Αφηρημένο

προηγούμενες εργασίες μας εντοπιστεί μια ενδιάμεση θέση δέσμευσης για ταξάνες στην νανοπόρων μικροσωληνίσκων. Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να δοκιμαστεί παράγωγα του paclitaxel έχουν σχεδιαστεί να δεσμεύονται σε αυτό το ενδιάμεσο χώρο διαφορικά ανάλογα με τον ισότυπο του β-τουμπουλίνης. Από β-τουμπουλίνης ισοτύπων έχουν ιστο-εξαρτώμενη έκφραση-ειδικά, ο ισότυπος βIII είναι πολύ άφθονα σε επιθετικούς όγκους και πολύ λιγότερο συχνές σε φυσιολογικούς ιστούς-αυτό αναμένεται να οδηγήσει σε τουμπουλίνη στοχευμένες φάρμακα τα οποία είναι περισσότερο αποτελεσματικά και έχουν λιγότερες παρενέργειες. Επτά παράγωγα του paclitaxel έχουν σχεδιαστεί και τέσσερα από αυτά ήταν επιδεκτικά για σύνθεση σε επαρκή καθαρότητα και απόδοση για περαιτέρω δοκιμές στο μοντέλο κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού. Κανένα από τα παράγωγα που μελετήθηκαν ήταν ανώτερη χρησιμοποιούνται σήμερα ταξάνες, ωστόσο προσομοιώσεις σε υπολογιστή παρέχεται γνώσεις σχετικά με τη δραστηριότητα των παραγώγων. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ούτε σύνδεση με τον ενδιάμεσο χώρο πρόσδεσης ούτε η τελική θέση δέσμευσης είναι αρκετή για να εξηγήσει τις δραστηριότητες των παραγώγων ταξάνες που μελετήθηκαν. Τα ευρήματα αυτά υπογραμμίζουν την ανάγκη να βελτιωθεί η επαναληπτικά για το σχεδιασμό του ταξάνες με βάση τη δραστηριότητα τους σε συστήματα μοντέλο. Γνώση που αποκτήθηκε από την ικανότητα των τεχνητών φαρμάκων να συνδέεται με τους στόχους και να επιφέρει δραστηριότητα με προβλέψιμο τρόπο, είναι ένα βήμα προς την εξατομίκευση των θεραπειών

Παράθεση:. Αγίου Γεωργίου Μ, Ayoub AT, Banerjee Α, Churchill CDM, Χειμώνας P, Klobukowski M, et al. (2015) Σχεδιασμός και δοκιμή νέων ταξάνες για να εξετάσει τις εξαιρετικά πολύπλοκες μηχανισμούς με τους οποίους ταξάνες προσκολληθούν σε μικροσωληνίσκους και να προκαλέσει κυτταροτοξικότητα στα καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 10 (6): e0129168. doi: 10.1371 /journal.pone.0129168

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Shian-Ying Σουνγκ, Ταϊπέι Ιατρικό Πανεπιστήμιο, Ταϊβάν

Ελήφθη: 4 Φεβ του 2015? Αποδεκτές: 5 Μάη 2015? Δημοσιεύθηκε: 8 του Ιούν 2015

Copyright: © 2015 St. George et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. Χρηματοδοτείται από την καναδική μαστού επιχορήγηση του Ιδρύματος Καρκίνου απονέμεται σε JAT, αριθμός: RES0010014. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Οι ταξάνες, συμπεριλαμβανομένων paclitaxel και docetaxel, τουμπουλίνης, την πρωτεϊνική υπομονάδα των μικροσωληνίσκων στόχευση, και δεσμεύονται σε ένα καλά χαρακτηρισμένο θέση στο β-τουμπουλίνης [1]. Οι μηχανισμοί πρόσδεσης και δράσης, ωστόσο, είναι εξαιρετικά πολύπλοκες. Σε αντίθεση με άλλα αντι-τουμπουλίνης φάρμακα, οι ταξάνες στοχεύουν ειδικά την άθικτη μικροσωληνίσκων και θέση δέσμευσης τους είναι προς το μικροσωληνίσκων αυλό [2]. Προηγούμενη εργασία από Freedman et al. [2] χαρτογραφηθεί τα nanopores κατά μήκος της επιφάνειας των μικροσωληνίσκων μέσω της οποίας ταξάνες πρέπει να περάσει προκειμένου να φτάσει στην θέση πρόσδεσης. Μία ειδική θέση στον νανοπόρων ταυτοποιήθηκε ως ένα ενδιάμεσο θέση σύνδεσης ταξανίου. Ένα δεύτερο θέμα είναι ότι υπάρχουν πολλαπλές ισότυποι β-τουμπουλίνης και ότι αυτές διαφέρουν τόσο στη συγγένειά τους για ταξάνες και υποκυτταρικών ρόλους και τις θέσεις τους [3]. Η πακλιταξέλη φαίνεται να ασκεί μεγαλύτερη επίδραση της επί του ισοτόπου βΙΙ [4], η οποία είναι επίσης η κύρια β-τουμπουλίνης ισοτύπου σε νευρώνες [3], πιθανώς αντιπροσωπεύοντας τη νευροπάθεια που σχετίζεται με ταξάνες. Ο ισότυπος βIII, η οποία είναι πολύ άφθονα σε επιθετικούς όγκους και πολύ λιγότερο συχνές σε φυσιολογικούς ιστούς, φαίνεται να είναι μια καλή εναλλακτική λύση στόχος [5,6]. Στόχος μας ήταν να σχεδιάσουν ορθολογικά και παράγωγα δοκιμή νέων ταξάνης που θα συνδέονται προς το ενδιάμεσο θέση σύνδεσης με διαφορική συγγένεια, ανάλογα με το β-τουμπουλίνης ισότυπο που εκφράζεται σε κύτταρα.

