Αφηρημένο

Ιστορικό

υποδοχείς νευροτροφίνης Αρχικά εντοπίστηκε στα νευρικά κύτταρα. Είχαν πρόσφατα ανιχνεύθηκε σε μερικούς καρκίνους σε συνδυασμό με διεισδυτικότητα, αλλά η λειτουργία αυτών των υποδοχέων κινάσης τυροσίνης δεν είχε προηγουμένως ερευνηθεί σε ορθοκολικό καρκίνο κύτταρα (CRC).

Μέθοδοι και Εκτίμηση

Αναφέρουμε εδώ ότι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές CRC συνθέσουν το νευρωνικό παράγοντα ανάπτυξης εγκέφαλο νευροτροφικός παράγοντας (BDNF) υπό συνθήκες στρες (ασιτία ορού). Παράλληλα, κύτταρα CRC εκφράζεται υψηλής (TrkB) και χαμηλής συγγένειας (ρ75

NTR) υποδοχείς στην πλασματική μεμβράνη, ενώ TrkA και TrkC, δύο άλλοι υποδοχείς υψηλής συγγένειας για NGF και ΝΤ-3, αντίστοιχα, ήταν μη ανιχνεύσιμα. Έχουμε αποδείξει ότι ο BDNF επαγόμενο πολλαπλασιασμό των κυττάρων και είχε ένα αντι-αποπτωτικό αποτέλεσμα τη μεσολάβηση TrkB, όπως εκτιμήθηκε από K252a, έναν αναστολέα φαρμακολογικό Trk. Κατέστειλε τόσο κυτταρικού πολλαπλασιασμού και την επιβίωση των CRC κύτταρα που δεν εκφράζουν TrkA ούτε TrkC. Παράλληλα με την αύξηση του BDNF έκκρισης, sortilin, μια πρωτεΐνη που ενεργεί ως μεταφορέας νευροτροφίνη, καθώς και συν-υποδοχέας για ρ75

NTR, αυξήθηκε στο κυτταρόπλασμα των πρωτογενών και μεταστατικών CRC κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι sortilin θα μπορούσε να ρυθμίσει νευροτροφίνης μεταφοράς σε αυτά τα κύτταρα. Ωστόσο, προ-BDNF, ανιχνεύθηκε επίσης σε κύτταρα CRC, συν-εκφράζεται με ρ75

NTR στην κυτταρική μεμβράνη και συν-εντοπισμένη με sortilin. Σε αντίθεση με BDNF, εξωγενές προ-BDNF επάγεται CRC απόπτωση, γεγονός που υποδηλώνει ότι ένας μηχανισμός αντίβαρο εμπλέκεται στον έλεγχο της κυτταρικής επιβίωσης CRC, μέσω sortilin ως συν-υποδοχέας για ρ75

NTR, η υψηλή συγγένεια για τον υποδοχέα προ- νευροτροφίνες. Ομοίως, δείχνουμε ότι BDNF και TrkB μεταγραφές (και όχι p75

NTR) υπερεκφράζονται σε όγκους των ασθενών σε σύγκριση με τα γειτονικά τους φυσιολογικούς ιστούς τους, κυρίως σε προχωρημένα στάδια της CRC.

Συμπέρασμα

Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα τονίζουν ότι BDNF και TrkB είναι απαραίτητα για την ανάπτυξη των κυττάρων και την επιβίωση CRC in vitro και σε όγκους. Αυτό αυτοκρινούς βρόχου θα μπορούσε να είναι μείζονος σημασίας για τον καθορισμό νέων στοχευμένων θεραπειών

Παράθεση:. Akil Η Perraud Α, Melin C, Jauberteau ΜΟ, Mathonnet Μ (2011) Πρόστιμο-Tuning ρόλοι των ενδογενής εγκεφάλου νευροτροφικού παράγοντα που προέρχεται , TrkB και Sortilin στον Καρκίνο του παχέος κυττάρων επιβίωσης. PLoS ONE 6 (9): e25097. doi: 10.1371 /journal.pone.0025097

Επιμέλεια: Mark Π Mattson, του Εθνικού Ινστιτούτου για τη Γήρανση εσωτερικό ερευνητικό πρόγραμμα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 6 Ιούλη του 2011? Αποδεκτές: 23 Αυγούστου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 26 Σεπτεμβρίου του 2011

Copyright: © 2011 Akil et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από Ligue contre le Καρκίνος και Conseil Régional du Limousin. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Brain-προερχόμενο νευροτροφικό παράγοντα (BDNF), ένα μέλος της οικογένειας νευροτροφίνης, είναι γνωστό ότι παίζει ένα κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση της κυτταρικής επιβίωσης, διαφοροποίησης και απόπτωσης στο νευρικό σύστημα [1].

σήματα BDNF μέσω δύο τύποι υποδοχέων κυτταρικής επιφάνειας: ο υψηλής συγγένειας tropomyosin σχετίζονται κινάσης (Trk) υποδοχέα Β (TrkB), ένας υποδοχέας κινάσης τυροσίνης και ο υποδοχέας χαμηλής συγγένειας (ρ75

NTR), καθώς επίσης και ένας υποδοχέας περιοχή θανάτου που ανήκουν στον παράγοντα νέκρωσης όγκου (TNF), ένα κοινό υποδοχέα για όλα αυξητικού παράγοντα νευροτροφίνες νεύρων (NGF), νευροτροφίνη-3 (ΝΤ-3), και νευροτροφίνη-4/5 (ΝΤ-4/5 ). Οι νευροτροφίνες συντίθενται ως πρόδρομοι (proneurotrophins) που διασπώνται πρωτεολυτικά για να ωριμάσουν νευροτροφίνες. Pro-BDNF διάσπαση μπορεί να συμβεί είτε ενδοκυτταρικά με τη δράση της φουρίνης ή proconvertase, ή εξωκυτταρικά με τη δράση της πλασμίνης, μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας 7 (ΜΜΡ-7) ή ΜΜΡ-9 [2]. Τόσο ώριμο BDNF και pro-BDNF είναι βιολογικά ενεργό, με αποκλίνουσες ρόλους που αντανακλούν διαφορετικές συγγένειες υποδοχέα: pro-BDNF εμφανίζει υψηλότερη συγγένεια για p75

