Αφηρημένο

Scoparone, μια φυσική ένωση που απομονώνεται από

Artemisia capillaris

, έχει χρησιμοποιηθεί σε κινεζικά φυτικό φάρμακο για τη θεραπεία του νεογνικού ίκτερου. μετατροπέα σήματος και ενεργοποιητής της μεταγραφής 3 (STAT3) συμβάλλει στην ανάπτυξη και την επιβίωση πολλών ανθρώπινων όγκων. Αυτή η μελέτη έγινε για να διερευνηθεί η δραστικότητα κατά του όγκου των scoparone κατά των καρκινικών κυττάρων του προστάτη DU145 και να προσδιοριστεί αν τα αποτελέσματά του μέσω της αναστολής της δραστικότητας STAT3. Scoparone ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων DU145 μέσω διακοπή του κυτταρικού κύκλου G

1 φάση. Παροδική διαμόλυνση προσδιορισμοί έδειξαν ότι scoparone καταστέλλεται τόσο συστατική και IL-6 που προκαλείται μεταγραφική δραστικότητα του STAT3. αναλύσεις κηλίδος Western και ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου έδειξε ότι scoparone κατέστειλε την μεταγραφή των γονιδίων στόχων STAT3 όπως κυκλίνη D

1, c-myc, survivin, Bcl-2, και Socs3. Σε συμφωνία με αυτό, scoparone μειωμένη φωσφορυλίωση και πυρηνική συσσώρευση του STAT3, αλλά δεν μείωσε τη φωσφορυλίωση του Janus κινάση 2 (JAK2) ή Src, τα μεγάλα ανάντη κινάσες υπεύθυνος για την ενεργοποίηση STAT3. Επιπλέον, η μεταγραφική δραστικότητα ενός ουσιαστικά δραστική μεταλλαγμένη του STAT3 (STAT3C) αναστάλθηκε από scoparone, αλλά όχι από AG490, έναν αναστολέα JAK2. Επιπλέον, η θεραπεία scoparone κατέστειλε ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη σε μαλακό άγαρ και την ανάπτυξη του όγκου των ξενομοσχευμάτων DU145 σε γυμνά ποντίκια, η ταυτόχρονη με τη μείωση της φωσφορυλίωσης STAT3. Υπολογιστική μοντελοποίηση πρότεινε ότι scoparone μπορεί να δεσμεύει τον τομέα SH2 της STAT3. Τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι scoparone προκαλεί μία αντικαρκινική δράση έναντι του καρκίνου του προστάτη DU145 κυττάρων στο τμήμα μέσω αναστολής της δραστηριότητας STAT3.

Παράθεση: Kim J-K, Kim J-Υ, Kim H-J, Πάρκο Κ-G, Harris RA, Cho W-J, et al. (2013) Scoparone Ασκεί αντι-όγκου δραστηριότητα ενάντια DU145 κύτταρα καρκίνου προστάτη μέσω αναστολής της STAT3 δραστηριότητας. PLoS ONE 8 (11): e80391. doi: 10.1371 /journal.pone.0080391

Επιμέλεια: Μιχαήλ Muders, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο του Carl Gustav Carus Δρέσδη, Γερμανία

Ελήφθη: May 31, 2013? Αποδεκτές: 2 Οκτώβρη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 15 Νοέμβρη, 2013

Copyright: © 2013 Kim et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο του υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών [2012R1A2A2A01043867, 2012R1A2A1A03670452 και Βασική Επιστήμη ερευνητικό πρόγραμμα, (2.012 έως 0.001.350)] που χρηματοδοτείται από το Υπουργείο Επιστημών, των ΤΠΕ & amp? Μελλοντικό σχεδιασμό και την επιχορήγηση του ενισχυτή τεχνολογία Κορέα Υγεία Ε &? D Έργου, Υπουργείο Υγείας & amp? Πρόνοιας, Δημοκρατία της Κορέας (A111345). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και την ανάλυση δεδομένων, την απόφαση να δημοσιεύσει, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν ανταγωνιστικά συμφέροντα υπάρχουν

Εισαγωγή

καρκίνου

προστάτη είναι η δεύτερη πιο κοινή μορφή καρκίνου και η έκτη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στους άνδρες σε όλο τον κόσμο [1]. Αν και μεταστατικό καρκίνο του προστάτη αποκρίνεται αρχικά σε θεραπεία στέρησης ανδρογόνων, οι περισσότεροι ασθενείς τελικά εξελίσσονται σε μια κατάσταση ευνουχισμός ανθεκτικών καρκίνου του προστάτη (CRPC) [2,3]. Ακόμη και με ντοσεταξέλη χημειοθεραπεία με βάση, η θεραπεία ασθενών με μεταστατικό CRPC παραμένει σημαντική κλινική πρόκληση. Σε αυτό το πλαίσιο, τον μετατροπέα σήματος και ενεργοποιητής της μεταγραφής 3 (STAT3) μονοπατιού σηματοδότησης έχει επικυρωθεί ως μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική στόχου σε μεταστατικό καρκίνο του προστάτη: αυτή η πρωτεΐνη ενεργοποιούνται ανωμάλως στον καρκίνο του προστάτη και συμβάλλει στην προαγωγή της μεταστατικής προόδου [4,5 ].