Οι ταξάνες είναι μεταξύ των πλέον δραστικών κατά του όγκου παραγόντων στη θεραπεία των διαφόρων τύπων καρκίνου, ιδίως του μαστού, των ωοθηκών και του καρκίνου του πνεύμονα [7,8]. Αντοχή σε ταξάνες είναι ένα πρόβλημα για την επιτυχή χημειοθεραπεία και μπορούν ενδεχομένως να προκύψουν από τουλάχιστον τρεις διακριτούς μηχανισμούς. Πρώτον, υπάρχει το κλασικό μηχανισμό που προκύπτουν από την δράση του Ρ-γλυκοπρωτεΐνης (P-gp, που κωδικοποιείται από το

MDR1

γονίδιο), η οποία αντλεί ουσιαστικά ναρκωτικά έξω από τα καρκινικά κύτταρα [9]. Δομικά διαφορετικές ταξάνες θα μπορούσαν, κατ ‘αρχήν, έχουν διαφορετικές ευαισθησίες στη δράση της P-gp. Δεύτερον, β-τουμπουλίνης, ο στόχος ταξανίων, υπάρχει ως πολυάριθμες ισοτύπων διαφέρουν σε αλληλουχία αμινοξέων και κωδικοποιούνται από διαφορετικά γονίδια [3]. Ένα από τα ταξάνες, πακλιταξέλη, έχει ισχυρότερο επιδράσεις του στην ισότυπο βΙΙ [4]. Από βΙΙ υπερεκφράζεται σε πολλούς όγκους [10] αυτό δεν αποτελεί έκπληξη, ωστόσο, βΙΙ είναι επίσης μια σημαντική συνιστώσα του νευρικού συστήματος [5], η οποία μπορεί να ευθύνεται για την νευροτοξικότητα των ταξάνες. Ο ισότυπος βIII θα είναι μια καλύτερη στόχο, δεδομένου ότι εμφανίζεται σε μεγάλο βαθμό σε νευρώνες αλλά σε πολύ χαμηλότερα επίπεδα από ό, τι βΙΙ, ενώ η έκφραση του είναι πολύ κοινό στην επιθετική και μεταστατικούς καρκίνους [6]. Τρίτον, η σύνδεση του ταξανίων να μικροσωληνίσκων είναι πολύ περίπλοκη, και το φάρμακο πρέπει να διασχίσει από το εξωτερικό περιβάλλον στη θέση σύνδεσης στον αυλό (εσωτερικό) της μικροσωληνίσκων [11] για να επιφέρει την καταλυτική αλληλουχία γεγονότων που οδηγούν σε πολυμερισμό ή αποπολυμερισμού. Αυτό σημαίνει ότι η ταξάνη έχει πρώτα να δεσμεύεται σε ένα ενδιάμεσο χώρο επί της επιφανείας του μικροσωληναρίου και, στη συνέχεια, κάνει το δρόμο του μέσα. Αυτό το ενδιάμεσο χώρο διαφέρει επίσης μεταξύ των ισοτύπων. Τα φάρμακα που περιγράφονται εδώ έχουν σχεδιαστεί και δοκιμαστεί τόσο

in vitro

και

in silico

σε μια προσπάθεια να αντιμετωπίσει και τα τρία από τα παραπάνω θέματα.

Οι χημικές δομές του paclitaxel και docetaxel δείχνονται στο Σχήμα 1. Η δεύτερη γενιά ημι-συνθετικό ναρκωτικό docetaxel διαφέρει σε δύο θέσεις από paclitaxel. Η υποκατάσταση του οξικού εστέρα στη θέση C-10 με μία ομάδα υδροξυλίου καθιστά docetaxel περισσότερα υδατοδιαλυτά και βιοδιαθέσιμο από την πακλιταξέλη [12,13], και ως docetaxel αποτέλεσμα είναι η ευνοείται των δύο ενώσεων για χρήση σε κλινικές εφαρμογές. Πολλά φάρμακα τρίτης γενιάς που αναπτύσσονται για να βελτιώσει τα γονικών ενώσεων, με τους στόχους της βελτίωσης της διαλυτότητας στο νερό, η διαπερατότητα του όγκου, και κυτταρικής κατακράτησης, καταλήγοντας έτσι σε καλύτερα αποτελέσματα και μεγαλύτερους χρόνους επιβίωσης για τους ασθενείς [14].

Οι ταξάνες στοχεύουν ειδικά τη β-τουμπουλίνης υπομονάδα του α /β-τουμπουλίνης ετεροδιμερές [15,16]. Η τοποθεσία της θέσης σύνδεσης βρίσκεται επί του αυλού της κοίλης δομής των μικροσωληνίσκων. Δεδομένου ότι οι μικροσωληνίσκοι που αποτελείται από επαναλαμβανόμενες σφαιρικές πρωτεΐνες, οι ενδιάμεσοι χώροι (nanopores) που βρίσκονται κατά μήκος του μήκους του μικροσωληνίσκων μεταξύ γειτονικών [2] πρωτονηματίων. Είναι μέσω αυτών των nanopores που έχουν ταξάνες έχουν αποδειχθεί για να μετακινήσετε και να αποκτήσουν πρόσβαση στην ιστοσελίδα δεσμευτική για τον αυλό [11,17]. Μόλις συνδεθεί με την τελική θέση σύνδεσης λαμβάνει χώρα μια διαμορφωτική αλλαγή, όπου ένα μοτίβο της β-τουμπουλίνης γνωστό ως M-βρόχος σταθεροποιείται, αποτρέποντας την αποσυναρμολόγηση των μικροσωληναρίων [16]. Ταξάνια δεσμεύονται σε μια αναλογία 1: 1 με ετεροδιμερή κατά μήκος της μικροσωληνίσκων [18]. Παρά το γεγονός ότι οι ταξάνες μπορούν δυνητικά να δεσμεύεται σε κάθε ετεροδιμερές σε μια δομή μικροσωληνίσκων, μόνο ένα ταξάνιο μόριο απαιτείται για τη σταθεροποίηση εκατοντάδες τουμπουλίνης [18,19].

Τόσο α-τουμπουλίνης και β-τουμπουλίνης βρίσκονται σε πολλαπλές ισότυποι που εκφράζονται από διαφορετικά γονίδια [20]. Υπάρχουν τουλάχιστον οκτώ ανθρώπινης β-τουμπουλίνης ισότυπους, και η έκφραση αυτών των ισοτύπων έχει παρατηρηθεί να διαφέρουν σε φυσιολογικούς ιστούς και δείγματα όγκου [21]. Class έχει παρατηρηθεί III β-τουμπουλίνης (βIII) ειδικότερα ότι υπερεκφράζεται σε πολλές μορφές καρκίνου, ιδιαίτερα ανθεκτικά σε φάρμακο του καρκίνου [6], ενώ βΙ εκφράζεται συστατικά, και βΙΙ εκφράζεται έντονα στον εγκεφαλικό ιστό [21]. Με βάση την εξέταση της δομής των μικροσωληνίσκων, το ενδιάμεσο θέση σύνδεσης στο νανοπόρων, και οι παραλλαγές αλληλουχίας μεταξύ β-τουμπουλίνης ισοτύπων, υποθέσαμε ότι ταξάνες κατασκευαστεί για να αλληλεπιδράσει διαφορικά με τουμπουλίνες θα ασκήσει βιολογικές δραστηριότητες επηρεάζονται από στερεοχημικούς παράγοντες ή /και συγγένειες του μηχανικής τμήματα σε θέσεις δέσμευσης, σχετική αφθονία των ισομορφών τουμπουλίνης, εμποδίων που επιβάλλονται από διπλοστιβάδες λιπιδίων (σχετική διαλυτότητα) και ελεύθερες ενέργειες της σύνδεσης ή αποσύνδεσης [2]. Οι ειδικοί στόχοι που εξετάζονται στην παρούσα μελέτη είναι:

