Αφηρημένο

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θνησιμότητας από καρκίνο σχετίζονται με, και περίπου το 85% των περιπτώσεων καρκίνου του πνεύμονα είναι μη μικροκυτταρικό-κυττάρων (NSCLC). Είναι σημαντικό ότι, η πρόσφατη πρόοδος στην έρευνα για τον καρκίνο δείχνουν ότι η μεταβολή των καρκινικών κυττάρων βιοενεργειακό μπορούν να παρέχουν έναν αποτελεσματικό τρόπο για να στοχεύσετε τέτοιο προχωρημένο καρκίνο κύτταρα που έχουν αποκτήσει οι μεταλλάξεις σε πολλαπλές κυτταρικές ρυθμιστικές αρχές. Η μελέτη αυτή έχει ως στόχο να προσδιορίσει βιοενεργειακό μεταβολές στα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα από άμεση μέτρηση και τη σύγκριση βασικές μεταβολικές δραστηριότητες σε ένα ζευγάρι των κυτταρικών σειρών που αντιπροσωπεύουν την κανονική και NSCLC κύτταρα αναπτύχθηκε από τον ίδιο ασθενή. Βρήκαμε ότι οι ρυθμοί κατανάλωσης οξυγόνου και η βιοσύνθεση της αίμης εντάθηκαν στα κύτταρα NSCLC. Επιπροσθέτως, τα κύτταρα NSCLC εμφάνισαν σημαντικά αυξημένα επίπεδα σε μια σειρά από πρωτεΐνες προώθηση σύνθεση αίμης, η πρόσληψη και τη λειτουργία. Αυτές οι πρωτεΐνες περιλαμβάνουν το περιοριστικό του ρυθμού ένζυμο αίμης βιοσυνθετικών δυστυχώς, πρωτεΐνες μεταφορείς HRG1 και HCP1 που εμπλέκονται στην πρόσληψη αίμης, και διάφορους τύπους αιμοπρωτεϊνών οξυγόνο χρησιμοποιώντας όπως cytoglobin και κυτοχρώματα. Διάφοροι τύποι ανθρώπινων καρκινικών ξενομοσχευμάτων εμφανίζεται επίσης αυξημένα επίπεδα αυτών των πρωτεϊνών. Επιπλέον, βρήκαμε ότι η μείωση της βιοσύνθεσης της αίμης και την πρόσληψη, όπως και η μείωση μιτοχονδριακή αναπνοή, μείωσε αποτελεσματικά την κατανάλωση οξυγόνου, του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων, μετανάστευση και σχηματισμό αποικίας. Αντίθετα, η μείωση της υποβάθμισης αίμης δεν έχει επίδραση στον καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αυξημένη ροή αίμης και η λειτουργία είναι ένα βασικό χαρακτηριστικό των κυττάρων NSCLC. Περαιτέρω, η αυξημένη παραγωγή και προμήθεια της αίμης και αιμοπρωτεΐνες οξυγόνο που χρησιμοποιούν στα καρκινικά κύτταρα θα οδηγήσει σε εντατικοποίηση κατανάλωση οξυγόνου και την παραγωγή κυτταρικής ενέργειας από μιτοχονδριακή αναπνοή, η οποία θα τροφοδοτήσει τον πολλαπλασιασμό και την εξέλιξη των καρκινικών κυττάρων. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αναστολή της αίμης και αναπνευστική λειτουργία μπορεί να συλλάβει αποτελεσματικά την εξέλιξη του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων. Ως εκ τούτου, η κατανόηση της λειτουργίας της αίμης μπορεί να επιδράσει θετικά στην έρευνα στον πνεύμονα βιολογίας και της θεραπευτικής του καρκίνου

Παράθεση:. Hooda J, Cadinu D, Alam MM, Shah Α, Cao TM, Sullivan LA, et al. (2013) Ενισχυμένη Λειτουργία αίμη και μιτοχονδριακή αναπνοή Προώθηση της προόδου των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα. PLoS ONE 8 (5): e63402. doi: 10.1371 /journal.pone.0063402

Επιμέλεια: Shree Ram Singh, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2 Φεβρουαρίου, 2013? Αποδεκτές: 31ης Μαρτίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: May 21, 2013

Copyright: © 2013 Hooda et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τον Cecil H. και Ida Πράσινη ταμεία (LZ) και τη χορήγηση NCI SPORE P50CA70907 (RB). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Τα καρκινικά κύτταρα έχουν μια αυξημένη ζήτηση για τα θρεπτικά συστατικά, τα οποία παρέχουν κυτταρικής ενέργειας και μεταβολικές δομικά στοιχεία. Αυξημένη μεταβολική ζήτηση σε καρκινικά κύτταρα συχνά συνοδεύει αλλαγμένο μεταβολισμό. Στη δεκαετία του 1920, Otto Warburg απέδειξαν ότι τα κύτταρα του όγκου μεταβολίζουν τη γλυκόζη και να παράγει γαλακτικό σε υψηλότερα επίπεδα, παρά την παρουσία της άφθονης οξυγόνου, ένα φαινόμενο που ονομάζεται το αποτέλεσμα Warburg [1], [2]. Πιο πρόσφατες μελέτες έχουν αποκαλύψει τα μοριακά γεγονότα που διέπουν πολλές μεταβολικές αλλαγές στα καρκινικά κύτταρα [3] – [5]. Για παράδειγμα, Αναστασίου et al. [5] έδειξε πρόσφατα ότι το ένζυμο πυροσταφυλική κινάση Μ2 (PKM2), που είναι το κυρίαρχο πυροσταφυλική κινάση βρεθεί σε καρκινικά κύτταρα, είναι ζωτικής σημασίας για τη διατήρηση της ομοιόστασης κυτταρική οξειδοαναγωγής. Επιπλέον, πρόσφατες μελέτες υποδηλώνουν ότι τα μεταβολικά ένζυμα μπορούν να δράσουν ως καταστολείς όγκων (π.χ., φουμαρικό υδρατάσης και ηλεκτρική αφυδρογονάση), ή ογκογονίδια (π.χ., μεταλλαγμένο ισοκιτρική αφυδρογονάση 1 και 2) [6] – [8]. Αυτές οι πρόσφατες μελέτες επιβεβαίωσαν ότι αλλαγμένο μεταβολισμό είναι πράγματι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα του καρκίνου, και πρότεινε ότι οι αλλαγές στον μεταβολισμό σε καρκινικά κύτταρα είναι πολύ πιο περίπλοκη από ότι προτάθηκε αρχικά.