STAT3, ένα από τα επτά STAT παράγοντες μεταγραφής της οικογένειας, λειτουργεί ως καθοδικός τελεστής διαφόρων κυτοκινών, παραγόντων ανάπτυξης, και ορμόνες συμπεριλαμβανομένων των IL-6, επιδερμικό αυξητικό παράγοντα (EGF), και λεπτίνη [6-9]. Σε απάντηση σε εξωκυτταρικά ερεθίσματα, STAT3 ενεργοποιείται μέσω φωσφορυλίωσης σε Y705 και S727 από κινάσες τυροσίνης μη-υποδοχέα, συμπεριλαμβανομένων των JAK2 και Src, και από μιτογόνο πρωτεϊνικές κινάσες που ενεργοποιούνται (MAPKs) [10-12]. Οι φωσφορυλιωμένες STAT3 πρωτεΐνες σχηματίζουν διμερή που μετατοπίζονται μέσα στον πυρήνα, όπου ρυθμίζουν την μεταγραφή του κατάντη γονιδίων στόχων. Παρά το γεγονός ότι η φωσφορυλίωση της είναι παροδική και σφιχτά ρυθμίζονται σε κανονικά μη-μετασχηματισμένα κύτταρα, STAT3 επίμονα ενεργοποιείται σε μία ποικιλία ανθρώπινων όγκων, συμπεριλαμβανομένων κακοηθειών αιματολογικών (λευχαιμία, πολλαπλό μυέλωμα και λέμφωμα) και συμπαγείς όγκους (κεφαλής και αυχένα πλακωδών κυττάρων καρκίνωμα [HNSCC] , καρκίνοι μελανώματος, του παχέος εντέρου, ηπάτωμα, του μαστού και του προστάτη) [13-17]. Ένας μεγάλος αριθμός μελετών έχουν παράσχει πειστικές ενδείξεις για την ογκογόνο ρόλο μόνιμα ενεργών STAT3 [13-20]. Επίμονη ενεργοποίηση STAT3 προωθεί ποικίλες ογκογόνο και μεταστατικό διαδικασιών μέσω μεταγραφικής ρύθμισης διαφόρων γονιδίων που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Κυκλίνη D

1, c-myc, και ρ21), επιβίωση (Bcl-2, Mcl-1, και Survivin), μετάσταση (ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9), και την αγγειογένεση (VEGF). Ως εκ τούτου, STAT3 τώρα θεωρείται ότι αντιπροσωπεύει μια πολλά υποσχόμενη μοριακός στόχος για την ανάπτυξη θεραπευτικών κατά του καρκίνου με τη χρήση τόσο άμεσες όσο και έμμεσες προσεγγίσεις [13,14,21].

Scoparone (6,7-διμεθοξυκουμαρίνης), ένα σημαντικό συστατικό της κινεζικής βότανο

Artemisia capillaris

(γιν πηγούνι), έχει χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία του νεογνικού ίκτερου στην Ασία [22,23]. Η προστατευτική δράση του scoparone έναντι υπερχολερυθριναιμία διαμεσολαβείται από την ενεργοποίηση του υποδοχέα συστατική ανδροστανίου (CAR), έναν υποδοχέα πυρηνικής ορμόνης που δρα ως παράγοντας μεταγραφής να ρυθμίζουν προς τα πάνω έκφραση των ενζύμων που εμπλέκονται στην κάθαρση της χολερυθρίνης. Scoparone έχει επίσης πολλές άλλες βιολογικές ιδιότητες, συμπεριλαμβανομένων των αντι-πηκτική, υπολιπιδαιμικά, αγγειοχαλαρωτική, αντι-οξειδωτικό, και αντι-φλεγμονώδεις επιδράσεις [24-28]. Η αναστολή της μεταγραφικής δραστικότητας του πυρηνικού παράγοντα κΒ-(NF-κΒ) φαίνεται να είναι υπεύθυνη για την αντι-φλεγμονώδη δράση του [28]. Ωστόσο, το δυναμικό αντικαρκινική δραστικότητα του scoparone και μοριακών στόχων της, εκτός από CAR και NF-κΒ δεν έχουν ερευνηθεί εκτενώς. Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε την αντικαρκινική δραστικότητα του scoparone έναντι προστάτη DU145-καρκινικά κύτταρα μη εξαρτώμενου από ανδρογόνα και διαπιστώθηκε ότι οι μοριακοί μηχανισμοί της δράσης που συνδέεται με την αναστολή της δραστικότητας STAT3.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια και κατασκευάσματα πλασμιδίου

Scoparone (6,7-διμεθοξυκουμαρίνη), AG490 (ένας αναστολέας JAK2), TNF-α, φορσκολίνη (FSK), και φορβόλη 12-μυριστικό 13-οξικό άλας (ΡΜΑ) ήταν αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, USA). IL-6 ελήφθη από BD Biosciences (San Jose, CA, USA). Το κατασκεύασμα αναφοράς M67-Luc και οι φορείς έκφρασης για άγριου τύπου STAT3 ή μόνιμα ενεργή μορφή της STAT3 (STAT3C) [20] ήταν ευγενικό δώρα από το Δρ James E. Νταρνέλ (Πανεπιστήμιο Rockefeller, New York, NY, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής) . κατασκευάσματα Reporter (NF-κΒ-Luc, ΑΡ-1-Luc, CRE-Luc, και Egr-1-Luc) και φορέα έκφρασης για Egr-1 που περιγράφηκε προηγουμένως [29]. Το κατασκεύασμα ανταποκριτή λουσιφεράσης pTOPFLASH [30] και ο φορέας έκφρασης για κυρίαρχη ενεργό μετάλλαγμα ανθρώπινης β-κατενίνης (ΔΝ-β-κατενίνης) που περιέχει ένα εντός πλαισίου Ν-τερματική διαγραφή των αμινοξέων 29-48 [31] ήταν ευγενική δωρεά Ο Δρ Hans Clevers (University Medical Center της Ουτρέχτης, Ουτρέχτη, Ολλανδία) και ο Δρ Frank McCormick (University of California, San Francisco, CA, USA), αντίστοιχα. Για να δημιουργήσετε το Vxy Puro-Luc κατασκευή, cDNA που κωδικοποιεί λουσιφεράση πυγολαμπίδας ενισχύθηκε με PCR και εισάγεται η

Μπαμ

Η1

/Xho

1 θέσεων του πλασμιδίου Vxy-puro [12].

