Αφηρημένο

CK2 πρωτεΐνης κινάσης έχει διάφορες λειτουργίες προώθηση και διατηρώντας φαινοτύπους καρκίνου. Ερευνήσαμε την επίδραση της αναστολής CK2 στον καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων με τη μεσολάβηση Τ790Μ αντίσταση στον αναστολέα της ΤΚ του EGFR. Ανθεκτικό sublines PC-9 στο gefitinib (PC-9 /GR) και erlotinib (PC-9 /ER) ιδρύθηκαν από προηγούμενη μελέτη, και Τ790Μ δευτερογενή μετάλλαξη βρέθηκε και στα δύο ανθεκτικά υποσειρές. Μια μείωση του EGFR με κατεργασία siRNA ελέγχεται αποτελεσματικά την ανάπτυξη των ανθεκτικών κυττάρων, υποδηλώνοντας έτσι ότι εξακολουθούν να έχουν EGFR-εξάρτησης. CX-4945, ένας ισχυρός και εκλεκτικός αναστολέας της CK2, που προκαλείται από αυτοφαγία στο PC-9 /GR και PC-9 /ER, και η οποία υποστηρίχθηκε από την επαγωγή της αυτοφαγικά κενοτόπια και μικροσωληνίσκων που σχετίζονται με την αλυσίδα 3 (LC3) έκφραση φως της πρωτεΐνης 1, και η αύξηση των σημάτων στικτή φθορισμού σε ανθεκτικά κύτταρα προ-επιμολυσμένα με πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) σημασμένο με επισύναψη LC3. Ωστόσο, η απόσυρση του CX-4945 οδήγησε στην ανάκαμψη των καρκινικών κυττάρων με αυτοφαγία. Βρήκαμε ότι η επαγωγή της αυτοφαγία με CX-4945 και στις δύο ανθεκτικά κύτταρα ήταν CK2 εξαρτώμενη από τη χρήση μικρών παρεμβαλλόμενο RNA κατά CK2. Η θεραπεία με CX-4945 και μόνο προκάλεσε μία ελάχιστη αναστολή ανάπτυξης σε ανθεκτικά κύτταρα. Ωστόσο, συνδυασμένη αγωγή του CX-4945 και EGFR-ΤΚΙ ανέστειλε αποτελεσματικά τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και επαγόμενη απόπτωση. CX-4945 αύξησε την μετατόπιση του EGFR από την κυτταρική επιφάνεια εντός του autophagosome, στη συνέχεια οδηγεί στην μείωση του EGFR ενώ η αναστολή της αυτοφαγία με 3MA ή ATG7 στόχευση siRNA προεπεξεργασία μείωσε την μείωση του EGFR με CX-4945. Κατά συνέπεια, η απόπτωση με ένα συνδυασμό CX-4945 και EGFR-ΤΚΙ καταστάλθηκε από 3MA ή ATG7 στόχευση siRNA προεπεξεργασία, υποδηλώνοντας έτσι ότι autophagosome μεσολάβηση EGFR κάτω ρύθμιση θα έχει ένα σημαντικό ρόλο όσον αφορά αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο με EGFR-ΤΚΙ. Συνδυασμένη θεραπεία του αναστολέα CK2 και EGFR-ΤΚΙ μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική για την αντιμετώπιση Τ790Μ μεσολάβηση αντίσταση

Παράθεση:. Έτσι KS, Κιμ CH, Rho JK, Kim SY, Choi YJ, Τραγούδι JS, et al . (2014) Autophagosome-Mediated EGFR κάτω ρύθμιση που προκαλείται από την CK2 Αναστολέας Ενισχύει την αποτελεσματικότητα του EGFR-ΤΚΙ σε EGFR-Mutant καρκινικά κύτταρα πνεύμονα με αντίσταση από Τ790Μ. PLoS ONE 9 (12): e114000. doi: 10.1371 /journal.pone.0114000

Επιμέλεια: Spencer B. Gibson, Πανεπιστήμιο της Μανιτόμπα, Καναδά

Ελήφθη: 2, Αυγούστου του 2014? Αποδεκτές: 2 Νοέμβρη του 2014? Δημοσιεύθηκε: 8 Δεκεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 Έτσι, et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. Το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε με επιχορήγηση της Κορέας Υγεία Τεχνολογία R & amp? D Έργου, Υπουργείο Υγείας & amp? Πρόνοιας (HI12C1146000013) και επιχορήγηση (2.011 με 0.529) από Ασάν Ινστιτούτο Life Science, Σεούλ, Δημοκρατία της Κορέας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Στόχευση τον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) με μικρού-μορίου, αναστολείς κινάσης τυροσίνης έχει γίνει ένα σημαντικό θεραπευτική στρατηγική για τον καρκίνο του πνεύμονα μη-μικρού κυττάρου (NSCLC) με μετάλλαξη EGFR. Μετά την επιβεβαίωση της όφελος επιβίωσης σε σύγκριση με εκείνη των συμβατικών κυτταροτοξικής χημειοθεραπείας [1], [2], EGFR-TKIs έχουν εγκριθεί ως οι παράγοντες πρώτης γραμμής. Ωστόσο, παρά την αρχικά αξιοσημείωτη απάντηση, επίκτητη αντοχή αναπτύσσεται τελικά, περιορίζοντας έτσι τη μέση διάρκεια απόκρισης σε λιγότερο από ένα έτος [3], [4]. Περίπου το ήμισυ της αντίστασης προκαλείται από μια μετάλλαξη δεύτερης θέσης στην θέση 790, δηλαδή Τ790Μ [5], [6]. Το ογκώδες υπόλειμμα μεθειονίνης σε Τ790Μ θα μπορούσαν να παρεμποδίσουν την πρόσδεση του φαρμάκου ή την αυξημένη συγγένεια ΑΤΡ στο θύλακα σύνδεσης ΑΤΡ, και ελαχιστοποιώντας έτσι την αποτελεσματικότητα του φαρμάκου [5], [7].