Για να διερευνήσουν το δεσμό υδρογόνου μεταξύ του C-7 υδροξύλιο ταξάνες με Ser275 στο

α

Ι και

β

ΙΙ, σε σχέση με τις αλληλεπιδράσεις τους με ο νανοπόρων, και η προκύπτουσα διάχυση ταξανίων στη θέση σύνδεσης.

για να διερευνηθεί η δέσμευση υδρογόνου μεταξύ διατηρημένων Ser278 σε ισότυποι τουμπουλίνης (

β

I,

β

II και

β

III) με ποικίλες πλευρικές αλυσίδες μηχανικής στο C-10 ταξανίων, σε σχέση αλληλεπιδράσεις τους με το νανοπόρων και το προκύπτον διάχυση ταξανίων στη θέση σύνδεσης.

η

Η βασική παραδοχή για τον πρώτο στόχο βασίζεται στην υπολογιστική μοντελοποίηση, η οποία διαπίστωσε ότι σε βIII τουμπουλίνης, η οποία έχει αλανίνη αντί της σερίνης στη θέση 275, δεν είναι σε θέση να σχηματίσει έναν δεσμό υδρογόνου με το υδροξύλιο C-7 σε πακλιταξέλη, η οποία με τη σειρά της αποδυναμώνει την αλληλεπίδραση της πακλιταξέλης με την νανοπόρων, αναστέλλει τη διάχυση του paclitaxel στο ενδιάμεσο θέση σύνδεσης, και οδηγεί σε μια αποτελεσματική απώλεια δραστικότητας paclitaxel σε μικροσωληνίσκους που περιέχουν βIII τουμπουλίνης [2].

Η δοκιμή του πρώτου στόχου απαιτεί τη σύνθεση παραγώγων πακλιταξέλης με το C-7 υδροξύλιο αντικαθίσταται από ένα μη-πολική λειτουργική ομάδα (Τχ-Α και Tx-Β, Σχήμα 1) ή φθόριο (Τχ-C, Σχήμα 1). Περιμέναμε να δούμε μειωμένη προώθηση των πολυμερισμού με πακλιταξέλη για μικροσωληνίσκους αποτελείται από το ισοτόπου βIII. Όταν είτε Tx-Α ή Tx-Β δοκιμάζεται όμως, περιμένουμε να δούμε ότι η προώθηση του πολυμερισμού επηρεάζεται λιγότερο από την β-τουμπουλίνης ισοτόπου? Με άλλα λόγια, τα αποτελέσματα του Tx-Α ή Tx-B θα πρέπει να είναι αναίσθητος (ή τουλάχιστον λιγότερο ευαίσθητες) προς την β-τουμπουλίνης ισότυπου. Τχ-C θα πρέπει να έχει ένα ενδιάμεσο δραστηριότητα, λόγω της χαμηλότερης ενέργειας που συνδέεται με δεσμούς υδρογόνου προς το άτομο του φθορίου (3 kcal /mol σε σύγκριση με 5 kcal /mol). Ήμασταν σε θέση να συνθέσουν ενώσεις Tx-Α και Tx-C, και αυτές ελέγχθηκαν με το

vitro

δοκιμασίες πολυμερισμού ή με τα μοντέλα κυτταρική σειρά για την κυτταροτοξική δράση.

Η προϋπόθεση για το δεύτερο στόχος είναι ότι ένα χάσμα μεταξύ 4 και 9 A πρέπει να βαθμονομείται για την πρόσβαση Ser278, και ως εκ τούτου, ένα τμήμα της πλευρικής αλυσίδας θα μπορούσε να συμβάλει στη γεφύρωση αυτού του χάσματος. δεσμών υδρογόνου μεταξύ πακλιταξέλης και Ser278 προβλέπεται να προκαλέσει την σταθεροποίηση της αλληλεπίδρασης ταξανίου στο νανοπόρων, με αποτέλεσμα την ταχύτερη μετακίνηση του φαρμάκου στη θέση σύνδεσης στο εσωτερικό του μικροσωληνίσκων, ενισχυμένη πολυμερισμού μικροσωληνίσκων και αυξημένη κυτταροτοξικότητα. Η δοκιμή του δεύτερου στόχου απαιτεί τη σύνθεση αρκετές τροποποιήσεις στη θέση C-10 του paclitaxel. Σχεδιάσαμε ταξάνες που έχουν διαφορετικά μήκη αλυσίδας στην θέση C-10 χρησιμοποιώντας είτε ένα γουανιδινίου (ενώσεις Τχ-Ε και Tx-G, Σχήμα 1) ή ένα καρβοξυλικό άλας (ενώσεις Τχ-D και Tx-F, σχήμα 1) λειτουργική ομάδα. Αυτές οι ενώσεις αναμένεται να είναι περισσότερο δραστικό από πακλιταξέλη. Ήμασταν σε θέση να συνθέσουν τις ενώσεις Tx-D και Tx-F και αυτές ελέγχθηκαν με το

in vitro

δοκιμασίες πολυμερισμού ή με μοντέλα κυτταρική σειρά για την κυτταροτοξική δράση.

Υλικά και Μέθοδοι

Χημική Σύνθεση

αρχικά αγοράστηκε ενώσεις Tx-Α, Tx-C, Tx-D και Tx-F (μεταξύ το

in silico

σχεδιαστεί ενώσεις Tx-Α μέσω Tx-G ? Σχήμα 1) λόγω της σχετικής ευκολίας της σύνθεσης σε επαρκή απόδοση και καθαρότητα σε σχέση προς τη δοκιμή των προτεινόμενων στόχων. Οι ταυτότητες των ενώσεων εκτιμήθηκαν με φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR), και η καθαρότητα με χρωματογραφία λεπτής στιβάδας (TLC)? ενώσεις Tx-Α, Τχ-C, Τχ-D και Tx-F ήταν 88%, 94%, 94% και 96% καθαρό, αντίστοιχα, με αποδόσεις από 6%, 10%, 3,6% και 3,3%, αντίστοιχα. Όλες οι ενώσεις συντέθηκαν κατά παραγγελία μέσω του παρόχου υπηρεσιών σύμβαση Helios Biotech Ltd., Έντμοντον, Αλμπέρτα, Καναδάς.