Ηθική δήλωση

Όλες οι πειραματικές διαδικασίες διεξήχθησαν αυστηρά σύμφωνα με τις κατάλληλες θεσμικές κατευθυντήριες γραμμές για την έρευνα σε ζώα. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας των πειραμάτων σε ζώα του Εθνικού Πανεπιστημίου Kyungpook (Αριθμός Άδειας: 2013-0015).

Κυτταρική καλλιέργεια και παροδική επιμόλυνση

δοκιμασία

Ανθρώπινο προστάτη καρκινικές κυτταρικές γραμμές (DU145 και PC-3), μία αθανατοποιημένη ανθρώπινου προστάτη επιθηλιακή κυτταρική σειρά (RWPE-1), ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού ( MCF-7 και MDA-MB-231), ανθρώπινες κυτταρικές σειρές ηπατοκυτταρικού καρκινώματος (HepG2 και Hep3B), ένα τραχηλικό καρκίνο κυτταρική σειρά (HeLa), και καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές γραμμές (ΗΤ-29, ΗΟΤ-116, και HCT-15) ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC? Manassas, VA, USA). DU145, PC-3, MDA-MB-231, HeLa, ΗΤ-29, ΗΟΤ-116, και ΗΟΤ-15 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε RPMI (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS ? Hyclone, Logan, UT, USA) και αντιβιοτικά. MCF-7 και Hep3B κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ (Invitrogen) μέσο συμπληρωμένο με 10% FBS και αντιβιοτικά. κύτταρα RWPE-1 αναπτύχθηκαν σε πλήρες μέσο χωρίς ορό κερατινοκυττάρων (K-SFM? Invitrogen) που περιέχει /mL εκχυλίσματος 50 μg βόειας υπόφυσης, 5 ng /ml ανθρώπινου ανασυνδυασμένου EGF, και αντιβιοτικά. Κύτταρα HepG2 καλλιεργήθηκαν σε ΜΕΜ (Invitrogen) συμπληρωμένου με 10% FBS και αντιβιοτικά. Για προσδιορισμούς παροδικής διαμόλυνσης, HepG2 (8 × 10

4), DU145 (3 χ 10

4), και PC-3 (3 χ 10

4) κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων και επιμολύνθηκαν με το κατασκεύασμα ανταποκριτή M67-Luc (200 ng /φρεάτιο), με ή χωρίς φορέα έκφρασης (100 ng /φρεάτιο) για είτε άγριου τύπου ή ουσιαστικά δραστική μεταλλαγμένη STAT3 (STAT3C) χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο διαμόλυνσης διαμετακόμιση LT1 (Mirus Bio LLC, Madison, WI, USA). κύτταρα HepG2 επιμολύνθηκαν επίσης με pTOPFLASH ή Egr-1-Luc πλασμίδια ανταποκριτές (200 ng /φρεάτιο) μαζί με ή χωρίς πλασμίδια έκφρασης (100 ng /φρεάτιο) για ΔΝ-β-κατενίνης ή Egr-1, αντίστοιχα. πλασμίδιο έκφρασης pSV40-β-γαλακτοσιδάσης χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Στις 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα διεγείρονται με IL-6 (10 ng /mL) για 24 ώρες, εάν απαιτείται, και στη συνέχεια συλλέχθηκαν για προσδιορισμούς λουσιφεράσης και β-γαλακτοσιδάσης. Η δραστικότητα λουσιφεράσης ομαλοποιήθηκε έναντι δραστικότητα β-γαλακτοσιδάσης.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

δοκιμασίες πολλαπλασιασμού κυττάρων πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας πολλαπλασιασμού κυττάρου WST-8, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29]. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 1,5 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο και στερήθηκαν ορού για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια διεγέρθηκαν με 10% FBS με την παρουσία 0,1% DMSO (φορέας) ή 0,1, 1, 10, 50, 100, 200, 500 ή 1000 μmol /L scoparone για 72 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37 ° C για περαιτέρω 2 ώρες σε μέσο που περιέχει WST-8 αντιδραστήριο (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan). Η απορρόφηση στα 450 nm μετρήθηκε για να προσδιοριστεί πολλαπλασιασμό των κυττάρων.

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του κυτταρικού κύκλου

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του κυτταρικού κύκλου διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29]. Εν συντομία, τα κύτταρα DU145 (4 × 10

5 κύτταρα /100 mm τρυβλίο καλλιέργειας) συγχρονίστηκαν σε G

0 /G

1 φάση με ασιτία ορού για 24 ώρες. Με βάση την προηγούμενη έκθεση [32] που δείχνει ότι τα κύτταρα DU145 σε παντελή στέρηση ορού προχωρήσει από το G

1 έως φάση S του κυτταρικού κύκλου μετά 27.5 ώρες διέγερσης ορού, τα κύτταρα διεγέρθηκαν με 10% FBS με την παρουσία 0,1% DMSO ή scoparone (0,5 και 1 mmol /L) για 28 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, και στη συνέχεια αναλύθηκαν με ροή FACSCalibur κυτταρόμετρο (BD Bioscience).

