Αφηρημένο

Gambogic οξύ (GA), το κύριο δραστικό συστατικό της ρητίνης Gamboge, έχει ισχυρή αντικαρκινική δράση τόσο

in vivo

και

in vitro

. Ωστόσο, οι υποκείμενες μοριακοί μηχανισμοί παραμένουν ασαφείς. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι μπορούσε να κινήσει GA αυτοφαγία σε ορθοκολικό καρκίνο κύτταρα, και η αναστολή της διαδικασίας autophagy επιτάχυνε την επίδραση της πολλαπλασιαστικής αναστολής και αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο που επάγεται από GA, υπονοώντας ένα προστατευτικό ρόλο του αυτοφαγία. Δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση πρωτεομική που βασίζεται έδειξαν ότι η θεραπεία GA μετέβαλε την έκφραση πολλαπλών πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην οξειδοαναγωγική σηματοδότηση και τον μεταβολισμό των λιπιδίων. Λειτουργικές μελέτες αποκάλυψαν ότι GA-επαγόμενη απορύθμιση του μεταβολισμού των λιπιδίων θα μπορούσε να ενεργοποιήσει την 5-λιποξυγενάση (5-LOX), με αποτέλεσμα ενδοκυτταρική συσσώρευση ROS, που ακολουθείται από την αναστολή της Akt-mTOR σηματοδότηση και την έναρξη αυτοφαγία. Τέλος, τα αποτελέσματα χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος προτεινόμενες ROS προκαλούμενη autophagy προστασία έναντι της κατά του όγκου αποτέλεσμα της GA. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα έδειξαν νέες βιολογικές δραστηριότητες του GA κατά ορθοκολικού καρκίνου βασίζεται η προστατευτικός ρόλος των ROS που προκαλείται αυτοφαγία. Η μελέτη αυτή θα παρέχει πολύτιμες πληροφορίες για μελλοντικές μελέτες σχετικά με τις αντικαρκινικές τους μηχανισμούς της GA

Παράθεση:. Zhang Η, Lei Υ, Yuan P, Li L, Luo C, Gao R, et al. (2014) ROS-διαμεσολαβούμενη Autophagy Induced από δυσ-ρύθμιση του μεταβολισμού των λιπιδίων παίζει προστατευτικό ρόλο για τον καρκίνο του παχέος κύτταρα επεξεργασμένα με Gambogic Οξύ. PLoS ONE 9 (5): e96418. doi: 10.1371 /journal.pone.0096418

Επιμέλεια: Spencer B. Gibson, Πανεπιστήμιο της Μανιτόμπα, Καναδά

Ελήφθη: 25 Δεκεμβρίου 2013? Δεκτές: 7 Απρίλη 2014? Δημοσιεύθηκε: May 8, 2014

Copyright: © 2014 Zhang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (αριθμός Grant: 30672480), Εθνικό υψηλής Τεχνολογίας Έρευνας και του Προγράμματος Ανάπτυξης της Κίνας (863 Προγράμματος? No.2012AA020201), την Εθνική 973 Βασική Ερευνητικό Πρόγραμμα της Κίνας (2013CB911300) και την Εκπαίδευση Τμήμα Hubei επαρχία της επιστήμης και της τεχνολογίας ερευνητικά προγράμματα των εκκρεμών νέους έργου ταλέντο (Q20091207). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η τρίτη κύρια αιτία του καρκίνου και η τέταρτη για θανάτους από καρκίνο σχετίζονται με όλο τον κόσμο [1], [2]. Αν CRC μπορεί να διαγνωστεί και αντιμετωπιστεί σε πρώιμο στάδιο, περίπου το ήμισυ των ασθενών CRC μπορεί να θεραπευτεί με χειρουργική επέμβαση και πολυτροπικές θεραπεία πριν συμβεί μετάσταση [3]. Ωστόσο, μέχρι σήμερα αποτελεσματικές στρατηγικές θεραπείας για προχωρημένους CRC είναι περιορισμένες. 40-50% των ασθενών έχουν μεταστατική νόσο, εκ των οποίων το 90% πεθαίνουν εντός 5 ετών από τη διάγνωση [4], [5]. Παρά την αυξανόμενη εξελίξεις στη μοριακή ιατρική, η αποτελεσματική έγκαιρη ανίχνευση, παρακολούθηση και θεραπεία της CRC παραμένει ένα δίλημμα. Ως εκ τούτου, βελτιωμένη συστημική θεραπευτικές στρατηγικές απαιτούνται επειγόντως για την αποτελεσματική εξάλειψη πρωτογενή ή μεταστατικό καρκίνο, για το οποίο ανάπτυξη νέων φαρμάκων μπορεί να είναι ευεργετική

Gambogic οξύ (GA?. C

38Η

44ο

8, ΜΒ 628,76), ένα polyprenylated xanthone, είναι ένα σημαντικό δραστικό συστατικό που απομονώνεται από Gamboge

Garcinia

[6], [7]. Έχει αναφερθεί στην παραδοσιακή κινεζική ιατρική που Gamboge είναι κρύο, όξινη, καυστική και δηλητηριώδη [8]. Στη Νοτιοανατολική Ασία, GA έχει μια μακρά ιστορία της χρήσης για αποτοξίνωση, ομοιόσταση, αντι-φλεγμονώδη και παρασιτοκτόνο φάρμακα [7], [9], [10], [11]. Κατά τον τελευταίο μισό αιώνα, φαρμακολογικές μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι GA έχει ισχυρή αντικαρκινική δράση έναντι διαφόρων όγκων συμπεριλαμβανομένων των ανθρώπινων λευχαιμία, ηπάτωμα, του στόματος, του μαστού, του στομάχου, του παγκρέατος, του προστάτη, του επιθηλίου του τραχήλου της μήτρας και καρκίνο του πνεύμονα [9], [12], [ ,,,0],13]. Πρόσφατα, GA έχει επίσης αναφερθεί ότι έχει μια αξιοσημείωτη επίδραση κατά του όγκου για κύτταρα CRC

in vivo

και

in vitro

[14], [15]. Λόγω του ευρέως φάσματος δραστικότητα κατά του όγκου με ελάχιστη τοξικότητα σε φυσιολογικά κύτταρα, GA έχει εγκριθεί από την κινεζική Food and Drug Administration για την αντιμετώπιση διαφόρων καρκίνων και έχει τελειώσει φάση II των κλινικών δοκιμών [7], [16]. Παρά το γεγονός ότι η χημική δομή GA είχε εντοπιστεί στη δεκαετία του 1980 και από τα δύο λεπτομερή NMR και ακτίνων-Χ κρυσταλλογραφικές μελέτες [12], [17], [18], και των μηχανισμών πολλαπλής αντικαρκινική (συμπεριλαμβανομένης της επαγωγής προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου, ρύθμιση κυτταρικού κύκλου, κατάθλιψη τελομεράσης, ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων, αναστολή αγγειογένεσης, αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS)

κλπ.