Cell Culture

Ο καρκίνος του μαστού κυτταρικές σειρές SK-BR-3 [22], MDA-MB -231 [23], και Τ-47D [24] παρεσχέθησαν ευγενώς από τον Dr. Ing Swie Goping (University of Alberta, Canada). Αυτά είναι αντιπροσωπευτικά του καρκίνου του μαστού κυτταρικές γραμμές που αντανακλά τη μοριακή ετερογένεια που παρατηρείται σε όγκους σε κλινικό περιβάλλον. Το επιλεγμένο κυτταρικές σειρές ενισχύσεις στον γενίκευσης των ευρημάτων και να βοηθήσει να αποκλείσει μια άμεση επιρροή του γονοτύπου-φαινοτύπου ενός κυττάρου γραμμής για τη σύνδεση και την κυτταροτοξική δυναμικό της πακλιταξέλης και των αναλόγων της. Επιπλέον, οι επιλεγμένες κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού έχουν προηγουμένως αναφερθεί ότι παρουσιάζουν ποικίλους βαθμούς αντίστασης paclitaxel [25], και το ενδιαφέρον μας ήταν να αναπαράγουν αυτά τα ευρήματα και να ανακρίνει αν η εγγενής αντίσταση εμποδίζει τις σχέσεις δομής-δραστικότητας σε αναλόγων ταξανίου που περιγράφεται στην Σκοπός της μελέτης. Οι όγκοι του καρκίνου του μαστού που χαρακτηρίζεται από την άποψη της έκφρασης τους διάφορους υποδοχείς κυτταρικής επιφάνειας όπως HER2 (ανθρώπινο επιδερμικό αυξητικό παράγοντα του υποδοχέα 2), υποδοχέα οιστρογόνου (ER) και υποδοχέα προγεστερόνης (PR), οι οποίες εμπλέκονται στην κυτταρική σηματοδότηση και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό.

Η κυτταρική σειρά SK-bR-3 είναι HER2

+, ER

– και PR

-.

Η κυτταρική σειρά MDA-MB-231 δεν εκφράζει ή έχει πολύ χαμηλή έκφραση των υποδοχέων (HER, ER ή PR) και ονομάζεται τριπλά αρνητικό. Ασθενείς με τριπλή ιδιότητα αρνητικό υποδοχέα υποβάλλονται σε θεραπείες με κυτταροτοξικά θεραπείες, όπως η πακλιταξέλη ή ντοσεταξέλη

Η κυτταρική σειρά Τ-47D είναι ER

+ αλλά HER2

. -. Όγκους που είναι ER

+ και HER2

– (αν PR

+ ή PR

-) ονομάζονται όγκοι του αυλού Μια

Η

Η πρόγνωση είναι καλύτερη για αυλού Α. και το χειρότερο για την τριπλή αρνητική? HER2

+ όγκους (Her 2

+ και ER

-) έχουν μια ενδιάμεση πρόγνωση [26]

Ένα δεύτερο σύνολο των μη-καρκίνου του μαστού κυτταρικές σειρές χρησιμοποιήθηκαν επίσης για την αξιολόγηση της γενικότητας. των ευρημάτων σε σχέση με πακλιταξέλη και τα ανάλογά της, εκτός από το ότι αυτές οι κυτταρικές σειρές είναι καλά χαρακτηρίζεται για την P-γλυκοπρωτεΐνη (P-gp) έκφρασης, και έχουν ταξινομηθεί ως ευαίσθητα είτε φάρμακο ή ανθεκτικών φαινοτύπων. MES-SA (P-gp αρνητική, άγριου τύπου) [27] και MES-SA /Dx5 (P-gp θετικά, ανθεκτικών στα φάρμακα) [28] κυτταρικές σειρές της μήτρας σάρκωμα, και Κ-562 (P-gp αρνητική, άγριου τύπου ) [29] και Κ-562 /R7 (P-gp θετικό, ανθεκτικών στα φάρμακα) [30] χρόνια μυελογενή λευχαιμία κυτταρικές γραμμές προσεφέρθησαν ευγενώς από τον Dr. Charles Dumontet (Πανεπιστήμιο της Λυών, Γαλλία). Αυτή η ομάδα είχε επιλεγεί για να προσδιοριστεί εάν οι αλλαγές στις δομές ταξάνη είχε επιπτώσεις στην εξειδίκευση υποστρώματος για την αντλία εκροής αντίσταση σε πολλά φάρμακα, P-gp. MES-SA και MES-SA /Dx5 είναι προσκολλημένα κύτταρα, ενώ η Κ-562 και Κ-562 /R7 είναι κύτταρα αναστολή. Έχει αναφερθεί στο παρελθόν ότι το MES-SA /K-562 κυτταρικές σειρές /R7 Dx5 και υπερεκφράζουν Ρ-gp πρωτεΐνες και παρουσιάζουν διασταυρούμενη αντοχή σε μια ποικιλία χημειοθεραπευτικών ενώσεων [28,31].

Όλα κυττάρων γραμμές διατηρήθηκαν σε Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 μέσο συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), στους 37 ° C, 5% CO

2 και σε ένα υγροποιημένο περιβάλλον. Τα προσκολλημένα κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο μέχρι ~ 90% συρροή. Τα κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν σε ένα διάλυμα θρυψίνης-ΕϋΤΑ (Gibco, Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, USA) σε μια τελική συγκέντρωση 0.25%.