NTR, ενώ ώριμο BDNF έχει μεγαλύτερη συγγένεια για TrkB

BDNF συνδέεται. η 145 TrkB υποδοχέα πλήρους μήκους και ένα περικόπτεται παραλλαγή gp95TrkB που διατηρεί δραστηριότητες άμεση σηματοδότηση [3] και αυξάνει την εξειδίκευση για BDNF [3], [4], [5]. Ενώ οι υποδοχείς Trk που εμπλέκονται στις περισσότερες από τις ιδιότητες επιβίωση και την ανάπτυξη των νευροτροφινών, οι λειτουργίες της ρ75

NTR, εκτεταμένα μελετηθεί σε νευρώνες, εξαρτάται από νευρωνικά κυτταρικό τύπο, με την παρουσία του συνδέτη, και τη σύνδεσή της σε μια συνεργασία αισθητήριο νεύρο. Πράγματι, ρ75

NTR που συνδέονται με ενισχύει Trk συν-υποδοχέα [6] ή να καταστείλει νευροτροφίνη μεσολάβηση κυτταρικής επιβίωσης [7]. Δείχθηκε πρόσφατα για να είναι σε θέση να δεσμεύσει υπέρ-BDNF και προκαλεί κυτταρικό θάνατο, όταν συνδέονται με sortilin (μέλος του Vps10p-τομέα υποδοχείς της οικογένειας) [8], [9], [10].

Έτσι, , ρύθμιση της προ-BDNF επεξεργασία προσθέτει επιπλέον έλεγχο της ισορροπίας μεταξύ της p75

NTR και δέσμευση TrkB [11], [12]. Αντιαποπτωτικού λειτουργία του BDNF διαμεσολαβείται αν και αλληλεπίδραση με τον υψηλής συγγένειας υποδοχείς 95 και 145TrkB [5], ενώ προ-BDNF προκαλεί απόπτωση μέσω αλληλεπίδρασης με ένα σύμπλοκο υποδοχέα του ρ75

NTR και sortilin [10], [13].

Sortilin εκφράζεται σε πολλούς ιστούς, κυρίως στον εγκέφαλο, το νωτιαίο μυελό, καρδιά, μύες, λιποκύτταρα [14] και Β λεμφοκυττάρων [8]. Sortilin περιγράφηκε αρχικά σε ανθρώπινα νευρικά κύτταρα ως μια ενδοκυτταρική πρωτεΐνη μεταφοράς για νευροτροφίνες και proneurotrophins [15] και, πρόσφατα, ως μεταφορέας του Trk νευροτροφίνης υποδοχέων σε νευρικά κύτταρα [16]. Επιπλέον, sortilin ήταν επίσης γνωστός ως υποδοχέας συν (NTSR3) για έναν υποδοχέα συζευγμένου με πρωτεΐνη G, ο νευροτενσίνη υποδοχέα-1 (NTSR1) που ενεργοποιείται από νευροτενσίνη [17]. Neurotensin αρχικά φαίνεται να παίζουν ένα ρόλο στην ανάπτυξη και την επιβίωση των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC), μέσω της σύνδεσης του με την παρούσα sortilin /NTSR1 συγκρότημα [18].

BDNF έχει ενοχοποιηθεί στην παθογένεση και την πρόγνωση του πολυάριθμων ανθρώπινων κακοηθειών όπως νευροβλάστωμα [19], [20], μυελοβλάστωμα [21], του καρκίνου του προστάτη [22], [23], ο καρκίνος του πνεύμονα [24], παγκρεατικό καρκίνωμα [25], [26], [27], και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [28]. Σε CRC, μια υπερέκφραση του BDNF [29] και TrkB [30] έχει αναφερθεί πρόσφατα σε ιστούς των ασθενών, αλλά δεν ασχολείται δεδομένα με τη λειτουργία του BDNF ως αυτοκρινής βρόχων σε κυτταρική επιβίωση CRC. Δεδομένου ότι η έκφραση TrkB συνδέεται σε αρκετές καρκίνους? Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να καθορίσει τους όρους της ενδογενούς έκκρισης του BDNF και της έκφρασης των υποδοχέων νευροτροφίνης στο CRC. Εδώ, δείχνουμε ότι η ενδογενής BDNF εκκρίνεται από τα κύτταρα CRC υποβάλλονται σε στέρηση ορού και επάγει την κυτταρική επιβίωση μέσω του υποδοχέα κινάσης TrkB τυροσίνης που εκφράζεται επί της μεμβράνης των κυττάρων τόνισε. Είναι αξιοσημείωτο ότι TrkB και η έκφραση BDNF ενισχύθηκε σε όγκους ασθενών ιδιαίτερα σε προχωρημένα στάδια. Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα επισημαίνουν τη σημασία του BDNF οδού /TrkB στην ανάπτυξη και τις δυνατότητες εισβολής της CRC.

Υλικά και Μέθοδοι

Cells και τον πολιτισμό

κυτταρικές σειρές ανθρώπινου CRC που αντιστοιχούν σε διαφορετικά στάδια του όγκου αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection. WiDr [31] και SW480 [32] ήταν πρωταρχικός CRC-κυτταρικές γραμμές που παράγονται, ενώ οι δύο άλλες γραμμές προήλθαν από CRC μεταστάσεις, σε λεμφαδένα (SW620 προέρχονται από τον ίδιο ασθενή όπως η γραμμή SW480) [32] και ασκίτη (COLO 205) [33]. Κάτω από βασικές συνθήκες, τα κύτταρα WiDr διατηρήθηκαν σε μέσο ΜΕΜ (Gibco) συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο ορό εμβρύου μόσχου (FCS) (Gibco), 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο (Gibco), 1% μη απαραίτητα αμινοξέα (Gibco), 100 IU /ml πενικιλλίνη και 100 mg /ml στρεπτομυκίνη (Gibco). SW480, SW620 και COLO 205 γραμμές καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI (Gibco) συμπληρωμένο με 10% FCS, 100 IU /ml πενικιλλίνη και 100 mg /ml στρεπτομυκίνη, στους 37 ° C υπό υγρή ατμόσφαιρα και 5% CO2. Καλλιεργημένα κύτταρα τόνισε από 24 έως 72 ωρών στέρηση ορού. Το ποντίκι ανταγωνιστικό μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-BDNF (mAb) κλώνος 35928.11 (10 μg /ml) αγοράστηκε από την Calbiochem. Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη BDNF (100 ng /ml), ανασυνδυασμένη προ-BDNF (4 ng /ml), και Κ252 & (200 ηΜ) αγοράστηκαν από Alomone Labs.

