Αφηρημένο

Παρά το γεγονός ότι οι νέες θεραπευτικές αγωγές έχουν βελτιώσει τη συνολική επιβίωση των ασθενών προσβληθεί από καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC ), η πρόγνωση του μεταστατικού κατάσταση εξακολουθεί να είναι περιορισμένη. Η οικογένεια Bcl-2 πρωτεϊνών έχει ταυτοποιηθεί ως υποσχόμενο στόχο την καταπολέμηση του καρκίνου του φαρμάκου. Ακόμη και αν τα μικρά μόρια που στοχεύουν πρωτεΐνες Bcl-2 είναι σε κλινικές δοκιμές, λίγα είναι γνωστά σχετικά με τις επιδράσεις τους επί CRC. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να διερευνήσει προκλινικά την αξία της ΑΒΤ-737 και Obatoclax ως αντικαρκινικά φάρμακα για τη θεραπεία CRC. Τα αποτελέσματα των BH3-μιμητικά ΑΒΤ-737 και Obatoclax σε κύτταρα CRC εκτιμήθηκαν χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς βιωσιμότητα και η απόπτωση. Επούλωση των πληγών της μετανάστευσης και Boyden δοκιμασίες εισβολής θάλαμο εφαρμόστηκαν. πολιτισμών 3-διαστάσεων κυττάρων χρησιμοποιήθηκαν για τη μακροπρόθεσμη αξιολόγηση της εισβολής και του πολλαπλασιασμού. Κλινικά σχετικές συγκεντρώσεις του παν-Bcl-2 αναστολέας Obatoclax δεν προκαλεί κυτταρικό θάνατο. Σε αντίθεση, το ΒΗ3-μιμητικό ΑΒΤ-737 επαγόμενη απόπτωση με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Obatoclax προκάλεσε μια κυτταρική γραμμή ειδική επιβράδυνση της κυτταρικής ανάπτυξης CRC. Επιπλέον, Obatoclax, αλλά όχι ΑΒΤ-737, ανακτήθηκε η έκφραση Ε-καδερίνης και οδήγησε σε μειωμένη μετανάστευση και εισβολή των κυττάρων CRC. Η πολλαπλασιαστική ικανότητα και την ικανότητα εισβολής των κυττάρων CRC ήταν εντυπωσιακά αναστέλλεται από χαμηλή δόση Obatoclax σε μακροχρόνιες καλλιέργειες 3-διαστάσεων κυττάρων. Obatoclax, αλλά όχι ΑΒΤ-737, προκάλεσε μια σύλληψη G1-φάση συνοδεύεται από μια προς τα κάτω ρύθμιση της κυκλίνης D1 και προς τα πάνω ρύθμιση της ρ27 και ρ21. Η υπερέκφραση του Mcl-1, ΒοΙ-χ

L ή Bcl-2 ανέστρεψε την ανασταλτική δράση του Obatoclax για τη μετανάστευση, αλλά απέτυχε να αποκαταστήσει την πολλαπλασιαστική ικανότητα των Obatoclax κατεργασμένα κύτταρα CRC. Τα στοιχεία που παρουσιάζονται δείχνουν ευρεία και πολύπλευρη αντικαρκινική δράση του αναστολέα της παν-Bcl-2 Obatoclax στα κύτταρα CRC. Σε αντίθεση με ΑΒΤ-737, Obatoclax ανέστειλε τη μετανάστευση, εισβολή και πολλαπλασιασμό σε υποθανατηφόρες δόσεις. Εν ολίγοις, αυτή η μελέτη συνιστά παν-Bcl-2 αναστολή ως μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για κλινικές δοκιμές σε CRC

Παράθεση:. Koehler π.Χ., Scherr AL, Lorenz S, Elssner C, Kautz Ν, Welte S, et al . (2014) Pan-Bcl-2 αναστολέα Obatoclax Καθυστερεί κυττάρων Κύκλου εξέλιξη και μπλοκ μετανάστευση των κυττάρων του καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 9 (9): e106571. doi: 10.1371 /journal.pone.0106571

Επιμέλεια: Αντρέι Λ Gartel, Πανεπιστήμιο του Ιλινόις στο Σικάγο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 23 Μαρ, 2014? Αποδεκτές: 30 Ιουλίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 5 Σεπ 2014

Copyright: © 2014 Koehler et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα στοιχεία που περιλαμβάνονται στο έγγραφο

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη αυτή υποστηρίζεται από μια μεταδιδακτορική-υποτροφία χορηγείται σε BCK από την Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου της Χαϊδελβέργης, στη Γερμανία (http: //www.medizinische-fakultaet- hd.uni-heidelberg.de), καθώς και επιχορηγήσεις προς HSB από το γερμανικό Ίδρυμα Ερευνών (Deutsche Forschungsgemeinschaft, https://www.dfg.de/, DFG SCHU 1443 /4-1). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνωμα του παχέος εντέρου (CRC) αποτελεί την τέταρτη αιτία θανάτου από καρκίνο [1]. Η συχνότητα εμφάνισης αυξάνει παγκοσμίως και το 40% όλων των ασθενών έχουν μακρινή μετάσταση όργανο κατά τη στιγμή της πρώτης διάγνωσης. Συστημικές προσεγγίσεις και χειρουργική θεραπεία έχουν βελτιώσει τη συνολική επιβίωση, αλλά η πρόγνωση σε UICC σταδίου IV εξακολουθεί να είναι κακή. Η οικογένεια πρωτεϊνών Bcl-2 περιλαμβάνει βασικά ρυθμιστές της απόπτωσης που ενεργεί στο μιτοχονδριακό επιφάνεια. Αντι-αποπτωτική μέλη της οικογένειας πράξη μέσω δέσμευσης προαποπτωτική συγγενείς τους, προστατεύοντας έτσι το κύτταρο από το θάνατο. Οι πρωτεΐνες αντιαποπτωτικών Mcl-1, Bcl-2 και Bcl-x