μικροσωληνίσκων Δοκιμασία πολυμερισμός

Βοοειδή εγκεφάλου παρασκευή τουμπουλίνης και ο καθαρισμός του αβϋ και αβIII διμερή (α-τουμπουλίνης ήταν ένα μίγμα ισοτύπων? μόνο β-τουμπουλίνης καθαρίστηκε σε βΙΙ και βIII, αντίστοιχα) πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32]. δοκιμασίες μικροσωληνίσκων πολυμερισμού έγιναν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [33]. Δείγματα (200 μλ) του ισοτυπικά καθαρού βόειου εγκεφάλου τουμπουλίνης (1,4 mg /ml) σε ρυθμιστικό τουμπουλίνης (100 mM MES-Na, 1 mM EGTA, 0,1 mM EDTA, 0.5 mM MgCl

2, 1 mM GTP, ρΗ 6.4) επωάστηκαν με την παρουσία των φαρμάκων (1-16 μΜ) στους 37 ° C για 15 λεπτά σε ένα μοντέλο DU φασματοφωτόμετρο (Beckman Coulter, Inc., Indianapolis, ΙΝ, USA) και η θολότητα των δειγμάτων παρακολουθήθηκαν στα 350 nm κάθε 8 s. Τα ανεπεξέργαστα δεδομένα αποκτήθηκαν και επεξεργασία χρησιμοποιώντας το λογισμικό KINLOTUS. Τα ανεπεξέργαστα δεδομένα που ήταν στη συνέχεια βασική γραμμή διορθωμένες και οι τιμές θολερότητας παρίστανται γραφικώς έναντι του χρόνου.

MTS Δοκιμασία

Η βιωσιμότητα των κυττάρων με την παρουσία του φαρμάκου προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το CellTiter 96 AQ

ueous Μη Δοκιμασία -Radioactive κυτταρικού πολλαπλασιασμού (MTS) (Promega, Madison, WI, USA). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων (Nalge Nunc International, Rochester, ΝΥ, USA) σε επίπεδα ανάλογη προς τους ρυθμό ανάπτυξης (που κυμαίνεται από 5 έως 10 χιλιάδες κύτταρα ανά φρεάτιο) σε όγκο 100 μΐ και αφέθηκαν να προσκολληθούν στην πλάκα διανυκτέρευση. Την επόμενη ημέρα τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ένα εύρος 100 μΙ συγκεντρώσεων φαρμάκου 2χ για τελική συγκέντρωση 1χ φαρμάκου ανά φρεάτιο. Κάθε συγκέντρωση φαρμάκου χορηγήθηκε σε έξι διαφορετικά φρεάτια, την αξιολόγηση της τεχνικής αναπαραγωγιμότητα της δοκιμασίας. Αυτή η θεραπεία διατηρήθηκε αμετάβλητη για μια περίοδο 72 ώρας. Μετά από 72 ώρες αγωγής, 30 μΐ αντιδραστηρίου MTS προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 ° C για μία χρονική περίοδο από 30 λεπτά έως 4 ώρες, ανάλογα με την ανάπτυξη χρώματος, ένα ποσοστό που ήταν μεταβλητή από την κυτταρική σειρά σε κυτταρική γραμμή. Σχετική βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με μέτρηση της απορρόφησης του κάθε φρεατίου στα 490 nm και μετατρέπεται σε ένα τοις εκατό του συνολικού βιωσιμότητα σε σύγκριση με ένα μη κατεργασμένο έλεγχο. Πειραματικά αποτελέσματα είναι κατά μέσο όρο τουλάχιστον η = 3 πειράματα.

SDS-PAGE

νατριούχο δωδεκυλο θειικό άλας ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) ανάλυση διεξήχθη για western αποτύπωση. πηκτές πολυακρυλαμιδίου 10% (από ένα απόθεμα διαλύματος 40% 29: 1 ακρυλαμίδιο /διάλυμα δις, 0,375 Μ Tris, 0,1% (ν /ν) SDS, 0,1% (ν /ν) υπερθειϊκό αμμώνιο, 0,1% (ν /ν) ΤΕΜΕϋ (Ν, Ν, Ν ‘, Ν’-τετραμεθυλαιθυλενοδιαμίνη), νερό όγκος) χρησιμοποιήθηκαν για όλα τα πειράματα κηλίδος western. Polyacrylamide πηκτώματα (7,5%) χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση western blot του P-gp πρωτεΐνη (170 kDa) για την απαιτούμενη ανάλυση των ζωνών πρωτεΐνης σε αυτό το εύρος μεγέθους. Συνολική προϊόντα λύσης πρωτεΐνης (25 μg) φορτώθηκαν σε 10 ή 15 και πηκτές πολυακρυλαμιδίου χρησιμοποιώντας 1χ Laemmli Sample Buffer (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA). Τα πηκτώματα έτρεξαν στα 200 V επί ~ 1 ώρα σε 1Χ Τρις /γλυκίνης /SDS ρυθμιστικού κίνηση (ICN Biomedicals Inc., Irvine, CA, USA) πριν να απομακρυνθεί και χρωματίζονται με Coomassie Blue ή μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης για ανάλυση κηλίδος western. Χρώση με Coomassie πηκτώματα αποχρωματίζονται χρησιμοποιώντας ένα διάλυμα 50% Η

2O, 40% μεθανόλη, και 10% κρυσταλλικό οξικό οξύ. Αποχρωματίζονται τζελ σαρώθηκαν σε CanoScan LiDE 600F (Canon Inc., Τόκιο, Ιαπωνία) και εμφανίσθηκε με τη χρήση του Adobe Photoshop 6.0 του λογισμικού (Adobe Systems, San Jose, CA, USA).