Ασθενείς και δείγματα ιστών

Όλα ιστούς που λαμβάνονται από ασθενή συλλέχθηκαν και αρχειοθετούνται, στο Tumorotheque του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Λιμόζ, σύμφωνα με τα πρωτόκολλα έχουν εγκριθεί από το Διοικητικό συμβούλιο αναθεώρηση Θεσμική (AC Ν 2007 με 34, DC 2008-604 και 72-2011-18). Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλα τα υποκείμενα για την παρούσα μελέτη. ιστούς όγκων ελήφθησαν από 20 ασθενείς, οι οποίοι υποβλήθηκαν σε χειρουργική αφαίρεση της CRC στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Λιμόζ μεταξύ του Ιανουαρίου 2006 και του Φεβρουαρίου 2007. ασθενείς αδενοκαρκίνωμα Τέσσερις ανά στάδιο (σύμφωνα με την κατάταξη pTNM [34]) έχουν επιλεγεί για αυτή τη μελέτη. Οι ιστοί από τέσσερις ασθενείς με καλοήθη ασθένεια του παχέος, megadolichocolon, χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες.

RT-PCR ανάλυση

κυτταρικές γραμμές CRC καλλιεργήθηκαν σε μέσο που περιείχε ή όχι 10% FCS για 24 έως 72 -h. SV συνολικό σύστημα απομόνωσης RNA (Promega) χρησιμοποιήθηκε για την απομόνωση ολικού RNA από τις κυτταρικές γραμμές, όπως περιγράφεται στις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ποσότητα του RNA που εξάγεται ποσοτικοποιήθηκε με μέτρηση της απορρόφησης στα 260 nm χρησιμοποιώντας το φασματοφωτόμετρο Nanodrop ND-1000 (Labtech). Η καθαρότητα του RNA ελέγχθηκε με την αναλογία DO260 /DO280 nm μεταξύ 1,83 και 2,00. Η απουσία αποικοδόμησης RNA επιβεβαιώθηκε με ηλεκτροφόρηση σε ένα πήκτωμα αγαρόζης 1,5% που περιέχει βρωμιούχο αιθίδιο. Εκχύλιση RNA από ιστούς ασθενών διεξήχθη όπως περιγράφεται [35]. σύνθεση cDNA πρώτου κλώνου δημιουργήθηκε με χρήση SuperScript III (Invitrogen). PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Taq DNA πολυμεράση (Invitrogen). Ολικό RNA απομονώθηκε από ανθρώπινο νευροβλάστωμα κυτταρικές γραμμές (IMR32, SH-SY5Y) και ανθρώπινα κύτταρα Κ562 erythromyeloblastoid λευχαιμίας χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί έλεγχοι. Μη αντίστροφη μεταγραφεί δείγματα (που κατασκευάζεται από την παράλειψη της αντίστροφης μεταγραφάσης) έτρεξαν παράλληλα με τα μεταγραφεί αντίστροφα δείγματα για τον αποκλεισμό της μόλυνσης από γενωμικό DNA.

Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας Primer 3 (που παρέχεται στο δημόσιο τομέα με το Whitehead Institute for Biomedical Research /MIT Center for γονιδιωματική έρευνα, Cambridge, MA, και είναι διαθέσιμη σε https://www.wi.mit.edu). έχουν σχεδιαστεί ζεύγη εκκινητών που παρατίθενται, μαζί με την αναμενόμενη θερμοκρασίες μέγεθος του προϊόντος και ανόπτηση τους στον πίνακα 1.

Η

αλληλουχίας

Μετά την εκχύλιση των προϊόντων PCR με ταχύ καθαρισμό Συστήματα PCR (MARLIGEN Bioscience), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, τα προϊόντα PCR υποβλήθηκαν σε απ ‘ευθείας προσδιορισμό αλληλουχίας με τη χρήση της BigDye® Terminator Cycle Κιτ v1.1 Sequencing (Applied Biosystems) εντός ενός θερμοκυκλωτή GeneAmp® PCRSystem 2700 (Applied Biosystems). Τα θραύσματα καθαρίστηκαν με καθίζηση ισοπροπανόλης. Το πήκτωμα αλληλούχισης διεξήχθη σε έναν αυτοματοποιημένο αλληλουχητή λέιζερ φθορίζον DNA ΑΒΙ Prism® 3130 × l Genetic Analyser (Applied Biosystems) και ομολογίες ελέγχθηκαν, χρησιμοποιώντας Finch τηλεόραση, μετά ανατινάξεις με τον BDNF, TrkB145, TrkB95, ρ75

NTR, και sortilin GenBank αλληλουχίες (NM_001143816, NM_001018064, NM_001007097, NM_002507, και NM_002959, αντίστοιχα).