κηλίδος Western ανάλυση

ανάλυση κηλίδος Western διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως με ελάσσονες τροποποιήσεις [12,29]. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε Immobilon-P-μεμβράνης (Millipore, Billerica, ΜΑ). Μετά τον αποκλεισμό, η μεμβράνη επωάστηκε με πρωτεύοντα αντισώματα ενάντια Κυκλίνη D

1, φωσφο-pRb (ppRb), JAK2, φωσφο-JAK2 Tyr1007 /1008 (pJAK2), Src, οικογένεια φωσφο-Src Tyr416 (pSrc), STAT3, φωσφο-STAT3 Tyr705 (pSTAT3 Y705), φωσφο-STAT3 Ser727 (pSTAT3 S727), Survivin, c-myc, SOCS3, και Bcl-2 (Cell Signaling, Beverly, ΜΑ, USA)? Κυκλίνη Ε (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), και β-ακτίνης (Sigma-Aldrich). Μετά το πλύσιμο, οι μεμβράνες επωάστηκαν με υπεροξειδάση κρένου (HRP) – ή IRDye-συζευγμένο (IRDye 800CW και IRDye 680LT, LI-COR Biosciences, Lincoln, ΝΕ) δευτερεύοντα αντισώματα, και τα σήματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα ανίχνευσης στυπώματος ECL Western (Amersham , Buckinghamshire, Ηνωμένο Βασίλειο) ή Odyssey Infrared System απεικόνισης (LI-COR Βιοεπιστημών, Lincoln, NE, USA), αντίστοιχα. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης πρωτεΐνης. εντάσεις σήματος ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρία χρησιμοποιώντας το λογισμικό Image J και κανονικοποιημένο έναντι του αντίστοιχου σήματα β-ακτίνης.

Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qRT-PCR) ανάλυση

κύτταρα DU145 επωάστηκαν με scoparone για 1, 3, 6, 12, ή 24 ώρες. Ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο λύσης QIAzol (Qiagen, Valencia, CA, USA), και 1 μg ολικού RNA μεταγράφηκαν ανάστροφα χρησιμοποιώντας το κιτ σύνθεσης RevertAid First Strand cDNA (Thermo Scientific, Waltham, ΜΑ, USA) σύμφωνα με τους κατασκευαστές «οδηγίες. Για qRT-PCR, 25-50 ng του cDNA χρησιμοποιήθηκε για ενίσχυση PCR (θερμοκρασία αναδιάταξης: 60C) με τη χρήση δύναμης SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Warrington, UK) με την VIIA ™ 7 PCR Πραγματικού χρόνου System (Applied Biosystems ). Όξινες ριβοσωμικές P0 φωσφοπρωτεΐνη (RPLP0? 36Β4) χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. κατάσταση PCR και αλληλουχίες εκκινητών παρατίθενται στον Πίνακα S1.

ανοσοφθορισμού ανάλυση

κύτταρα DU145 σπάρθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες και αφέθηκαν να προσκολληθούν για 24 ώρες. Με βάση τα αποτελέσματα μας κηλίδος Western που δείχνει παρατεταμένη μείωση στη φωσφορυλίωση STAT3 από 2-6 ώρες μετά τη θεραπεία scoparone, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με scoparone (0,5 mmol /L) για 4 ώρες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 95% αιθανόλη για 15 λεπτά στους -20 ° C, και στη συνέχεια επωάστηκαν με αντισώματα έναντι pSTAT3 (Y705) ή STAT3 που ακολουθείται από επώαση με Alexa Fluor 488- ή Alexa Fluor 568-σημασμένο δευτερεύοντα αντισώματα, αντίστοιχα. πυρήνες κυττάρων χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ και ελήφθησαν συνεστιακή εικόνες και συγχωνεύονται.

Anchorage-ανεξάρτητη δοκιμασία ανάπτυξης

Soft προσδιορισμούς αποικίας άγκαρ σχηματισμός διεξήχθησαν όπως περιγράφεται προηγουμένως με ελάσσονες τροποποιήσεις [12]. DU145 (1 × 10

4) κύτταρα σε 1,5 ml μέσου ανάπτυξης αναμίχθηκαν με 1.5 mL από 0.5% αγαρόζη σε θερμάνθηκε μέσο ανάπτυξης που περιέχει φορέα (0,1% DMSO) ή 50, 100, ή 200 μmol /L scoparone και επιστρώνεται σε 0,5% άγαρ βάσης σε πιάτα κυτταρικής καλλιέργειας 60-mm. μέσο καλλιέργειας που περιέχει scoparone προστέθηκε μόνο μια φορά? στη συνέχεια, μέσο χωρίς scoparone προστέθηκε κάθε εβδομάδα για 21 ημέρες μέχρι μεγάλες αποικίες ήταν εμφανείς. Τα κύτταρα βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες για την καταμέτρηση των αποικιών.

Μοριακή μοντελοποίηση και σύνδεσης μελέτη

Η μοντελοποίηση και σύνδεσης μελέτη μοριακών διεξήχθη χρησιμοποιώντας Surflex-Dock στο SYBYL έκδοση 8.1.1 από την Tripos Associates (St . Louis, ΜΟ, USA), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [33]. Η κρυσταλλική δομή της STAT3 ανακτήθηκε από την Τράπεζα Δεδομένων Πρωτεΐνης (κωδικός ΠΣΠ ID 1BG1) και εκλεπτυσμένη για τη διαδικασία σύνδεσης [34]. Η δομή του scoparone δημιουργήθηκε με τη χρήση του πακέτου SYBYL με το πρότυπο μήκη δεσμών και γωνίες, και να ελαχιστοποιηθούν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο των συζυγών έως ότου η κλίση ήταν 0.001 kcal /mol με το πεδίο δυνάμεων Tripos. Η χρέωση Gasteiger-Huckel, με ένα διηλεκτρικό λειτουργία εξαρτάται από την απόσταση, εφαρμόστηκε για τη διαδικασία ελαχιστοποίησης. Η εικόνα της προβλεπόμενης αλληλεπίδρασης δημιουργήθηκε με την MOLCAD μοριακή πρόγραμμα γραφικών. Μετά την εκτέλεση Surflex-Dock, το διαμορφωτή με την καλύτερη συνολική βαθμολογία επιλέχθηκε και χρησιμοποιήθηκε για την πρόβλεψη των λεπτομερών δεσμευτικών προτύπων στην κοιλότητα.