δεύτερης γενιάς EGFR-TKIs , όπως BIBW2992 (afatinib) και PF00299804 (dacomitinib), έχουν προταθεί προκειμένου να ξεπεραστεί η Τ790Μ μεσολάβηση αντίσταση θεωρώντας ότι αυτά δραστικός, μη αναστρέψιμος EGFR-TKIs ανταγωνίζονται πλέον με ΑΤΡ από τη στιγμή που έχουν γίνει συνδεδεμένες με ομοιοπολικούς δεσμούς με τον τομέα κινάσης [ ,,,0],8], [9]. Ωστόσο, είναι αβέβαιο αν μη αναστρέψιμη EGFR-TKIs μπορεί να ξεπεράσει την αντίσταση που προκαλείται από Τ790Μ και κάποια προκαταρκτικά αποτελέσματα των εν εξελίξει κλινικές δοκιμές ήταν μάλλον απογοητευτικές όσον αφορά την υπέρβαση της αντίστασης, αν και θα μπορούσε να επιτευχθεί μεγαλύτερη επιτυχία, επιβίωση χωρίς εξέλιξη των ασθενών όταν χρησιμοποιείται ως παράγοντας πρώτης γραμμής σε σύγκριση με αναστρέψιμη EGFR-TKIs [10], [11]. Ως εκ τούτου, θα απαιτηθεί περαιτέρω κλινικής έρευνας, προκειμένου να παρέχουν πιο αποτελεσματικές στρατηγικές υπέρβασης.

CK2 πρωτεΐνης κινάση είναι μία ουσιαστικά δραστική και εξαιρετικά συντηρημένη, πανταχού παρούσα σερίνη /θρεονίνη κινάση η οποία εμπλέκεται σε μια ποικιλία κυτταρικών σηματοδότησης που σχετίζονται με του κυτταρικού κύκλου, του πολλαπλασιασμού, και την απόπτωση [12] – [14]. Η παρεκκλίνουσα έκφραση CK2 και η δραστικότητα έχουν αναφερθεί σε πολλές ανθρώπινες ασθένειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου [15]. Η υπερέκφραση του CK2 εξασθενεί την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων, ενώ ρύθμιση προς τα κάτω του ενισχύει τον κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από φάρμακο ή ακτινοβολία, και υποδηλώνοντας έτσι σημαντικό ρυθμιστικό ρόλο της όσον αφορά τον καθορισμό του καρκίνου κυττάρων μοίρα [16] – [19]. CK2-εξαρτώμενη φωσφορυλίωση του Cdc37 απαιτείται για τη λειτουργία συνοδό του Hsp90 σε πολυάριθμες ογκοπρωτεΐνες πελάτη, συμπεριλαμβανομένης της CK2, η ίδια [20]. Επειδή Hsp90 είναι απαραίτητη για την ωρίμανση ογκοπρωτείνης και σταθερότητα, η επιβίωση των καρκινικών κυττάρων εξαρτάται σε κρίσιμο βαθμό από τη σωστή λειτουργία του, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο έλεγχος της HSP90, άμεσα ή έμμεσα μέσω της αναστολής της CK2 θα ελπιδοφόρα για τη θεραπεία του καρκίνου. Επιπλέον, μπορεί να ρυθμίσει CK2 EGFR και κατάντη σηματοδότησης της, ιδιαίτερα τη δραστηριότητα των μελών της οδού ΡΙ3Κ-Akt-mTOR [21] – [24]. Η αναστολή αυτής της οδού έχει δειχθεί ότι ενισχύει τη δράση των αναστολέων EGFR [25].

Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την δραστικότητα του CX-4945, ενός εκλεκτικού και ισχυρός αναστολέας CX-2, επί EGFR- μεταλλαγμένο καρκινικά κύτταρα πνεύμονα με Τ790Μ μετάλλαξη που οδηγεί σε αντοχή σε EGFR-TKIs. Εξετάστηκε επίσης κατά πόσον θα μπορούσε να ενισχύσει τη δράση του EGFR-TKIs, προκειμένου να ξεπεραστεί η αντίσταση.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικής καλλιέργειας και αντιδραστηρίων

Gefitinib /Erlotinib- ανθεκτικές κυτταρικές σειρές (PC-9 /GR και PC-9 /ER) ιδρύθηκαν σε μια προηγούμενη μελέτη [26]. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) που περιέχει 10% βόειο εμβρυϊκό ορό, 100 μονάδες /ml πενικιλίνη, και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη (Invitrogen, Carlsbad, CA) στους 37 ° C σε ατμόσφαιρα 5% CO2. Το διάλυμα ΜΤΤ αγοράστηκε από την Sigma (St Louis, ΜΟ, USA). Gefitinib, Η erlotinib, 17-DMAG, CX-4945, και 3MA αγοράστηκαν από Σέλεκ Chemicals Co. Ltd (Houston, TX, USA).