κηλίδος Western

ποντικού αντι-BDNF (1 μg /ml) και ποντικού αντι-TrkB (1 μg /ml) αντισωμάτων (Abs) αγοράστηκαν από την R & amp? D Systems, αντι-Ρ75 κουνελιού

NTR (1 μg /ml), κατσίκα αντι-sortilin (1 μg /ml) και κουνελιού αντι-φωσφο-Ακί (Ser 473 ? 1 μg /ml) Abs από την Santa Cruz Biotechnology, κουνελιού αντι-TrkA (1:1000), κουνελιού αντι-TrkC (1:1000) και ποντικού (1:2000) Abs-Akt αντι από την Cell Signaling Technology. Υποσυρρέουσες κυτταρικές γραμμές καλλιεργειών λύθηκαν (5 λεπτά επί πάγου) στις φιάλες καλλιέργειας με 1 × κυττάρων ρυθμιστικού λύσης (Cell Signaling Technology) που περιέχει 1 mM PMSF (Sigma-Aldrich). Το εναιώρημα υποβλήθηκε σε υπερήχους για 1 λεπτό (ένα παλμό 40 Hz κάθε 20 sec) για την αποικοδόμηση χρωμοσωμικού DNA και φυγοκεντρήθηκε στα 14.000 g για 10 λεπτά. Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία Bradford συγκέντρωση πρωτεΐνης (Sigma). SDS-PAGE πραγματοποιήθηκε και οι πρωτεΐνες ηλεκτρο-στυπώθηκαν σε μεμβράνες PVDF (BioTrace ™). Μετά από μία ώρα επώασης σε θερμοκρασία δωματίου με διάλυμα αποκλεισμού (5% άπαχο ξηρό γάλα σε PBS), οι μεμβράνες εκτέθηκαν στο ειδικό πρωτεύον Abs σε διάλυμα αποκλεισμού επί μία νύκτα στους 4 ° C. Στη συνέχεια, οι μεμβράνες πλύθηκαν τρεις φορές για 5 λεπτά με TBS /0,1% Tween-20 και οι ανοσοαντιδράσεις ανιχνεύθηκαν με συζευγμένη με υπεροξειδάση χρόνου δευτερογενή Ab ποντικού, κουνελιού, ή αίγα Ig (DakoCytomation) αραιωμένο σε 1:2000 σε διάλυμα αποκλεισμού γιά 1 h σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την πλύση, απεικόνιση άνοσο-σύμπλοκων επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας το Immobilon Western χημειοφωταύγειας HRP Substrate (Millipore). έλεγχος Protein-φόρτωση διεξήχθη με αντι-ακτίνης Ab (Cell Signaling Technology). Western blots σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα βιο-απεικόνισης (Genesnap? Genetool? Syngene). Η πυκνομετρική αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα πρόγραμμα λογισμικού ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA https://rsb.info.nih.gov/ij/). Η έκφραση της πρωτεΐνης προσδιορίστηκε σε σχετικές μονάδες σε σχέση προς ακτίνη έκφραση.

ανοσοφθορισμού

κύτταρα αναπτύσσονται πάνω σε καλυπτρίδες 12 mm-σταθεροποιήθηκαν με 4% PFA σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά, και διαπερατά ή όχι με 0,1% Triton Χ-100. Η μη ειδική σύνδεση παρεμποδίζεται από επώαση 30 λεπτών με PBS-2% BSA σε θερμοκρασία δωματίου. Οι καλυπτρίδες στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C εντός διαλύματος αποκλεισμού με την πρωτογενή Ab. Χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα Abs: κουνελιού αντι-BDNF Ab (1 μg /ml? Santa Cruz Biotechnology), κουνελιού αντι-pro-BDNF Ab (8 μg /ml? Alomone Labs), αντι-TrkB Ab ποντικού (2,5 μg /ml? Ε & amp? D Systems), αντι-ρ75 κουνελιού

NTR (2 μg /ml? Santa Cruz Biotechnology) και γίδινο αντι-sortilin Ab (1 μg /ml? Santa Cruz Biotechnology). Τα κύτταρα πλύθηκαν 3 φορές σε PBS, και επωάστηκαν για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου με Alexa Fluor-συζευγμένο δευτερεύον Abs (Invitrogen) αραιωμένο 1:5000 σε PBS. Μετά από 3 πλύσεις σε PBS, οι πυρήνες χρωματίστηκαν για 5 λεπτά με DAPI. Μετά από εντατικές πλύσεις, καλυπτρίδες αναστράφηκαν σε διαφάνειες και τοποθετείται με Dako φθορισμού Τοποθέτηση Medium (DakoCytomation). Οι αρνητικοί μάρτυρες ήταν κύτταρα επωάστηκαν με άσχετο κανονικό κουνέλι, ποντίκι, ή IgG αίγας (Sigma). Εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο (Carl Zeiss, LSM 510)? επιφάνεια οικόπεδα των δεδομένων φθορισμού δημιουργήθηκαν με λογισμικό πρόγραμμα ImageJ.

ELISA

Μετά από 24 ώρες, 48 ώρες και 72 ώρες καλλιέργειας, τα δείγματα του υπερκείμενου από κυτταρικές σειρές συλλέχθηκαν και φυλάχθηκαν στους -80 ° C μέχρι την ημέρα της δοκιμασίας. Ανοσοδοκιμασίες Systems (Promega), ειδικό για BDNF διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SEM (pg /mL). Τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα για κάθε πειραματική συνθήκη, το καθένα με τις μετρήσεις εις τριπλούν.

προσδιορισμούς πολλαπλασιασμού κυττάρων

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το Click-it edu Alexa Fluor 488 ροής προσδιορισμού ( Invitrogen), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα (2 χ 10

5 ανά φρεάτιο) επωάστηκαν για μία νύχτα σε τρυβλία δώδεκα φρεατίων πριν από τη θεραπεία, στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες σε μέσο χωρίς ορό με ή χωρίς εξωγενή BDNF, Κ252 & ή αμφότερα BDNF και K252a προστίθενται ταυτόχρονα . τιμές πολλαπλασιασμό μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής BD LSRFortessa (BD Biosciences). Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν, και τρία σετ 50.000 κύτταρα συλλέχθηκαν για κάθε κατάσταση. Τα δεδομένα αποκτήθηκαν και αναλύθηκαν από το 6.0 λογισμικό BD FACSDiva (BD Biosciences). Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές.

