της ΡΚΑ εξής προεπεξεργασία με Ht31 (25 μΜ) πριν από την έκθεση ΤΟΡβ (Σχήμα 3Α). Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες [15], Ht31 ήταν σε θέση να εμποδίσει την TGFβ διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση ΡΚΑ. Από την αλληλεπίδραση ΑΚΑΡ-PKA φαίνεται να είναι μια απαίτηση για TGFβ μεσολάβηση ενεργοποίηση PKA, εμείς αιτιολογημένη ότι αυτές οι αλληλεπιδράσεις μπορεί επίσης να απαιτείται για την κατάντη γεγονότων σηματοδότησης που οδηγεί σε απώλεια ΧΙΑΡ (Εικόνα 3Β). Η προσθήκη του Ht31inhibitor για 1 ώρα πριν από την TGFβ θεραπεία για καθορισμένους χρόνους κατήργησε εντελώς την απώλεια ΧΙΑΡ.

ΑΚΑΡ αναστολέα Ht31 (25 μΜ) αγωγή για 1 ώρα πριν από την έκθεση ΤΟΡβ ακυρώνει τον ΤΟΡβ μεσολαβεί δραστικότητα ΡΚΑ (Α) και TGFβ μεσολάβηση απώλεια ΧΙΑΡ (Β). AKAP149 siRNA knockdown έγινε σε FET κύτταρα (C). Νοκ ντάουν της AKAP149 οδηγεί σε κατάργηση του TGFβ μεσολάβηση δραστηριότητας PKA (D) και ΧΙΑΡ ρύθμιση προς τα κάτω (Ε). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± S.E.M (n = 3). Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης για κηλίδες Western. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές ανεξάρτητα.

Η

Δεδομένου ότι η οικογένεια ΑΚΑΡ περιλαμβάνει περισσότερα από 50 μέλη [24], η πρόκληση ήταν να εντοπίσει ένα άτομο ΑΚΑΡ που να ανταποκρίνεται στις επιπτώσεις TGFβ /PKA στις ΧΙΑΡ . Μετά την αρχική διαλογή για την παρουσία των διαφόρων μελών της οικογένειας ΑΚΑΡ σε FET κύτταρα, βρήκαμε έκφραση πρωτεΐνης AKAP149 σε αυτά τα καρκινικά κύτταρα κόλου. AKAP149 (αναφέρεται επίσης ως D-AKAP1 και AKAP121 σε ποντίκι) έχει ταυτοποιηθεί ως μία πρωτεΐνη μεμβράνης των μιτοχονδρίων [25]. Έχει αναφερθεί ότι το μιτοχονδριακό AKAP121 εμπλέκεται στη στόχευση cAMP ενεργοποιείται ΡΚΑ στην εξωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη (OMM) και παίζει ένα ρόλο στη μιτοχονδριακή βιογένεση και επιβίωση [26]. Υποθέσαμε βασίζεται στην αντίληψη ότι η μιτοχονδριακή ΧΙΑΡ και survivin κίνηση στο κυτταρόπλασμα μετά από μια αντίδραση στο στρες που AKAP149 μπορεί να ρυθμίζει TGFβ /PKA μεσολάβηση της υποβάθμισης ΧΙΑΡ. Η έκφραση ενός AKAP149 μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) απέτρεψε την TGFβ διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση ΡΚΑ (Σχήμα 3C-D). Περαιτέρω, παρατηρήσαμε ότι TGFβ ήταν σε θέση να ρυθμίζουν προς τα κάτω ΧΙΑΡ πρωτεΐνης σε AKAP149 siRNA knockdown κυττάρων συγκριτικά με γονικά κύτταρα ελέγχου FET (Σχήμα 3Ε). Αυτό προ-αποπτωτική λειτουργία του AKAP149 είναι σε αντίθεση με τη γνωστή λειτουργία του μιτοχονδριακού AKAP121 (ή ανθρώπινο AKAP149 ομόλογο του) στην προαγωγή της επιβίωσης.