δοκιμασίες επιβίωση των κυττάρων

Για την εκτέλεση της δοκιμασίας ΜΤΤ , τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε αποστειρωμένα πλαστικά τρυβλία 96 φρεατίων. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε διάφορες δόσεις CX-4945. Μετά από 72 ώρες, 15 μΙ του διαλύματος ΜΤΤ (5 mg /mL) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και οι πλάκες επωάστηκαν για 4 ώρες. Η κρυσταλλική φορμαζάνη διαλύθηκε με 100 μι ενός 10% (w /v) διαλύματος SDS για 24 ώρες. Η απορρόφηση στα 595 nm αναγνώστηκε φασματοφωτομετρικώς χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακός. Για να επικυρώσετε τις συνδυασμένες επιπτώσεις των CX-4945 ή εξάρτηση EGFR, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με CX-4945, EGFR-TKIs, ένας συνδυασμός του CX-4945 και gefitinib ή ερλοτινίμπη, ή EGFR στοχευμένες siRNA για τους χρόνους που υποδεικνύονται. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα ADAM-MC αυτόματο απαριθμητή κυττάρων (NanoEnTek, Σεούλ, Κορέα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Western ανάλυση κηλίδος

λύματα πλήρων κυττάρων παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας EBC ρυθμιστικού λύσης ( 50 mM Tris-HCI [ρΗ 8,0], 120 mM NaCl, 1% Triton Χ-100, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,3 mM φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο, 0,2 mM ορθοβαναδικό νάτριο, 0.5% ΝΡ40, και 5 U /mL απροτινίνη) και στην συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν. Το προκύπτον υπερκείμενο (20 μg) διαχωρίστηκε επί 8% έως 12% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (Invitrogen). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με χρήση 5% αποβουτυρωμένο γάλα-ΡΒδ-0.1% Tween 20 για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου πριν επωάζονται όλη τη νύχτα με πρωτεύοντα αντισώματα ειδικά για ρ-CK2α η οποία αγοράστηκε από την Sigma (St Louis, ΜΟ, USA) και CK2α οποία αγοράστηκε από την Abcam (Cambridge, UK). ρ-EGFR (Tyr1173), EGFR, κασπάση-3, Akt, ρ-Erk, Erk, και β-ακτίνης λήφθηκαν από Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). P-Ακί (Ser473), διασπασμένη PARP (Asp214), ATG7 και LC3 αγοράσθηκαν από τη Cell Signaling Technology (Berverly, ΜΑ, USA). Χρένου συζευγμένο με υπεροξειδάση αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν ως δεύτερα αντισώματα. Οι μεμβράνες αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ ECL (PerkinElmer, Waltham, ΜΑ, USA).

ακριδίνης χρώση πορτοκαλί

Autophagy αναλύθηκε με χρώση των κυττάρων με ζωτικής χρωστικής, πορτοκαλί της ακριδίνης (Sigma, St Louis, ΜΟ). Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και επωάστηκαν με πορτοκαλί της ακριδίνης σε μια τελική συγκέντρωση 5 μg /mL για 30 λεπτά στους 37 ° C σε ατμόσφαιρα 5% CO2. Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε ένα FACScan (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό CellQuest (Becton Dickinson). Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών, ανεξάρτητα πειράματα, και οι ράβδοι σφάλματος σημαίνουν τυπικές αποκλίσεις (SDS).

LC3-GFP έκφραση

Τα κύτταρα επιμολυσμένα με ένα πλασμίδιο, pEGFP-LC3 διάνυσμα (Addgene Inc., Cambridge, ΜΑ, USA) και καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με CX-4945 για 24 ώρες. Τα πρότυπα διάστικτη του LC3 σε επιμολυσμένα κύτταρα εξετάστηκαν με μικροσκοπία φθορισμού.

Προσδιορισμός απόπτωσης

Η απόπτωση ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ απόπτωσης Annexin V-FITC (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, κατακρημνίστηκαν με φυγοκέντρηση, και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα αννεξίνης V (150 mM NaCl, 18 mM ΟαΟ

2, 10 ηΜ HEPES, 5 mM ΚΟΙ, 1 mM MgCl

2) σύνδεση. FITC-συζευγμένη αννεξίνη V (1 μg /ml) και ιωδιούχο προπίδιο (50 μg /ml) προστέθηκε στα κύτταρα τα οποία επωάστηκαν για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Αναλύσεις έγιναν επί FACScan (Becton Dickinson). Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό CellQuest (Becton Dickinson). Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών, ανεξάρτητα πειράματα, και οι ράβδοι σφάλματος σημαίνουν τυπικές αποκλίσεις (SDS).

Μικρές παρεμβαίνει επιμόλυνση RNA

Μικρές παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) ολιγονουκλεοτίδια ειδικά για EGFR, ATG7, CK2α και ο έλεγχος siRNA αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα δίσκο 60-mm, τα οποία στη συνέχεια αφέθηκε για 24 ώρες. Ένα κλάσμα 2 μΙ διαλύματος siRNA (10 μΜ) και 5 μί Λιποφεκταμίνης 2000 (Invitrogen) αναμείχθηκαν έκαστο με 100 μι RPMI 1640 χωρίς ορό. Αυτά επωάστηκαν για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου μετά τον συνδυασμό των δύο μίγματα, και αυτό στη συνέχεια προστέθηκε στα κύτταρα που είχαν σπαρθεί στο πιάτο. Μετά από 24 ώρες, συλλέχθηκαν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western. Τα κύτταρα επίσης σε επεξεργασία για τη βιωσιμότητα των κυττάρων και την ανάλυση απόπτωσης.