Προσδιορισμός απόπτωσης

Η απόπτωση μετρήθηκε με την ανίχνευση της κυτταροπλασματικής διαλυτού νουκλεοσωμάτων χρησιμοποιώντας μια θερμιδομετρική δοκιμασία, Cell Death Detection ELISAPLUS κιτ (Roche Molecular Diagnostic) σύμφωνα με το τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι τιμές απορρόφησης μετρήθηκαν στα 405 – 490 nm διπλά μήκη κύματος. Η απορρόφηση που ελήφθη στο ελέγχων κανονικοποιήθηκε σε μια τιμή από 1, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [7]. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

Στατιστική ανάλυση

Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίζεται με μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης (ANOVA) με StatView 5.0 λογισμικό (Abacus Concepts ).

P

τιμές & lt? 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές. Οι μέσες τιμές και SEM ελήφθησαν από τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα.

Αποτελέσματα

κυτταρικές σειρές του καρκίνου του παχέος εντέρου εκφράζουν TrkB και p75

NTR αλλά δεν TrkA ή TrkC υποδοχείς

TrkB και ρ75

NTR εκφράσεις ανιχνεύθηκαν σε κυτταρικές σειρές CRC υπό βασικές (10% FCS) συνθήκες καλλιέργειας, τόσο σε mRNA (Σχήμα 1Α) και τα επίπεδα πρωτεΐνης (Εικόνα 1D) με κάποιες διαφορές ανάλογα με κυτταρικές σειρές. Ενώ το πλήρες μήκος TrkB (TrkB145) και ρ75

NTR μεταγραφές ήταν κυρίαρχη σε ένα πρωτεύον (SW480) και μια μετάσταση (SW620) γραμμή (Σχήμα 1Α) (δύο κυτταρικές σειρές που απομονώθηκαν από τον ίδιο ασθενή), τα πιο ισχυρά εκφράζονται μεταγραφές ήταν εκείνα της κομμένης ισομορφή (TrkB95) σε όλες τις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 1Α), εκτός από τα κύτταρα WiDr που εκφράζεται TrkB95 και ρ75

NTR μόνο μετά από μια 48-h στέρηση ορού (Εικόνα 1Β). TrkB και p75

αλληλουχίας NTR μετά από πηκτές αγαρόζης έκλουση επικυρωμένα αυτά τα αποτελέσματα. Ωστόσο, TrkA και TrkC μεταγραφές (Σχήμα 1 C), καθώς και πρωτεΐνες υποδοχέων (Εικόνα 1ϋ) δεν ανιχνεύθηκαν, ανεξαρτήτως των συνθηκών καλλιέργειας, σε αντίθεση με την erythromyeloblastoid κυτταρική γραμμή λευχαιμίας Κ562 που είναι γνωστό ότι εκφράζουν αυτά υποδοχέων νευροτροφίνης [36].

(Α): RT-PCR του BDNF, υψηλή (TrkB) και χαμηλή (ρ75

NTR) υποδοχείς συγγένειας, TrkA, και TrkC από κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε βασικό (10% μέσου FCS), WiDr (λωρίδα: 1 ), SW480 (λωρίδα: 2), SW620 (λωρίδα: 3), Colo 205 (λωρίδα: 4). επιπέδων GAPDH mRNA χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Θετικός έλεγχος (λωρίδα 5) ήταν η κυτταρική σειρά νευροβλαστώματος (IMR32) για BDNF, TrkB και ρ75

NTR? και τα erythromyeloblastoid κύτταρα λευχαιμίας (Κ562) για TrkA και C. Ένα αντιπροσωπευτικό αποτέλεσμα της κατά τουλάχιστον τρία έως πέντε ανεξάρτητα πειράματα. (Β) Σύγκριση TrkB95 και ρ75

NTR στο συνολικό RNA που εκχυλίζεται από τα κύτταρα WiDr καλλιεργήθηκαν σε 10% FCS ή μετά από 24 έως 72 ώρες στέρηση ορού (0% FCS). TrkB95 και ρ75

NTR mRNA /GAPDH mRNA ποσοτικοποίηση των εντάσεων ζώνης αξιολογούνται με πυκνομετρία φαίνονται παραπάνω λωρίδες και εκφράζονται σε αυθαίρετες μονάδες (μέσος όρος τριών ανεξάρτητων πειραμάτων). (C) Το ίδιο πείραμα: RT-PCR της TrkA και TrkC στο συνολικό RNA που εκχυλίζεται από τα κύτταρα WiDr καλλιεργήθηκαν υπό βασικές συνθήκες καλλιέργειας (10% FCS) και μετά από 24-72 ώρες ασιτία ορού σε σύγκριση με το θετικό έλεγχο (Κ562) (D) Η έκφραση του προ-BDNF και BDNF, πλήρους μήκους TrkB 145 και κολοβωμένη TrkB 95 και ρ75

NTR πρωτεϊνών σε κυτταρικές σειρές CRC καλλιεργήθηκαν σε 10% FCS. TrkA και TrkC δεν ανιχνεύθηκαν. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης πρωτεΐνης. WiDr (λωρίδα: 1), SW480 (λωρίδα: 2), SW620 (λωρίδα: 3), Colo 205 (λωρίδα: 4). Θετικός μάρτυρας (διαδρομή: 5) ήταν IMR32 κύτταρα για BDNF, pro-BDNF, TrkB και p75

NTR και τα κύτταρα Κ562 ή TrkA και TrkC. Ένα αντιπροσωπευτικό αποτέλεσμα τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