Δημιουργία σταθερών κυτταρικών σειρών που εκφράζουν λουσιφεράση πυγολαμπίδας

Για να δημιουργήσετε ρετροϊούς που εκφράζουν λουσιφεράση πυγολαμπίδας, κύτταρα Phoenix Α επιμολύνθηκαν με το Vxy Puro-Luc κατασκευάσματος όπως περιγράφεται προηγουμένως [12]. κύτταρα DU145 υπέστησαν μεταγωγή με ρετροϊούς που εκφράζουν λουσιφεράση πυγολαμπίδας και επιλέγονται με πουρομυκίνη (1 μg /mL) για 2 εβδομάδες. Επιλεγμένα κύτταρα DU145 (DU145-Luc) ελέγχθηκαν για δραστικότητα λουσιφεράσης και για την αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του scoparone (αδημοσίευτα δεδομένα).

Ξενομοσχεύματος μοντέλο όγκου και ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις

Έξι εβδομάδων αθυμικά αρσενικά BALB /c γυμνά (πυ /ηυ) ποντίκια (Japan SLC, Inc., Shizuoka, Ιαπωνία) εγκλιματίστηκαν υπό ελεγχόμενες πρότυπες συνθήκες για μία εβδομάδα πριν από το πείραμα σύμφωνα με τον οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση ζώων Εργαστηρίου του Εθνικού Ινστιτούτου Υγείας. DU145-Luc (5 × 10

6) κύτταρα σε 100 μΙ PBS εγχύθηκαν υποδορίως στην δεξιά ραχιαία περιοχή πλευρό αρσενικών αθυμικών γυμνών ποντικών (BALB /c Slc-

ηυ /ηυ

ότι 7 εβδομάδες παλιός). Η διάμετρος του όγκου μετρήθηκε εξωτερικά με ένα χάρακα δαγκάνα κάθε 2 ημέρες, και ο όγκος του όγκου (mm

3) εκτιμήθηκε. Μετά από 7 ημέρες, όταν οι όγκοι έφθασαν ένα μέσο μέγεθος περίπου 20-25 mm

3, τα ποντίκια απεικονίζεται στο σύστημα IVIS απεικόνισης (δαγκάνα Life Sciences, Hopkinton, MA, USA) 10 λεπτά μετά την ε.π. ένεση 100 μL XenoLight D-λουσιφερίνη (30 mg /mL, δαγκάνας). Τα ζώα στη συνέχεια διαιρέθηκαν τυχαία σε δύο ομάδες (η = 8 /ομάδα) και δέχονται ενδοπεριτοναϊκή (ε.π.) ενέσεις είτε οχήματος είτε scoparone (30 mg /kg) κάθε 2-3 ημέρες για 18 ημέρες. Οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν με πεντοβαρβιτάλη νατρίου (Entobar? HANLIM Pharmaceutical, Yong-In, Κορέα) και απεικονίζεται στο σύστημα απεικόνισης IVIS. Ξενομοσχεύματος όγκοι αποκόπηκαν για τη μέτρηση του όγκου και ανοσοϊστοχημεία. Για ανοσοϊστοχημική ανάλυση, οι ιστοί του όγκου αφαιρέθηκαν, μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη και εγκλεισμένα σε παραφίνη. Διαδοχικές τομές όγκου 4-μm αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο, επανυδατώθηκαν μέσω φθίνουσα ποιότητες αιθανόλης και είτε βάφτηκαν με αιματοξυλίνη και εοσίνη (Η &? Ε) ή υποβλήθηκαν σε ανοσοϊστοχημική ανάλυση χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι pSTAT3 (Y705) και Survivin όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29] .

η στατιστική ανάλυση

τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι όροι ± SEM Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με το αταίριαστο του Student

t-test

, και η τιμή του

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

Scoparone προκαλεί μία αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση στην DU145 τα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του προστάτη με επαγωγή διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη G

1 φάση

για την αξιολόγηση του δυναμικού αντικαρκινική scoparone επί κυττάρων καρκίνου του προστάτη

in vitro

, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία πολλαπλασιασμού WST-8 κυττάρων σε δύο ανεξάρτητες από ανδρογόνο κυτταρικές γραμμές ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη (DU145 και PC-3) και μια αθανατοποιημένη κυτταρική σειρά επιθηλιακών κυττάρων ανθρώπινου προστάτη (RWPE-1). θεραπεία Scoparone για 72 ώρες ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων DU145, με IC

50 τιμή του 41,3 μmol /L. Ωστόσο, το φάρμακο που ασκείται μικρή ανάπτυξη-ανασταλτική επίδραση επί PC-3 και τα κύτταρα RWPE-3 σε αυτή τη συγκέντρωση (Σχήμα 1Α). Παρ ‘όλα αυτά, και οι δύο κυτταρικές σειρές παρουσίασαν μειωμένη πολλαπλασιασμό σε υψηλότερες συγκεντρώσεις του φαρμάκου (& gt? 100 μmol /L), η οποία παρατηρήθηκε επίσης για διάφορες άλλες κυτταρικές σειρές που προέρχονται από καρκίνους του μαστού (MCF-7 και MDA-MB-231), ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HepG2 και Hep3B), του τραχήλου της μήτρας (HeLa), και καρκίνους του παχέος εντέρου (HCT-15 HCT-116 και ΗΤ-29) (Σχήμα 1Α και το Σχήμα S1), γεγονός που υποδηλώνει ότι scoparone έχει μια γενική αντι-πολλαπλασιαστική δράση επί των καρκινικών κυττάρων.