συνεστιακή μικροσκοπία

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μια διαφάνεια θάλαμο παρουσία ή απουσία του CX-4945 για 48 ώρες. Είχαν σταθερό για 10 λεπτά με ψυχρή μεθανόλη και κατόπιν πλύθηκαν τρεις φορές με PBS. Τα κύτταρα επωάστηκαν με αντι-EGFR (Santa Cruz, δύο παρα δέκα) και LC3 (Cell Signaling, 1:100) όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Δευτεροβάθμια επώασης του αντισώματος περιλαμβάνονται 1:100 αραίωση είτε Alexa Fluor 488 αντι-ποντικού ή Alexa Fluor αντισώματα 568 αντι-κουνελιού. Οι πυρήνες βάφτηκαν με 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ) και στη συνέχεια πλύθηκαν και καλύπτουν-γλίστρησε. Διαφάνειες έχουν δει κάτω από ένα μικροσκόπιο LSM710 συνεστιακό λέιζερ σάρωσης (Carl Zeiss, Jena, Γερμανία), και οι εικόνες φωτογραφήθηκαν.

Αποτελέσματα

CX-4945 προκαλεί αυτοφαγία στο gefitinib /erlotinib ανθεκτικό PC -9 κύτταρα

Ορισμένες μελέτες έχουν αναφέρει ότι CX-4945 οδήγησε σε αναστολή του πολλαπλασιασμού σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα [15], [24]. Για να διερευνηθεί αν CX-4945 μπορεί να αναστείλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα με Τ790Μ μεσολάβηση αντίσταση σε EGFR-ΤΚΙδ, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CX-4945 σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α, CX-4945 αγωγή δεν έδειξε σημαντική αναστολή ανάπτυξης σε gefitinib κύτταρα /erlotinib ανθεκτικά. Ωστόσο, βρήκαμε ότι CX-4945 αγωγή προκάλεσε την συσσώρευση του αυτοφαγικά κενοτοπίων (AV), ενώ αυτά τα κύτταρα επανέλθει στην προηγούμενη κατάστασή τους μετά τη διακοπή του φαρμάκου (Εικ. 1Β). Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η επαγωγή autophagy με CX-4945, αναλύσαμε την έκφραση του δείκτη αυτοφαγία, LC3-ΙΙ, και ο αριθμός των κυττάρων που βάφονται με πορτοκαλί της ακριδίνης εκτελώντας κηλίδωση Western και ανάλυση FACS. Σε συνέπεια με την επαγωγή του αυτοφαγικά vaculoles, CX-4945 αγωγή έδειξαν μία σημαντική αύξηση στην ποσότητα του ενδογενούς LC3-ΙΙ και στο ποσοστό των πορτοκαλί ακριδίνης-θετικών κυττάρων (σχ. 1C και D). Επιπλέον, CX-4945 αγωγή εμφάνισαν χαρακτηριστικό πρότυπο διάστικτο από LC3, ενώ τα κύτταρα υπό αγωγή με όχημα παρουσίασαν διάχυτη και αδύναμα LC3 σχετιζόμενη πράσινου φθορισμού (Σχ. Ε). Αυτό CX-4945 που προκαλείται από αυτοφαγία παρατηρήθηκε επίσης σε γονικά κύτταρα PC-9 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι CX-4945 έχει την ικανότητα να προκαλέσει την επαγωγή αυτοφαγία σε γονικά κύτταρα, καθώς και /erlotinib ανθεκτικά PC-9 κύτταρα gefitinib.

Α, τα κύτταρα κατεργάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις CX-4945 για 72 ώρες, και ο ρυθμός αναστολής προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ. Β, κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς CX-4945 (5 μΜ) για 48 ώρες και στη συνέχεια επωάστηκαν για 24 ώρες με ένα μέσο χωρίς φάρμακο που περιέχει 10% FBS. Εικόνες που δείχνει το σχηματισμό αυτοφαγικά κενοτόπιο (Avos) πάρθηκαν σε × 20 μεγέθυνση. Γ και Δ, τα κύτταρα κατεργάστηκαν με CX-4945 για 48 ώρες. Κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western. Ποσοτική ανίχνευση των όξινων φυσαλιδώδους οργανιδίων από πορτοκαλί της ακριδίνης χρώση των κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση FACS. * Ρ & lt? 0.01 και ** ρ & lt? 0.001 σε σύγκριση με τον έλεγχο. Ε, κύτταρα μορφομετατράπηκαν με ένα πλασμίδιο για να εκφράσει LC3-GFP. Μετά από 24 ώρες διαμόλυνσης, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CX-4945 (5 μΜ) για 24 ώρες. μοτίβο στικτή της LC3 εντοπισμού αναλύθηκαν με μικροσκοπία ανοσοφθορισμού. F και G, τα κύτταρα επωάστηκαν με CX-4945 (5 μΜ), 17-DMAG (100 ηΜ) ή ραπαμυκίνη (20 μΜ) για 48 ώρες. Εικόνες ελήφθησαν σε × 20 μεγέθυνση. Η επαγωγή της LC3-Ι /ΙΙ δείχθηκε με ανάλυση κηλίδας Western.