Ανάλυση Western Blot

Μετά την ηλεκτροφόρηση γέλης και τη μεταφορά των πρωτεϊνών σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης, οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα (TBS), συν το γάλα και Tween (TBSMT) (154 mM Tris HCl, 1.37 Μ NaCl, 0,1% (ν /ν ) Tween20, 5% (w /v) γάλα) διάλυμα για 1 ώρα. Οι πρωτεΐνες επί μεμβρανών εκτέθηκαν όλη τη νύχτα σε πρωτεύον διάλυμα αντισώματος TBSMT. Την επόμενη ημέρα, οι μεμβράνες πλύθηκαν σε Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, συν Tween (TBST) (154 mM Tris HCl, 1.37 Μ NaCl, 0,1% (ν /ν) Tween20, ρΗ 7,6), για 6 κύκλους με 5 λεπτά πλύσεως /επώαση για κάθε κύκλο σε TBST προς απομάκρυνση του μη συνδεδεμένου αντισώματος. Οι μεμβράνες περαιτέρω εκτεθεί σε δευτερογενές αντίσωμα σε TBST για 30 λεπτά. Μετά την επώαση δευτερεύον αντίσωμα, οι μεμβράνες πλύθηκαν σε TBST για 12 κύκλους με 5 λεπτά πλύσεως /επώαση για κάθε κύκλο σε TBST προς απομάκρυνση τυχόν μη δεσμευμένου δεύτερου αντισώματος. Πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν μετά από 5 λεπτά έκθεσης σε είτε Αντιδραστήριο ECL Prime Western Blotting Detection (GE Healthcare, Little Chalfont, Αγγλία) ή Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche Diagnostics, Indianapolis, ΙΝ, USA) και του εκτεθειμένου φιλμ αναπτύχθηκε χρησιμοποιώντας μια KODAK m35A επεξεργαστή X-ΟΜΑΤ (Eastman Kodak, Rochester, NY, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας αντι-ανθρώπινα αντισώματα πρωτογενούς ποντικού ήταν: βIII (ab14545? Abcam, Cambridge, England) χρησιμοποιείται σε αραίωση 1 σε 1.000, P-gp (ab3366? Abcam, Cambridge, England) χρησιμοποιείται σε αραίωση 1 σε 2.000 , και κατσίκα αντι-ανθρώπινο ακτίνης (SC-1616? Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, ΤΧ, USA) χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1 προς 4000. Δευτερογενή αντισώματα κατσίκας αντι-ποντικού (115-035-003? Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, ΡΑ, USA), σε αραίωση 1 σε 10.000 και αντι-κατσίκας κονίκλου (305-035-045? Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, ΡΑ, USA) χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1 προς 40.000. Οι αρχικές ταινίες σαρώθηκαν και οι εικόνες εισήχθησαν στο PowerPoint. Οι ζώνες που βρίσκεται στην αναμενόμενη περιοχή μεγέθους είχαν περικοπεί από τις ταινίες. Μέγεθος και την αντίθεση της κάθε σχήμα ρυθμίστηκε έτσι ώστε όλα τα στοιχεία ταιριάζουν στο μέγεθος και στη συνέχεια ομαδοποιούνται. Η αντίθεση του συνόλου του ομίλου ρυθμίσθηκε έτσι ώστε ζώνες θα μπορούσε να απεικονιστεί καλύτερα και το χρώμα ήταν συνεπής.

Στατιστική Ανάλυση

GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA) χρησιμοποιήθηκε για να δημιουργήσει τα αριθμητικά δεδομένα και εκτελεί στατιστικές αναλύσεις των αποτελεσμάτων. T-test Πρότυπο Student χρησιμοποιήθηκε για να συγκριθούν τα αποτελέσματα κυτταροτοξικότητας για κάθε ένα από τα ανάλογα σε σχέση με το paclitaxel επαγόμενη κυτταροτοξική προφίλ? όπως επίσης και για όλα τα αποτελέσματα κυτταροτοξική δοκιμασία με και χωρίς άλλες μεταβλητές (π.χ. βεραπαμίλη). Ένας τρόπος ANOVA (ανάλυση διακύμανσης) χρησιμοποιήθηκε για να δείξει την στατιστική σημασία μεταξύ χαμηλής, μέσης και υψηλής αντοχής φαρμάκου σε κυτταρικές σειρές που έλαβαν θεραπεία με πακλιταξέλη και τα παράγωγα.

Υπολογιστική Προσομοιώσεις

Η σύνδεση προς το ταξάνιο θέση σύνδεσης.

Οι συντεταγμένες του συμπλόκου τουμπουλίνης-ταξάνης υποδοχέα-συνδέτη ελήφθησαν από το ΠΣΠ κρυσταλλική δομή 1JFF [34], το οποίο αντιπροσωπεύει την πακλιταξέλη συν-κρυσταλλώνεται με τουμπουλίνη. Οι συντεταγμένες αυτής της κρυσταλλικής δομής χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή των συμπλοκών των άλλων παραγώγων ταξανίου. Οι δομές χτίστηκαν χρησιμοποιώντας Avogadro 1.0.3 λογισμικού [35]. Εννέα συγκροτήματα χτίστηκαν, συμπεριλαμβανομένων Τχ-Α έως Tx-G, καθώς και πακλιταξέλη και δοκεταξέλη ως έλεγχοι. Ο υποδοχέας παρασκευάστηκε με απομάκρυνση του άλφα υπομονάδα της 1JFF, καθώς δεν συμβάλλουν άμεσα στην πρόσδεση του ταξάνες. Η ελλείπουσα πρώτο υπόλειμμα μεθειονίνης προστέθηκε και το C-άκρο καλύφθηκε με ένα υπόλειμμα Ν-μεθυλ. Ο συμπαράγοντας γουανοσίνη διφωσφορική (ΑΕΠ) επίσης περιλαμβάνεται στη δομή και τις παραμέτρους της ελήφθησαν από Meagher et al. [36] Ο ιονισμός πολιτείες των υπολειμμάτων πρωτεϊνών είχαν ανατεθεί με τη χρήση του εξυπηρετητή PROPKA [37-39]. Οι συνδετήρες παραμετροποιηθεί ανάλογα με τον τομέα γενική AMBER δύναμης (καμάκι) [40] και τη μερική επιβαρύνσεις είχαν ανατεθεί με τη μέθοδο AM1-BCC [41] χρησιμοποιώντας το

προθάλαμο

ενότητα του AMBER 12 [42]. Τα συγκροτήματα χτίστηκαν στη συνέχεια χρησιμοποιώντας το