Α και Β Scoparone αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών. Ο καρκίνος του προστάτη κύτταρα (DU145 και PC-3), RWPE-1 (ένα αθανατοποιημένο ανθρώπινου προστάτη επιθηλιακή κυτταρική γραμμή), και κύτταρα καρκίνου του μαστού (MCF-7 και MDA-MB-231) στερήθηκαν τον ορό για 24 ώρες. Τα κύτταρα μετά επωάστηκαν σε μέσο ανάπτυξης συμπληρωμένο με 10% FBS με την παρουσία του οχήματος (0,1% DMSO) ή τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις scoparone για 72 ώρες, και ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με WST-8 δοκιμασίας. Τα δεδομένα εκφράζονται ως ποσοστά του ελέγχου οχήματος (που ορίζεται ως 100%) και αντιπροσωπεύουν το μέσο ± S.E.M. από τρία ανεξάρτητα πειράματα, κάθε πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Β Scoparone προκαλεί διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε G

1 φάση στα κύτταρα DU145. Στερούνται ορού κύτταρα DU145 διεγέρθηκαν με 10% FBS με την παρουσία του οχήματος ή scoparone (0,5 και 1 mmol /L) για 28 h, και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του κυτταρικού κύκλου. γράφημα Bar δείχνει το ποσοστό των κυττάρων σε G

1 φάση. Τα δεδομένα είναι τα μέσα ± S.E.M. από τρία ανεξάρτητα πειράματα, κάθε εκτελέστηκαν εις διπλούν.

*

P

& lt? 0,001 έναντι του ελέγχου οχήματος?

#

P

& lt? 0.005,

##

P

& lt? 0.001 vs. διέγερση ορού. Γ Αντιπροσωπευτικά Western Blot ανάλυση των πρωτεϊνών που σχετίζονται με τον κύκλο του κυττάρου. κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με scoparone (0,5 mmol /L) για τους υποδεικνυόμενους χρόνους, και στη συνέχεια συλλέγονται για ανάλυση στυπώματος Western. D. Η ποσοτικοποίηση των σχετικών επιπέδων πρωτεΐνης. εντάσεις σήματος ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρική ανάλυση και ομαλοποιήθηκε με εκείνη του αντίστοιχου σήματος β-ακτίνης. Το επίπεδο έκφρασης του κάθε πρωτεΐνη εκφράστηκε ως αναλογία σε σχέση με το επίπεδο στον έλεγχο σε χρόνο 0 h, η οποία ορίστηκε ως 1. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο ± S.E.M από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

*

P

& lt? 0.05,

#

P

& lt? 0,005 έναντι του ελέγχου του οχήματος σε κάθε χρονικό σημείο.

Η

Για να καθοριστεί περαιτέρω εάν η αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση των scoparone οφείλεται στην αναστολή της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου ή την επαγωγή της απόπτωσης, θα πραγματοποιηθεί μια κυτταρομετρίας ροής ανάλυση του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα DU14, τα οποία ήταν η πλέον ευαίσθητη στην αύξηση-ανασταλτική δράση της scoparone. Συνεπής με μια προηγούμενη αναφορά [32], το ποσοστό των κυττάρων DU145 προχωρούν στη φάση S του κυτταρικού κύκλου ήταν σημαντικά αυξημένη μετά από 28 ώρες διέγερσης ορού. Με την παρουσία του scoparone, η αύξηση του ορού που διεγείρεται στον πληθυσμό των κυττάρων φάσης S ήταν μειωμένη, και ο αριθμός των κυττάρων σε G

1 φάση ταυτόχρονα αυξημένη (Σχήμα 1Β). Ωστόσο, η υπο G

1 κορυφή, ενδεικτικά ενός αποπτωτικό κυτταρικό πληθυσμό δεν αυξήθηκε από scoparone. Έτσι, σε κύτταρα DU145, scoparone επάγει διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε G

1 φάση χωρίς επαγωγή απόπτωσης.

Η G

1-φάσης διακοπή του κυτταρικού κύκλου που προκαλείται από scoparone επιβεβαιώθηκε περαιτέρω από την εξέταση των κυτταρικών επιπέδων των ρυθμιστικών πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου που προάγουν την G

1-S μετάβασης. Οι αναλύσεις στυπώματος Western αποκάλυψε ότι scoparone αύξησε τα επίπεδα του ανασταλτικών πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου, όπως ρ21 και ρ27, οι οποίες είναι αναστολείς του κυκλίνης /ΟϋΚ σύμπλοκο (Σχήμα 1 C και D). Αντιθέτως, μείωσε σημαντικά τα επίπεδα του κυτταρικού κύκλου προώθηση πρωτεΐνες κυκλίνης D

1 και φωσφορυλιωμένα pRb (ppRb), αν και είχε μικρή επίδραση στην έκφραση της κυκλίνης Ε Αυτά τα ευρήματα καταδεικνύουν ότι scoparone επάγει G

1-φάση διακοπή του κυτταρικού κύκλου, διαφοροποιώντας τα επίπεδα των πρωτεϊνών που επηρεάζουν την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου.

Scoparone αναστέλλει τη συστατική και IL-6 που διεγείρεται μεταγραφική δραστικότητα του STAT3

Για να προσδιοριστούν οι παράγοντες μεταγραφής που στοχεύονται από scoparone, αξιολογήσαμε την επίδρασή της στην μεταγραφική δραστηριότητα αρκετών παραγόντων μεταγραφής που παίζουν σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Είναι ενδιαφέρον, scoparone κατέστειλε έντονα IL-6 που διεγείρεται STAT3 μεταγραφική δραστικότητα (Σχήμα 2Α) και, όπως αναφέρθηκε, καταπιεσμένη ΤΝΡ-α που διεγείρεται δραστικότητα μεταγραφικής ΝΡ-κΒ. Scoparone επίσης ελαφρώς ανέστειλε ΡΜΑ-επαγόμενη δραστικότητα ΑΡ-1 και δραστικότητα Egr-1, ενώ ασκείται μικρή επίδραση στις δύο CREB- ή β-κατενίνης εξαρτώμενη μεταγραφή (Σχήμα S2).