) έχουν προταθεί από έναν αριθμό ερευνητικών ομάδων παγκοσμίως, [7], [12], [13], [18] , [19], [20], οι μοριακοί μηχανισμοί που αφορούν ισχυρή αντικαρκινική δράση της παραμένει ασαφής και απαιτούν περαιτέρω διερεύνηση.

η αυτοφαγία είναι μια εξαιρετικά διατηρημένη καταβολική διαδικασία που χαρακτηρίζεται από τη μεταφορά των κυτταρικών συστατικών από αυτοφαγοσώματα δύο στρώσεων σε λυσοσώματα για υποβάθμισης και της ανακύκλωσης σε απάντηση σε θρεπτικά συστατικά πείνα ή μεταβολικό στρες [21]. Autophagosome πυρήνων ενεργοποιείται από τον ΙΙΙ-Atg6 /Beclin 1 σύμπλοκο ΡΙ3 κινάσης τύπου, ενώ η επιμήκυνση παρακολουθείται από /LC3-φωσφατιδυλαιθανολαμίνη συζυγούς συστήματα, και τα δύο από τα οποία είναι βασικά χαρακτηριστικά της autophagy [21], [22] Atg12-Atg5 και Atg8 , [23]. Autophagy μπορεί να προκληθεί από έναν αριθμό χημειοθεραπευτικών παραγόντων, όπως το τριοξείδιο του αρσενικού και οξαλιπλατίνη [24], [25]: Ωστόσο, ο ρόλος της αυτοφαγία στον καρκίνο είναι αμφιλεγόμενη [26], [27], [28]. Μια ρυθμιζόμενη αυτοφαγικά απάντηση μπορεί να εξασφαλίσει τη φυσιολογική του κύκλου εργασιών των κατεστραμμένων οργανίδια και μακρομορίων ανακυκλώνονται για την κάλυψη των ενεργειακών αναγκών σε απάντηση κυτταροτοξικών φαρμάκων, οδηγώντας σε παρατεταμένη επιβίωση των κυττάρων [26], [29]. Αντίθετα, μια μαζική συσσώρευση αυτοφαγικά κενοτόπια μπορεί να οδηγήσει είτε σε αυτοφαγικά κυτταρικό θάνατο (II προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος τύπου), ή μία ύστατη προσπάθεια του κυττάρου να επιβιώσει ανάλογα με τον τύπο του όγκου, το στάδιο, γενετική πλαίσιο και τον περιβάλλοντα κυτταρικό περιβάλλον [26] , [29], [30]

Αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) είναι ένας συλλογικός όρος που καλύπτει ατελής αναγωγή του οξυγόνου, όπως το ανιόν υπεροξειδίου (O

2

-)., υπεροξείδιο του υδρογόνου (H

2O

2) και της ρίζα υδροξυλίου (ΗΟ •) [31], [32]. Οι κύριες πηγές των κυτταρικών ROS που δημιουργούνται από τη μιτοχονδριακή αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων (Mito-ETC), η οξειδάση του NADPH (NOX), πολύπλοκα και η ενδοπλασματικό δίκτυο [31], [32]. Τα καρκινικά κύτταρα από προχωρημένους όγκους στάδιο συχνά επιδεικνύουν υψηλή οξειδωτικό στρες, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα αυξημένα επίπεδα ROS διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην πρόοδο του όγκου και επίσης να δημιουργήσουν τα καρκινικά κύτταρα με χαμηλότερο ανοχή για ROS [33], [34]. Η ενεργοποίηση των ογκογονιδίων, απώλεια της λειτουργικής ρ53, παρεκκλίνουσα του μεταβολισμού και η χημική επεξεργασία έχουν αναφερθεί ότι αυξάνουν την παραγωγή ROS σε καρκινικά κύτταρα [33], [34]. Η ενδοκυτταρική ομοιοστασία οξειδοαναγωγής αποτελεί καθοριστικό παράγοντα της κυτταρικής τύχης: η υπερβολική παραγωγή των ROS συνήθως οδηγεί σε κυτταροτοξικά αποτελέσματα και μπορεί να οδηγήσει σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, ενώ μέτρια επίπεδα ROS μπορεί να λειτουργήσει ως ένα δεύτερο αγγελιοφόρο για τη ρύθμιση των διαφόρων κυτταρικών διαδικασιών, όπως η κυτταρική επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό και τη μετάσταση [35], [36], [37]. Η συσσώρευση των ROS έχει αναφερθεί να συνδέσουν με την έναρξη της αυτοφαγία και να συμμετέχουν πάντα στην έκβαση της αυτοφαγία (κυτταρικής επιβίωσης ή θανάτου) [38], [39]. Είναι γενικά αποδεκτό ότι ROS μπορεί να προκαλέσει την αυτοφαγία, και ότι αυτοφαγία, με τη σειρά της, βοηθά στην κάθαρση του υπερβολικού ROS να προστατεύουν τα κύτταρα από οξειδωτική βλάβη, η οποία μπορεί να αντανακλά την ισορροπία του είτε κυτταρικής επιβίωσης ή θανάτου [28], [38], [39].

Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι GA μπορεί να προκαλέσει τη συσσώρευση των ROS σε καρκινικά κύτταρα που συμβάλλουν στην αντικαρκινική δραστηριότητα [40], [41], [42], ενώ αυτοφαγία μπορεί να αναστείλει το θεραπευτικό αποτέλεσμα της GA σε κύτταρα γλοιοβλαστώματος [43]. Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι GA θα μπορούσε να προωθήσει την απόπτωση και την αυτοφαγία σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα

in vitro

και

in vivo

, και η αναστολή της αυτοφαγία ενίσχυσε την ευαισθησία έναντι της θεραπείας GA. Επιπλέον, απαιτήθηκε η συσσώρευση των ενδοκυττάριων ROS που απορρέουν από 5-LOX για GA-που προκαλείται από αυτοφαγία.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture και αντιδραστήρια

κυττάρων ανθρώπινου καρκινώματος κόλου γραμμές, HCT116 και SW620, και η μυϊκή κυτταρική γραμμή καρκινώματος κόλου C26 αγοράσθηκαν από την ATCC. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, 10

5 U /L πενικιλλίνη και 100 mg /L στρεπτομυκίνη στους 37 ° C σε ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2.

Τα ακόλουθα αντιδραστήρια χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη: Gambogic οξύ (Γαία Chemical Corp, G1000), ΜΤΤ (Sigma, Μ2128), 3-μεθυλαδενίνη (3-ΜΑ) (Sigma, M9281), NAC (Sigma, A9165), Z-VAD -fmk (Sigma, V116), πορτοκαλί της ακριδίνης (Sigma, A6014), διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) (Sigma, D2650) αποκυνίνη (Sigma, A10809), Rotenone (Sigma, R8875), νορδιυδρογουαϊαρετικό οξύ (NDGA) (Sigma, 74540) , πεπστατίνη Α (Sigma, P4265), Ε64ϋ (Sigma, E8640). Για την αποθήκευση, ένα mM διαλύματος GA 10 παρασκευάστηκε σε DMSO, φυλαγμένο στους -20 ° C, και στη συνέχεια αραιώθηκε όπως απαιτείται σε μέσο καλλιέργειας

Αντισώματα έναντι των ακόλουθων πρωτεϊνών χρησιμοποιήθηκαν:. Διασπασμένη κασπάση 3 (κυτταρική σηματοδότηση , 9664S), Beclin 1 (Santa Cruz, SC-11427), LC3 (Abcam, ab58610), Atg5 (Abcam, ab78073), ATG7 (Abcam, ab53255), Ρ62 (Abcam, ab91526), ​​5-LOX (Abcam, ab39347 ), ακτίνη (Santa Cruz, sc-1616), Akt (Cell σηματοδότησης, 4685), φωσφόρου-Akt (Cell σηματοδότησης, 4051), mTOR (Cell σηματοδότησης, 2983), φωσφόρου-mTOR (Cell σηματοδότησης, 2971), S6K p70 (Santa Cruz, sc-9027), φώσφορο-P70 S6K (Santa Cruz, 7984-R), υπεροξειδάση κοχλιαρίας (HRP) δευτερογενές αντίσωμα αντι-κουνελιού (Santa Cruz, sc-2004), HRP-συζευγμένο αντι-ποντικού δευτερογενούς αντίσωμα (Santa Cruz, sc-2005).

Βιωσιμότητας κυττάρων Δοκιμασία

τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας 96-φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία για 12 ώρες, 24 ώρες και 36 ώρες αντίστοιχα. Στη συνέχεια η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ [44]. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 490 nm (μήκος κύματος δοκιμής) και 570 nm (μήκος κύματος αναφοράς) με ένα πολυ-καλά φασματοφωτόμετρο (MDC, Sunnyvale, CA).

Annexin V-FITC /ΡΙ Double-επισημασμένο Κυτταρομετρίας Ροής

Για την ανίχνευση της αποπτωτικά λόγος των κυττάρων σε επεξεργασία με GA (0.25, 0.5 ή 1.0 μΜ), η έκφραση αννεξίνης V-FITC και ο αποκλεισμός του ΡΙ ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας δύο χρωμάτων κυτταρομετρία ροής (FCM). HCT116 ή SW620 κύτταρα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας σωλήνες ΕΡ, πλύθηκε δύο φορές με PBS και επαναιωρήθηκαν σε 500 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης. Τα δείγματα επωάστηκαν με 5 μL Annexin V-FITC για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια προστέθηκαν 5 μL ΡΙ. Κάθε δείγμα επωάστηκε για περαιτέρω 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι πριν από την ένταση φθορισμού ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής (Beckman Coulter, Miami, FL, USA).

GFP-LC3 Χρώση αυτοφαγοσώματα

HCT116 και SW620 κύτταρα επιμολύνθηκαν με ένα πλασμίδιο pEGFP-LC3 (που αναφέρεται ως GFP-LC3) χρησιμοποιώντας λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen, 11668027) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ο φθορισμός της GFP-LC3 θεωρήθηκε και ο ρυθμός σχηματισμού χυμοτόπια GFP-LC3-σημασμένο (αυτοφαγοσώματα) μετρήθηκε κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού [45], [46]. Κύτταρα με κουκκίδες στικτή GFP-LC3 ορίστηκαν ως θετική εάν τα κύτταρα που είχαν 5 ή περισσότερα GFP-LC3 τελείες στο κυτταρόπλασμα [47].

Ανίχνευση των όξινων φυσαλιδώδους Οργανίδια

κύτταρα (1 × 10

5) επιστρώθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων. Μετά την αγωγή του φαρμάκου, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με 1 μg /mL πορτοκαλί ακριδίνης για 15 λεπτά, πλύθηκαν με PBS και εξετάστηκαν με μικροσκοπία φθορισμού [48], [49].