κύτταρα CRC παράγουν ενδογενή BDNF

Από CRC εκφράζονται υποδοχείς TrkB, ψάξαμε για έναν ενδογενή παραγωγή του BDNF, ένα συνδετήρα TrkB. BDNF mRNA ανιχνεύθηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν υπό βασικές (10% FCS) συνθήκες, κυρίως σε δύο κύριες γραμμές CRC (WiDr και SW480). Είναι ενδιαφέρον ότι, μετά στέρηση ορού για 24 έως 72 ώρες, τα επίπεδα BDNF mRNA (Σχήμα 2Α), όπως επίσης και πρωτεΐνη BDNF ώριμης (17 kDa) που ανιχνεύεται με στύπωμα Western σε λύματα κυττάρου, ενισχύθηκαν στα τέσσερα κύτταρα CRC (Σχήμα 2Β), όπως φαίνεται από τις τιμές πυκνομετρία (αναλογίες BDNF /GAPDH για mRNA και BDNF /Actin αναλογίες για πρωτεΐνες) (Σχήμα 2Α, Β). Επιπλέον, η έκκριση BDNF ανιχνεύτηκε με ELISA σε υπερκείμενο καλλιέργειας κυτταρικών γραμμών CRC. απελευθέρωση BDNF αυξήθηκε σημαντικά με ασιτία ορού στις δύο πρωτογενείς κυτταρικές σειρές WiDr και SW480 CRC (Σχήμα 2C και Πίνακας 2), ενώ, κρίθηκε ότι δεν είναι σημαντικά αυξημένη σε μεταστατικούς SW620 και CRC κυτταρικές γραμμές COLO 205 (Πίνακας 3). στέρηση ορού οδήγησε σε αύξηση των επιπέδων BDNF στο κυτταρόπλασμα αυτών των τεσσάρων κυτταρικών σειρών, όπως φαίνεται για SW480 στο σχήμα 2D. Η ποσοτικοποίηση του πράσινου ένταση φθορισμού σε κάθε συνθήκες καλλιέργειας επιβεβαίωσε τα ευρήματα από τις εικόνες φθορισμού (Σχήμα 2D) και ενίσχυσε τα αποτελέσματα που προέκυψαν από κηλίδωση Western.

παραγωγή (Α) BDNF αξιολογούνται με RT-PCR του συνολικού RNA που εξάγεται από κύτταρα που καλλιεργούνται σε βασικό όρο (10% FCS) και για 24 έως 72 ώρες στέρησης ορού. Ποσοτικοποίηση των εντάσεων ζώνης παρουσιάζεται ως ανωτέρω (μέση τιμή τριών ανεξάρτητων πειραμάτων). έκφρασης (Β) BDNF με κηλίδωση Western (σε σχέση με ακτίνη) σε ολικής κυτταρικής πρωτεΐνης που εξάγεται από κυτταρικές γραμμές καλλιεργήθηκαν υπό βασικές συνθήκες (10% FCS) και μετά από 24-72 ώρες στέρηση ορού (0% FCS). Σύμφωνα με πυκνομετρικές αναλύσεις, ποσοτικοποίηση έδειξε σημαντική αυξημένη έκφραση του BDNF σε καλλιεργημένα κύτταρα. Τα ιστογράμματα είναι μέσοι όροι ± SEM από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. **

σ

& lt? 0,01? ***

σ

& lt? 0.001, σε σύγκριση με το βασικό συνθήκες καλλιέργειας. (Γ) Η έκκριση του BDNF αξιολογήθηκε με ELISA σε υπερκείμενο των κυτταρικών γραμμών WiDr και SW480 υπό βασικές συνθήκες (10% FCS) και μετά από 24-72 ώρες στέρηση ορού (0% FCS). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM των τριπλών από τρία διαφορετικά πειράματα. ***

σ

& lt? 0.001, σε σύγκριση με βασική προϋπόθεση πολιτισμό. (D) Σύγκριση της έκφρασης BDNF από SW480 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 10% FCS και μετά από 72-h στέρηση ορού. Ομοεστιακό μικροσκόπιο με αντι-BDNF Ab και Alexa φθόριο-488 συζυγούς (πράσινο) και πυρήνες πάγκο βάφονται με το μπλε-φθορίζουσα χρωστική DNA DAPI. Σχετική ποσοτικοποίηση εκτιμήθηκε με πράσινο οικόπεδο επιφάνειας φθορισμού. Εικόνες ήταν αντιπροσωπευτικά για τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Ράβδοι κλίμακας, 10 μm. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν με τις τρεις άλλες γραμμές (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Η

Η

Ορός πείνα προκαλεί μεμβρανώδη έκφραση των TrkB και colocalization της με BDNF

Η διαπίστωση ότι η ενδογενής BDNF εκκρίνεται υπό συνθήκες στέρησης ορού μας οδήγησε στην αναζήτηση για την έκφραση του υποδοχέα υψηλής συγγένειας του. Στην βασική (FCS περιέχον) καλλιέργειες (Σχήμα 3Α, C), η TrkB υψηλής συγγένειας υποδοχέα και του προσδέματός του BDNF τους απομόνωσε σε όλες τις κυτταρικές σειρές CRC. A 24-h ασιτία ορού προκάλεσε μία μετατόπιση του TrkB στην κυτταρική μεμβράνη (Εικόνα 3Β, D). Είναι ενδιαφέρον ότι, μια συνεντόπισης του TrkB και BDNF επί της μεμβράνης ανιχνεύθηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν και έφθασε ένα μέγιστο στις 72 ώρες της στέρησης, όπως δείχνεται για WiDr και COLO 205 κύτταρα (Σχήμα 3Β, D). Παρόμοια σχήματα χρώσης ελήφθησαν για SW480 και SW620 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η συνέκφραση στη μεμβράνη τόσο του TrkB και ενδογενών BDNF υποδηλώνει ότι BDNF και TrkB θα μπορούσε να εμπλέκεται σε έναν αυτοκρινή βρόχο σε στρεσαρισμένα κύτταρα CRC.

συνεστιακή μικροσκοπία του WiDr (Α, Β) και COLO 205 (C, D ) κύτταρα, χρωματίστηκαν με ένα αντι-BDNF Ab (κόκκινο), αντι-TrkB mAb (πράσινο) ή και των δύο (επικάλυψη) που καλλιεργήθηκαν με 10% FCS (A, C) ή μετά από 24-h στέρηση ορού (Β, D). Κάτω από βασικές συνθήκες καλλιέργειας (10% FCS), TrkB και BDNF ήταν ρυθμισμένο στο κυτόπλασμα (βέλη) σε WiDr (Α) και COLO 205 κύτταρα (C). Τα ίδια πρότυπα χρώσης ελήφθησαν με τις δύο άλλες κυτταρικές γραμμές (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μετά μετεγκατάσταση ορό ασιτίας στην κυτταρική μεμβράνη και συνεντόπισης του TrkB και BDNF (κίτρινο σε συγχωνεύονται, βέλη) ανιχνεύθηκαν σε WiDr (Β) και COLO 205 (D). Εικόνες ήταν αντιπροσωπευτικές για τουλάχιστον τρεις έως πέντε ανεξάρτητα πειράματα.