L έχει αποδειχθεί ότι ρυθμίζεται προς τα πάνω σε διάφορα στερεά και αιματολογικός καρκίνος οντοτήτων συμπεριλαμβανομένων CRC [2] – [4]. Αυτές οι παρατηρήσεις οδήγησαν στην διερεύνηση των διαφόρων ενώσεων που στοχεύουν άμεσα αντιαποπτωτικό πρωτεΐνες Bcl-2. Τα λεγόμενα BH3-μιμητικά δρουν με σύνδεση προς τη σχισμή ΒΗ3 των πρωτεϊνών αντιαποπτωτικών [5]. Αυτή η αλληλεπίδραση οδηγεί στην απελευθέρωση του προαποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2 προώθηση τελικά κυτταρικό θάνατο. Κλινικές μελέτες έχουν αποδείξει την ασφάλεια και την αποτελεσματικότητα του ΒΗ3 μιμητικών σε διάφορες αιματολογικές και μερικές στερεές κακοήθειες [6]. Παρά τις κλινικές έρευνες, που ισχύει προκλινικά δεδομένα σχετικά με την ισχύ του ΒΗ3 μιμητικών ως θεραπευτική επιλογή για CRC είναι περιορισμένες. Σε αυτή τη μελέτη, ερευνήσαμε την αντικαρκινική δράση των Obatoclax και ΑΒΤ-737 σε κύτταρα CRC. Και οι δύο είναι μικρού μορίου αναστολείς αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2. Διαφέρουν στο προφίλ τους αναστολής, αφού ΑΒΤ-737 δεν αναστέλλει Mcl-1, ενώ Obatoclax είναι μια παν-Bcl-2 αναστολέα. Η μελέτη μας δείχνει ότι η ΑΒΤ-737 επάγει κυτταρικό θάνατο σε διάφορες κυτταρικές σειρές CRC. Σε αντίθεση, ο κυτταρικός θάνατος που επάγει χωρητικότητα Obatoclax είναι περιορισμένη και ποικίλλει μεταξύ CRC κυτταρικές σειρές.

Η ικανότητα να μεταναστεύουν και να εισβάλλουν ξένων ιστών είναι ένα κοινό χαρακτηριστικό των καρκινικών κυττάρων που συμβάλλουν δραματικά στην κακοήθεια της νόσου. Η ομάδα μας έχει πρόσφατα καταδειχθεί ότι η ρύθμιση προς τα κάτω του Mcl-1, ΒοΙ-χ

L ή Bcl-2 οδηγεί σε ένα εντυπωσιακό απομείωση της μετανάστευσης και εισβολής των κυττάρων CRC [7]. Εδώ, θα διερευνηθεί η συνάφεια των ΒΗ3-μιμητικά Obatoclax και ΑΒΤ-737 για εκείνες κακοήθη χαρακτηριστικά. Σε αντίθεση με ABT-737, σχεδόν θανατηφόρες δόσεις Obatoclax μετανάστευσης μπλοκ και την εισβολή των κυττάρων CRC σε ένα εξαρτώμενο πρωτεΐνη τρόπο Bcl-2.

Επιπλέον, η μελέτη αυτή έχει ως στόχο να αξιολογηθεί η ικανότητα πολλαπλασιασμού των κυττάρων CRC αντιμετωπίζονται με Obatoclax και ABT-737. Χαμηλή δόση Obatoclax, αλλά όχι ΑΒΤ-737, έχει εντυπωσιακά ανασταλτικές επιδράσεις στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και πολλαπλασιασμό. Εδώ, περιγράφουμε αντιπολλαπλασιαστικές επιδράσεις της Obatoclax ανεξάρτητων πρωτεϊνών Bcl-2.

Εν κατακλείδι, τα δεδομένα μας αποκάλυψε ότι παν-Bcl-2 αναστολέας Obatoclax ασκεί διάφορες αντικαρκινικές δράσεις ανεξάρτητες από την επαγωγή κυτταρικού θανάτου, συνιστώντας παν-Bcl- 2 αναστολή για περαιτέρω κλινική ανάπτυξη στον καρκίνο του παχέος εντέρου.

Αποτελέσματα

ΑΒΤ-737, αλλά δεν Obatoclax mesylate επάγει την απόπτωση σε κύτταρα CRC

για την εκτίμηση του κυτταρικού θανάτου μετά την επεξεργασία των κυττάρων CRC με Obatoclax και ΑΒΤ-737 για 48 ώρες, αναλύσαμε κατακερματισμού του DNA με κυτταρομετρία ροής. ΑΒΤ-737 προκάλεσε κυτταρικό θάνατο σε όλες τις κυτταρικές σειρές ερευνήθηκε με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Το πιο εντυπωσιακό αποτέλεσμα παρατηρήθηκε σε κύτταρα ΟοΙο205 (πάνω από 90% αποπτωτικά κύτταρα μετά από αγωγή 48 ώρες με 10 μΜ ΑΒΤ-737, Σχ. 1Α). Σε αντίθεση, αυξανόμενες συγκεντρώσεις Obatoclax μόνο ελαφρώς επάγεται κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα SW480, ΟοΙο205 και CaCo2

(Α και Β) Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής για DNA-κατάτμηση ως δείκτης για αποπτωτικό θάνατο σε τέσσερις κυτταρικές σειρές CRC.? 48 ώρες αγωγή με ABT-737 ή Obatoclax. (Γ) ανάλυση ΜΤΤ κυττάρων ΗΤ29 μετά από 72 ώρες από Obatoclax και ΑΒΤ-737 αγωγή. (Ρ-τιμές: Oba 0,25 μΜ: 0.003? Oba 0,05 μΜ: 0.004? ΑΒΤ-737 5 μΜ: 0.589) (D) Αντιπροσωπευτική κηλίδα Western για διασπασμένης ΡΑΚΡ μετά από 24 ώρες θεραπείας Obatoclax. Τουμπουλίνης υπηρέτησε ως έλεγχος φόρτωσης. 2 θεραπεία μΜ με σταυροσπορίνη για 24 ώρες χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος για την επαγωγή κυτταρικού θανάτου. Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν εις τριπλούν. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. Δοκιμασίες είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Oba = Obatoclax, STS = σταυροσπορίνη.

Η

ΗΤ29 κύτταρα δεν έδειξαν αποπτωτικών DNA κατακερματισμού (Εικ. 1Β).

Επαληθεύσαμε περαιτέρω τα ευρήματά μας με κηλίδωση Western για διασπασμένης PARP. Σύμφωνα με κυτταρομετρία ροής δεδομένων, δεν υπήρχε διασπασμένης ΡΑΚΡ ανιχνεύσιμα σε όλες τις κυτταρικές σειρές CRC ως παραδειγματικά δείχνεται για ΗΤ29 και SW480 στο Σχ. 1D.

Προκειμένου να διερευνηθεί επιδράσεις της Obatoclax στον πολλαπλασιασμό, ακολουθήσαμε την κυτταρική ανάπτυξη των κυττάρων ΗΤ29 πάροδο του χρόνου (72 ώρες). Η ανάπτυξη των κυττάρων αναστάλθηκε ακόμη και κάτω από χαμηλή δόση Obatoclax, ενώ μη επεξεργασμένα και ΑΒΤ-737 επεξεργασμένα κύτταρα συνέχισαν να πολλαπλασιάζονται. Αυτό το αποτέλεσμα είναι ενδεικτικό για μια ισχυρή επίδραση της Obatoclax στην πολλαπλασιαστική ικανότητα (Σχήμα 1 C).