tleap

ενότητα της ΠΟΡΤΟΚΑΛΙ 12 στην οποία η πρωτεΐνη παραμετροποιηθεί χρησιμοποιώντας το πεδίο ισχύος AMBERff12SB [43,44]. Το συγκρότημα διαλυμένες σε ένα περικομμένο κουτί οκταεδρική εκτείνεται 12 α σε κάθε κατεύθυνση. Το συγκρότημα στη συνέχεια εξουδετερώθηκε με την προσθήκη 16 ιόντα νατρίου. Ένα άλλο 22 ιόντα νατρίου και χλωρίου προστέθηκαν για να επιτευχθεί μια συγκέντρωση άλατος 100 mM. Κάθε συγκρότημα στη συνέχεια ελαχιστοποιείται με βαριές περιορισμούς (500 kcal /(mol Α)) σχετικά με την πρωτεΐνη και χωρίς SHAKE σε άτομα υδρογόνου για 1000 απότομη κατάβαση τρέχει ακολουθείται από 1000 τρεξίματα των συζυγών. Μια άλλη ελαχιστοποίηση με 3000 απότομη τρέχει κατάβαση που ακολουθείται από 3.000 τρεξίματα των συζυγών έγινε χωρίς περιορισμούς. Θέρμανση σε θερμοκρασία 300 Κ υπό σταθερό όγκο με SHAKE και τα υποστηρίγματα επί της πρωτεΐνης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα θερμοστάτη Langevin για 20 ps. Πυκνότητα εξισορρόπησης σε σταθερή πίεση για 200 ps στη συνέχεια διεξήχθη χρησιμοποιώντας ανακινείται στο άτομα υδρογόνου και υπό μειώνεται σταδιακά περιορισμούς για τα βαρέα άτομα. Αυτό ακολουθήθηκε από μια φάση παραγωγής 10 ns στους 300 Κ υπό σταθερή πίεση, όπου οι συντεταγμένες καταγράφηκαν κάθε 2 ps. Όλες οι προσομοιώσεις έγιναν υπό περιοδικές οριακές συνθήκες χρησιμοποιώντας το σωματίδιο πλέγμα Ewald μέθοδο για τη θεραπεία της ηλεκτροστατικής μεγάλου βεληνεκούς. Πυκνότητα, θερμοκρασία, η συνολική ενέργεια και RMSD ελέγχθηκαν για εξισορρόπηση. Τα τελευταία 2 ns της παραγωγής, ήταν μετα-επεξεργασία για τη σύνδεση δωρεάν υπολογισμό της ενέργειας που χρησιμοποιούν τα Μοριακής Μηχανικής /Poisson-Boltzmann Επιφάνεια (MM /PBSA) [45] ή Μοριακής Μηχανικής /Γενικευμένη περιοχή Born της επιφάνειας (MM /GBSA) προσεγγίσεις [46]. Εξάγαμε 200 ομοιόμορφα κατανεμημένες στιγμιότυπα από τα τελευταία 2 ns της περιόδου παραγωγής, και τα χρησιμοποίησε για την MM /PBSA και υπολογισμοί MM /GBSA. Πραγματοποιήσαμε επίσης κανονική ανάλυση λειτουργία για κάθε συγκρότημα που χρησιμοποιούν 100 ομοιόμορφα διαστήματα στιγμιότυπα που έχουν εξαχθεί από τα τελευταία 2 ns της περιόδου παραγωγής. Δεδομένου ότι η κανονική ανάλυση λειτουργίας είναι πολύ χρονοβόρα, χρησιμοποιήσαμε μια προσέγγιση στην οποία έχει περικοπεί η πρωτεΐνη. Συγκεκριμένα, όλα τα υπολείμματα μακρύτερα από 12 α από το συνδετήρα ήταν κολοβωμένο, και η ανάλυση πραγματοποιήθηκε μόνο στο εναπομείναν σύστημα. Αυτή η προσέγγιση έχει αποδειχθεί αποτελεσματική και αρκετά ακριβές από Genheden et al [46]

Στην προσέγγισή μας, η δέσμευση ελεύθερη ενέργεια υπολογίζεται σύμφωνα με τον τύπο:. (1), όπου είναι η μέση μοριακή μηχανική ενέργεια, συμπεριλαμβανομένων των συνεισφορών από ομολόγων, γωνία, δίεδρο, van der Waals και ηλεκτροστατικές όρους. είναι ο ενυδάτωσης ελεύθερη ενέργεια υπολογίζεται από την επίλυση της εξίσωσης Poisson-Boltzmann (ή Γενικευμένη Born) για να ληφθεί η πολική ενυδάτωσης ελεύθερης ενέργειας και από την εκτίμηση μη πολικό ενυδάτωσης ελεύθερη ενέργεια χρησιμοποιώντας έναν όρο επιφάνεια. –

TS

MM

είναι ο όρος εντροπία υπολογίζεται χρησιμοποιώντας την κανονική ανάλυση λειτουργία. Μόλις η μέση ελεύθερη ενέργεια υπολογίζεται για το συνδετήρα, υποδοχέα, και πολύπλοκη, η ενέργεια πρόσδεση λαμβάνεται μέσω της ακόλουθης εξίσωσης: (2).

Η σύνδεση με το ενδιάμεσο νανοπόρων Ιστοσελίδας

Α μικροσωληνίσκων μοντέλο νανοπόρων κατασκευάστηκε συνδυάζοντας δεδομένα ηλεκτρονικής μικροσκοπίας για μικροσωληνίσκων (1XRP) [47] με τα δεδομένα ακτίνων Χ για μία αβ-τουμπουλίνης ετεροδιμερές (1JFF) [34]. Ξεκινώντας από την πρωτεΐνη και νουκλεοτιδικές συνιστώσες του κρυστάλλου 1JFF, λείπουν τα υπολείμματα (συγκεκριμένα α: 1,35-60 και β: 1) ελήφθησαν από 1TUB [1] και επιστρώθηκαν επάνω σε 1JFF. Στη συνέχεια, η κατάσταση πρωτονίωσης των ιονιζόμενων καταλοίπων σε 1JFF προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας PROPKA και άτομα υδρογόνου προστέθηκε για να ληφθεί ένα πλήρες αβ-τουμπουλίνης ετεροδιμερές. Τέλος, αυτή η διμερές χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή ενός τμήματος ενός μικροσωληνίσκων με ηλεκτρονική μικροσκοπία δεδομένα από 1XRP. Το μοντέλο που χρησιμοποιήθηκε ήταν για τον πόρο τύπου 1 [2], και μόνο τα τέσσερα μονομερή τουμπουλίνης πλησίον του πόρου διατηρήθηκαν.

Ο τρόπος συνδέσεως του paclitaxel στο ενδιάμεσο θέση σύνδεσης λήφθηκε από Freedman et al. [2] και επιστρώθηκαν πάνω στην δομή νανοπόρων που περιγράφεται παραπάνω, με αποτέλεσμα στο μοντέλο νανοπόρων-paclitaxel που χρησιμοποιείται σε αυτή τη μελέτη (Σχήμα 2) ως αρχικό δομή για να καθορίσει το ενδιάμεσο θέση σύνδεσης στους υπολογισμούς σύνδεσης. Σημειώστε ότι interdimer επαφές δεν έχουν εξισορροπηθεί σε αυτό το μοντέλο. Ο τρόπος πρόσδεσης της πακλιταξέλης στο ενδιάμεσο θέση σύνδεσης αναφέρθηκε από Freedman et al. διαφέρει από εκείνη που αναφέρεται από Maccari et al. [48], η οποία βρίσκεται πιο κοντά στην α

3-τουμπουλίνης. Είναι πιθανό ότι και οι δύο περιοχές είναι σταθερές καταστάσεις κατά μήκος της ίδιας οδού εσωτερίκευση.