Η

BDNF προάγει τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των κυτταρικών σειρών CRC μέσω TrkB

Για τον προσδιορισμό της λειτουργίας αυτού του συστήματος συνδετήρα-υποδοχέα στο πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των WiDr, SW480, SW620 και COLO 205 CRC κυττάρων, πολλαπλασιασμό και την απόπτωση δοκιμασίες διεξήχθησαν με εξωγενή BDNF είτε σε FCS-ελεύθερο ή σε 10% FCS καλλιέργειες που περιέχουν. Μετά από μια καλλιέργεια 24 ώρες σε μέσο χωρίς ορό, εξωγενείς BDNF αύξησε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό όλων μελετήθηκαν κυτταρικές γραμμές, σε αντίθεση με την απουσία του αποτελέσματος με την παρουσία 10% FCS (Σχήμα 4Α και Πίνακας 2, 3). Από TrkB εκφράστηκε στην επιφάνεια του τόνισε κυττάρων, υποθέσαμε πιθανός ρόλος του στην πολλαπλασιασμού των κυττάρων υπό αυτές τις συνθήκες. Πράγματι, η προσθήκη του Κ252 &, ένας αναστολέας Trk [37], κατέστειλε την πολλαπλασιαστική επίδραση του εξωγενούς BDNF σε καλλιέργειες χωρίς ορό σε όλες μελετήθηκαν κυτταρικές σειρές (Σχήμα 4Α), το οποίο υποδηλώνει ότι η ενδογενής BDNF είχε εμπλακεί στην ανάπτυξη των κυττάρων μέσω της TrkB (Σχ. 4Α και ο Πίνακας 2, 3). Για την περαιτέρω αξιολόγηση του ρόλου της TrkB και BDNF σε στρεσαρισμένα κυτταρική επιβίωση CRC, η απόπτωση εκτιμήθηκε με διαλυτή νουκλεοσώματος κυτταροπλασματικά επίπεδα σε καλλιέργειες με και χωρίς εξωγενή BDNF ή K252a. Μετά από 24 ώρες ασιτία ορού, WiDr, SW480, SW620, και COLO 205 κύτταρα διεγερμένα με εξωγενή BDNF είχε μειωθεί σημαντικά αποπτωτικά αναλογίες, ενώ δεν παρατηρήθηκε σημαντική επίδραση επί των κυττάρων διατηρήθηκαν σε φυσιολογικό μέσο (Σχήμα 4Β, C και στον Πίνακα 2, 3 ). Επιπλέον, 200 ηΜ K252a αύξησε τις αναλογίες των αποπτωτικών WiDr, SW480, SW620, και COLO 205 (Σχήμα 4Β, C και στον Πίνακα 2, 3). Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν μετά από ασιτία 48 και 72 ωρών ορό επιβεβαίωσε αυτά τα δεδομένα (Σχ. 4Β, C), γεγονός που υποδηλώνει ότι ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων CRC μπορεί να διαμεσολαβείται από έναν /μονοπάτι σηματοδότησης TrkB BDNF.

(Α) Ρόλος ενδογενούς BDNF και του υποδοχέα της TrkB στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων CRC: επιδράσεις εξωγενών BDNF και καταστολή ενδογενή υποδοχέα TrkB επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Οι τέσσερις κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες σε μέσου άνευ FCS (FCS 10%, -) με την παρουσία του εξωγενούς BDNF (+), Κ252 & (+) μόνη ή σε συνδυασμό. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής χρησιμοποιώντας edu Alexa Fluor 488. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως ιστογράμματα πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων σε σχετικές μονάδες ± SEM από πέντε ανεξάρτητα πειράματα. *,

σ

& lt? 0,05? **

σ

& lt? 0,01? ***

σ

& lt? 0.001, σε σύγκριση με το μέσο ελεύθερο ορού. (B, C) Επίδραση της εξωγενούς BDNF και καταστολή ενδογενή υποδοχέα TrkB στην επιβίωση των κυττάρων. Τα αποπτωτικά αναλογίες διαλυτού νουκλεοσωμάτων ανιχνεύθηκαν με ELISA κυττάρων για WiDr, SW480, SW620, και COLO 205 που προκαλείται από τη στέρηση ορού μόνο (FCS 10%, -) ή σε συνδυασμό είτε με εξωγενή BDNF (+), ή με Κ252 & (+), κατά τη διάρκεια 24-72 ώρες στέρηση ορού. Ιστογράμματα, μέση αναλογία των αποπτωτικών κυττάρων ± SEM από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. *,

σ

& lt? 0,05? **

σ

& lt? 0,01? ***

σ

& lt? 0.001, σε σύγκριση με τον όρο ελεύθερο ορού μόνο. (D, E) αποπτωτικά αναλογία μετά από 24 ώρες και μόνο στέρηση ορού (0% FCS) ή με συνδυασμό με ένα εξουδετερωτικό αντι-BDNF mAb (0% αντι-BDNF). Ιστογράμματα, μέση αναλογία των αποπτωτικών κυττάρων ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. *,

σ

& lt? 0,05? **

σ

& lt? 0,01? ***

σ

& lt?. 0.001, σε σύγκριση με τον όρο ελεύθερο ορού και μόνο

Η

Για να ορίσετε το μονοπάτι μεταγωγής σήματος που προκαλείται από την ενεργοποίηση /TrkB BDNF, ψάξαμε για Akt φωσφορυλίωση σε δύο κυτταρικές σειρές CRC μετά την αγωγή BDNF. Πράγματι, κηλίδωση Western αποκάλυψε ότι η έκθεση του WiDr ή SW480 σε BDNF μετά από μια 16-ωρών στέρηση ορού, που προκαλείται από Akt φωσφορυλίωση (Ser 473) μετά από 5 λεπτά, έφθασε μέγιστο σε 30 λεπτά (7 έως 8-πλάσια αύξηση) και ακόμη ανιχνευθεί μετά 24 ώρες (3 έως 4-πλάσια αύξηση) (Σχήμα 5).