Πρόσφατες μελέτες απεικονίζεται ότι η ενισχυμένη γλυκολυτική ροή σε καρκινικά κύτταρα δεν εξαρτάται από μειωμένη κατανάλωση οξυγόνου ή μιτοχονδριακή αναπνοή [9] – [11]. Για παράδειγμα, δύο ξεχωριστές μελέτες [12], [13] έδειξε ότι μιτοχονδριακή αναπνοή ενισχύεται σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού. Μια άλλη μελέτη έδειξε ότι τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να διατηρήσει την οξειδωτική φωσφορυλίωση σε μειωμένη, αλλά ακόμη σημαντικό ποσοστό ακόμη και σε επίπεδο% 1 οξυγόνου [14]. Τα αποτελέσματα αυτά υπογραμμίζουν ότι η μιτοχονδριακή αναπνοή και η λειτουργία είναι ζωτικής σημασίας για το μεταβολισμό και την Βιοενέργεια καρκινικό κύτταρο. Ιδιαίτερα, η αίμη είναι ένας κεντρικός παράγοντας στη λειτουργία των μιτοχονδρίων και του μεταβολισμού του οξυγόνου [15], [16]. Αίμης παίζει κρίσιμο ρόλο σχεδόν σε κάθε διαδικασία που εμπλέκονται στο μεταβολισμό του οξυγόνου. Αίμης χρησιμεύει ως προσθετική ομάδα στην αιμοσφαιρίνη, μυοσφαιρίνη και άλλα σφαιρίνες ότι η μεταφορά ή αποθήκευση οξυγόνου, στο μιτοχονδριακό συγκροτήματα αναπνευστική αλυσίδα, σε κυτοχρώματος Ρ450 και άλλες οξυγενάσες που χρησιμοποιούν οξυγόνο για τις αντιδράσεις βιοσύνθεσης και της υποβάθμισης, και σε άλλα ένζυμα που χρησιμοποιούν ή να αποτοξινώσει το οξυγόνο όπως ως υπεροξειδάσες και καταλάσες [15], [17]. Ομοίως, βιοσύνθεση αίμης απαιτεί οξυγόνο ως υπόστρωμα, παρόλο που η Km της αίμης βιοσυνθετικών ενζύμων για το οξυγόνο είναι πολύ χαμηλή [18]. Ως εκ τούτου, αίμης και το οξυγόνο είναι στενά συνδεδεμένες και αλληλοεξαρτώμενες.

Εδώ θα διερευνήσει τη λειτουργία της αίμης και τα μιτοχόνδρια στην ανάπτυξη καρκίνου του πνεύμονα. Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θνησιμότητας σχετίζονται με τον καρκίνο στις ΗΠΑ και σε όλο τον κόσμο, και περίπου το 85% των περιπτώσεων καρκίνου του πνεύμονα είναι μη μικροκυτταρικό-κυττάρων (NSCLC) [19], [20]. Οι περισσότεροι ασθενείς έχουν τοπικά προχωρημένο στάδιο III /IV όγκους κατά τη στιγμή της παρουσίασης [21]. Αξιοποίηση του μεταβολισμού των τρωτών σημείων μπορεί να παρέχει αποτελεσματικές εναλλακτικές στρατηγικές για την καταπολέμηση της εξέλιξης του καρκίνου του πνεύμονα. Ως εκ τούτου, η οποία χαρακτηρίζεται και συγκρίθηκαν μεταβολισμού του οξυγόνου και λειτουργία αίμης σε HBEC30KT και HCC4017 κυττάρων [22], [23]. Αυτό το ζευγάρι των κυτταρικών σειρών παριστάνουν τα φυσιολογικά κύτταρα μη κακοήθη HBEC (HBEC30KT) και NSCLC (HCC4017) αναπτύχθηκε από τον ίδιο ασθενή. Συγκρίναμε την μεταβολική και μοριακή προφίλ αυτού ζεύγος κυτταρικών γραμμών που καλλιεργούνται κάτω από τις ίδιες συνθήκες. Ήμασταν ενδιαφέρονται για τον προσδιορισμό εάν και σε ποιο βαθμό μεταβολισμού του οξυγόνου και τα επίπεδα αίμης έχουν μεταβληθεί και αν αυτές οι τροποποιήσεις συμβάλλουν στη διατήρηση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η κατανάλωση οξυγόνου και η σύνθεση αίμης εντείνονται σημαντικά σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα, σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα. Επιπλέον, τα επίπεδα των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην ενδοκυτταρική σύνθεση αίμης και η πρόσληψη είναι σημαντικά αυξημένες σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Περαιτέρω, τα επίπεδα της αιμοπρωτεϊνών οξυγόνο χρησιμοποιώντας, όπως cytoglobin, ήταν δραματικά αυξημένη σε καρκινικά κύτταρα. Αναστολή της αίμης ή μιτοχονδριακής λειτουργίας προτίμηση καταστέλλεται κατανάλωση οξυγόνου, του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων, σχηματισμό αποικιών και τη μετανάστευση. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ενισχυμένη σύνθεση της αίμης και αιμοπρωτεΐνες στον καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων οδηγεί σε εντατικοποίηση της κατανάλωσης οξυγόνου και μιτοχονδριακή αναπνοή ότι η ανάπτυξη του καρκίνου κυψελών καυσίμου.

Υλικά και Μέθοδοι

πνεύμονα Συντήρηση, Θεραπεία και κυττάρων Καταμέτρηση

HBEC30KT και κυτταρικές σειρές HCC4017 αντιπροσωπεύουν κανονικά και NSCLC κύτταρα [22], [23] δόθηκαν από εργαστήριο Δρ John Minna του (UTSW) ως δώρο. Έχουν αναπτυχθεί από τον ίδιο ασθενή και διατηρήθηκαν σε ACL4 συμπληρωμένο με 2% FBS κάτω από 5% CO

2 στους 37 ° C [23]. Για την αγωγή με τον αναστολέα της σύνθεσης της αίμης, ηλεκτρινύλ ακετόνη, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο που περιέχει αίμη-εξαντλημένο ορό. Η αίμη απεμπλουτισμένο ορός παρασκευάστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Για τη μέτρηση της επίδρασης των αντιδραστηρίων επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων των πνευμόνων, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκα 48 φρεατίων σε μια πυκνότητα των 10

3 κύτταρα /φρεάτιο. Μετά από καλλιέργεια για 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0.5 mM ηλεκτρονυλ ακετόνη ή με 10 μΜ καρβονυλ κυανιούχου 3-χλωροφαινυλυδραζόνη (CCCP). Κάθε μετα-κατεργασία 24 ώρες, ο αριθμός των ζώντων κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας βαφή κυανούν τρυπανίου και αιμοκυτταρόμετρο.