επόμενο ερώτημα κατά πόσον η δράση του AKAP149 ήταν επιλεκτική σε αυτό το αποτέλεσμα TGFβ /ΡΚΑ . Ενώ η αλληλεπίδραση ΑΚΑΡ-ΡΚΑ είναι ένα παγκόσμιο φαινόμενο, η επικύρωση της AKAP149 ως επιλεκτική ρύθμιση TGFβ /PKA σηματοδότηση θα είναι μια νέα επέκταση της κατανόησης μας του TGFβ /PKA μεσολάβηση ΧΙΑΡ αρνητική ρύθμιση. AKAP220 έχει αποδειχθεί ότι ρυθμίζει πρωτεϊνική φωσφατάση 1 (ΡΡ1) δραστηριότητα με το συντονισμό της θέσης του ΡΚΑ και καταλυτικής υπομονάδας ΡΡ1 [27]. Εμείς σιγήσει η έκφραση AKAP220 σε FET κύτταρα με AKAP220 siRNA. Αυτά τα επιμολυσμένα κύτταρα όταν υποβάλλονται σε επεξεργασία με ΤΟΡβ δεν είχε επίδραση είτε στην επαγωγή της δραστηριότητας ΡΚΑ ή ΧΙΑΡ μειορύθμιση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στο σύνολό τους, ΑΚΑΡ σκαλωσιές διαδραματίζει καίριο ρόλο στην οδό TGFβ /PKA μεσολάβηση ΧΙΑΡ ρύθμιση προς τα κάτω με το μιτοχονδριακό εντοπισμένη AKAP149 είναι αναγκαία για την μεσολάβηση απάντηση TGFβ /PKA.

Συμμετοχή της ΡΡ2Α σε TGFβ /PKA μεσολάβηση ΧΙΑΡ αρνητική ρύθμιση

έχει παρατηρηθεί ότι η ενεργοποίηση του ΡΚΑ οδηγεί στην αδρανοποίηση του ΑΚΤ μέσω αποφωσφορυλίωση από πρωτεϊνική φωσφατάση 2Α (ΡΡ2Α) [28]. Αυτό οδήγησε στην υπόθεση ότι η ΤΟΡβ διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση του ΡΚΑ είναι υπεύθυνη για την καταστολή της ενεργοποίησης ΑΚΤ που έχουν αναφερθεί στο παρελθόν ως συνέπεια της TGFβ σηματοδότησης [13]. Κατά συνέπεια, προσδιορίσαμε δραστηριότητα ΡΡ2Α σε FET κύτταρα (Σχήμα 4Α). επεξεργασία TGFβ για καθορισμένους χρόνους αύξησε σημαντικά τη δραστηριότητα ΡΡ2Α. ΡΡ2Α εκλεκτικός αναστολέας οκαδαϊκό οξύ (ΟΑ, 50 nM) ήταν σε θέση να καταργήσει εντελώς την ενεργοποίηση ΡΡ2Α όταν αντιμετωπίζεται μόνο του ή σε προεπεξεργασία πριν από την έκθεση TGFβ. Στη συνέχεια, εξετάσαμε το ρόλο του ΤΟΡβ στην μεσολάβηση ΑΚΤ απενεργοποίηση και απώλεια ΧΙΑΡ (Σχήμα 4Β). Παρατηρήθηκε ότι ΤΟΡβ μεσολάβηση αποφωσφορυλίωση ΑΚΤ εξαρτάται ΡΡ2Α όπως αντανακλάται από την ικανότητα των ΟΑ να μπλοκάρουν την ΤΟΡβ μεσολάβηση αποφωσφορυλίωση της ΑΚΤ. ΧΙΑΡ ρύθμιση προς τα κάτω επίσης καταργήθηκε με τη θεραπεία της ΟΑ. Αν και ΡΡ2Α είναι ένας καταστολέας όγκων που εμπλέκονται στον έλεγχο πολλών οδών κυτταρικής επιβίωσης [29], την τεκμηρίωση ενός ρόλου σε ανατροπή κυτταρικής επιβίωσης σηματοδότησης εντός της οδού ΤΟΡβ είναι μία νέα επέκταση της λειτουργίας ΡΡ2Α.

κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία FET με ΤΟΡβ (5 ng /ml) για τον αναφερόμενο χρόνο και ΡΡ2Α δραστικότητα προσδιορίστηκε με χρησιμοποίηση του πρωτοκόλλου προσδιορισμού δραστικότητας ΡΡ2Α όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους (Α). αναστολέας ΡΡ2Α οκαδαϊκό οξύ (ΟΑ, 50 ηΜ) χρησιμοποιήθηκε για να αναστείλει ΡΡ2Α. Η προεπεξεργασία με ΟΑ πριν από ΤΟΡβ (5 ng /ml) μεταχείριση κατήργησε TGFβ μεσολάβηση απώλεια ΧΙΑΡ και αποφωσφορυλίωση ΑΚΤ (Β). Σταθερό shRNA knockdown του ΡΡ2Α καταλυτικής υπομονάδας α-έγιναν σε FET κύτταρα (C). Εξόντωση ΡΡ2Α καταλυτικής α υπομονάδας οδήγησε σε κατάργηση του ΤΟΡβ (5 ng /ml) με τη μεσολάβηση ΧΙΑΡ μειορρύθμιση χωρίς να επηρεάζει δραστικότητα ΡΚΑ (D-E). μελέτες ανοσοκαταβύθισης ΧΙΑΡ σε κύτταρα FET αγωγή με ΤΟΡβ (5 ng /ml) ή σε προεπεξεργασία με Η89 ή Ht31 για 1 ώρα πριν από την έκθεση ΤΟΡβ. ΧΙΑΡ διίσταται από ρΑΚΤ μετά τη θεραπεία TGFβ για χρονικό διάστημα που υποδεικνύεται (F). Αναστολής της δραστηριότητας ΡΚΑ από Η89 ή ΑΚΑΡ-PKA αλληλεπίδραση με Ht31 καταργεί την TGFβ μεσολάβηση ΧΙΑΡ-ρΑΚΤ διάστασης.

Η

Για να επικυρώσετε περαιτέρω το ρόλο της ΡΡ2Α σε TGFβ /PKA σηματοδότησης, δημιουργήσαμε σταθερή καταλυτική shRNA ΡΡ2Α knockdown υπομονάδας σε FET κύτταρα χαρακτηρίζονται FET ΡΡ2Α Cat KD (Σχήμα 4C). θεραπεία ΤΟΡβ κυττάρων FET ΡΡ2Α Cat KD έδειξαν ενεργοποίηση ΡΚΑ υποδεικνύοντας ότι η ενεργοποίηση ΡΚΑ είναι ανάντη της ενεργοποίησης ΡΡ2Α (Εικόνα 4D). Ωστόσο, σταθερή shRNA knockdown της καταλυτικής υπομονάδας ΡΡ2Α καταργήθηκε πλήρως ΤΟΡβ παρεμπόδιση που προκαλείται ΧΙΑΡ και έδειξε παρατεταμένη φωσφορυλίωση της ΑΚΤ, καθώς και (Σχήμα 4Ε). κύτταρα FET PKACatα KD αγωγή με ΤΟΡβ έδειξε επίσης μια παρατεταμένη φωσφορυλίωση της ΑΚΤ (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Ενώ η αναστολή της ενεργοποίησης ΑΚΤ θα έχει δυναμικό για πολλές επιδράσεις στην επιβίωση των κυττάρων, μία επίδραση που έχει ιδιαίτερο ενδιαφέρον ως συναφείς σε λειτουργία TGFβ /PKA είναι στο πλαίσιο που στοχεύει σταθερότητα ΧΙΑΡ. Μια προηγούμενη μελέτη ανέφερε ότι ΧΙΑΡ φωσφορυλιώνεται από ΑΚΤ σε Ser