Στη συνέχεια, με στόχο την αξιολόγηση της δραστικότητας των Obatoclax παράλληλα χημειοθεραπευτικών παραγόντων εγκριθεί για τη θεραπεία CRC. Παρατηρήσαμε ότι η κυτταροτοξικότητα οξαλιπλατίνη αυξήθηκε όταν συνδυάζεται με Obatoclax. Οι επιπτώσεις εμφανίζονται για μια περίοδο θεραπείας 48 h σε συμβατικές κυτταρική καλλιέργεια και περαιτέρω επικυρωθεί για μία περίοδο θεραπείας 7 ημέρες σε καλλιέργεια κυττάρων 3D (Εικ. S3). Ούτε Obatoclax ούτε οξαλιπλατίνη μόνο ήταν σε θέση να επάγει κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα SW480 (Ποσοστό διασπασμένης ΡΑΚΡ θετικών κυττάρων: [ανεπεξέργαστων] 1,3%, 1,7 [0,25 μΜ Obatoclax] και 1,6% [20 μΜ οξαλιπλατίνη]). Σε έντονη αντίθεση, 22,7% των κυττάρων υπέστησαν απόπτωση όπως υποδεικνύεται από διασπασμένης ΡΑΚΡ χρώση όταν Obatoclax και οξαλιπλατίνη συνενώθηκαν (Σχ. S3C). Σημαντικά, δεν υπήρξε καμία επίδραση ευαισθητοποίησης για τον συνδυασμό Obatoclax με 5-FU (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στο σύνολό τους, οι παρατηρήσεις μας δείχνουν μια δοσοεξαρτώμενη επαγωγή κυτταρικού θανάτου από ABT-737 και μία δόση και το είδος των κυττάρων που εξαρτώνται επίδραση στον πολλαπλασιασμό των Obatoclax. Ο συνδυασμός του Bcl-2 αναστολείς με χημειοθεραπεία, π.χ. οξαλιπλατίνη, θα πρέπει να αναλυθεί ως δυνητική θεραπευτική προσέγγιση σε μελλοντικές μελέτες.

Obatoclax ανακτά Ε-καδερίνης σε κύτταρα CRC, αλλά αφήνει αντιαποπτωτικού Bcl-2 επίπεδα πρωτεΐνης αμετάβλητη

Έχουμε αποδείξει πρόσφατα ότι siRNA μεσολάβηση ρύθμιση προς τα κάτω του αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2 παρεμποδίζει τη μετανάστευση και την εισβολή του CRC κυττάρων [7]. E-καδχερίνη είναι πρωτίστως συνδεδεμένη μεμβράνη πρωτεΐνης με ένα πλήκτρο λειτουργίας για τις διασταυρώσεις προσκόλληση και Wnt σηματοδότησης. Έχει αποδειχθεί ότι χάνεται κατά τη διάρκεια κακοήθους μετασχηματισμού [8]. Εντυπωσιακά, βρήκαμε μια εξέχουσα ανάκτηση του Ε-καδερίνης σε όλες τις κυτταρικές σειρές, με εξαίρεση την SW480 κύτταρα, μετά Obatoclax θεραπεία (Εικ. 2Α). Αξίζει να σημειωθεί, Ν-καδερίνη, η οποία έχει αναφερθεί ως υποκινητή της μετανάστευσης, δεν ήταν ανιχνεύσιμη στις τέσσερις κυτταρικές γραμμές διερευνήθηκαν (δεδομένα δεν παρουσιάζονται) [9].

(Α) κηλίδωση Western για Ε-καδερίνης σε τέσσερις κυτταρικές σειρές CRC μετά την αγωγή 24 ώρες με Obatoclax σε κλιμακούμενες δόσεις (αριστερά). Αντίστοιχες πυκνομετρική ανάλυση σε σχέση με τους χωρίς θεραπεία ελέγχους και ρυθμίστηκε σε τουμπουλίνης ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) κηλίδωση Western για Mcl-1, Bcl-2 και Bcl-x

L σε κύτταρα ΗΤ29 (αριστερά) και τα κύτταρα SW480 (δεξιά) μετά από 24 ώρες αγωγή με Obatoclax. Τουμπουλίνης χρησίμευσε ως μάρτυρας φόρτωσης. Western κηλίδες είναι αντιπροσωπευτικά για τουλάχιστον τρεις κηλίδες από ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Άλλοι ανέφεραν ότι αντιαποπτωτικού-Bcl 2 πρωτεϊνών, π.χ. Mcl-1, ταχέως και πλήρως αποικοδομούνται σε καρκινικά κύτταρα που υπέστησαν αγωγή με Obatoclax [10]. Σε έντονη αντίθεση, τα δεδομένα μας δεν δείχνουν καμία μείωση του Mcl-1, Bcl-2 ή ΒοΙ-χ

επίπεδα L. Αρκετά αντιθέτως, ολόκληρο ανοσοστύπωση κυτταρικής πρωτεΐνης αποκάλυψε ένα αυξημένο επίπεδο του Bcl-x

L και μια μικρή αύξηση των επιπέδων της Bcl-2 σε κύτταρα ΗΤ29 σε όλες τις συγκεντρώσεις Obatoclax εφαρμόζονται (Σχ. 2Β, αριστερά). Σε SW480 κύτταρα, Bcl-2 και Bcl-x

επίπεδα L αυξήθηκε υπό χαμηλή δόση Obatoclax, αλλά έδειξε επίπεδα παρόμοια με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα υπό υψηλότερες Obatoclax δόσεις (Σχ. 2Β, δεξιά). επίπεδα Mcl-1 έδειξε μια πιο εμφανή αύξηση υπό θεραπεία Obatoclax σύγκριση με Bcl-2 και Bcl-x

L σε ΗΤ29 κύτταρα (Σχ. 2Β, αριστερά). Δεν υπάρχουν αξιοσημείωτες αλλαγές στην Mcl-1 επίπεδα ανιχνεύτηκαν για SW480 κύτταρα (Εικ. 2Β, δεξιά).