Η

Hsp90 είναι απαραίτητη για πολλές ογκοπρωτεΐνες ωρίμανση και σταθερότητα συμπεριλαμβανομένων CK2α [20]. Επιπλέον, η λειτουργία συνοδό του Hsp90 που απαιτείται φωσφορυλίωσης Cdc37 από CK2α [27], [28]. Για να αξιολογηθεί περαιτέρω εάν Hsp90 είχε εμπλακεί σε CX-4945 που προκαλείται από αυτοφαγία, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 17-DMAG, αναστολέα Hsp90. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1F και G, η αναστολή της Hsp90 δεν έδειξε την επαγωγή της αυτοφαγία. Αν και τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις ίδιες δόσεις εκάστου φαρμάκου, CX-4945 που προκαλείται από αυτοφαγία ήταν πιο ισχυρό από ραπαμυκίνη, έναν αναστολέα mTOR.

Αν και CX-4945 έχει την εκλεκτικότητα για CK2, μπορεί να αναστέλλουν άλλες κινάσες, όπως FLT3, Pim1 και CDK1. Έτσι, εξετάσαμε αν CX-4945 που προκαλείται από αυτοφαγία εξαρτάται από την CK-2. Συνεπής με το αποτέλεσμα της CX-4945 αγωγή, η καταστολή της επαγόμενης CK2α μόνο μία ελάχιστη αναστολή της ανάπτυξης, ενώ είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση του vaculoles αυτοφαγικά και ενδογενή LC3-II (Εικ. 2). Αυτά αποτέλεσμα πρότεινε ότι CX-4945 που προκαλείται από αυτοφαγία μπορεί να είναι CK2-εξαρτώμενη.

Α και Β, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με έλεγχο ή CK2α siRNA (100 ηΜ) για 48 ώρες. Οι αριθμοί των κυττάρων προσδιορίστηκαν με απαριθμητή αυτόματο κύτταρο ADAM-MC. Εικόνες που δείχνει το σχηματισμό αυτοφαγικά κενοτόπιο (Avos) πάρθηκαν σε × 20 μεγέθυνση. * Ρ & lt? 0,01 σε σύγκριση με τον έλεγχο. C, Μετά από 48 ώρες διαμόλυνσης, CK2α και LC3-I /II αποδείχθηκε με ανάλυση στυπώματος Western.

Η

CX-4945 ενισχύει την αποτελεσματικότητα του EGFR-ΤΚΙδ σε gefitinib κύτταρα /erlotinib ανθεκτικά

Η σχέση μεταξύ της επαγωγής της αυτοφαγία και την ευαισθησία σε EGFR-TKIs έχει αμφιλεγόμενο παρέμεινε [29] – [32]. Προσδιορισμός εάν CX-4945 που προκαλείται από αυτοφαγία μπορεί να επηρεάσει την ευαισθησία σε EGFR-ΤΚΙδ, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CX-4945, EGFR-ΤΚΙ ή ένα συνδυασμό και των δύο για 48 ώρες. Ο συνδυασμός του CX-4945 και gefitinib ή erlotinib οδήγησε σε σημαντική αναστολή της ανάπτυξης, ενώ CX-4945 που προκαλείται από αυτοφαγία μειώθηκε σε συνδυασμένη θεραπεία (Εικ. 3Α). Επιπλέον, συνδυασμένη αγωγή με EGFR-ΤΚΙδ και CX-4945 που προκαλείται από κασπάση-3 και PARP-1 διάσπασης, οδηγώντας έτσι σε αυξημένη κυτταρικό θάνατο (Σχ. 3Β και C).

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CX-4945 ( 5 μΜ), gefitinib (1 μΜ), και ερλοτινίμπη (1 μΜ) ή ένας συνδυασμός των CX-4945 και gefitinib ή CX-4945 και ερλοτινίμπη για 48 ώρες. Α, οι αριθμοί των κυττάρων προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας έναν μετρητή κυττάρων (άνω πάνελ). Ποσοτική ανίχνευση των όξινων φυσαλιδώδους οργανιδίων από πορτοκαλί της ακριδίνης χρώση των κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση FACS (κάτω πίνακας). † p & lt? 0,01 σε σύγκριση με μόνη CX-4945. Β, η απόπτωση εκτιμήθηκε με χρώση ιωδιούχου αννεξίνης V-FITC /προπίδιο και κυτομετρία ροής. Διαγράμματα ιωδιούχου Annexin V-FITC /προπιδίου κυτταρομετρία ροής σε ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα παρουσιάζονται στο αριστερό πλαίσιο. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα, και οι ράβδοι σφάλματος σημαίνουν τυπικές αποκλίσεις (± SDS). C, η διάσπαση της PARP-1 και κασπάσης-3 δείχθηκε με ανάλυση κηλίδας Western. * P & lt? 0,01 και ** p & lt?. 0.001 σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

Για να διερευνήσουν τον μηχανισμό με τον οποίο CX-4945 αποκατέστησε τις αντικαρκινικές δράσεις των EGFR-ΤΚΙ σε ανθεκτικά κύτταρα, εξετάσαμε πρώτον την εξάρτηση του EGFR σηματοδότησης και στους δύο τύπους κυττάρων ανθεκτικών. Αν και η αποτελεσματικότητα να μειορυθμίζουν EGFR διέφεραν, η ανάπτυξη και των δύο κυττάρων ανθεκτικών ανεστάλη σημαντικά με θεραπεία siRNA, υποδηλώνοντας έτσι και την εμμονή της εξάρτησης EGFR παρά την αντίσταση Τ790Μ μεσολάβηση (Σχ. 4Α και Β). Εμείς επόμενη παρατηρείται τις δραστηριότητες του EGFR και κατάντη μορίων του όταν τα κύτταρα εκτέθηκαν σε κάθε φάρμακο. Η ανασταλτική δράση ενός ενιαίου θεραπεία με CX-4945, gefitinib ή erlotinib σε EGFR και Akt δραστηριότητες ήταν μέτρια, ενώ ο συνδυασμός του CX-4945 και gefitinib ή ερλοτινίμπη εντελώς καταστέλλεται EGFR και δραστηριότητα Akt (Εικ. 4C). Η θεραπεία με CX-4945 που προκαλείται από την προς τα κάτω ρύθμιση του συνολικού EGFR, όπως φαίνεται στη θεραπεία siRNA. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η προσθήκη του CX-4945 με το EGFR-ΤΚΙ μπορεί να ξεπεράσει Τ790Μ μεσολάβηση αντίσταση μέσω της αυξημένης δραστικότητας του EGFR-ΤΚΙ να καταστείλουν σήματα EGFR από την προς τα κάτω ρύθμιση του EGFR.