Μέτρηση της γλυκόζης ανάλωση, ανάλωση οξυγόνου και αίμη Synthesis

Για τη μέτρηση της κατανάλωσης της γλυκόζης, τα κύτταρα (~ 90% συρροή) επωάστηκαν για 24 ώρες με φρέσκο ​​μέσο. Η γλυκόζη επίπεδο στο μέσο καλλιέργειας μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας γλυκόζης (GO) (Sigma). Η κατανάλωση οξυγόνου μετρήθηκε, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Εν συντομία, τα κύτταρα με περίπου 80% συρροή θρυψινοποιήθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε φρέσκο, air-κορεσμένο μέσο. Για κάθε μέτρηση, 10

6 κύτταρα (σε 350 μΐ) εισήχθησαν στο θάλαμο ενός συστήματος Oxygraph (Hansatech Instruments), με ένα ηλεκτρόδιο τύπου Clark τοποθετείται στο κάτω μέρος του αναπνευστικού θαλάμου. Κατά τη διάρκεια των μετρήσεων, ο θάλαμος θερμοστατικά στους 37 ° C με ένα λουτρό κυκλοφορούντος ύδατος. Ένα ηλεκτρομαγνητικό αναδευτήρα χρησιμοποιήθηκε για την ανάμιξη των περιεχομένων του θαλάμου. ρυθμός σύνθεση αίμης μετρήθηκε όπως περιγράφεται [24]. Εν συντομία, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0.5 mM ηλεκτρινυλ ακετόνη, ή 10 μΜ CCCP για 48 ώρες, και επωάστηκαν με 0,3 μθί [4-

14C] 5-αμινολεβουλινικό οξύ (PerkinElmer Life and αναλυτική Sciences) για 24 ώρες. Η αίμη εκχυλίσθηκε από αυτά τα κύτταρα με τη χρήση ακετόνης-υδροχλωρικό οξύ και διαιθυλαιθέρα, και η ποσότητα του ραδιοσημασμένου αίμης μετρήθηκε, όπως περιγράφεται [26]. Η ενσωμάτωση ραδιενέργειας στο εκχυλίζεται αίμης επιτρέπει τη μέτρηση της βιοσύνθεσης της αίμης. Η ποσότητα του ραδιοσημασμένου αίμης μετρήθηκε με απαρίθμηση σπινθηρισμού.

PCR πραγματικού χρόνου Η ποσοτικοποίηση και Ανίχνευση του μιτοχονδριακού DNA

Ολιγονουκλεοτιδικοί εκκινητές για τη μέτρηση των επιπέδων μεταγραφής των γονιδίων σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα Primer3 ( https://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για τη σχετική ποσοτικοποίηση των μεταγραφημάτων. Ολικό RNA εξήχθη από μη επεξεργασμένα κύτταρα ή κατεργασμένα με 0,5 mM ηλεκτρονυλ ακετόνη σε αίμη-εξαντλημένο μέσο χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen). RNA καθαρίστηκε με χρήση κιτ RNeasy (Qiagen). Η αντίστροφη μεταγραφή και PCR διεξήχθησαν σε ένα μόνο βήμα χρησιμοποιώντας το LightCycler RNA κύριο SYBR Green Ι Kit (Roche Applied Science), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Διεξήχθη PCR με τη χρήση ενός Roche LightCycler. Οι υπολογισμοί έγιναν με τη χρήση του λογισμικού της Roche LightCycler. Primer αλληλουχίες που χρησιμοποιήθηκαν για PCR πραγματικού χρόνου ήταν ως εξής: β-ακτίνης: 5′-προς τα εμπρός CACAGGGGAGGTGATAGCAT -3 ‘, 5′-αντίστροφη CACGAAGGCTCATCATTCAA -3’. ALAS1: διαβιβάσει 5′-CACACACCCCAGATGATGAA -3 ‘, 5′-αντίστροφη CCTGCAGAAGTTGCACTCAG -3’. ALAS2: προς τα εμπρός 5′-TGTCACCACCTATGCCTGAG -3 ‘, 5′-αντίστροφη GGCACACAACAAAGCAGAAG -3’

Το περιεχόμενο του mtDNA μετρήθηκε και συγκρίθηκε με την ποσοτικοποίηση των επιπέδων του μιτοχονδριακού γονιδίου 16S rRNA και το γονίδιο της πυρηνικής GAPDH, από. χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27]. Primer αλληλουχίες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ως εξής (5′-3 ‘): GAPDH: εμπρός TTCAACAGCGACACCCACT, αντίστροφη CCAGCCACTACCAGGAAAT. 16S rRNA: προς τα εμπρός CCAAACCCACTCCACCTTAC, αντίστροφη TCATCTTTCCCTTGCGGTA. Real-time PCR ενίσχυση διεξήχθη χρησιμοποιώντας το LightCycler FastStart DNA κύριο

PLUS SYBR Green Ι κιτ (Roche Applied Science), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Real-time PCR ενίσχυση για κάθε δείγμα πραγματοποιήθηκε σε τριάδες. Τα δεδομένα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό LightCycler. Η αναλογία του μιτοχονδριακού (16 rRNA) έναντι πυρηνικό DNA (GAPDH) υπολογίσθηκε.

Παρασκευή εκχυλισμάτων πρωτεΐνης, Western Blotting και μικροσκοπία ανοσοφθορισμού

HBEC30KT και HCC4017 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία, συλλέγονται, και λύθηκαν με τη χρήση του ρυθμιστικού RIPA (Cell Signaling Technology) που περιέχει το κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης. ξενομοσχεύματα ανθρώπινου όγκου διατηρήθηκαν, και προϊόντα λύσης από ανθρώπινα ξενομοσχεύματα όγκου παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται [28]. Οι πρωτεϊνικές συγκεντρώσεις προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας BCA (Thermo Scientific). 50 μg πρωτεϊνών από κάθε συνθήκη θεραπείας ηλεκτροφορήθηκαν σε 9% γέλες SDS-πολυακρυλαμιδίου, και στη συνέχεια μεταφέρθηκε στο Immuno-Blot PVDF μεμβράνη (Bio-Rad). Οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με πολύκλωνα αντισώματα, που ακολουθείται από ανίχνευση με ένα χημειοφωταύγειας κηλίδωση Western κιτ (Roche Diagnostics). Τα σήματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σταθμό εικόνα Carestream 4000mm Pro, και ποσοτικοποίηση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Carestream μοριακή απεικόνιση έκδοση λογισμικού 5.0.5.30 (Carestream Health, Inc.). χρώση ανοσοφθορισμού εκτελέστηκε ακολουθώντας τις διαδικασίες που παρέχονται από τον κατασκευαστή του αντισώματος. FITC και DAPI φθορίζουσες εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού ένα πολυκάναλο Zeiss Axio Observer.Z1. Πολυκλωνικά αντι-ALAS1, αντι-HRG1, αντι-κυτόχρωμα c, αντι-cytoglobin, αντι-CYP1B1, αντι-Cox-2 και αντι-HCP1 αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology. Το μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-β-ακτίνης αγοράστηκε από την Cell Signaling Technology.