Χαμηλή δόση Obatoclax μειώνει εντυπωσιακά τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων CRC

Για να διερευνηθεί περαιτέρω η αντίκτυπο της Obatoclax στα κύτταρα CRC, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς μετανάστευσης επούλωση των πληγών. Ακόμη και σχεδόν θανατηφόρες δόσεις ήταν σε θέση να βλάψει μαζικά μεταναστευτικά ικανότητα των κυττάρων ΗΤ29 την πάροδο του χρόνου. Μετά από 48 ώρες, η μετρούμενη κλείσιμο χάσμα ήταν 650 μm σε κύτταρα ελέγχου σε σύγκριση με 263 μm σε κύτταρα κατεργασμένα Obatoclax (σχήμα 3Α και Β, ρ & lt?. 0.001). Επιπλέον, τα κύτταρα CaCo2 μετανάστευσε σημαντικά λιγότερο υπό θεραπεία με 0.25 μΜ Obatoclax. κλείσιμο της ψαλίδας ήταν 901 έναντι 744 μm (Σχήμα 3C, σ & lt?. 0.05). Αξίζει να σημειωθεί, ΑΒΤ-737 απέτυχαν να αναστείλουν τη μετανάστευση, ακόμη και σε μία δόση των 5 μΜ όπως φαίνεται στο Σχ. S1.

(Α) Εκπρόσωπος εικόνες των πληγών δοκιμασίες επούλωσης μηδέν οχήματος (άνω) και Obatoclax (κάτω) κατεργασμένων κυττάρων ΗΤ29. μπαρ κλίμακα ισχύει για όλες τις εικόνες. (Β) Gap κλείσιμο των κυττάρων ΗΤ29 μετά από θεραπεία 48 ώρες με Obatoclax. (C) Gap κλείσιμο των Caco2 κύτταρα αγωγή 48 ώρες με Obatoclax. Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν εις τριπλούν. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. Δοκιμασίες είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * P & lt? 0,05, *** p & lt? 0.001. Oba = Obatoclax.

Η

Τα συστήματα Τρισδιάστατο κυτταρικής καλλιέργειας αντανακλά καλύτερα φυσιολογική ανάπτυξη των κυττάρων, καθώς και η μορφολογία και την προώθηση των αλληλεπιδράσεων κυττάρου-κυττάρου [11]. Επιπλέον, ένα τρισδιάστατο σύστημα αυξάνει την πιθανότητα να εκτελέσει τα πειράματα καλλιέργειας κυττάρων για μεγάλο χρονικό διάστημα, συμπεριλαμβανομένης της έκθεσης φάρμακο κερδίζει περισσότερες πληροφορίες από τα συμβατικά κυτταρική καλλιέργεια. Έτσι, χρησιμοποιούνται ικριώματα πολυστυρόλιο για 7 ημέρες θεραπείας Obatoclax που ακολουθείται από αξιολόγηση της εισβολής, του πολλαπλασιασμού και απόπτωσης. ΗΤ29 κύτταρα δεν έδειξαν διέγερση απόπτωσης μετά από θεραπεία με Obatoclax (Εικ. 1 Β και D). Εντυπωσιακά, υπήρχε μαζική αποκλεισμό της εισβολής σε 3D μακροχρόνια καλλιέργεια κυττάρων (Σχ. 4Α και Β). Επιπλέον, ΟοΙο205 έδειξε μια βαθιά διαταραγμένη μετανάστευσης στην μακροχρόνια καλλιέργεια κυττάρων όπως υποδεικνύεται από μια μείωση του βάθους εισβολής (Εικ. S2). Αριθ επαγωγή απόπτωσης αλλά μια δυσλειτουργία του πολλαπλασιασμού, όπως υποδεικνύεται από τη μείωση του Κί67 θετικότητας, παρατηρήθηκε (Εικ. S2). Αυτή η παρατήρηση υπογραμμίζει περαιτέρω την ευρεία αντικαρκινική αποτελεσματικότητα του Obatoclax σε σχέση με ένα αναστολής μετανάστευσης φαινότυπο σε συνδυασμό με ένα αντιπολλαπλασιαστικό αποτέλεσμα, ανεξάρτητα από επαγωγή κυτταρικού θανάτου.

(Α) Αντιπροσωπευτική εικόνες των κυττάρων ΗΤ29 σε ικριώματα μετά από 7 ημέρες θεραπείας με Obatoclax (αιματοξυλίνη και ηωσίνη χρώση. μπαρ Κλίμακα ισχύει και για τις δύο φωτογραφίες) (Β) Αντίστοιχη ανάλυση βάθος εισβολή στη ικριώματα. Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν εις τριπλούν. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. Δοκιμασίες είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. *** P & lt? 0.001. Oba = Obatoclax.

Η

Στη συνέχεια, μελετήσαμε την ικανότητα εισβολής των κυττάρων SW480 αγωγή με χαμηλή δόση Obatoclax σε matrigel περιέχει δοκιμασία Boyden θάλαμο. Για να αποδειχθεί κατάλληλη προσκόλληση κυττάρων σε μέσο που περιέχει Obatoclax, τα κύτταρα προηγουμένως σπάρθηκαν πάνω σε πλάκες πολυστυρολίου που ακολουθείται από ανάλυση ΜΤΤ μετά από 24 ώρες. Δεν υπήρξε καμία διαταραχή της προσκόλλησης που παρατηρείται στην παρουσία του Obatoclax (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Εισβολή ήταν εντυπωσιακά αναστέλλεται σε κύτταρα κατεργασμένα με 0,25 μΜ Obatoclax (293 εισέβαλαν κύτταρα ελέγχου έναντι 89 εισέβαλαν Obatoclax επεξεργασμένα κύτταρα, ρ & lt?. 0.001, Εικόνα 5) και περαιτέρω καταργήθηκε σε κύτταρα κατεργασμένα με 0,5 μΜ Obatoclax (293 εισέβαλαν κύτταρα ελέγχου vs. 59 εισέβαλαν Obatoclax επεξεργασμένα κύτταρα, σ & lt?.. 0.001, Σχήμα 5)

κύτταρα SW480 σπάρθηκαν στο ανώτερο θάλαμο ενός transwell. 48 ώρες μετά την σπορά, οι πυρήνες στην κάτω επιφάνεια οπτικοποιήθηκαν με χρώση Hoechst. (Α) Εκπρόσωπος εικόνες της κάτω ένθετο επιφάνεια μετά από χρώση Hoechst (γραμμή κλίμακας δείχνουν μεγέθυνση σε όλους τους πίνακες). (Β) πέντε οπτικά πεδία ανά ένθετο μετρήθηκαν. Ν = 5 ανά ομάδα. Οι τιμές εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. Δοκιμασίες είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. *** P & lt? 0.001. Oba = Obatoclax, ctrl = έλεγχος.