Α και Β, Έλεγχος και EGFR siRNAs (100 ηΜ) εισήχθησαν σε γονικής ή ανθεκτικά κύτταρα, και η καταστολή EGFR επιβεβαιώθηκε με ανάλυση στυπώματος Western. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα μετρητή κυττάρων 72 ώρες αργότερα. * Ρ & lt? 0.01 και ** ρ & lt? 0.001 σε σύγκριση με τον έλεγχο. C, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με φάρμακα όπως στο Σχ. 2. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, και η διαμόρφωση του σηματοδότηση EGFR στις υποδεικνυόμενες κυτταρικές σειρές ανιχνεύθηκε με ανάλυση κηλίδος Western.

Η

Η αναστολή της CX-4945 που προκαλείται από αυτοφαγία εξασθενίζει απόπτωση σε gefitinib /erlotinib ανθεκτικά κύτταρα

Παρατηρήσαμε ότι CX-4945 θεραπείας οδήγησε στην κάτω ρύθμιση του EGFR. Για να καθοριστεί εάν η επαγωγή του autophagy συνδέεται με την προς τα κάτω ρύθμιση του EGFR, οι αλλαγές στην εντόπιση EGFR επιβεβαιώθηκαν με συνεστιακή μικροσκοπία χρησιμοποιώντας το αντι-EGFR και αντίσωμα αντι-LC3 συζευγμένο με φθορισμοφόρο. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Α, CX-4945 θεραπείας παρουσίασαν αύξηση inLC3 /EGFR συν-εντοπισμού. Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι CX-4945 που προκαλείται από αυτοφαγία μπορεί να παγιδεύσουν EGFR από μεμβράνης πλάσματος εντός του autophagosome και ότι παγιδευμένο πρωτεΐνες μπορούν να αποικοδομούνται από λυσόσωμα.

Α, κύτταρα PC-9 /ER υποβλήθηκαν σε αγωγή με CX-4945 ( 5 μΜ) για 48 ώρες και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη, ανοσοχρώση με αντι-LC3 (κόκκινο), αντι-EGFR (πράσινο), και ϋΑΡΙ (μπλε), και αναλύθηκαν με συνεστιακή μικροσκοπία για να προσδιοριστεί η ενδοκυτταρική εντόπιση του EGFR. Β, Η καταστολή των ATG7 με κατεργασία siRNA ανιχνεύθηκε με ανάλυση κηλίδος Western. κύτταρα PC-9 /ER υποβλήθηκαν σε αγωγή με CX-4945 (5 μΜ) για 48 ώρες υπό την παρουσία ή απουσία 3MA (2 mM) και ATG7 siRNA (100 ηΜ). Η διαμόρφωση του EGFR ανιχνεύθηκε με ανάλυση κηλίδος Western. Γ και Δ, τα κύτταρα κατεργάστηκαν με φάρμακα όπως στο Σχ. 2 υπό την παρουσία ή απουσία 3MA και ATG7 siRNA. Διάσπαση της PARP-1 και κασπάσης-3 δείχθηκε με ανάλυση κηλίδας Western. Η απόπτωση εκτιμήθηκε με χρώση ιωδιούχου αννεξίνης V-FITC /προπίδιο και κυτομετρία ροής. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα, και οι ράβδοι σφάλματος σημαίνουν τυπικές αποκλίσεις (± SDS). * P & lt? 0,01 και ** p & lt?. 0.001 σε σύγκριση με το συνδυασμό του CX-4945 και gefitinib ή ερλοτινίμπη

Η

Για να διερευνηθεί περαιτέρω η CX-4945 που προκαλείται από αυτοφαγία οδηγεί απευθείας στο κάτω ρύθμιση της EGFR, αξιολογήσαμε το επίπεδο του EGFR με την παρουσία ή απουσία του αναστολέα αυτοφαγικά (3-μεθυλαδενίνη, 3MA) και θεραπεία ATG7 siRNA. Ο αριθμός των αυτοφαγοσώματα ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε προ-κατεργασμένα κύτταρα με 3MA (τα δεδομένα δεν φαίνονται), και 3MA ή θεραπεία ATG7 siRNA αποκατασταθεί τις δραστηριότητες, καθώς και το συνολικό επίπεδο του EGFR (Εικ. 5Β). Επιπλέον, η αναστολή της αυτοφαγία με 3MA ή καταστολή του ATG7 μειώθηκε κασπάσης-3 και PARP-1 διάσπασης και, κατά συνέπεια, οδήγησαν σε μείωση του αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο (Σχ. 5C και D). Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η επαγωγή της αυτοφαγία από CX-4945 μπορεί να έχει ένα σημαντικό ρόλο στην αντιμετώπιση Τ790Μ μεσολάβηση αντοχή σε EGFR-TKIs.