Ηλεκτρονική Μικροσκοπία

Τα κύτταρα συγκομίζονται, σφαιροποιήθηκαν και σταθεροποιήθηκαν σε παραφορμαλδεΰδη (0,1% γλουταραλδεΰδη σε 0,1 Μ κακοδυλικό νάτριο) για 2 ώρες, σταθεροποιήθηκαν με 1% ΟΣΟ

4 για 1,5 ώρα, πλύθηκαν και τελικώς χρωματίστηκαν για 1 ώρα σε 3% υδατικό οξικό ουρανύλιο. Τα δείγματα κατόπιν ξεπλύθηκαν με νερό και πάλι, αφυδατώνονται με διαβαθμισμένη αλκοόλη (50%, 75% και 95-100% αλκοόλη) και ενσωματωμένα σε Εροη-Araldite ρητίνη (Canemco, 034). Εξαιρετικά λεπτές τομές κόβονται σε ένα Reichert Ultramicrotome, αντίθετα με 0,3% κιτρικό μόλυβδο και εξετάστηκαν σε ένα Philips EM420 ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Κύτταρα με αυτοφαγικά κενοτόπια ορίστηκαν ως θετική εάν είχαν 5 ή περισσότερα αυτοφαγικά κενοτόπια. Η περιοχή που καταλαμβάνεται από αυτοφαγικά κενοτόπια και το κυτταρόπλασμα προσδιορίστηκαν με την έκδοση Image Pro Plus ανάλυσης εικόνας Λογισμικό 3 και χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό της κυτταροπλασματική περιοχή που καταλαμβάνεται από τις αυτοφαγικά κενοτόπια [50].

ΤΟΥΝΕΛ Δοκιμασία

δοκιμασία TUNEL πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα αδιέξοδο Φθορομετρικής TUNEL (Promega, G3250) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. TUNEL θετικά κύτταρα εξετάστηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού [51].

παρεμβολή RNA

Atg5

,

Beclin 1, 5-LOX

και αρνητικό μάρτυρα siRNA συντέθηκαν με Genepharma. Οι αλληλουχίες των siRNA ήταν ως εξής: ανθρώπινα

Atg5

siRNA, αίσθηση 5′-GAC Ουυ GGU AAC UGA CAA ΑΤΤ-3 ‘και αντιπληροφοριακό 5′-UUU GUC AGU UAC CAA CGU CTT-3’? ανθρώπινα

Beclin 1

siRNA, αίσθηση 5′-GGA GCC AUU υΑυ UGA AAC UTT-3 ‘και αντιπληροφοριακό 5′-AGU UUC AAU ΑΑΑ UGG CUC CTT-3’. 5-LOX σχεδιάστηκε σύμφωνα με προηγούμενη μελέτη (αλληλουχία στόχευσης: 5′-GCGCAAGTACTGGCTGAATGA-3 ‘? NM_000698) [52]. Το siRNA επιμολύνθηκαν με Lipofectamine 2000 αντιδραστήριο (Invitrogen, 11668027) για 24 ώρες σε κύτταρα HCT116 σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS)

Μέτρηση

επίπεδο Η ενδοκυτταρική ROS ανιχνεύθηκε με χρώση κυττάρων με 2 ‘, 7’-διχλωρο διοξεικό (DCFH-DA) (GENMED, GMS10016.2) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το σήμα DCFH-DA μετρήθηκε με φθοριόμετρο Molecular Devices Spectramax Μ5 (490 nm διέγερση και 530 nm εκπομπή).

Ανοσοστύπωμα

Οι πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν σε ρυθμιστικό RIPA (50 mM Tris-base, 1.0 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% TritonX-100, 1% δεοξυχολικό νάτριο, 1 mM PMSF) και ποσοτικοποιούνται με το κιτ προσδιορισμού πρωτεΐνης DC (Bio-Rad). Τα δείγματα διαχωρίστηκαν με 12% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν για μία νύχτα με Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα με Tween 20 (TBST) (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20) σε 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε 4 ° C, και εν συνεχεία ανιχνεύθηκαν με τη χρήση των πρωτογενών αντισωμάτων: κουνελιού-αντι-Beclin 1 (αραιωμένο 1:500), κουνελιού αντι-Atg5 (αραιωμένο 1:1,000), κουνελιού αντι-ATG7 (αραιωμένο 1:500), κουνελιού αντι-LC3 (αραιωμένο 1:1,000), κουνέλι -αντι-5-LOX (αραιωμένο 1:1,000), κουνελιού αντι-Ακί (αραιωμένο 1:1,000), κουνελιού αντι-φωσφο-Ακί (αραιωμένο 1:1,000), κουνελιού αντι-mTOR (αραιωμένο 1:1,000) , κουνελιού-αντι-φωσφο-mTOR (αραιωμένο 1:1,000). Οι κηλίδες επωάστηκαν με τα αντίστοιχα πρώτα αντισώματα για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από πλύση τρεις φορές σε TBST, τα στυπώματα επωάστηκαν με συζευγμένο με HRP αντι-κουνελιού δευτερογενές αντίσωμα (αραιωμένο 1:5,000) ή HRP-συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα αντι-ποντικού (αραιωμένο 1:6,000) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι κηλίδες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Immobilon δυτική αντιδραστήρια χημειοφωταύγειας (Millipore, WBKLS0500).

Ως μέτρο αυτοφαγικά ροής, ανοσοαποτυπώματα για LC3 εκτελέστηκαν εν απουσία ή παρουσία αναστολέων λυσοσωμικού ενζύμου. ροή LC3 προσδιορίστηκε από την αναλογία της αξίας των πυκνομετρική LC3-ΙΙ σε σχέση με τον αντίστοιχο έλεγχο DMSO-αγωγή χωρίς φαρμακευτική αγωγή όπως περιγράφεται αλλού [23], [53].

2-DE και MS /MS ανάλυση

2-DE και ανάλυση MS /MS διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [54]. Εν συντομία, τα κύτταρα διαλύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (7 Μ ουρία, 2 Μ θειουρία, 4% CHAPS, 100 mM DTT, 0,2% pH3-10 αμφολύτη, Bio-Rad, USA) παρουσία αναστολέα πρωτεάσης (Sigma). Τα δείγματα φορτώθηκαν σε IPG λωρίδες (17 cm, pH3-10NL, Bio-Rad) χρησιμοποιώντας μία μέθοδο παθητικής επανυδάτωση, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε ισοηλεκτρική εστίαση (Bio-Rad). Η δεύτερη διάσταση διαχωρισμός πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας 12% SDS-PAGE μετά την εξισορρόπηση. Τα πήγματα κηλιδώθηκαν με CBB R-250 (Bio-Rad). Ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση της πρωτεΐνης κηλίδες στη γέλη επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας PDQuest λογισμικού (Bio-Rad).