Η

Η υπερέκφραση του αντιαποπτωτικού πρωτεϊνών Bcl-2 αποκαθιστά τη μετανάστευση των Obatoclax επεξεργασμένων κυττάρων CRC

Στη συνέχεια, έχουμε ως στόχο να διερευνήσει τη δέσμευση της αντιαποπτωτικού Bcl-2 πρωτεΐνες με τον φαινότυπο αναστολής μετανάστευσης που προκλήθηκε από Obatoclax. Βρήκαμε μια εντυπωσιακή ανάκαμψη της μετανάστευσης στα κύτταρα ΗΤ29 αγωγή με 0,25 μΜ Obatoclax αλλά υπερεκφράζουν αντιαποπτωτικού πρωτεϊνών Bcl-2. Αυτός ο φαινότυπος επαναφορά αποτέλεσμα παρατηρήθηκε για Mcl-1 (ρ & lt? 0,05), Bcl-x

L (ρ & lt? 0.001) και Bcl-2 (ρ & lt? 0.001), με την πλέον έντονη επίδραση για Bcl-2 (Σχ. 6Α-D). Η υπερέκφραση του αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών μπλοκάρει συνεχώς την αναστολή της μετανάστευσης υπό θεραπεία Obatoclax επί 72 ώρες. Έχει μεγάλη σημασία στο πλαίσιο αυτό για να εξασφαλιστεί ότι η αποκατάσταση της μετανάστευσης δεν είναι δευτερεύων χαρακτηριστικό του αυξημένου πολλαπλασιασμού οφείλεται σε υπερέκφραση αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2. Συνεπώς, ερευνήσαμε πολλαπλασιασμό σε κύτταρα που υπερεκφράζουν Mcl-1, Bcl-2 ή ΒοΙ-χ

L. Δεν παρατηρήσαμε καμία επίδραση στον πολλαπλασιασμό για οποιαδήποτε από τις πρωτεΐνες που ελέγχθηκαν, όπως φαίνεται λεπτομερώς στο Σχ. S4. (Α-Δ).

(Α-Δ) κλείσιμο Gap της επούλωσης πληγών δοκιμασίες μετανάστευσης των κυττάρων ΗΤ29 σε επεξεργασία με Obatoclax. (Α) και Vector Mcl-1 επιμολυσμένων κυττάρων (Β) φορέα και Bcl-xL επιμολυσμένα κύτταρα και (D) του φορέα και Bcl-2 κύτταρα. (C) Αντιπροσωπευτική εικόνες της επούλωσης του φορέα και Mcl-1 επιμολυσμένα κύτταρα κατεργασμένα με Obatoclax τραύματος. Οι τιμές εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. Δοκιμασίες είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. *** P & lt? 0.001. Vec = φορέα.

Η

Χαμηλή δόση Obatoclax αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό μέσω G1 διακοπή της φάσης-συνοδεύεται από ρύθμιση προς τα πάνω του p27 και p21, καθώς και προς τα κάτω ρύθμιση της κυκλίνης D1

Δεδομένου ότι τα κύτταρα CRC σε 3D ικριώματα παρουσίασαν απομείωση του πολλαπλασιασμού υπό μακροχρόνια θεραπεία με Obatoclax, αποφασίσαμε να αναλύσουμε περαιτέρω ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Χρώση για το περιεχόμενο του DNA υπό θεραπεία Obatoclax αποκάλυψε μια μαζική στροφή από το G2- στην G1 φάσης του κυτταρικού κύκλου που είναι ενδεικτικό για τη σύλληψη G1 φάσης ή διαταραχθεί μετάβαση G1 φάσης. Η αναλογία των κυττάρων στην G2-φάση μειώθηκε από 37% σε κύτταρα ελέγχου σε 13% σε κύτταρα ΗΤ29 σε επεξεργασία με 0,25 μΜ Obatoclax (Σχ 7Α και Β, ρ & lt?. 0.001).

(Α) Αντιπροσωπευτική ροή cytomeric ανάλυση για το περιεχόμενο του DNA σε κύτταρα ΗΤ29 σε επεξεργασία με 0,25 μΜ Obatoclax. 2Ν = διπλοειδή κύτταρα σε G1-φάση, 4Ν = τετραπλοειδούς κυττάρων σε G2-φάση. (Β) Γραφική ανάλυση της κατανομής φάσεων του κυτταρικού κύκλου που αντιστοιχεί στο (Α). Οι τιμές εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. *** P & lt? 0.001. (C) Σχετ. επίπεδα του mRNA της κυκλίνης D1, ρ21 και ρ27 σε 2 κύτταρα ΗΤ29 και CaCo μετά την αγωγή 24 ώρες με Obatoclax. τα επίπεδα mRNA ήταν ποσοτικά με QRT-PCR και κανονικοποιούνται σε GAPDH ως γονίδιο καθαριότητας. Δοκιμασίες είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (D) Αντιπροσωπευτική Western blots για Κυκλίνη D1, ρ21, και ρ27 σε κύτταρα ΗΤ29 και CaCo2 κατεργάζεται με Obatoclax για 24 ώρες. Τουμπουλίνης χρησίμευσε ως μάρτυρας φόρτωσης. Oba = Obatoclax, ctrl = έλεγχος.

Η

Επιπλέον, με στόχο την ποσοτικοποίηση ρυθμιστικές πρωτεΐνες κεντρικού κυτταρικού κύκλου υπό θεραπεία Obatoclax. Κυκλίνη D1 (CD1) αντιπροσωπεύει το κλειδί κυκλίνης για G1-μεταβατική φάση [12]. CD1 ήταν αξιοσημείωτα μειωτικά υπό θεραπεία Obatoclax τόσο στο mRNA και πρωτεΐνης σε επίπεδο ΗΤ29 (0,5 φορές μεταβολής) και κύτταρα CaCo2 (πάνω από 0,5 φορές αλλαγή, το Σχ. 7C και D). ρ27 είναι ένας εξαρτώμενος από κυκλίνη αναστολέας κινάσης (CDKI) και προς τα πάνω ρύθμιση του υποδεικνύει διακοπή του κυτταρικού κύκλου [13]. Παρατηρήσαμε μια ρύθμιση προς τα άνω του ρ27 σε mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης σε κύτταρα ΗΤ29 και CaCo2 κατεργάζεται με Obatoclax (Σχ. 7C και D). Επιπλέον, παρατηρήσαμε μια αξιόλογη και εξαρτώμενη από τη δόση αύξηση Κυκλίνης αναστολέα ρ21 εξαρτώμενη από την κινάση σε mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης σε κύτταρα ΗΤ29 και CaCo2 (Εικ. 7C και D). Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά είναι ενδεικτικά για την ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου από Obatoclax μέσω βασικών ρυθμιστικών πρωτεϊνών της μετάβασης του κυτταρικού κύκλου, όπως η κυκλίνη D1, ρ27 και ρ21.