Α. Η επίδραση της scoparone στις δραστηριότητες των μεταγραφικών παραγόντων. κύτταρα HepG2 συνδιαμολύνθηκαν παροδικά με διάφορες λουσιφεράσης πλασμίδια ανταποκριτές οδηγείται από συνθετικοί υποκινητές που περιέχει θέσεις δέσμευσης για τους σχετικούς παράγοντες μεταγραφής. Στις 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τα κατάλληλα ανάντη διεγέρτες και scoparone για 24 ώρες, και στη συνέχεια συλλέχθηκαν για προσδιορισμούς λουσιφεράσης και β-γαλακτοσιδάσης. RLU, σχετικές μονάδες φωταύγειας. Τα δεδομένα είναι τα μέσα ± S.E.M. από τρία ανεξάρτητα πειράματα, κάθε εκτελέστηκαν εις διπλούν.

*

P

& lt? 0,0005,

#

P

& lt? 0.005 έναντι μόνο δημοσιογράφος?

**

P

& lt? 0.005,

***

P

& lt? 0.001,

##

P

& lt? 0,01 έναντι διέγερση. B. Scoparone αναστέλλει τόσο τη συστατική και IL-6 που διεγείρεται μεταγραφική δραστικότητα του STAT3. κύτταρα DU145 επιμολύνθηκαν παροδικά με M67-Luc, ένα συνθετικό προαγωγό που περιέχει τέσσερα αντίγραφα της θέσης δέσμευσης STAT3. PC-3 κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με M67-Luc κατασκευή και ο φορέας έκφρασης για άγριου τύπου STAT3. Στις 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με IL-6 με την παρουσία scoparone για 24 ώρες. Τα δεδομένα είναι τα μέσα ± S.E.M. από τρία ανεξάρτητα πειράματα, κάθε εκτελέστηκαν εις διπλούν.

*

P

& lt? 0.005,

#

P

& lt? 0.05,

##

P

& lt? 0,01 έναντι μόνο δημοσιογράφος?

**

P

& lt? 0.01,

***

P

& lt? 0.005 vs. IL-6 διέγερση. Γ και Δ qRT-PCR και Western blot αναλύσεις STAT3 γονιδίων κατάντη στόχου. κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με scoparone (0,5 mmol /L) για τους υποδεικνυόμενους χρόνους, και στη συνέχεια συλλέχθηκαν για qRT-PCR (C) και στύπωμα Western (D) αναλύσεις. επίπεδα του mRNA των γονιδίων στόχων STAT3 προσδιορίστηκαν με ανάλυση qRT-PCR (C) και κανονικοποιημένο έναντι του επιπέδου της RPLP0 /36Β4. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± S.E.M. από τρία ανεξάρτητα πειράματα, κάθε πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

*

P

& lt? 0.05,

#

P

& lt? ελέγχου του οχήματος 0.005 vs. σε κάθε χρονικό σημείο. επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης (Δ) ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρική ανάλυση και ομαλοποιήθηκε έναντι των αντίστοιχων επιπέδων του β-ακτίνης. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± S.E.M. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

*

P

& lt? 0.05,

#

P

& lt? 0,005 έναντι του ελέγχου οχήματος σε κάθε χρονικό σημείο.

Η

Για να επικυρωθεί το ανασταλτικό αποτέλεσμα scoparone στην μεταγραφική δραστικότητα STAT3, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς παροδικής διαμόλυνσης χρησιμοποιώντας κύτταρα DU145 εκφράζουν ουσιαστικά δραστική STAT3 και PC-3 κύτταρα λείπει STAT3 [35]. Scoparone αναστέλλει σημαντικά συστατική και IL-6-ενισχυμένη μεταγραφική δραστικότητα των STAT3 σε κύτταρα DU145 (Σχήμα 2Β, αριστερά). Σε κύτταρα PC-3 STAT3-αρνητικό, όπως αναμενόταν, η βασική δράση της λουσιφεράσης ήταν εξαιρετικά χαμηλό? Επιπλέον, η IL-6 θεραπεία δεν αυξάνει δραστικότητα γονιδίου αναφοράς, η οποία δεν επηρεάστηκε από scoparone (Σχήμα 2Β, δεξιά). Ωστόσο, η υπερέκφραση του άγριου τύπου STAT3 οδήγησε σε αύξηση της δραστικότητας λουσιφεράσης σε απόκριση στην IL-6 διέγερση του PC-3 κύτταρα. θεραπεία Scoparone μείωσε σημαντικά την IL-6 που διεγείρεται δραστικότητα STAT3. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι scoparone αναστέλλει τόσο τη συστατική και IL-6 που διεγείρεται μεταγραφική δραστικότητα του STAT3.

Για να διερευνηθεί περαιτέρω η scoparone μπορεί να καταστείλει τη μεταγραφή του STAT3 κατάντη στόχους, πραγματοποιήσαμε ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qRT-PCR) αναλύσεις για τα γονίδια-στόχους STAT3 όπως κυκλίνης D

1, c-myc, Σουρβιβίνη, Bcl-2, και Socs3. αναλύσεις qRT-PCR έδειξε ότι scoparone μείωσε τα επίπεδα έκφρασης του mRNA των γονιδίων στόχων STAT3 (Σχήμα 2C). Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα qRT-PCR, είναι επίσης μειωθεί σημαντικά τα επίπεδα πρωτεΐνης αυτών των γονιδίων (Σχήμα 2D). Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι scoparone καταστέλλει του γονιδίου-στόχου STAT3 μεταγραφή.