Συζήτηση

Έρευνες για την παροχή αποτελεσματικών στρατηγικών για την ξεπερνώντας Τ790Μ μεσολάβηση αντίσταση είναι πολύ σημαντικό καθώς οι περισσότεροι από τους ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με EGFR-TKIs επίκτητη αντοχή και Τ790Μ ήταν η αιτία της ανθεκτικότητας στο μισό από αυτούς τους ασθενείς [5], [6]. Ως δεύτερης γενιάς, μη αναστρέψιμη EGFR-TKIs, όπως afatinib και dacomitinib, απέτυχε να ξεπεράσει την αντίσταση που προκαλείται από Τ790Μ [33], [34], άλλα μέτρα, όπως EGFR διπλή στόχευση με cetuximab και afatinib [35] και το τρίτο -geneneration, μεταλλαγμένο-επιλεκτική EGFR-TKIs [36] – [38] αξιολογούνται ενεργά. Οι προκαταρκτικές εκθέσεις σχετικά με την αποτελεσματικότητα των μεταλλαγμένων-επιλεκτικής EGF-TKIs είναι αρκετά ελπιδοφόρες [39]. Αυτές οι νέες ουσίες, αναμένεται να είναι κλινικά διαθέσιμες στο άμεσο μέλλον για ασθενείς με Τ790Μ μεσολάβηση αντίσταση. Ωστόσο, λόγω της ετερογένειας των όγκων και γενωμική αστάθεια, η εμφάνιση ανθεκτικότητας στα φάρμακα αυτά φαίνεται να είναι αναπόφευκτη απαιτούν άλλες θεραπευτικές στρατηγικές.

Chen et al. έδειξαν ότι EGFR-ειδικό siRNAs παρεμποδίζει ισχυρά την ανάπτυξη των κυττάρων και την απόπτωση που επάγεται σε κύτταρα που φιλοξενούν H1975 τόσο L858R και Τ790Μ [40]. Ακόμη knock-down της μεταγραφής Τ790Μ από siRNAs, όταν συνδυάζονται με afatinib, ήταν αποτελεσματικό στον έλεγχο Τ790Μ-μεταλλαγμένο, καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Σύμφωνα με αυτό, επιβεβαίωσε επίσης την εμμονή της εξάρτησης EGFR σε Τ790Μ-μεταλλαγμένο, καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Αυτό είναι θεωρητικά εύλογο θεωρώντας ότι Τ790Μ μόνο μειώνει τη συγγένεια biding του EGFR-TKIs, αλλά δεν ενεργοποιεί το περιττό μηχανισμό για την επιβίωση του καρκίνου κυττάρων, εκτός από σπάνιες περιπτώσεις που έχουν άλλα συγχορηγούμενα, ανθεκτικό μηχανισμούς. Ως εκ τούτου, η ρύθμιση προς τα κάτω του EGFR θα μπορούσε να ασκήσει αντικαρκινικές επιδράσεις επί καρκινικών κυττάρων με εξάρτηση EGFR, καθώς και την ενίσχυση της αποτελεσματικότητας του EGFR-TKIs στον καθορισμό ενός μειωμένο επίπεδο έκφρασης EGFR. Η μελέτη μας έδειξε ότι πρώτον EGFR κάτω ρύθμιση που προκαλείται από CX-4945 ενίσχυσε την αποτελεσματικότητα του EGFR-ΤΚΙ σε EGFR-μεταλλαγμένων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα με Τ790Μ μεσολάβηση αντίσταση.

Μέχρι τώρα, έχει αμφιλεγόμενα παραμείνει αν αυτοφαγία συσχετίζεται με την ευαισθησία ή αντίσταση σε EGFR-TKIs. Ωστόσο, ορισμένα χαρτιά πρόσφατα προταθεί ότι η επαγωγή της αυτοφαγία είναι αναγκαία για την κυτταροτοξική δράση του EGFR-ΤΚΙδ σε πρωτογενείς και ανθεκτικά κύτταρα με μεταλλαγμένη EGFR [29], [32], [41]. Έδειξαν επίσης ότι η ενισχυμένη autophagy απαιτείται για την επιβίωση σε EGFR-ανεξάρτητος καρκίνος του πνεύμονα EGFR-μεταλλαγμένο [41]. Στη μελέτη μας, τα δύο ανθεκτικά κύτταρα είχαν ακόμα EGFR-εξάρτηση και η αναστολή της αυτοφαγία οδήγησε στη μείωση του κυτταρικού θανάτου. Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η επαγωγή της autophagy έχει ένα σημαντικό ρόλο να ξεπεραστούν επίκτητη ανθεκτικότητα σε EGFR-TKIs αν και οι μηχανισμοί για την επαγωγή autophagy μπορεί να είναι διαφορετική.