Συζήτηση

Anitapoptotic μέλη της Bcl -2 οικογένεια πρωτεϊνών συχνά υπερεκφράζεται σε ανθρώπινους καρκίνους συμπεριλαμβανομένου CRC [3]. Υψηλά επίπεδα αντιαποπτωτικών πρωτεΐνες έχουν δειχθεί ότι συνεισφέρουν στην κακή απόκριση θεραπεία και για την προώθηση της προόδου του όγκου. Για παράδειγμα, Bcl-x

έκφραση L συσχετίζεται με μετάσταση λεμφαδένα, κακή διαφοροποίηση και υψηλότερο στάδιο Duke στο CRC [14]. πρότυπα έκφρασης των Mcl-1 είναι προγνωστικά για την ανταπόκριση θεραπεία σε ασθενείς με διάγνωση μετάσταση CRC [15]. Ως εκ τούτου, οι μεγάλες προσπάθειες έχουν γίνει για να στοχεύσετε αντιαποπτωτικού πρωτεϊνών Bcl-2 με στόχο τον καρκίνο επαγωγής κυτταρικού θανάτου [16]. Είναι σημαντικό ότι, βαθύτερη μηχανιστική και δομικές ιδέες οδήγησε στην ανάπτυξη του μικρού μορίου αναστολείς αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2. Αυτή η κατηγορία μικρών μορίων δρα με σύνδεση προς το υδρόφοβο ΒΗ3-σχισμή του αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2 που μιμούνται τον τρόπο αυτό προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2 και την προώθηση κυτταρικό θάνατο [17]. έχουν την Ασφάλεια και τη δόση εξεύρεση δοκιμές με Obatoclax έχουν πραγματοποιηθεί σε στερεά κακοήθειες και λέμφωμα [18], [19]. Παρά το γεγονός ότι BH3-μιμητικά έχουν ήδη εισέλθει πρώιμες κλινικές δοκιμές, μόνο λίγοι είναι γνωστά για τις επιδράσεις της Bcl-2 αναστολή πρωτεΐνη εκτός από τη ρύθμιση του κυτταρικού θανάτου [18], [19]. Δείξαμε πρόσφατα ότι ένα knockdown του Mcl-1, Bcl-2 ή ΒοΙ-χ

L αναστέλλει εντυπωσιακά διηθητικότητα των κυττάρων CRC. Σε αυτήν την προηγούμενη μελέτη, μια knockdown ενός ενιαίου πρωτεΐνης Bcl-2 (Mcl-1, Bcl-2 ή ΒοΙ-χ

L) ήταν αρκετή για να εμποδίσει τη μετανάστευση και εισβολή [7].

Με βάση αυτές οι προηγούμενες εκθέσεις, η μελέτη μας αποσκοπεί στη διερεύνηση του δυναμικού των Bcl-2 ανασταλτική μικρά μόρια ως υποψήφια φάρμακα για τη θεραπεία CRC

in vitro

. Πρώτον, συνέκρινε την αποτελεσματικότητα του Bcl-2 και Bcl-x

αναστολέας L ΑΒΤ-737 με την παν-Bcl-2 αναστολέα Obatoclax. Μια άμεση σύγκριση των δύο αναστολέων επιτρέπει διακριτικό αποτελέσματα μιας ευρείας αναστολής παν-Bcl-2 με Obatoclax από ένα πιο συγκεκριμένο τρόπο με τη χρήση ΑΒΤ-737. Παρά το γεγονός ότι και οι δύο αναστολείς παρουσίασαν σημαντική τοξικότητα σε κλινικές δοκιμές, οι ενώσεις αυτές μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως εργαλεία για προκλινικές

in vitro

-Δοκιμή του Bcl-2 αναστολή [19] – [22]. ΑΒΤ-737 έχει δειχθεί ότι συνεργούν με οξαλιπλατίνη και celecoxib σε θανάτωση κυττάρων CRC [23], [24]. Παρατηρήσαμε δοσοεξαρτώμενη επαγωγή της απόπτωσης που προκαλείται από ABT-737 σε όλες τις κυτταρικές σειρές ερευνήθηκε. Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι η αντίσταση προς ΑΒΤ-737 μπορεί να οδηγείται από τα υψηλά επίπεδα του Mcl-1 μέσω αναστολής της προαποπτωτικών NOXA [25]. Πολύ πρόσφατα, έχει αποδειχθεί ότι τα καρκινικά κύτταρα σε συνθήκες υποξίας ξαναευαισθητοποιημένου να ΑΒΤ-737 από την απώλεια Mcl-1 [26]. Από επιπτώσεις της ΑΒΤ-737 είναι σαφώς προ-αποπτωτικών και τους καθοριστικούς παράγοντες για την ευαισθησία στην CRC είναι καλά τεκμηριωμένη, αποφασίσαμε να εστιάσουμε περισσότερο στην αντικαρκινική δράση της Obatoclax.

Σε έντονη αντίθεση με ABT-737, Obatoclax δεν οδήγησε σε σημαντική επαγωγή κυτταρικού θανάτου σε κύτταρα CRC. Στη μελέτη μας, Obatoclax δόσεις που χρησιμοποιήθηκαν ήταν κλινικά σημαντικές, όπως αναφέρεται σε δοκιμές φάσης Ι, και δεν φθάνουν την ένωση IC

50 αναφερθεί για Obatoclax [19], [27] Είναι ενδιαφέρον ότι, η θεραπεία Obatoclax οδήγησε σε σταθερή ή αύξηση των επιπέδων έκφρασης του συνόλου των πρωτεϊνών αντιαποπτωτικών Bcl-2 διερευνηθεί. Μια άλλη μελέτη έδειξε αρνητική ρύθμιση της αντιαποπτωτικού πρωτεϊνών Bcl-2 υπό Obatoclax θεραπεία σε κύτταρα λεμφώματος [10]. Δεδομένου ότι αυτή η μελέτη καταδεικνύει την απόπτωση των κυττάρων λεμφώματος που προκαλείται από Obatoclax, μειωμένα επίπεδα αντιαποπτωτικών πρωτεΐνες μπορεί να είναι δευτερεύουσα στην πορεία του κυτταρικού θανάτου και όχι ενεργοποιείται από ένα άμεσο δεσμευτικό αποτέλεσμα των Obatoclax.