Σχηματισμού Αποικίας and Cell Δοκιμασίες Μετανάστευση

Για την δοκιμασία σχηματισμού αποικίας, HCC4017 κύτταρα μετρήθηκαν και σπάρθηκαν σε πυκνότητα 1000 κύτταρα ανά καλά σε πλάκες 6 φρεατίων. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χωρίς ή με 0,5 mM ηλεκτρινυλ ακετόνη, ηλεκτρινύλ ακετόνη + αίμης (10 μΜ), 10 μΜ καρβονυλ κυανιούχου m-χλωροφαινυλ υδραζόνη (CCCP), ή 10 μΜ Tin πρωτοπορφυρίνης IX (SnPP). Μέσο ανανεώνεται κάθε τέσσερις ημέρες. Μετά από 10-12 ημέρες, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη, χρωματίστηκαν με 0.5% κρυσταλλικό ιώδες. Οι εικόνες που αποκτήθηκαν με τη χρήση του HP Scanjet 8270.

Μια δοκιμασία μηδέν in vitro χρησιμοποιήθηκε για να εξετάσει την επίδραση της αίμης και η ανεπάρκεια αίμης για τη μετανάστευση των κυττάρων HCC4017, όπως περιγράφεται [29]. Εν συντομία, HCC4017 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χωρίς ή με 0,5 mM ηλεκτρινυλ ακετόνη, ηλεκτρινύλ ακετόνη + αίμης (10 μΜ), ή 10 μΜ Tin πρωτοπορφυρίνης IX (SnPP) για 6 ημέρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και σπάρθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας σε 95% συρροή. Οι μονοστιβάδες χαραχθεί με 200 μΙ άκρο αποστειρωμένη πιπέττα και στη συνέχεια πλένονται για αρκετές φορές με PBS για την απομάκρυνση των κυτταρικών υπολειμμάτων. Τα κύτταρα στη συνέχεια διατηρήθηκαν στα αντίστοιχα μέσα, και τη μετανάστευση των κυττάρων παρακολουθήθηκε με τη χρήση μικροσκοπίου. Εκπρόσωπος εικόνες συλλήφθηκαν κατά μήκος του μηδέν σε διάφορα χρονικά σημεία. Κάθε αγωγή διεξήχθη εις τριπλούν.

Αποτελέσματα

NSCLC κύτταρα Εμφάνιση Εντατική τιμές της κατανάλωσης οξυγόνου

Μετρήσαμε και συγκρίναμε τις τιμές της γλυκόζης και της κατανάλωσης οξυγόνου σε ένα ζεύγος των τα κύτταρα είναι κανονικά, μη κακοήθη βρογχικών επιθηλιακών (HBEC30KT) και NSCLC (HCC4017) [22], [23]. Ο Πίνακας 1 δείχνει ότι τα ποσοστά των δύο κατανάλωσης γλυκόζης και οξυγόνου στα κύτταρα HCC4017 ήταν αυξημένα, με την ανύψωση της κατανάλωσης οξυγόνου πλησιάζει 2.5-φορές (Πίνακας 1). Ωστόσο, η αναλογία του μιτοχονδριακού DNA σε πυρηνικό DNA, μετρήθηκε όπως περιγράφεται [30], δεν ήταν διαφορετική μεταξύ των κυτταρικών σειρών. Αυτά τα στοιχεία δείχνουν ότι ενώ μιτοχονδριακή λειτουργία δεν διαταράσσεται, μιτοχονδριακή αναπνοή είναι σημαντικά αυξημένη στα κύτταρα NSCLC.

Η

Το ποσοστό της αίμης Βιοσύνθεση και τα επίπεδα έκφρασης της αίμης βιοσυνθετικών ενζύμων είναι σημαντικά αυξημένη σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα

η αίμη χρησιμεύει ως προσθετική ομάδα σε πολλές πρωτεΐνες και ένζυμα ότι η μεταφορά, την αποθήκευση και τη χρήση οξυγόνου και μπορεί να ρυθμίσει άμεσα πολλές διαδικασίες που εμπλέκονται στο μεταβολισμό του οξυγόνου [15], [16]. Ως εκ τούτου, εμείς αιτιολογημένη ότι η αυξημένη κατανάλωση οξυγόνου στα κύτταρα NSCLC μπορεί να οφείλεται σε αυξημένα επίπεδα της αίμης και αιμοπρωτεΐνες. Για να ελεγχθεί αυτή η πιθανότητα, μετρήσαμε πρώτα και συνέκρινε τα επίπεδα σύνθεσης αίμης σε NSCLC και φυσιολογικά κύτταρα. Βρήκαμε ότι ο ρυθμός σύνθεσης της αίμης αυξήθηκε σημαντικά στα κύτταρα NSCLC HCC4017, σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα HBEC30KT (Σχήμα 1Α). Η ισχυρός αναστολέας της σύνθεσης της αίμης, ηλεκτρινύλ ακετόνη (SA) [24], [31], ανέστειλε την σύνθεση αίμης σε NSCLC και φυσιολογικά κύτταρα, όπως αναμενόταν. Ηλεκτρινύλ ακετόνη έδειξε προηγουμένως ότι είναι ένας ειδικός και ισχυρός αναστολέας της σύνθεσης της αίμης σε διάφορα κύτταρα κυμαίνεται από τα κύτταρα HeLa, τα κύτταρα PC12 για νευρωνικά κύτταρα πρωτογενή ποντικού [32] – [37]. Είναι ενδιαφέρον ότι η CCCP μιτοχόνδρια αποσυζεύκτη (καρβονυλ κυανιούχο μετα-χλωροφαινυλυδραζόνη) μείωσε επίσης το ποσοστό της σύνθεσης της αίμης, αν και σε μικρότερο βαθμό (Σχήμα 1Α). CCCP αποσυνδέει οξειδωτική φωσφορυλίωση με ΑΤΡ γενιά στα μιτοχόνδρια [38]. Επειδή ο ρυθμός της κατανάλωσης οξυγόνου είναι πολύ υψηλή, σε σύγκριση με αυτό που απαιτείται για τη βιοσύνθεση της αίμης (Πίνακας 1), η ποσότητα του οξυγόνου που χρησιμοποιούνται για την βιοσύνθεση της αίμης είναι αμελητέος [18].