-gel πέψη των πρωτεϊνών πραγματοποιήθηκε με τη χρήση μάζας βαθμού φασματομετρία θρυψίνη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι κηλίδες γέλης αποχρωματίζονται με 100 mM ΝΗ

4HCO

3/50% ακετονιτρίλιο (ACN) και αφυδατωμένο με 100% ACN. Τα πήγματα στη συνέχεια επωάστηκαν με θρυψίνη (Promega, V5280), που ακολουθείται από διπλή εκχύλιση με 50% ACN /5% τριφθοροοξικό οξύ (TFA). Τα πεπτιδικά εκχυλίσματα ξηράνθηκαν σε συμπυκνωτή Speed-Vac (Thermo), και υποβλήθηκαν σε ανάλυση με φασματομετρία μάζας χρησιμοποιώντας ένα Q-TOF φασματόμετρο μάζας (Micromass, Manchester, UK) εφοδιασμένο με μία πηγή ESI.

Ανοσοϊστοχημεία

η ανοσοϊστοχημεία εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το Σύστημα EnVision Dako (Dako Cytomation GmbH, Hamburg, Germany). τομές ιστών συνεχόμενες παραφίνη-ενσωματωμένες (3-5 μm) αποκηρώθηκαν και επανυδατώθηκαν. Το αντιγόνο ανάκτηση διεξήχθη με προεπεξεργασία των διαφανειών σε κιτρικό ρυθμιστικό (ρΗ 6,0) σε ένα φούρνο μικροκυμάτων για 12 λεπτά. Στη συνέχεια πλάκες ψύχθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου σε απιονισμένο νερό. Η ενδογενής δραστικότητα υπεροξειδάσης αποσβέστηκε με επώαση των αντικειμενοφόρων πλακών σε μεθανόλη που περιέχει υπεροξείδιο του υδρογόνου 3%, ακολουθούμενη από πλύση σε PBS για 5 λεπτά μετά το οποίο οι τομές επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με φυσιολογικό ορό κατσίκας και στη συνέχεια επωάστηκαν στους 4 ° C όλη τη νύχτα με το πρωτογενή αντισώματα. Επόμενη οι τομές ξεπλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (PBS με 0.1% αλβουμίνη βόειου ορού) και επωάστηκαν με αντισώματα αντι-κουνελιού υπεροξειδάσης αρμορακίας-συνδεδεμένο κατσίκα που ακολουθείται από αντίδραση με διαμινοβενζιδίνη και αντικηλίδωση με αιματοξυλίνη Mayer του.

μοντέλο ξενομοσχεύματος όγκου

τα πειραματικά πρωτόκολλα πραγματοποιήθηκαν σε συμμόρφωση με την οδηγία του Συμβουλίου Ευρωπαϊκών Κοινοτήτων της 24ης Νοεμβρίου 1986 (86/609 /ΕΟΚ) με την έγκριση της Επιτροπής Δεοντολογίας της Tongji Medical College. Υγιείς θηλυκοί ποντικοί (BALB /c, ηλικίας 6-8 εβδομάδων, μη γόνιμο και 18-20 g το καθένα) ενέθηκαν υποδορίως με κύτταρα C26 (ένα εκατομμύριο κύτταρα ανά ποντικό). Όταν οι όγκοι ήταν περίπου 5 mm × 5 mm σε μέγεθος (συνήθως δέκα ημέρες μετά τον εμβολιασμό), τα ζώα τυχαίως κατά ζεύγη συμφωνημένα σε δύο ομάδες (εννέα ποντικοί ανά ομάδα) ως εξής: μια ομάδα ελέγχου (ενδοπεριτοναϊκή ένεση του οχήματος: 5% DMSO , 50% PEG-400 σε PBS) και μια ομάδα gambogic οξύ (ενδοπεριτοναϊκή ένεση 8 mg /kg gambogic οξύ φορά κάθε δεύτερη ημέρα για έξι φορές). Οι όγκοι των όγκων αξιολογήθηκαν ως εξής: ο όγκος του όγκου (mm

3) = (μήκος Χ πλάτος

2) /2. Τα ζώα θυσιάστηκαν 12 ημέρες μετά την ένεση. Οι όγκοι ανατμήθηκαν και καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο ή μονιμοποιήθηκαν σε φορμαλίνη αμέσως.

Για να δοκιμαστεί η αποτελεσματικότητα των θεραπειών συνδυαστική, όταν οι όγκοι ήταν περίπου 600 mm

3, τα ζώα ήταν ζεύγος αντιστοίχιση σε τέσσερις ομάδες (8 ποντίκια ανά ομάδα): μια ομάδα ελέγχου, GA, GA + NAC, και GA + 3-ΜΑ. Ομάδα ελέγχου: ενδοπεριτοναϊκή ένεση του οχήματος: 5% DMSO, 50% PEG-400 σε PBS. θεραπεία GA: ενδοπεριτοναϊκή ένεση 8 mg /kg gambogic οξύ φορά κάθε δεύτερη ημέρα για δέκα φορές. θεραπεία NAC: ζώα έλαβαν είτε απιονισμένο νερό ή νερό που περιέχει NAC (7 mg /mL? εξουδετερώθηκε σε ρΗ 7.4 με NaOH)? Υποθέσαμε μέσο βάρος ποντικού 25 γραμ και ημερήσια κατανάλωση νερού του 6,7 mL, η υπολογιζόμενη ημερήσια δόση της μητρικής ήταν 1,9 g /kg /d [55]. θεραπείας 3-MA: υποδόριες ενέσεις αλατούχου διαλύματος (έλεγχος) ή 1 mg /kg 3-ΜΑ, και η ένεση επαναλήφθηκε κάθε μέρα [56]. Οι όγκοι των όγκων αξιολογήθηκαν ως εξής: ο όγκος του όγκου (mm

3) = (μήκος Χ πλάτος

2) /2

Στατιστική Ανάλυση Δεδομένων

Συγκρίσεις μεταξύ των δύο ομάδων ήταν. εκτελούνται από δοκιμή Student. Η στατιστική σημαντικότητα ορίσθηκε ως

* ρ & lt? 0,05?