Knockdown ή υπερέκφραση του Mcl-1 , Bcl-2 ή ΒοΙ-χ

L δεν καθυστερεί την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και τον πολλαπλασιασμό σε κύτταρα CRC [7]. Αντίθετα, χαμηλή δόση θεραπείας Obatoclax προκάλεσε καθυστερημένη πολλαπλασιασμό στη μελέτη μας. Ανακαλύψαμε μια σύλληψη G1 φάσης που συνοδεύεται από απώλεια της έκφρασης κυκλίνης D1 και προς τα πάνω ρύθμιση του p21 και ρ27. Κυκλίνη D1 (CD1) είναι το πιο σημαντικό G1 φάσης Κυκλίνης και έχει αναφερθεί ως ένα ογκογόνο οδηγός σε καρκινικά κύτταρα. έκφραση CD1 συνδέεται με νεοπλασματικό μετασχηματισμό και την αυξημένη κακοήθεια στον καρκίνο [12]. Η μετάβαση G1 /S-φάσης ρυθμίζεται αυστηρά από CDKIs όπως p21 και p27 μέσω απενεργοποίησης των εξαρτώμενων G1 κυκλίνης-κυκλίνη κινασών (CDK) συγκροτήματα [13], [28]. Στο σύνολό τους, τα δεδομένα μας αποκαλύπτουν ένα νέο κυτταρικό κύκλο ρύθμισης ιδιοκτησίας του Obatoclax μέσω σύλληψη G1 φάσης. Η επίδραση αυτή δεν ανταγωνίστηκε από υπερέκφραση αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2. Επιπλέον, ούτε η υπερέκφραση του αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2 ούτε ΑΒΤ-737 πρόοδο του κύκλου προσβεβλημένο κύτταρο. Η καθυστέρηση του κυτταρικού κύκλου και αλλοιώνοντας ανεξέλεγκτη ανάπτυξη των κυττάρων CRC είναι προφανώς ένα Bcl-2 πρωτεΐνη ανεξάρτητη επίδραση του Obatoclax. Ακόμη και αν οι ακριβείς υποκείμενοι μηχανισμοί και οι σχετικές στόχοι παραμένουν ασαφείς, μπορεί να είναι δυνατό ότι η σηματοδότηση του mTOR παίζει ρόλο σε αυτό το πλαίσιο. Μια συνδετική δραστικότητα του Obatoclax να mTOR, καθώς και μια καθυστερημένη αναστολή στάδιο autophagy έχουν πρόσφατα αναφερθεί και θα μπορούσε να παίξει ένα ρόλο αιτιολογικός για τις περιγραφόμενες αντιπολλαπλασιαστικά αποτελέσματα [29], [30]. Περαιτέρω αξιοπρεπή μοριακές αναλύσεις δικαιολογείται να τεμαχίσει Obatoclax σχετικές επιπτώσεις για τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Για παράδειγμα, CDKs μπορούν να ερευνηθούν ως πιθανοί στόχοι της Obatoclax σε μελλοντικές μελέτες.

Τα συμβατικά χημειοθεραπευτικά είναι πιο αποτελεσματικά στη διάδοση των καρκινικών κυττάρων. Ακόμα και αν έχουμε αποδείξει σαφώς ότι Obatoclax μειώνει τις πολλαπλασιαστικές ιδιότητες των κυττάρων CRC, τα δεδομένα μας αποδεικνύει Obatoclax ικανότητα να ξεπεράσει την αντίσταση του κυτταρικού θανάτου προς την οξαλιπλατίνη στα κύτταρα SW480. Το θεραπευτικό δυναμικό του συνδυασμού πλατίνας που βασίζεται σε σχήματα χημειοθεραπείας με Obatoclax προκειμένου να ξεπεράσει την αντίσταση της απόπτωσης έχει ήδη αναφερθεί και υπογραμμίζεται περαιτέρω από τα δεδομένα μας [31], [32]. Σε κύτταρα καρκινώματος του οισοφάγου, Obatoclax είχε συνεργιστική δραστηριότητες μαζί με 5-FU [32]. Στη μελέτη μας, συνεργιστικά αποτελέσματα της Obatoclax περιορίζονταν στην οξαλιπλατίνη δείχνοντας σε έναν τύπο καρκινικού κυττάρου εξαρτάται αποτέλεσμα. Οι ισχυρές επιδράσεις της Obatoclax στην αυτοφαγία έχουν αποδειχθεί σε αρκετές πρόσφατες μελέτες [32] – [34]. Ωστόσο, η σημασία της Obatoclax που προκαλείται από σηματοδότηση αυτοφαγία παραμένει άπιαστο για CRC

Μετανάστευση και την εισβολή αποτελούν προϋποθέσεις των καρκινικών κυττάρων εξάπλωσης, οδηγώντας σε τοπική εισβολή και τη μετάσταση μακρινό όργανο [35] -. [37]. Η ομάδα μας απέδειξε πρόσφατα ρυθμιστικές λειτουργίες της αντιαποπτωτικού πρωτεϊνών Bcl-2 για τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων CRC ανεξάρτητη από τον κυτταρικό θάνατο και τον πολλαπλασιασμό [7]. Υπό το πρίσμα του γεγονότος ότι Obatoclax δεν θα μπορούσε να προκαλέσει αρκετά θάνατο σε κύτταρα CRC, ερευνήσαμε τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων CRC υπό θεραπεία Obatoclax. Εντυπωσιακά, χαμηλή δόση Obatoclax μπλοκάρει τη μετανάστευση και την εισβολή σε όλες τις κυτταρικές σειρές ερευνήθηκε. Μακροπρόθεσμες 3D κυτταρικής καλλιέργειας των κυττάρων υπό θεραπεία CRC Obatoclax επιβεβαίωσε αυτή αποκλεισμό της μετανάστευσης παρά την έλλειψη επαγωγή κυτταρικού θανάτου. Είναι σημαντικό ότι, η μετανάστευση έχει αποκλειστεί από Obatoclax σε ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές όπως ΟοΙο205 και CaCo2. Καντερίνες είναι σημαντικοί ρυθμιστές της κυτταρικής προσκόλλησης και εμπλέκονται σε μεγάλα δίκτυα σηματοδότησης όπως Wnt. Έχει δειχθεί ότι μια υπό όρους εντερική ειδικό knockout του Ε-καδερίνης προκάλεσε αυξημένη μετανάστευση και τον πολλαπλασιασμό στο έντερο [38]. Από την άλλη πλευρά, η έκφραση της Ε-καδερίνης επιβραδύνθηκε μετανάστευση και πολλαπλασιασμό στα εντερικά κρύπτες [39]. Σε παχέος καρκινογένεση, λειτουργική εξάλειψη του E-Καντερίνες αντιπροσωπεύει ένα σημαντικό βήμα στην απόκτηση της εισβολής [40]. Εμείς, ως εκ τούτου, με στόχο να διερευνήσει αλλαγές στην έκφραση Ε-καδερίνης. Έχουμε αποδείξει μια βαθιά αποκατάσταση της Ε-καδερίνης σε κύτταρα CRC υπό θεραπεία με Obatoclax. Ωστόσο, Ε-καδερίνη αυξητική ρύθμιση μπορεί να αντιπροσωπεύει το μοριακό διακόπτη πίσω σε μια λιγότερο επεμβατική φαινότυπο των κυττάρων που προκαλείται από CRC Obatoclax.