87 η οποία οδηγεί σε αυξημένη σταθεροποίηση των ΧΙΑΡ και μειωμένη απόπτωση των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών σε ανταπόκριση στη σισπλατίνη [30]. Εμείς αιτιολογημένη ότι ΡΡ2Α αναστολή της δραστηριότητας ΑΚΤ μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα πρόσθετο μηχανισμό για τη διάσπαση της σταθεροποίησης του ΧΙΑΡ που στοχεύει από την οδό TGFβ /ΡΚΑ μέσω ενίσχυσης της δραστηριότητας ΡΡ2Α. Για το σκοπό αυτό, FET κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον ΤΟΡβ ή προεπεξεργασία με διαφορετικές αναστολείς μονοπάτι ΤΟΡβ /ΡΚΑ πριν από την έκθεση TGFβ για συγκεκριμένους χρόνους και ανοσοκαταβυθίστηκαν για ΧΙΑΡ και ανοσοστυπώθηκαν για πιθανές πρωτεΐνες συνδέεται με ΧΙΑΡ. Βρήκαμε μια ένωση του ΧΙΑΡ με ρΑΚΤ (Σχήμα 4F). Μετά την αγωγή ΤΟΡβ, υπήρχε μια σημαντική διάσταση του συμπλόκου ΧΙΑΡ-ρΑΚΤ. Ωστόσο, η προκατεργασία με Η89 ή Ht31 πριν TGFβ έκθεση εντελώς ακύρωσε ΧΙΑΡ-ρΑΚΤ διαχωρισμό των δύο πρωτεϊνών δείχνει ότι TGFβ /ΡΚΑ σηματοδότηση διαμεσολαβούμενη απενεργοποίηση του ΑΚΤ αποσταθεροποιεί ΧΙΑΡ οδηγεί στην αποδόμηση του πρωτεασώματος της. Ως εκ τούτου, με τη χρήση μελετών αναστολέα και σταθερή knockdown, εμείς υπογραμμίζουν την καινοτόμο εύρημα ότι TGFβ /ΡΚΑ σηματοδότηση διαμεσολαβεί απώλεια του ΧΙΑΡ πρωτεΐνης από ένα ΡΚΑ ΡΡ2Α εξαρτώμενη καταστολή της ενεργοποίησης ΑΚΤ που οδηγεί σε απώλεια ΧΙΑΡ.

ανασύσταση του υποδοχέα ΤΟΡβ οδηγεί μειώθηκαν μεταστατικό αποικισμός: Επιπτώσεις στην ΤΟΡβ /ΡΚΑ σηματοδότησης