Scoparone αναστέλλει τη φωσφορυλίωση και την πυρηνική συσσώρευση STAT3 ανεξάρτητα από JAK2 και Src

Για να οριοθετηθούν των μοριακών μηχανισμών που διέπουν την αναστολή της δραστηριότητας STAT3 από scoparone, αξιολογήσαμε επίδρασή του στην φωσφορυλίωση STAT3 στα κύτταρα DU145. Scoparone μείωσε σημαντικά τα επίπεδα της φωσφορυλίωσης STAT3 στο Tyr705 (pSTAT3 Y705) και Ser727 (pSTAT3 S727) σε κύτταρα DU145 2 ώρες και 30 λεπτά μετά την αγωγή, αντιστοίχως (Σχήμα 3Α). Μειώθηκε επίσης IL-6-ενισχυμένη φωσφορυλίωση του STAT3 (σχήμα 3Β). Τα συνολικά επίπεδα πρωτεΐνης STAT3 δεν επηρεάστηκαν από αγωγή scoparone (Σχήμα 3Α και Β, και το Σχήμα S3). Σε συμφωνία με αυτά τα ευρήματα, χρώση ανοσοφθορισμού των pSTAT3 Y705 έδειξε ότι pSTAT3 πρωτεΐνες κυρίως εντοπισμένες στον πυρήνα των κυττάρων DU145 (Σχήμα 3C). Το σήμα πυρηνικής pSTAT3 ήταν σημαντικά μειωμένη σε κύτταρα scoparone φάρμακο. Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι scoparone αναστέλλει τη συστατική και IL-6 που διεγείρεται από τη φωσφορυλίωση και πυρηνική συσσώρευση pSTAT3 σε κύτταρα DU145.

Α και Β Scoparone αναστέλλει τόσο συστατική (Α) και IL-6-ενισχυμένη (Β) φωσφορυλίωση της STAT3 σε Tyr705 και Ser727. κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα ή scoparone (Α), ή τον ορό επί 24 ώρες ακολουθούμενη από επεξεργασία scoparone (0,5 mmol /L) για 4 ώρες πριν από τη διέγερση με IL-6 (Β) για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν για κηλίδωση Western με τη χρήση αντισωμάτων έναντι pSTAT3 (Y705), pSTAT3 (S727), και STAT3. Τα επίπεδα πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρία και κανονικοποιήθηκε έναντι των αντίστοιχων επιπέδων του β-ακτίνης. Το επίπεδο έκφρασης του κάθε ISS πρωτεΐνης που εκφράζεται ως μια αναλογία σε σχέση με το επίπεδο στον έλεγχο σε χρόνο 0 h (ορίζεται ως 1). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο ± S.E.M από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

§

P

& lt? 0,0005 και

§§

P

& lt? 0,005 έναντι του ελέγχου σε χρόνο 0?

*

P

& lt? 0,0005,

**

P

& lt? 0.005,

#

P

& lt? 0.01

##

P

& lt? ελέγχου του οχήματος 0,05 vs. σε κάθε χρονικό σημείο. Γ Scoparone μειώνει την πυρηνική συσσώρευση φωσφορυλιωμένη STAT3. κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με scoparone για 4 ώρες και υποβάλλονται σε επεξεργασία για χρώση ανοσοφθορισμού με αντισώματα έναντι pSTAT3 (Y705) ή STAT3. πυρήνες κυττάρων χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ, και ελήφθησαν συνεστιακή εικόνες και συγχωνεύονται. μπαρ κλίμακας δείχνει 10 μm. Δ Scoparone δεν αναστέλλει τη φωσφορυλίωση των JAK2 και Src, δύο μεγάλες STAT3 ανάντη κινάσες. κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με scoparone για τους υποδεικνυόμενους χρόνους, και στη συνέχεια συλλέγονται για ανάλυση στυπώματος Western. εντάσεις σήματος ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρική ανάλυση και κανονικοποιημένο έναντι του αντίστοιχου σήματα β-ακτίνης. επίπεδο έκφρασης του κάθε πρωτεΐνη εκφράζεται ως αναλογία σε σχέση με το επίπεδο του ελέγχου σε χρόνο 0 h, η οποία ορίστηκε ως 1.

*

P

& lt? 0,05 έναντι του ελέγχου του οχήματος σε κάθε χρονικό σημείο.

Η

Για να καθοριστεί αν η ανασταλτική δράση των scoparone στην φωσφορυλίωση STAT3 οφείλεται στην καταστολή των ανάντη γεγονότα σηματοδότησης, εκτιμήσαμε την επίδραση της scoparone επί της φωσφορυλίωσης της JAK2 και Src, δύο μεγάλες ανάντη κινάσες υπεύθυνη για την ενεργοποίηση STAT3. Scoparone δεν μείωσε τα επίπεδα πρωτεΐνης του ιδιοσυστατικά φωσφορυλιωμένη JAK2 (Σχήμα 3D) και φωσφορυλίωση της Src δεν μειώθηκε, αλλά μάλλον ελαφρώς αυξημένα, με scoparone. Τα συνολικά επίπεδα πρωτεΐνης και mRNA για JAK2 και Src δεν μεταβλήθηκαν με επεξεργασία scoparone (Σχήμα 3D και σχήμα S4). Συλλογικά, οι παρατηρήσεις αυτές υποδηλώνουν ότι scoparone αναστέλλει φωσφορυλίωση και πυρηνική συσσώρευση του STAT3 ανεξάρτητα από τα ανάντη κινάσες JAK2 ή Src.

Scoparone μπορεί να αναστέλλει τη μεταγραφική δραστηριότητα της STAT3 με απευθείας σύνδεση με τον τομέα SH2 της STAT3

Για την περαιτέρω επιβεβαίωση αν scoparone θα μπορούσε να ρυθμίζουν τη δραστηριότητα STAT3 ανεξάρτητα από ανάντη σηματοδότησης, τα κύτταρα PC-3 ήταν παροδικά επιμολυσμένα με STAT3C, μία ουσιαστικά δραστική μετάλλαξη του STAT3 που μιμείται τη δράση των φωσφορυλιωμένων STAT3 με υποκατάσταση δύο υπολειμμάτων κυστεΐνης εντός του τομέα του SH2 και ενεργοποιεί τη μεταγραφή του γονιδίου-στόχου, χωρίς ανάντη ερεθίσματα [20].