Η κανονική HBEC30KT πνευμονικά επιθηλιακά (HBEC κύτταρα) και NSCLC HCC4017 (HCC) καλλιεργήθηκαν, RNA και πρωτεΐνες εξήχθησαν. Τα επίπεδα μεταγραφημάτων ανιχνεύθηκαν με τη χρήση ποσοτικής πραγματικού χρόνου RT-PCR, και τα επίπεδα της πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν με τη χρήση κηλίδωση Western. (Α) Τα επίπεδα της βιοσύνθεσης της αίμης σε φυσιολογικά και NSCLC κύτταρα. (Β) Το επίπεδο μεταγραφή του ενζύμου αίμης βιοσυνθετικής ALAS1 σε φυσιολογικά και NSCLC κύτταρα. (Γ) Το επίπεδο μεταγραφή του ενζύμου αίμης βιοσυνθετικής ALAS2 σε φυσιολογικά και NSCLC κύτταρα. (Δ) Το επίπεδο της πρωτεΐνης του ενζύμου αίμης βιοσυνθετικής ALAS1 σε φυσιολογικά και NSCLC κύτταρα. Το επίπεδο πρωτεΐνης του β-ακτίνης στα δείγματα χρησιμοποιήθηκε για ομαλοποίηση. Για στατιστική ανάλυση, τα επίπεδα σε καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με τα επίπεδα στα φυσιολογικά κύτταρα, με τη χρήση Welch 2-δείγμα t-test. * Τιμή p & lt? 0,05? **, Ρ τιμή & lt?. 0.005

Η

Στη συνέχεια, μετρήθηκε το επίπεδο έκφρασης της ALAS1 (συνθάσης 5-αμινολεβουλινικό οξύ 1), η οποία είναι το ένζυμο περιορισμού του ρυθμού για τη σύνθεση της αίμης σε nonerythorid κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων του πνεύμονα [39]. Αρχικά μετρήθηκαν τα επίπεδα μεταγραφής ALAS1 σε NSCLC και φυσιολογικά κύτταρα χρησιμοποιώντας πραγματικού χρόνου RT-PCR. Η Εικόνα 1Β δείχνει ότι το επίπεδο μεταγραφής του γονιδίου nonerythroid ALAS1 πράγματι αυξήθηκε στα καρκινικά κύτταρα. Όπως αναμένεται από προηγούμενες μελέτες [[40], [41] και εκεί παραπομπές], η αναστολή της δραστικότητας ALAS με ηλεκτρινυλ ακετόνη προκάλεσε επαγωγή ALAS1 τόσο καρκίνου και φυσιολογικά κύτταρα, αν και η έκταση της επαγωγής φάνηκε να είναι μεγαλύτερη σε καρκινικά κύτταρα. Το γονίδιο ALAS2 ερυθροειδών ειδική δεν πιστεύεται ότι εκφράζεται σε φυσιολογικά κύτταρα του πνεύμονα? Ωστόσο, τα στοιχεία που παρέχονται από την ανθρώπινη πρωτεΐνη Atlas (www.proteinatlas.org) πρότεινε ότι ALAS2 εκφράζεται στο 16% των ιστών του καρκίνου του πνεύμονα. Ως εκ τούτου, μετρήσαμε επίσης το επίπεδο μεταγραφής ALAS2 σε πνευμονικά κύτταρα (Σχήμα 1Γ). Πράγματι, το επίπεδο μεταγραφής ALAS2 αυξήθηκε σε HCC4017 κύτταρα με σχεδόν πέντε φορές. Ηλεκτρυλο ακετόνη δεν είχε μετρήσιμη επίδραση στο επίπεδο ALAS2, όπως αναμενόταν, επειδή η έκφραση της ALAS2, σε αντίθεση με ALAS1, δεν ρυθμίζεται από το επίπεδο της αίμης [40]. Επιβεβαιώσαμε περαιτέρω την αύξηση του επιπέδου της πρωτεΐνης ALAS στον καρκίνο εναντίον φυσιολογικά κύτταρα. Το Σχήμα 1D δείχνει ότι το επίπεδο της πρωτεΐνης ALAS1 ήταν σημαντικά αυξημένη στα καρκινικά κύτταρα, και αυξήθηκε περαιτέρω κατά ηλεκτρινυλ ακετόνη. Αυτό είναι σύμφωνο με προηγούμενες μελέτες που δείχνουν ότι η αίμη μπορεί να ρυθμίσει αρνητικά ALAS1 μεταγραφικά και μετα-μεταγραφικά [40], [41]. Δεν μπορέσαμε να ανιχνεύσει την πρωτεΐνη ALAS2, ίσως λόγω του χαμηλού επιπέδου του στα κύτταρα του πνεύμονα. Παρά το γεγονός ότι το επίπεδο μεταγραφής του ανιχνεύεται σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα, το επίπεδο της φαίνεται να είναι σημαντικά χαμηλότερο σε σύγκριση με εκείνη των ALAS1.

Τα επίπεδα της αίμης πρόσληψη Πρωτεΐνες HCP1 και HRG1 και οξυγόνου χρησιμοποιώντας αιμοπρωτεΐνες είναι αυξημένα σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα

Για να εξακριβωθεί περαιτέρω η λειτουργία της αίμης στα κύτταρα NSCLC, συγκρίναμε τα επίπεδα των δύο μεταφορέων αίμης HCP1 (αίμης πρωτεϊνικό φορέα 1) και HRG1 (αίμη ανταποκρίνεται γονίδιο 1) [42], [43]. Εκφράζονται και εμπλέκονται στην πρόσληψη αίμης σε διάφορα μη-πολωμένα κύτταρα [43] – [46]. Βρήκαμε ότι τα επίπεδα των HCP1 και HRG1 είχαν αυξηθεί δραματικά σε HCC4017 κύτταρα, σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα (Σχήμα 2Α & amp? 2Β). Η αναστολή της σύνθεσης της αίμης με ηλεκτρινυλ ακετόνη δεν επηρέασε σημαντικά HCP1 και HRG1 επίπεδα, σε συμφωνία με προηγούμενα αποτελέσματα στα κύτταρα των θηλαστικών [44].