** p & lt? 0,01?

*** p & lt? 0.001

Αποτελέσματα

GA επάγει την απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του παχέος

Για να προσδιοριστεί η επίδραση της. GA επί ορθοκολικού καρκίνου, κύτταρα HCT116 και SW620 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις του GA για 12 ώρες, 24 ώρες ή 36 ώρες, αντίστοιχα. ΜΤΤ δοκιμασία χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η βιωσιμότητα των κυττάρων. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, η θεραπεία με GA είχε σαν αποτέλεσμα πολλαπλασιαστικές αναστολή των κυττάρων HCT116 τόσο σε δόση και χρονικά εξαρτώμενο τρόπο με IC

50 τιμές περίπου 1,1 μΜ, 0,6 μΜ και 0,5 μΜ για 12 ώρες, 24 ώρες και 36 h, αντίστοιχα. SW620 κυττάρων έδειξε μόνο δοσοεξαρτώμενη αναστολή με IC

50 τιμή περίπου 2 μΜ. Επιπλέον, η επίδραση της GA επί ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικό θάνατο εξετάστηκε χρησιμοποιώντας ισοθειοκυανικό αννεξίνης-ν φλουορεσκεΐνη (FITC) και διπλή χρώση ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ), όπως επίσης και προσδιορισμούς TUNEL. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, το ποσοστό αννεξίνης-ν-θετικά κύτταρα, το οποίο είναι ενδεικτικό των νεκρών κυττάρων, ήταν σημαντικά αυξημένη μετά τη θεραπεία με GA. Αυτά τα αποτελέσματα ήταν σύμφωνα με αυτά που λαμβάνονται από τη δοκιμασία TUNEL (Σχήμα 1 C). Στη συνέχεια, εξετάσαμε αν GA-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο ήταν κασπάσης-εξαρτώμενη. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1ϋ, διασπάται-κασπάσης 3 συσσωρεύθηκε κατά την αγωγή GA. Επιπλέον, GA κυτταρικό θάνατο που επάγεται θα μπορούσε να αναστραφεί σημαντικά από έναν αναστολέα παν-κασπάσης, Ζ-VAD-fmk (Σχήμα S1), γεγονός που υποδηλώνει ότι GA προκάλεσε μια κασπάσης-εξαρτώμενη αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο.

(Α) και HCT116 κύτταρα SW620 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του GA για 12 ώρες, 24 ώρες ή 36 ώρες, και ο δείκτης κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε με ανάλυση ΜΤΤ. (Β) HCT116 και SW620 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του GA για 24 ώρες, η κυτταρική απόπτωση ανιχνεύθηκε με ισοθειοκυανικό αννεξίνης-ν φλουορεσκεΐνη (FITC) και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) διπλή χρώση ακολουθούμενη από ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Dot απεικόνιση οικόπεδο αννεξίνης-ν-ΡΙΤΟ φθορισμού έναντι ιωδιούχο προπίδιο φθορισμού παρουσιάζεται σε λογαριθμική κλίμακα. Ζωντανά κύτταρα βρέθηκαν αρνητικά τόσο για αννεξίνη V-FITC και ΡΙ. Πληθυσμοί δοκιμή αννεξίνης V θετική /αρνητική PI ταξινομήθηκαν ως αποπτωτικά κύτταρα σε πρώιμα στάδια, και διπλά-θετικά κύτταρα ταξινομήθηκαν ως νεκρά κύτταρα. διάγραμμα ράβδων που δείχνει το ποσοστό των νεκρών κυττάρων μετά διαφορετικές θεραπείες. (Γ) HCT116 και SW620 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του GA για 24 ώρες, τα νεκρά κύτταρα ανιχνεύθηκαν με προσδιορισμό TUNEL. Οι TUNEL-θετικά κύτταρα μετρήθηκαν από τουλάχιστον 100 τυχαία πεδία. (Δ) Ανάλυση ανοσοαποτύπωσης των διασπασμένης κασπάσης 3 από προϊόντα λύσης HCT116 και SW620 κύτταρα επεξεργασμένα με διάφορες συγκεντρώσεις του GA για 24 ώρες, ή σε επεξεργασία με 1 μΜ GA για 12 ώρες και 24 ώρες.

Η

GA ξεκινά Autophagy στον καρκίνο του παχέος κύτταρα

Για να κατανοήσουμε καλύτερα την αντικαρκινική επίδραση της GA, της υπερδομής των κυττάρων HCT116 επεξεργασία με GA ή DMSO (& lt? 0,1%) αναλύθηκε με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (TEM). Πολυάριθμες δεσμευμένο σε μεμβράνη κενοτόπια, χαρακτηριστικό του αυτοφαγοσώματα, παρατηρήθηκαν στο κυτταρόπλασμα του GA-κατεργασμένων κυττάρων, ενώ κενοτόπια δεσμευμένη σε μεμβράνη θα μπορούσε σπανίως να βρεθεί στα κύτταρα κατεργασμένα με DMSO (Σχήμα 2Α). Επιπλέον, ακριδίνη χρώση πορτοκαλί χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση του σχηματισμού όξινων φυσαλιδώδους οργανίδια (Avós), ένα άλλο σημαντικό χαρακτηριστικό της αυτοφαγία. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, HCT116 κύτταρα κατεργασμένα με GA είχε ως αποτέλεσμα προφανή σχηματισμό Avós κίτρινο-πορτοκαλί σε σύγκριση με τα κύτταρα DMSO-αγωγή.