Έχουμε αναπτύξει τεχνολογία για ορθοτοπική κολονική εμφύτευση ανθρώπινων γραμμών καρκίνου του παχέος εντέρου σε αθυμικά ποντίκια που επιτρέπει την επαναλήψιμη ποσοτική ανάλυση της μετάστασης στο ήπαρ και στους πνεύμονες [31], [ ,,,0],32], [33]. Η μεταστατική μοτίβο εμφανίζεται σε αυτό το σύστημα μοντέλου αντικατοπτρίζει τη φύση της μεταστατικής εξάπλωσης σε ανθρώπους ασθενείς. Εξαιρετικά μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα GEO χρησιμοποιήθηκαν για την περαιτέρω κατανόηση των επιπτώσεων της TGFβ /PKA σηματοδότησης για μετάσταση. κύτταρα GEO έχουν εξασθενημένο TGFβRI έκφρασης και έτσι εξασθενεί ογκοκατασταλτικών TGFβ σηματοδότηση καθώς και [8]. Έχουμε χρησιμοποιηθεί κολονική ορθοτοπική εμφύτευση υποδορίως ξενομοσχευμάτων που καλλιεργούνται για το χαρακτηρισμό παράγοντες που επηρεάζουν την έκταση της μετάστασης σε ήπαρ και τους πνεύμονες χωρίς να επηρεάζει την εισβολή στην πρωτογενή θέση όγκου [31], [33]. κύτταρα GEO βρέθηκαν να είναι πολύ μεταστατικός σε αυτό το ορθοτοπικό μοντέλο όπως αντανακλάται από μεταστατικό αποικισμού σε 53% των εμφυτευμένων ζώων (Πίνακας 1). Διάσωση εξασθένησης υποδοχέα σε κύτταρα GEO με επιμόλυνση ενός φορέα έκφρασης TGFβRI (ορίζεται GEORI) είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση του μεταστατικού επίπτωσης έως περίπου 20% των ζώων που εμφυτεύθηκαν χωρίς να επηρεάζουν την εισβολή στην πρωτογενή θέση, καθώς οι δύο GEO και GEORI επιμολυσμένα ζώα προκάλεσε μια επεμβατική πρωτογενούς όγκου στο 100% των εμφυτευμένων ζώων. GEO μεταμοσχευμένα ζώα ανέπτυξαν ισχυρή μετάσταση στο ήπαρ σε σύγκριση με GEORI (Σχήμα 5Α). Αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε) χρώση δείχνει ηπατικών μεταστάσεων σε κύτταρα GEO φαίνεται στο Σχήμα 5Β. Ο χαρακτηρισμός των όγκων GEO έδειξαν αυξημένη κυτταρική επιβίωση σηματοδοτήσεως, όπως αντανακλάται από τα χαμηλότερα ποσοστά σε σχέση με TUNEL GEORI όγκους υποδεικνύοντας μία καταστολή της μεταστατικής αποικισμό από ΤΟΡβ ογκοκατασταλτικό σηματοδότηση συσχετίζεται με την καταστολή της κυτταρικής επιβίωσης σηματοδότησης in vivo (Σχήμα 5C-D). Περαιτέρω, καμία αλλαγή στη χρώση Ki67 IHC παρατηρήθηκε μεταξύ άκρως μεταστατική GEO και κακώς μεταστατικό πρωτοπαθείς όγκους GEORI υποδεικνύει καμία διαφορά στο ρυθμό πολλαπλασιασμού in vivo μεταξύ GEO και όγκους GEORI (Σχήμα 5Ε-F). Οι in vivo ευρήματα δείχνουν ότι η αποκατάσταση του υποδοχέα ΤΟΡβ καταστέλλει μεταστατική ικανότητα των κυττάρων GEO στο επίπεδο του μεταστατικού αποικισμού σε αντίθεση με την πρόληψη της εισβολής.

Σύγκριση των εικόνων GFP της μεταστατική εξέλιξη σε ήπαρ σε GEO και GEORI ποντίκια ( ΈΝΑ). GEO παχέος εντέρου Καρκίνος του ήπατος H & amp? Ε χρώση δείχνει μετάσταση στο ήπαρ (Β). Σύγκριση των πρωτογενών τμημάτων όγκου του GEO και GEORI ποντίκια με χρώση δοκιμασία TUNEL όπως αναφέρεται στο Υλικά και Μέθοδοι για τον προσδιορισμό συντελεστών αποπτωτική τους (C). Τα αποπτωτικά ποσοστά ποσοτικοποιήθηκαν (D). Σύγκριση των πρωτογενών τμημάτων όγκου του GEO και ποντίκια GEORI με χρώση Κί-67, όπως αναφέρεται στο Υλικά και Μέθοδοι για τον προσδιορισμό τους ρυθμούς πολλαπλασιασμού (Ε). Τα ποσοστά πολλαπλασιασμού ποσοτικά (F). ανασύσταση του υποδοχέα ΤΟΡβ οδηγεί σε μια αλλαγή στη δραστηριότητα ΡΚΑ. Σύγκριση της δραστικότητας ΡΚΑ σε ιδιαίτερα μεταστατικά κύτταρα GEO εναντίον ελάχιστα μεταστατικά κύτταρα GEORI (G) και σε εξαιρετικά μεταστατικά κύτταρα CBS εναντίον ελάχιστα μεταστατικά κύτταρα CBSRII (H). Σύγκριση του TGFβ (5 ng /ml) έκθεση μεταξύ GEO και τα κύτταρα GEORI (Ι) και CBS και τα κύτταρα CBSRII (J). PKA αναστολέας Η89 καταργηθεί TGFβ μεσολάβηση απώλεια ΧΙΑΡ στα κύτταρα GEORI και CBSRII (K).