Η ικανότητα του BDNF να ενεργοποιεί ΡΙ3-κινάση /αξιολογήθηκε Akt μονοπάτι σηματοδότησης σε κύτταρα CRC χρησιμοποιώντας αντισώματα ειδικά για Akt και φωσφο-Akt (pAkt ). WiDr και SW480 κύτταρα στερήθηκαν ορού για 16 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια εκτέθηκαν σε BDNF (100 ng /ml) και συλλέχθηκαν σε διαφορετικούς χρόνους, επί 5 λεπτά (min) για 24 ώρες (h). Τριάντα μα προϊόντα λύσης πρωτείνης αναλύθηκε για pAkt (Ser473) και ολική Akt με ανάλυση κηλίδος Western. Η πυκνότητα κάθε ζώνης pAkt διορθώθηκε για διακύμανση στη φόρτωση, χρησιμοποιώντας την πυκνότητα της αντίστοιχης συνολικής Akt. Η πλάσια επαγωγή αξιολογήθηκε ως η αναλογία του φωσφορυλιωμένου Akt πυκνότητες πρωτεΐνης μεταξύ του ελέγχου (0 λεπτά) και τα επεξεργασμένα κύτταρα. Ένα αντιπροσωπευτικό αποτέλεσμα τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Ως εκ τούτου, προσδιορίζεται αποπτωτική επίπεδα των τεσσάρων κυτταρικών σειρών παρουσία ενός εξουδετερωτικών αντι-BDNF mAb [38]. Αυτό το mAb πράγματι αύξησε την απόπτωση των πρωτογενών γραμμών CRC: WiDr (Σχήμα 4D, αριστερά και Πίνακας 2), SW480 (σχήμα 4D, δεξιά και Πίνακας 2) και μεταστατικό γραμμές, SW620 (σχήμα 4Ε, αριστερά και Πίνακας 3) και COLO 205 ( Σχήμα 4Ε, δεξιά και Πίνακας 3).

Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η ενδογενής BDNF εμπλέκεται στην κυτταρική επιβίωση CRC σε καλλιέργειες χωρίς ορό μέσω TrkB μέσω ενός αυτοκρινούς βρόχου. Αυτό οδήγησε στη μελέτη του ρόλου της sortilin σε BDNF κυκλοφορίας.

Sortilin, μια πρωτεΐνη διακίνηση BDNF, εκφράζεται από κυτταρικές γραμμές CRC

Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη των μεταγραφών sortilin αναγνώρισε την ενδοκυτταρική μέρος της πρωτεΐνης (sortilin IC εμπλέκονται στη διακίνηση των νευροτροφινών) και το εξωκυτταρικό τμήμα (sortilin ΕΚ που εμπλέκονται στις ιδιότητες του υποδοχέα της). Sortilin μεταγραφής (Σχήμα 6Α) και της πρωτεΐνης (Σχήμα 6Β) ανιχνεύθηκαν σε όλες τις κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν. Σε σύγκριση με τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 10% FCS, ένα 24 έως 72-h στέρηση ορού ενισχυμένη sortilin έκφραση όπως ανιχνεύθηκε σε ανοσοστυπώματα του WiDr, SW480, SW620 και COLO 205 εκχυλίσματα (Σχήμα 6Β). Sortilin είναι γνωστό ότι υπάρχουν σε δύο διαφορετικές καταστάσεις της γλυκοζυλίωσης στα κύτταρα CRC. Πράγματι, ανιχνεύθηκε ως διπλή κορυφή στην SW480 κυτταρική γραμμή (Σχήμα 6Β), αλλά μόλις σε άλλες (WiDr, ΟοΙο205) με ένα μεταβλητό έκφραση μεταξύ των κυτταρικών γραμμών και καλλιεργειών (Σχήμα 6Β). Sortilin ανιχνεύθηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές CRC με συνεστιακή μικροσκοπία επίσης, όπως φαίνεται για SW620 (σχήμα 6C). Διπλή χρώση για sortilin και BDNF έδειξε μια εντυπωσιακή colocalization με αυξημένη ένταση φθορισμού μετά από ασιτία 24 h ορού (Σχήμα 6C). Ποσοτικοποίηση το πράσινο (BDNF) και κόκκινο εντάσεις (sortilin) ​​φθορισμού σε κάθε συνθήκες καλλιέργειας επιβεβαίωσε τα ευρήματα από τις εικόνες φθορισμού (Σχήμα 6C). Παρόμοια σχήματα χρώσης παρατηρήθηκαν με WiDr, SW620, και COLO 205 κυτταρικές σειρές υπό τις ίδιες συνθήκες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Συνολικά, τα αποτελέσματα μας είναι σε συμφωνία με την υπόθεση ότι θα μπορούσε να ασκήσει sortilin τη λειτουργία του μεταφορέα για BDNF.

(Α) ανίχνευση Sortilin με RT-PCR του συνολικού RNA που εκχυλίζεται από τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 10% FCS και μετά από 24 -72 ώρες ασιτία ορού. Έκφραση ελέγχθηκε με ειδικούς εκκινητές για την εξωκυττάρια του (Sortilin ΕΚ) και ενδοκυτταρικά (Sortilin IC) μέρη. Ένα αντιπροσωπευτικό αποτέλεσμα από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. (Β) Αξιολόγηση από κηλίδωση Western της έκφρασης sortilin (σε σχέση με ακτίνη) σε συνολική κυτταρική πρωτεΐνη που εξάγεται από μελέτησε κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν υπό βασικές συνθήκες και μετά από 24-72 ώρες στέρησης ορού.