Η κανονική HBEC30KT πνευμονικά επιθηλιακά (HBEC) και κύτταρα NSCLC HCC4017 (HCC) καλλιεργήθηκαν και υποβάλλεται σε επεξεργασία όπως υποδεικνύεται. εκχυλίσματα πρωτεΐνης παρασκευάστηκαν και τα επίπεδα HCP1 και HRG1 ανιχνεύθηκαν με κηλίδωση Western. Το επίπεδο πρωτεΐνης του β-ακτίνης στα δείγματα χρησιμοποιήθηκε για ομαλοποίηση. (Α) Το επίπεδο της πρωτεΐνης της αίμης μεταφορέα HCP1 σε φυσιολογικά και NSCLC κύτταρα. (Β) Το επίπεδο της πρωτεΐνης της αίμης μεταφορέα HRG1 σε φυσιολογικά και NSCLC κύτταρα. Για στατιστική ανάλυση, τα επίπεδα σε καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με τα επίπεδα στα φυσιολογικά κύτταρα, με τη χρήση Welch 2-δείγμα t-test. **, Σ αξία & lt?. 0.005

Η

Η αύξηση της αίμης πρωτεΐνες πρόσληψη HCP1 και HRG1 μπορεί να παρέχει πρόσθετες αίμη για την παραγωγή αιμοπρωτεΐνες. Ως εκ τούτου, ανιχνεύθηκαν τα επίπεδα αρκετών αιμοπρωτεϊνών που εμπλέκονται στη μεταφορά και τη χρησιμοποίηση του οξυγόνου. Cytoglobin είναι αιμοπρωτεΐνη που εκφράζεται σε ινοβλάστες και πιθανόν διευκολύνει τη μεταφορά οξυγόνου και χρησιμοποίηση [47], [48]. Σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα πνεύμονα, cytoglobin δεν ανιχνεύθηκε, αλλά εκφράσθηκε με έντονο ρυθμό στη HCC4017 κύτταρα (Σχήμα 3Α). Ομοίως, τα επίπεδα των τριών άλλων αιμοπρωτεϊνών εμπλέκονται στην αξιοποίηση του οξυγόνου, το κυτόχρωμα c, CYP1B1 και Cox-2, ήταν επίσης σημαντικά αυξημένη (Σχήμα 3Β-3ϋ). Προφανώς, ενώ τα επίπεδα του cytoglobin και κυτόχρωμα c μειώθηκαν όταν ενδοκυτταρική τροφοδοσία αίμης μειώθηκε με καλλιέργεια κυττάρων σε αίμη-εξαντλημένο μέσο και με κατεργασία με τη σύνθεση της αίμης αναστολέα ηλεκτρινυλ ακετόνη, που επηρεάζονται από τα επίπεδα της αίμης, τα επίπεδα του ΟΥΡ1Β1 και Cox-2 δεν ήταν. Αυτό μπορεί να αποδοθεί στις διαφορετικές μηχανισμούς που διέπουν τη ρύθμιση αυτών των πρωτεϊνών. Ίσως ρυθμίζει αίμης άμεσα την έκφραση του cytoglobin και κυτόχρωμα c, ενώ ένα αίμης-ανεξάρτητο μηχανισμό συμβάλλει στην αύξηση των επιπέδων του ΟΥΡ1Β1 και Cox-2 σε καρκινικά κύτταρα. Εναλλακτικά, αίμη μπορεί να ρυθμίζει την έκφραση του ΟΥΡ1Β1 και Cox-2, αλλά η ρυθμιστική συγκέντρωση αίμης μπορεί να είναι πολύ χαμηλότερη από ότι για την έκφραση του cytoglobin και κυτόχρωμα c. Ως εκ τούτου, το κατώτερο επίπεδο της αίμης σε κύτταρα επεξεργασμένου με ακετόνη ηλεκτρονυλ μπορεί να μειώσει τα επίπεδα του cytoglobin και κυτόχρωμα c, αλλά όχι ΟΥΡ1Β1 και Cox-2.

Η κανονική HBEC30KT πνευμονικά επιθηλιακά (HBEC) και NSCLC HCC4017 (HCC) κύτταρα καλλιεργήθηκαν και υποβλήθηκε σε επεξεργασία όπως υποδεικνύεται. εκχυλίσματα πρωτεΐνης παρασκευάστηκαν και τα επίπεδα των αιμοπρωτεϊνών ανιχνεύθηκαν με κηλίδωση Western. Το επίπεδο πρωτεΐνης του β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε για ομαλοποίηση. (Α) Το επίπεδο της πρωτεΐνης των cytoglobin σε φυσιολογικά και NSCLC κύτταρα. (Β) το επίπεδο της πρωτεΐνης του κυτοχρώματος c σε φυσιολογικά και NSCLC κύτταρα. (Γ) Το επίπεδο πρωτεΐνης ΟΥΡ1Β1 σε φυσιολογικά και NSCLC κύτταρα. (D) Το επίπεδο πρωτεΐνης του Cox-2 σε φυσιολογικά και NSCLC κύτταρα. Για στατιστική ανάλυση, τα επίπεδα σε καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με τα επίπεδα στα φυσιολογικά κύτταρα, με τη χρήση Welch 2-δείγμα t-test. * Τιμή p & lt? 0,05? **, Σ αξία & lt?. 0.005

Η

Η επίδραση της μείωσης ενδοκυτταρική παροχή αίμης σε αυτές τις πρωτεΐνες μπορεί επίσης να παρατηρηθεί με τη χρήση χρώση ανοσοφθορισμού. Για παράδειγμα, το Σχήμα 4Α δείχνει ότι ALAS1 εμφάνισε μια μιτοχονδριακή μοτίβο εντοπισμού, ιδιαίτερα όταν το επίπεδο του ενισχύθηκε σε κύτταρα κατεργασμένα με ηλεκτρινυλ ακετόνη. Όταν ο φθορισμός υποβάθρου ήταν χαμηλή στο πάνελ SA (Σχήμα 4Α), FITC φθορισμού σαφώς colocalized με τον φθορισμό από Mitotracker, και η μιτοχονδριακή μοτίβο ήταν πολύ σαφέστερη. Το μοτίβο στον πίνακα Κανένα είναι λιγότερο σαφής, πιθανόν λόγω του φθορισμού υποβάθρου που προκαλείται από το χαμηλότερο επίπεδο των ALAS1 και χρώση του αντισώματος φόντο. Το Σχήμα 4Β δείχνει ότι το κυτόχρωμα c επέδειξε μία μιτοχονδριακή μοτίβο εντοπισμού, αλλά το επίπεδο του μειώθηκε σε κύτταρα επεξεργασμένα με ηλεκτρινυλ ακετόνη, και μιτοχονδριακό εντοπισμό του επίσης εξασθενήσει. Τα αποτελέσματα από χρώση έμμεσου ανοσοφθορισμού είναι συνεπή με τα αποτελέσματα από κηλίδωση Western. Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ενισχυμένη σύνθεση αίμης και την πρόσληψη σχετίζονται με αυξημένη παραγωγή διαφόρων αιμοπρωτεϊνών οξυγόνο χρησιμοποιώντας σε καρκινικά κύτταρα.