Η

Ένα κλειδί για την αξιοποίηση της καταστολής της μετάστασης από TGFβ σηματοδότησης είναι η διαλεύκανση του μοριακού μηχανισμού με τον οποίο μετάσταση αναστέλλεται. Με βάση την μείωση του μεταστατικού συχνότητα με την ανασύσταση ΤΟΡβ υποδοχέα οδηγεί σε διάσωση του TGFβ σηματοδότησης, υποθέσαμε ότι TGFβ /PKA μεσολάβηση ΧΙΑΡ αρνητική ρύθμιση απαιτεί ένα ανέπαφο TGFβ σηματοδότησης μηχανισμό που χάνεται στα υψηλά μεταστατικά κύτταρα GEO. Ωστόσο, η διάσωση της TGFβ σηματοδότησης από την ανασύσταση του υποδοχέα στα κύτταρα GEORI που οδηγεί σε μειωμένη μεταστατικό συχνότητα θα πρέπει να αυξήσει TGFβ /PKA σηματοδότησης και κατάντη επιπτώσεις της στην ΧΙΑΡ. κύτταρα GEO με εξασθενημένη σηματοδότηση TGFβ δεν είχε καμία ενεργοποίηση PKA με την έκθεση TGFβ (Σχήμα 5G). Εντούτοις, κύτταρα GEORI με λειτουργικές TGFβ σηματοδότησης λόγω ανασύσταση υποδοχέα είχε μια ισχυρή αύξηση στην ενεργοποίηση ΡΚΑ από ΤΟΡβ η οποία ήταν περίπου 4 φορές υψηλότερη από τον έλεγχο. Μια δεύτερη κυτταρική γραμμή καρκινώματος κόλου (κύτταρα CBS) με εξασθενημένο ΤΟΡβΚΙΙ σηματοδότηση [34] έδειξε επίσης μειωμένη μετάσταση μετά τη διάσωση της ανεπάρκειας του υποδοχέα (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μια παρόμοια απόκριση σε δραστηριότητα ΡΚΑ παρατηρήθηκε σε εξαιρετικά μεταστατικά κύτταρα CBS σε σύγκριση με τα ελάχιστα μεταστατικά κύτταρα CBSRII μετά τη θεραπεία ΤΟΡβ in vitro (Εικόνα 5Η).

Μετά από αυτήν την παρατήρηση, υποθέσαμε ότι ο πολύ μεταστατικός GEO και κυττάρων CBS θα είναι ανθεκτικά στην TGFβ /ΡΚΑ σηματοδότηση μεσολαβούμενη απώλεια του ΧΙΑΡ πρωτεΐνης. Εμείς αιτιολογημένη ότι η αδυναμία των TGFβ σηματοδότησης για να προκαλέσει την ενεργοποίηση της ΡΚΑ σε αυτά τα κύτταρα λόγω της αδρανοποίησης του υποδοχέα θα εμπόδιζε επίσης κατάντι επιπτώσεις του στην ΧΙΑΡ καθιστώντας έτσι αυτά τα κύτταρα περισσότερο μεταστατικό μέσω αυξημένης σηματοδότησης προ-επιβίωσης. Ενώ GEO και CBS δύο δεν έδειξαν ανταπόκριση στη θεραπεία TGFβ σε συγκεκριμένους χρόνους (Εικόνα 5Θ-J), GEORI και CBSRII κύτταρα έδειξαν ΧΙΑΡ ρύθμιση προς τα κάτω για παρόμοιες θεραπείες (Σχήμα 5Θ-J).