νανοπόρων αντιμετωπίζεται από μικροσωληνίσκων εξωτερικό. Ο μπλε κύκλος δείχνει την ενδιάμεση θέση δέσμευσης

Η

υπολογισμοί σύνδεσης πραγματοποιήθηκαν με τη Μοριακή λειτουργίας Περιβάλλοντος (MOE? Ομάδα Chemical Computing, Μόντρεαλ, Καναδάς).. επιλέχθηκε MOE για ελλιμενισμό λόγω της επαγόμενης προσαρμογής πρωτόκολλο σύνδεσης και την ικανότητα να διαμορφώσει εύκολα συνδετήρων με διαφορετικές χρεώσεις και τα κράτη ιονισμού. Οι τέσσερις ετεροδιμερή που συνθέτουν το πόρου τύπου 1 χρησιμοποιήθηκαν για τον καθορισμό του υποδοχέα και πέντε ταξάνες (πακλιταξέλη, Τχ-Α, Τχ-C, Τχ-D και Tx-F) έχουν ελλιμενίζεται στην τοποθεσία προσδιορίζονται από Freedman et al. [2]. Λόγω της χαμηλής ρΚ του καρβοξυλικού οξέος λειτουργικών ομάδων στα Tx-D και Tx-F, οι δύο αυτές ταξάνες μοντελοποιήθηκαν ως ανιονικά (αποπρωτονιωθεί) να αντιπροσωπεύει καλύτερα τη δομή τους σε φυσιολογικό ρΗ. Βαθμολόγησης αρχικά υπολογίστηκε με τη λειτουργία βαθμολόγησης του Λονδίνου ΓΔ, διατηρώντας 30 διαμορφομερή (με αντίγραφα αφαιρεθεί). Στη συνέχεια, φινέτσα έγινε χρησιμοποιώντας το δυναμικό πεδίο μέθοδο και επιπλέον αναβαθμολόγησης χρησιμοποιώντας τη λειτουργία βαθμολόγησης GBVI /WSA ΓΔ. Τέσσερα διαφορετικά πρωτόκολλα σύνδεσης χρησιμοποιήθηκαν με διαφορετικά μεγέθη της θέσης πρόσδεσης και είτε με έναν εύκαμπτο ή ένα άκαμπτο υποδοχέα.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

πολυμερισμού τουμπουλίνης Χρησιμοποιώντας πακλιταξέλη και σύνθεσης παράγωγα

δοκιμασίες πολυμερισμού τουμπουλίνης διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας τα παράγωγα paclitaxel για τη μέτρηση

in vitro δραστικότητα πολυμερισμού

σύγκριση με την πακλιταξέλη. Αυτά τα πειράματα χρησιμοποιήθηκε καθαρισμένο με συγγένεια βΙΙ και βIII ισοτύπων τουμπουλίνης από ένα βόειο πηγή εγκέφαλο? η α-τουμπουλίνης ήταν ένα μείγμα ισοτύπων? Αυτές οι μορφές τουμπουλίνης αναφέρονται ως αβϋ και αβIII, αντίστοιχα.

καμπύλες πολυμερισμού καθορίστηκαν χρησιμοποιώντας πακλιταξέλη και τέσσερα από τα παράγωγά του είτε με αβϋ και αβIII. Οι καμπύλες πολυμερισμού σε συγκεντρώσεις φαρμάκου 10 μΜ φαίνεται στο σχήμα 3Α συγκέντρωση φαρμάκου 10 μΜ ήταν η συγκέντρωση στην οποία οι διαφορές μεταξύ των αποτελεσμάτων όλων των φαρμάκων ήταν πιο ευδιάκριτα? Ωστόσο, οι ίδιες τάσεις παρατηρήθηκαν σε όλα τα επίπεδα συγκέντρωσης που δοκιμάστηκε (1-16 μΜ).

ισοτυπικά καθαρού βόειου εγκεφάλου τουμπουλίνης (αβϋ ή αβIII) σε 1,4 mg /ml επωάστηκε με την παρουσία των φαρμάκων και την απορρόφηση στα 350 nm μετρήθηκε κάθε 8 δευτερόλεπτα για τουλάχιστον 11 λεπτά. Η συγκέντρωση κάθε φαρμάκου ήταν 10 μΜ. ΡΤΧ είναι η πακλιταξέλη.

Η

Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η πακλιταξέλη αντιστοιχεί στο υψηλότερο ποσοστό του συνέρχεσθαι μικροσωληνίσκων. Αυτό ακολουθείται από Τχ-Α, στη συνέχεια, με Tx-C. TX-D και TX-F είχαν παρόμοιες τιμές, με τις πιο αργή ποσοστά του συνέρχεσθαι μικροσωληνίσκων. Κανένα από τα παράγωγα ελέγχθηκαν ξεπέρασε paclitaxel από την άποψη του ρυθμού πολυμερισμού της τουμπουλίνης. Υπήρξε μια αύξηση στο ποσοστό συναρμολόγησης για την πακλιταξέλη με ακολουθούμενη από Tx-Α, στη συνέχεια, με Tx-C. TX-D και TX-F είχαν παρόμοιες τιμές, με τις πιο αργή ποσοστά του συνέρχεσθαι μικροσωληνίσκων

Τα αποτελέσματα δεν ήταν συνεπείς με τις προηγούμενες προβλέψεις [2] και η βασική προϋπόθεση που περιγράφεται για τον πρώτο στόχο:. Δεν παρατηρήθηκε πακλιταξέλη να έχουν μειωθεί πολυμερισμού με βIII τουμπουλίνης (η παρατήρηση ήταν η αντίστροφη της προσδοκίας), και επιπλέον Τχ-Α και Tx-C δεν είχε την αναμενόμενη συμπεριφορά. Ούτε ήταν τα αποτελέσματα συμφωνούν με την υποκείμενη υπόθεση που περιγράφεται για το δεύτερο στόχο: Τχ-D και Tx-F δεν ήταν πιο ενεργή από την πακλιταξέλη. Ως εκ τούτου, αυτό το πείραμα δεν υποστηρίζει τη σημασία των καταλοίπων 275 ή 278, ή την προβλεπόμενη ρόλο του ενδιάμεσου θέση πρόσδεσης στο νανοπόρων μικροσωληνίσκων.

κυτταροτοξικότητα της πακλιταξέλης αναλόγων κατά του Καρκίνου του Μαστού Γραμμές κυττάρων.