κύτταρα NSCLC HCC4017 (HCC) καλλιεργήθηκαν σε κανονικό μέσο (καμία) ή σε heme- εξαντλημένο μέσο που περιέχει 0.5 mM ηλεκτρυλο ακετόνη (SA). Τα κύτταρα βάφτηκαν πρώτα με αντι-ALAS1 ή αντι-κυτοχρώματος αντισώματα c, και στη συνέχεια με συζευγμένο με FITC δεύτερο αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού, Mitotracker, καθώς και DAPI. FITC, Mitotracker και DAPI φθορίζουσες εικόνες συλλήφθηκαν και φαίνονται εδώ. Η γραμμή κλίμακας δείχνει 10 μm.

Η

Τα επίπεδα της αίμης βιοσυνθετικής Enzyme Αλίμονο, αίμη πρόσληψη Πρωτεΐνες HCP1 και HRG1, και οξυγόνο χρησιμοποιώντας αιμοπρωτεΐνες Αυξημένη σε διάφορα ξενομοσχεύματα ανθρωπίνων όγκων

Για να καθοριστεί εάν η αύξηση του ενζύμου περιορισμού της ταχύτητος της αίμης βιοσυνθετική δυστυχώς, πρωτεΐνες πρόσληψης αίμης, και διάφορα αιμοπρωτεϊνών οξυγόνο χρησιμοποιώντας εμφανίζεται σε όγκους του πνεύμονα, αξιολογήσαμε τα επίπεδα αυτών των πρωτεϊνών σε πέντε διαφορετικές ξενομοσχεύματα ανθρώπινου όγκου (Σχήμα 5). Το Σχήμα 5Α δείχνει ότι σε όλες τις ξενομοσχεύματος όγκους, η πρωτεΐνη ALAS1 εκφράστηκε σε επίπεδα συγκρίσιμα με ότι στην HCC4017 κύτταρα, αλλά σημαντικά υψηλότερο από ότι στα φυσιολογικά κύτταρα HBEC30KT (βλέπε Σχήμα 1D). Ομοίως, τα επίπεδα των μεταφορέων αίμης HCP1 (Σχήμα 5Β) και HRG1 (Σχήμα 5C) ήταν αυξημένα στους όγκους ξενομοσχεύματος. Τα επίπεδα της αίμης περιέχουν, οξυγόνο-δεσμευτικές πρωτεΐνες cytoglobin (Σχήμα 5D) και του κυτοχρώματος Ρ450 ΟΥΡ1Β1 (Σχήμα 5Ε) επίσης ενισχυμένη στους όγκους. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ενισχυμένη σύνθεση αίμης, η πρόσληψη και η σύνθεση των αιμοπρωτεϊνών οξυγόνο χρησιμοποιώντας συμβαίνουν σε ποικίλα κύτταρα του πνεύμονα και των όγκων.

Τα υλικά λύσεως από τα υποδεικνυόμενα ξενομοσχεύματα ανθρώπινου όγκου παρασκευάστηκαν, και ανιχνεύθηκαν τα επίπεδα των υποδεικνυόμενων πρωτεϊνών με κηλίδωση Western. Το επίπεδο πρωτεΐνης του β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε για ομαλοποίηση. (Α) Το επίπεδο της πρωτεΐνης των ALAS1 σε HCC4017 κύτταρα και σε διάφορα ξενομοσχεύματα ανθρώπινου όγκου. (Β) το επίπεδο της πρωτεΐνης των HCP1 σε HCC4017 κύτταρα και σε διάφορα ξενομοσχεύματα ανθρώπινων όγκων. (Γ) Το επίπεδο πρωτεΐνης του HRG1 σε HCC4017 κύτταρα και σε διάφορα ξενομοσχεύματα ανθρώπινων όγκων. (Δ) Το επίπεδο της πρωτεΐνης των cytoglobin σε HCC4017 κύτταρα και σε διάφορα ξενομοσχεύματα ανθρώπινου όγκου. (Ε) Το επίπεδο πρωτεΐνης ΟΥΡ1Β1 σε HCC4017 κύτταρα και σε διάφορα ξενομοσχεύματα ανθρώπινου όγκου. Για στατιστική ανάλυση, τα επίπεδα στο HCC4017 κύτταρα και οι όγκοι σε σύγκριση με τα επίπεδα στα φυσιολογικά κύτταρα, με τη χρήση Welch 2-δείγμα t-test. * Τιμή p & lt? 0,05? **, Σ αξία & lt?. 0.005

Η

Μείωση αίμη Διαθεσιμότητα για NSCLC κύτταρα Καταστέλλει Κατά προτίμηση οξυγόνο κατανάλωση

Η αυξημένη σύνθεση αιμοπρωτεΐνες οξυγόνο χρησιμοποιώντας πιθανό μπορεί να συμβάλει στην εντατικοποίηση της κατανάλωσης οξυγόνου στον καρκίνο κύτταρα. Για να δοκιμαστεί αυτή η ιδέα, εξετάσαμε την επίδραση της αίμης καταστρέφουν επί του ρυθμού κατανάλωσης οξυγόνου σε καρκινικά και φυσιολογικά κύτταρα του πνεύμονα. Βρήκαμε ότι η κατανάλωση οξυγόνου στα κύτταρα NSCLC επιλεκτικά μειωμένη όταν τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε αίμη-εξαντλημένο μέσο (βλέπε σχήμα 6, HD). Σε αντίθεση, η εξάντληση της αίμης εντός του μέσου δεν επηρέασε την κατανάλωση οξυγόνου σε φυσιολογικά κύτταρα. Η αναστολή της ενδογενούς σύνθεσης της αίμης με ηλεκτρυλο ακετόνη (HD + SA, Σχήμα 6) μειώνεται περαιτέρω η κατανάλωση οξυγόνου σε καρκινικά κύτταρα σε ένα επίπεδο παρόμοιο με το επίπεδο σε κύτταρα κατεργασμένα με την μιτοχονδριακή αποσυζεύκτη CCCP. Ηλεκτρινύλ ακετόνη είχε μικρότερο αποτέλεσμα στα φυσιολογικά κύτταρα καθώς επίσης (Σχήμα 6). Προφανώς, η αναστολή της οξυγονάσης αίμης, το ένζυμο που εμπλέκεται στην αποικοδόμηση της αίμης, από κασσίτερο πρωτοπορφυρίνη (SnPP, σχήμα 6) δεν επηρέασε κατά προτίμηση τα καρκινικά κύτταρα. Αξιοσημείωτα, αυτές οι θεραπείες έχουν τα ίδια αποτελέσματα επί των κυττάρων Α549 καρκινώματος πνεύμονα (δεν φαίνεται). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι άφθονη προσφορά της αίμης είναι ζωτικής σημασίας για τη διατήρηση της κατανάλωσης οξυγόνου στα κύτταρα NSCLC σε υψηλότερο ποσοστό από ό, τι στα φυσιολογικά κύτταρα. Αυτά υποδεικνύουν έντονα ότι η ενισχυμένη σύνθεση αίμης και την πρόσληψη απαιτούνται για την αυξημένη κατανάλωση οξυγόνου στα κύτταρα NSCLC.