(Α) άνω πλαίσια. Αντιπροσωπευτικά μικρογραφήματα ηλεκτρονίων μετάδοσης που απεικονίζουν υπερδομές των κυττάρων HCT116 αγωγή είτε με DMSO (έλεγχος, & lt? 0,1%) ή 1 μΜ GA για 24 ώρες. Κάτω πάνελ. Τα κύτταρα με αυτοφαγικά κενοτόπια ορίστηκαν ως κύτταρα που είχαν πέντε ή περισσότερα αυτοφαγικά κενοτόπια. Το ποσοστό των κυττάρων με αυτοφαγοσώματα και το μέσο αριθμό των κενοτοπίων ανά κύτταρο αναλύθηκαν από τουλάχιστον 100 τυχαίως επιλεγέντα πεδία ΤΕΜ. Ράβδοι κλίμακας: 1 μm? 100 nm (υποδεικνύεται διευρύνσεις). (Β) ακριδίνης χρώση πορτοκαλί σε κύτταρα HCT116 σε επεξεργασία με DMSO (έλεγχος, & lt? 0,1%), 0,5 μΜ GA ή 1,0 μΜ GA για 12 ώρες. Όλα τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. ** P & lt?. 0.01

Η

Ο εντοπισμός και η ομαδοποίηση των LC3 είναι γνωστό ότι είναι σημαντικό για τη μεταφορά και την ωρίμανση του autophagosome [57]. Ως εκ τούτου, το πλασμίδιο ρΕΟΡΡ-LC3 ήταν παροδικά επιμολυσμένα σε δύο κύτταρα HCT116 και SW620 να επιβεβαιώσει περαιτέρω αν GA ξεκινά αυτοφαγία σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. Όπως υποδεικνύεται στο Σχήμα 3Α, το ποσοστό των GFP-LC3-θετικά κύτταρα και το μέσο ποσό των κουκκίδων GFP-LC3 ήταν τόσο σημαντική αυξημένη κατά την κατεργασία GA με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Η λιπιδιωμένη μορφή LC3 μετατροπή από LC3-Ι LC3-ΙΙ συσχετίζεται με την έκταση της autophagosome σχηματισμού [57]. GA επίσης σημαντικά ενισχυμένη τον κύκλο εργασιών από LC3-Ι LC3-ΙΙ, ο οποίος περαιτέρω συσσωρευτεί υπό την παρουσία Ε64ϋ και πεπστατίνη Α (και τα δύο αναστολείς πρωτεάσης λυσοσωματική) (Σχήμα 3Β), υποδηλώνοντας ότι θα μπορούσε να ενισχύσει GA ροής αυτοφαγικά. Εκτός από την LC3, οι εκφράσεις μιας σειράς συνδέονται αυτοφαγικά πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένης ρ62, Beclin 1, ATG7 και Atg12-Atg5, έχουν δειχθεί να τροποποιηθούν κατά τη διάρκεια autophagy [23]. Ως εκ τούτου, ερευνήσαμε την έκφραση αυτών των πρωτεϊνών κατά την κατεργασία GA. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3C, GA ρυθμίζεται προς τα πάνω την έκφραση των Beclin 1, ATG7 και Atg12-Atg5 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, ενώ η συσσώρευση ρ62 μειώθηκε. Αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν περαιτέρω ότι GA μπορεί να επάγει το σχηματισμό αυτοφαγοσώματα σε ορθοκολικό καρκίνο κύτταρα.

(Α) HCT116 και SW620 κύτταρα επιμολυσμένα με ένα πλασμίδιο pEGFP-LC3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με δεικνυόμενες συγκεντρώσεις του GA για 24 ώρες. Τα κύτταρα ορίζονται ως θετική εάν είχαν 5 ή περισσότερα κουκκίδες GFP-LC3 στο κυτταρόπλασμα. Το ποσοστό των κυττάρων με τελείες GFP-LC3 και το μέσο αριθμό των κουκκίδων GFP-LC3 ανά κύτταρο αναλύθηκαν από τουλάχιστον 100 τυχαία πεδία. (Β) Ανάλυση ανοσοαποτύπωσης της μετατροπής της LC3-Ι σε LC3-ΙΙ σε κύτταρα HCT116 και τα κύτταρα SW620 μετά κατεργασία με δεικνυόμενες συγκεντρώσεις του GA για 24 ώρες, ή με 1,0 μΜ του GA για 12 ώρες και 24 ώρες εν απουσία ή παρουσία λυσοσωμικών αναστολέων (Ε64ϋ και πεπστατίνη καθένα στα 10 μg /ml). ανάλυση (C) Ανοσοστύπωμα το επίπεδο έκφρασης του συζυγούς Atg12-Atg5, ATG7, Beclin 1 και ρ62 μετά επεξεργάστηκε με δεικνυόμενες συγκεντρώσεις του GA για 24 ώρες, ή με 1 μΜ του GA για 12 ώρες και 24 ώρες. Ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. * P & lt? 0,05? ** P & lt?. 0.01

Η

Απόφραξη Autophagy Βελτιώνει GA-επαγόμενη απόπτωση

Λαμβάνοντας υπόψη τον παράδοξο ρόλο της αυτοφαγία στην προώθηση κυτταρικό θάνατο ή την επιβίωση, έχουμε περαιτέρω επεξεργασία του παχέος καρκινικά κύτταρα με που χρησιμοποιούνται συνήθως αναστολέα αυτοφαγία (3-ΜΑ) είτε μόνο του είτε σε συνδυασμό με GA για τον προσδιορισμό του λειτουργικού ρόλου του αυτοφαγία σε GA-επαγόμενη απόπτωση. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, προ-επεξεργασία των κυττάρων HCT116 με 3-MA ενίσχυσε σημαντικά την επίδραση της GA-επαγόμενης πολλαπλασιαστική καταστολή. Σε συμφωνία με αυτό, τα αποτελέσματα της αννεξίνης-ν /ΡΙ διπλή χρώση (Σχήμα 4Β) και δοκιμασίες TUNEL (Σχήμα 4C) έδειξε επίσης ότι GA σε συνδυασμό με 3-ΜΑ παρουσίασαν ισχυρότερη προ-αποπτωτικό αποτέλεσμα σε σύγκριση με το GA μόνο. Επιπλέον, παροδική επιμόλυνση με Atg5- ή beclin1 στοχευμένες siRNA για την εκτομή Atg5 ή Beclin 1 έκφραση μπορεί να αναστέλλει τη συσσώρευση LC3-ΙΙ GA-επαγόμενης, καθώς ενισχύει τις αντι-πολλαπλασιαστική και προ-αποπτωτικά αποτελέσματα του GA σε κύτταρα HCT116 (Σχήμα 4D-G). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι autophagy προστατεύει GA-αγωγή ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα από τον αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο.