Είναι σημαντικό ότι, και σε αντίθεση με τη λειτουργία αναστολής αύξησης του Obatoclax, μετανάστευση πλήρως αποκαταστάθηκε στα κύτταρα CRC υπερεκφράζουν Mcl-1, Bcl-2 ή ΒοΙ-χ

L. Στο πλαίσιο της διεισδυτικότητας, αντιαποπτωτικών πρωτεΐνες Bcl-2 εμφανίζονται ως τα κύρια επηρεάζονται στόχους. Αυτό είναι σύμφωνο με την προηγούμενη έκθεση μας δείχνει μια ρυθμιστική λειτουργία του αντιαποπτωτικού πρωτεϊνών Bcl-2 για τη διεισδυτικότητα των κυττάρων CRC χωρίς να επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό ή την επαγωγή κυτταρικού θανάτου [7]. Άλλες μελέτες υποστηρίζουν την υπόθεση ότι οι πρωτεΐνες Bcl-2 είναι σημαντικά για τη μετάσταση [41] – [43]. Αντιστρόφως, ΑΒΤ-737 αγωγή δεν επαρκεί για να εμποδίσει τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων CRC. Στη μελέτη μας, δείχνουμε ότι Obatoclax είναι ικανή να αναστέλλει αμφότερα, τη μετανάστευση και την εισβολή, ακόμη και σε πολύ χαμηλές δόσεις. Αυτή η επίδραση του Obatoclax είναι νέα και σημαντικά, ακόμη και σε κυρίως ανθεκτικά κύτταρα. Από ABT-737 δεν αναστέλλει τη μετανάστευση, προτείνουμε ένα χαρακτηριστικό παράγοντα-ειδικό και μοναδικό του Obatoclax εντός της ομάδας των ενώσεων που στοχεύουν πρωτεϊνών Bcl-2.

Συμπέρασμα

Με βάση τα στοιχεία του μας μελέτη, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι ο αναστολέας Pan-Bcl-2 Obatoclax εξουδετερώνει διάφορες βιολογικές διαδικασίες που αφορούν την εξέλιξη του όγκου. Η αποτελεσματικότητα του Obatoclax επί CRC κυττάρων είναι ευρεία και περιλαμβάνει ένα κυτταρικό θάνατο ανεξάρτητη αλλά πρωτεΐνης Bcl-2 εθισμένος αναστολή της μετανάστευσης. Το δεύτερο σημαντικό αποτέλεσμα επηρεάζει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και είναι ανεξάρτητη από πρωτεΐνη Bcl-2 στόχευσης. Έτσι, παν-Bcl-2 αναστολή, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης ειδικών και λιγότερο τοξικές αναστολείς, είναι μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για τη θεραπεία CRC και θα πρέπει να αναλυθούν περαιτέρω, π.χ. σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία.

Υλικό και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια και κυτταρικές σειρές

κυτταρικές σειρές CRC ΗΤ29, SW480, CaCo2 και ΟοΙο205 αγοράστηκαν από την ATCC. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε υγρή ατμόσφαιρα (37 ° C, 5% CO

2) σε RPMI + Glutamax (Gibco, Καρλσρούη, Γερμανία) συμπληρωμένο με 10% FCS (ΡΑΑ Laboratories, Cölbe, Γερμανία), 1% Pen /Strep (ΡΑΑ Laboratories), 1% HEPES (Gibco) και 1% μη βασικά αμινοξέα (ΝΕΑΑ, Gibco). Obatoclax και ΑΒΤ-737 αγοράστηκαν από Selleckchem (Μόναχο, Γερμανία), οξαλιπλατίνη από την Sigma-Aldrich (Μόναχο, Γερμανία).

βιωσιμότητα και ανάπτυξη των κυττάρων δοκιμής

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 12 φρεατίων και 24 ώρες μετά την σπορά επιμολυσμένα ή να αντιμετωπίζονται όπως υποδεικνύεται. Η ανάπτυξη των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας έναν χρωματομετρικό προσδιορισμό 3- (4, 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2, βρωμιούχο 5-διφαινυλτετραζόλιο (ΜΤΤ) όπως περιγράφεται [7].

ποσοτική πραγματικού χρόνου αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (q-RT PCR)

Απομόνωση ολικού RNA και σύνθεση cDNA διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [44]. Q-RT PCR χρησιμοποιώντας κιτ δοκιμασίας εκκινητή (Qiagen, Hilden, Germany). Η απόκτηση των δεδομένων και καθορισμός της γονιδιακής έκφρασης εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το πακέτο λογισμικού LightCycler (Roche, Mannheim, Germany). Κάθε αντίδραση PCR διεξήχθη εις διπλούν. mRNA έκφραση κανονικοποιήθηκε με την έκφραση του γονιδίου οικοκυρικής GAPDH.

Ανίχνευση απόπτωσης και διανομής φάση του κυτταρικού κύκλου

Την μία ημέρα μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως ενδείκνυται για 48 ώρες. Το υπερκείμενο μεταφέρθηκε σε σωλήνες FACS και τα κύτταρα στη συνέχεια ήπια αποκολλήθηκαν χρησιμοποιώντας Accutase. Μετά από φυγοκέντρηση, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε ένα υποτονικό ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 0.1% (w /v) κιτρικό νάτριο, 0,1% (ν /ν) Triton Χ-100 και 50 μg ml /ιωδιούχου προπιδίου (Sigma-Aldrich). Μετά από 1 h επώαση στους 4 ° C, η συνολική περιεκτικότητα DNA των κυττάρων μετρήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του Nicoletti

et al.

Χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής [45]. Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου διεξήχθη χρησιμοποιώντας FACS Diva 6 (Becton Dickinson) και FlowJo 7.6.5. (Δέντρο Αστέρι Inc.). Τα κύτταρα που αντιπροσωπεύουν το κλάσμα υπο-G1 απεικονίστηκαν ως αποπτωτικά.

Η κυτταρική λύση, SDS-PAGE, κηλίδωση Western και πυκνομετρία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 καλά, καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες και αντιμετωπίζονται ως υποδεικνύεται. Η κυτταρική λύση, SDS-PAGE και κηλίδωση Western έγιναν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [46].