Η κανονική HBEC30KT πνεύμονα επιθηλιακά (HBEC) και NSCLC HCC4017 (HCC) κύτταρα καλλιεργήθηκαν και αντιμετωπίζονται σε κανονικό μέσο (None) , σε μέσο με αίμης εξαντλημένο (HD), σε μέσο με αίμη εξαντλημένο και ηλεκτρυλο ακετόνη (HD + SA), και σε μέσο με CCCP. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και τα ποσοστά κατανάλωσης οξυγόνου εντοπίστηκαν και σχεδιάστηκαν εδώ. Οι τιμές απεικονίζονται ήταν μέσοι όροι από τουλάχιστον τρία πειράματα. Για στατιστική ανάλυση, τα επίπεδα σε καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με τα επίπεδα στα φυσιολογικά κύτταρα, με τη χρήση Welch 2-δείγμα t-test. * Τιμή p & lt? 0,05? **, Σ αξία & lt?. 0.005

Η

Η αναστολή της αίμης Σύνθεση και λειτουργία των μιτοχονδρίων Καταστέλλει Απόλυτα NSCLC πολλαπλασιασμό των κυττάρων, Colony Σχηματισμός και Μετανάστευσης

Για να αξιολογηθεί η επίδραση της αναστολής της σύνθεσης αίμης και μιτοχονδριακή λειτουργία επί του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων και τη λειτουργία, εξετάσαμε ρυθμό ανάπτυξης καρκίνου του πνεύμονα, τον σχηματισμό αποικίας και τη μετανάστευση. Το Σχήμα 7Α δείχνει ότι η αναστολή της σύνθεσης της αίμης διέκοψε την ανάπτυξη των κυττάρων του καρκίνου HCC4017 πιο σοβαρά από ό, τι τα φυσιολογικά κύτταρα HBEC30KT. Ομοίως, η μιτοχονδριακή αποσυζεύκτη CCCP διακόπτεται HCC4017 κυτταρική ανάπτυξη πιο σοβαρά από ό, τι τα κύτταρα HBEC30KT (Σχήμα 7Α). Σε αντίθεση, η αναστολή της αποικοδόμησης αίμης με SnPP δεν επηρέασε επιλεκτικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων HCC4017. Τα ίδια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν όταν μετριέται σχηματισμό HCC4017 αποικία. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 7Β, τόσο ηλεκτρυλο ακετόνη και CCCP σταμάτησε εντελώς σχηματισμό αποικίας των καρκινικών κυττάρων. Η προσθήκη της αίμης αντιστραφεί σε μεγάλο βαθμό την επίδραση της αναστολής της σύνθεσης της αίμης. Όπως αναμενόταν, η αναστολή της αποικοδόμησης αίμης από κασσίτερο πρωτοπορφυρίνη IX (SnPP) δεν επηρέασε σημαντικά τον σχηματισμό αποικίας των καρκινικών κυττάρων. Περαιτέρω, εξετάσαμε την επίδραση της αναστολής της βιοσύνθεσης της αίμης και η πρόσληψη για τη μετανάστευση HCC4017 κυττάρων. κυτταρική μετανάστευση HCC4017 ουσιαστικά αναστέλλεται σε μέσο με αίμη εξαντλημένο και με ηλεκτρυλο ακετόνη (Σχήμα 7C). Εκτός της αίμης αντιστρέφει την αναστολή για τη μετανάστευση. Προσπαθήσαμε επίσης να εξετάσει την επίδραση του να χτυπήσει κάτω αίμης βιοσυνθετικών ενζύμων στα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα με τη χρήση Τα siRNAs που χρησιμοποιήθηκαν για να χτυπήσει κάτω βιοσύνθεση της αίμης σε κύτταρα HeLa [33]. Ωστόσο, δεν ήμασταν σε θέση να ληφθούν κλώνοι που εμφανίζουν χαμηλότερα επίπεδα της βιοσύνθεσης της αίμης, πιθανότατα επειδή τα κύτταρα HCC4017 έχουν αυξημένη ζήτηση για υψηλότερα επίπεδα της αίμης, η μείωση της βιοσύνθεσης της αίμης θα μείωνε την επιβίωσή τους. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αναστολή της διαθεσιμότητας αίμης και λειτουργίας μειώνει σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, σχηματισμό αποικιών, και τη μετανάστευση.

Κύτταρα κατεργασμένα με ηλεκτρινυλ ακετόνη διατηρήθηκαν επίσης σε αίμη-εξαντλημένο μέσο. (Α) Μείωση διαθεσιμότητα αίμης ή μιτοχονδριακή λειτουργία μειώνει επιλεκτικά τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων NSCLC. % Ζωντανά κύτταρα υπολογίστηκε διαιρώντας τον αριθμό των κατεργασμένων κυττάρων με τον αριθμό των μη κατεργασμένων κυττάρων (εμβολιάστηκε με τον ίδιο αριθμό κυττάρων). Δείχνει τις σχετικές πολλαπλασιαστικές τιμές των επεξεργασμένων κυττάρων (ΑΕ ή SnPP) έναντι μη επεξεργασμένα κύτταρα (None). (Β) Μείωση διαθεσιμότητα αίμης ή μιτοχονδριακή λειτουργία μειώνει επιλεκτικά το σχηματισμό αποικιών κυττάρων NSCLC. (C) Μείωση διαθεσιμότητα αίμης μειώνει κατά προτίμηση την κυτταρική μετανάστευση NSCLC.