(Α-Ο) κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με έκδοχο ελέγχου (1 ‰ DMSO, Control), 3-ΜΑ, 1 μΜ GA (GA), ή 1 μΜ GA παρουσία 3-ΜΑ (GA + 3-ΜΑ) για 24 ώρες. Και τότε η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με ΜΤΤ δοκιμασία (Α), και το αποπτωτικό αποτέλεσμα ανιχνεύθηκε με χρώση ΡΙ /αννεξίνης-ν (Β) και δοκιμασίες TUNEL (C). (Δ) την ανίχνευση ανοσοκηλίδας της έκφρασης των ATG5, Beclin-1 και LC3 σε κύτταρα HCT116 που έλαβαν θεραπεία με GA στην παρούσα ή απούσα με siATG5 ή siBeclin 1. (Ε-G) κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε αγωγή με Lipofectamine 2000 (Control), τον έλεγχο siRNA (siControl), siATG5 (siATG5), 1 μΜ GA (GA), GA στον έλεγχο παρουσία siRNA (GA + siControl), siATG5 (GA + siATG5) ή siBeclin1 (GA + siBeclin 1) για 24 ώρες. Και τότε η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ (Ε), και το αποπτωτικό αποτέλεσμα ανιχνεύθηκε με χρώση ΡΙ /αννεξίνης-ν (F) και δοκιμασίες TUNEL (G). * P & lt? 0,05? ** P & lt?. 0.01

Η

Redox Δυσρύθμιστο προκλήθηκε κατά GA Θεραπεία

Για να διερευνήσουν τον μηχανισμό με τον οποίο GA προκαλεί αυτοφαγία, έχουμε προφίλ διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών σε κύτταρα HCT116 αγωγή με ή χωρίς GA. Συγκρίνοντας 2-DE μοτίβα, διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών ορίστηκαν ως στατιστικώς σημαντική (ρ & lt? 0,05) εάν πληρούνται και οι δύο ακόλουθα δύο κριτήρια: 1) αλλοιώσεις ένταση & gt? 2,0-πλάσια και 2) που παρατηρήθηκε σε τουλάχιστον τρία ξεχωριστά πειράματα. 25 σημεία που συνάντησε επιλέχθηκαν τα κριτήρια αυτά και αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ESI-Q-TOF φασματομετρία μάζας εν σειρά, και συνολικά 27 πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν (σχ. 5Α, Πίνακας Ι). Τα δεδομένα MS /MS αναζητηθεί χρησιμοποιώντας μασκότ αλγόριθμος αναζήτησης με τη βάση δεδομένων αλληλουχίας πρωτεΐνης ExPASy. Οι πρωτεΐνες αναγνωρίστηκαν με βάση μια σειρά κριτηρίων, συμπεριλαμβανομένων ρΐ, ΜΒ, την ταυτοποίηση πεπτιδίων και κάλυψη (Πίνακας Ι). Από αυτά, 13 πρωτεΐνες ρυθμίζεται προς τα κάτω ενώ 14 πρωτεΐνες επάνω ρυθμισμένη μετά την αγωγή GA (Σχ. 5D). Οι ταυτοποιημένες πρωτεΐνες χωρίστηκαν σε διάφορες ομάδες με βάση την υποκυτταρικό εντοπισμό τους και βιολογικές λειτουργίες (Σχ. 5Β και 5C). Οι πρωτεΐνες βρέθηκαν να βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα (59%), πυρήνα (4%), μιτοχόνδριο (15%), κυτταρική μεμβράνη (11%), ή ενδοπλασμικό δίκτυο (11%). Αυτή εμπλέκεται ρόλους στον πολλαπλασιασμό και απόπτωση (37%), η ρύθμιση Redox (22%), του μεταβολισμού των λιπιδίων (15%), γλυκομεταβολισμό (15%), Μεταγραφική & amp? τροποποίηση πρωτεϊνών (4%), και μοριακός συνοδός (7%). Μετά διάδοση των πυρηνικών όπλων και την απόπτωση, τα επόμενα πιο μεταβληθεί πρωτεΐνες που εμπλέκονται στη ρύθμιση της οξειδοαναγωγής κατά την αγωγή GA, προτείνοντας ROS μπορεί να εμπλέκονται σε GA-που προκαλείται από αυτοφαγία.

(Α) Εκπρόσωπος δισδιάστατες εικόνες γέλης του ελέγχου και της Γ.Σ. κατεργασμένα (1 μΜ, 24 ώρες) τα κύτταρα HCT116. Συνολικά εκχυλίσματα πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν σε ρΗ 3-10 μη γραμμικής ακινητοποιημένη λωρίδες βαθμίδωση ρΗ στην πρώτη διάσταση που ακολουθείται από 12% SDS-PAGE στη δεύτερη διάσταση και έγινε ορατό με χρώση CBB. (Β) Οι προσδιορίζονται πρωτεΐνες κατηγοριοποιούνται σε ομάδες ανάλογα με υποκυτταρικές θέσεις τους. (C) 27 διακριτές πρωτεΐνες ταξινομήθηκαν σε 6 ομάδες με βάση τις βιολογικές τους λειτουργίες. χάρτης (D) σύμπλεγμα πρωτεΐνης που παράγεται από το λογισμικό συμπλέγματος. Η έκφραση των πρωτεϊνών στον έλεγχο ήταν σταθερή στα 0, ενώ οι πρωτεΐνες υπερεκφράζονται σε GA-κατεργασμένα κύτταρα είναι σε κόκκινο, και οι πρωτεΐνες είναι μειωτικά σε πράσινο. Η ένταση του χρώματος πράσινο ή κόκκινο αντιστοιχεί στο βαθμό του αλλοίωση, αντίστοιχα, σύμφωνα με την λωρίδα χρώματος στο κάτω μέρος του σχήματος.

Η

ROS απαιτείται για GA-επαγόμενη Autophagy < ** P & lt? 0,01.