έκφραση EGFR στην επιφάνεια του κυττάρου ελέγχεται στενά από ένα πολύπλοκο, ενδοκύττωσης μηχανισμός [42]. Μετά την ενεργοποίηση συνδέτη μεσολάβηση και εσωτερίκευσης, EGFR είτε ανακυκλώνεται πίσω στην επιφάνεια του κυττάρου ή μεταφέρονται για λυσοσωμική αποικοδόμηση [42] – [44]. Αλλοίωση αυτής της λεπτής ισορροπίας μπορεί να αλλάξει το επίπεδο του EGFR στην επιφάνεια των κυττάρων. Αυξημένη αυτοφαγοσώματα σε κυτταρόπλασμα θα μπορούσε να συντηχθούν με ενδοσώματα που περιέχουν EGFR, και προκαλώντας έτσι τον σχηματισμό amphisomes. Στη συνέχεια, autolysomes που αναπτύχθηκε από τη σύντηξη με λυσόσωμα θα μπορούσε να οδηγήσει σε αποικοδόμηση EGFR (Εικ. 6). Στη μελέτη μας, CX-4945 που προκαλείται από αυτοφαγοσώματα ισχυρότερα από ραπαμυκίνη, ένα πολύ γνωστό αναστολέα του mTOR EGFR-μεταλλαγμένο, καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων με Τ790Μ. Μειωμένη έκφραση EGFR σε αυτά τα κύτταρα με CX-4945 θα μπορούσε να προκληθεί από τη διαδικασία που αναφέρθηκε προηγουμένως. Αυτό υποστηρίζεται από αποτελέσματα που δείχνουν ότι η αυξημένη εσωτερίκευση του EGFR στο αυτοφαγοσώματα με CX-4945 θα μπορούσε να απεικονιστεί σε φθορίζουσα κυτταροχημική χρώση και την αναστολή της αυτοφαγία με 3MA ή θεραπεία ATG7 siRNA αποκατασταθεί το επίπεδο EGFR. Ως εκ τούτου, η επαγωγή της αυτοφαγία οδηγεί σε αυξημένη αποδόμηση EGFR, όταν συνδυάζεται με EGFR-ΤΚΙδ, θα μπορούσε να είναι μία από τις πολλά υποσχόμενες θεραπευτικές επιλογές για EGFR ΤΚΙ ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα με εξάρτηση EGFR.

EGFR παραδίδεται από την μεμβράνη πλάσματος έως τις αρχές ενδοσώματα στα ενδοκυτταρικά κυστίδια. Αυτά τα κυστίδια είναι πίσω στην πλασματική μεμβράνη μέσω της οδού ανακύκλωσης. Ωστόσο, τα κυστίδια μπορούν επίσης να συντηχθούν με authophagosomes, και στη συνέχεια απευθείας με λυσοσώματα οδηγούν σε υποβάθμιση του EGFR.

Η

CX-4945 που προκαλείται από αυτοφαγία δεν μπορεί να προκαλείται από την αναστολή της συνοδείας λειτουργία του Hsp90 επειδή 17-DMAG δεν θα μπορούσε να προκαλέσει αυτοφαγία. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η καταστολή της CK2 επάγει αυτοφαγικά κυτταρικό θάνατο μέσω της διαφοροποίησης του mTOR και σηματοδότηση ΜΑΡΚ σε ανθρώπινα κύτταρα γλοιοβλαστώματος [45]. Σύμφωνα με αυτό, βρήκαμε ότι μειορρύθμιση ή αναστολή CK2α μπορούσε να οδηγήσει σε επαγωγή αυτοφαγία στον καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων με μετάλλαξη EGFR. Ωστόσο, ο κυτταρικός θάνατος δεν συνέβη όταν ανθεκτικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CX-4945 ή CK2α siRNA. Αυτό το αποτέλεσμα μπορεί να προκαλείται από το χαρακτηριστικό του EGFR-μεταλλαγμένου καρκινικά κύτταρα. Οι μεταγενέστεροι signalings (PI3K /AKT και ΜΑΡΚ) των κυττάρων με μετάλλαξη του EGFR εξαρτώνται από τη δραστηριότητα του EGFR πολύ. Έτσι, η αναστολή της μόνο CK2 μπορεί να μην είναι επαρκής για τη ρύθμιση της mTOR και σηματοδότηση ΜΑΡΚ σε αυτά τα κύτταρα. Περαιτέρω λεπτομερείς μηχανισμοί θα πρέπει να διερευνηθούν από τις ακόλουθες μελέτες.

Ωστόσο, προτείναμε ότι CX-4945 θα μπορούσε να είναι χρήσιμη για τη θεραπεία του EGFR-μεταλλαγμένο καρκίνο του πνεύμονα με Τ790Μ μεσολάβηση αντίσταση. Ωστόσο, για την κλινική εφαρμογή της, το ζήτημα της ασφάλειας που σχετίζονται με αυτό το νέο φάρμακο φαίνεται να επιλυθεί, διότι θα μπορούσε να αναστείλει την λειτουργία του Hsp90 η οποία είναι σημαντική στην ωρίμανση και τη σταθερότητα τόσο των φυσιολογικών πρωτεϊνών και ογκοπρωτεϊνών. Ως εκ τούτου, δεν είναι βέβαιο ότι μπορεί να φτάσει αποτελεσματική συγκέντρωση στον ορό, χωρίς σημαντικές ανεπιθύμητες ενέργειες θεωρώντας ότι χρησιμοποιούνται ως επί το πλείστον 5 μΜ του CX-4945 στη μελέτη μας. Ως εκ τούτου, απαιτούνται περαιτέρω έρευνες για την αντιμετώπιση της κατάλληλης δόσης του CX-4945 και χαρακτηριστικά ασφάλειας.

Εν περιλήψει, autophagosome μεσολάβηση EGFR κάτω ρύθμιση που επάγεται από CX-4945, ένας ισχυρός και εκλεκτικός αναστολέας CK2, ενισχύει το αποτελεσματικότητα του EGFR-ΤΚΙ σε EGFR-μεταλλαγμένο καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων με αντίσταση από Τ790Μ.