Αφηρημένο

Οργανικά κατιόντων /καρνιτίνη μεταφορέα 2 (OCTN2) είναι υπεύθυνη για την κυτταρική πρόσληψη του αντινεοπλαστικού παράγοντα, οξαλιπλατίνη. Επιγενετικές τροποποίηση είναι ένας πιθανός μηχανισμός της αλλαγμένης έκφρασης ναρκωτικά μεταφορέα σε καρκίνους, που οδηγεί σε μεταβολή της αποτελεσματικότητας των χημειοθεραπευτικών φαρμάκων. Ωστόσο, οι μηχανισμοί που διέπουν τον κανονισμό OCTN2 δεν είναι πλήρως κατανοητοί. Σε αυτή τη μελέτη, τα χαμηλά επίπεδα του OCTN2 στα HepG2 και τα κύτταρα LS174T ήταν αυξημένα από το αντιδραστήριο απομεθυλίωσης, δεκιταβίνη (DCA). Να αποκαλύψει περαιτέρω την επιγενετική μηχανισμό ρύθμισης προς τα κάτω της OCTN2, βρήκαμε ότι η Περιφέρεια-1 μέσα στο

OCTN2

υποκινητή (που εκτείνονται σε -354 με 85) ήταν ένας καθοριστικός παράγοντας της έκφρασης OCTN2 σε μια δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης. Επιπλέον, η μεθυλίωση-ειδική PCR (MSP) και όξινο θειώδες γονιδιωματική αλληλούχιση έδειξε ότι ο βαθμός της ατομικής μεθυλιωμένων CpG θέσεων εντός της περιοχής αυτής ήταν αντιστρόφως ανάλογη με τα επίπεδα του OCTN2 σε διαφορετικά καρκινικά κύτταρα. Εφαρμογή του DCA σε HepG2 και LS174T κύτταρα αντιστραφεί η κατάσταση υπερμεθυλίωση του

OCTN2

υποκινητή και αυξημένη OCTN2 έκφρασης, ενισχύοντας την κυτταρική πρόσληψη της οξαλιπλατίνη. Έτσι, προσδιορίζονται ότι η μεθυλίωση προαγωγού είναι υπεύθυνη για επιγενετική ρύθμιση προς τα κάτω του OCTN2 σε HepG2 και τα κύτταρα LS174T. Δεδομένου τον ουσιαστικό ρόλο της OCTN2 στην πρόσληψη των καρκινικών κυττάρων του χημειοθεραπευτικών, και ως εκ τούτου την αποτελεσματικότητα της θεραπείας, προεπεξεργασία με ένα αντιδραστήριο απομεθυλίωσης είναι μια πιθανή στρατηγική για τη βελτιστοποίηση φαρμακοθεραπείες έναντι καρκίνων

Παράθεση:. Qu Q, Qu J, Zhan Μ, Wu LX, Zhang YW, Lou ΧΥ, et al. (2013) Διαφορετικές Συμμετοχή του Διοργανωτή μεθυλίωσης στην έκφραση του οργανικού κατιόντος /Καρνιτίνη Transporter 2 (OCTN2) στον Καρκίνο Γραμμές κυττάρων. PLoS ONE 8 (10): e76474. doi: 10.1371 /journal.pone.0076474

Επιμέλεια: Suresh Yenugu, Πανεπιστήμιο της Hyderabad, Ινδία

Ελήφθη: 16, Ιουλίου 2013? Αποδεκτές: 29 Αύγ 2013? Δημοσιεύθηκε: 16 Οκτωβρίου 2013

Copyright: © 2013 Qu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Ταμείο Υποτροφιών μέλους από την Κίνα Υποτροφιών του Συμβουλίου (File Νο 201 206 370 103), το Εθνικό Επιστημονικό Ίδρυμα της Κίνας (Νο 81273595, 81072706), η επιστημονική θεμελίωση της Χουνάν (Αρ 11K073, 10JJ4020), το «863» του έργου (Αρ 2012AA02A518), NCET-10 έως 0843 και Ερευνητικό ίδρυμα Καινοτομίας Μεταπτυχιακών Φοιτητών στην επαρχία Χουνάν, ΛΔΚ (CX2011B056). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

το ανθρώπινο

SLC22A5

γονίδιο, το οποίο κωδικοποιεί μια 63 kDa οργανικών κατιόντων /καρνιτίνη μεταφορέα 2 (OCTN2), βρίσκεται στην περιοχή του συμπλέγματος κυτοκινών στο χρωμόσωμα 5q31 [1], [2]. OCTN2 εκφράζεται σε διάφορους ιστούς, συμπεριλαμβανομένων των νεφρών, των σκελετικών μυών, της καρδιάς, του παχέος εντέρου, του εγκεφάλου, του ήπατος, κλπ. [3] Οι λειτουργικές ανωμαλίες του OCTN2 που σχετίζονται με διάφορες ασθένειες συμπεριλαμβανομένης της ανεπάρκειας καρνιτίνης πρωτογενή, νόσος του Crohn, και άσθμα [4] – [8]. OCTN2 μεταφέρει όχι μόνο καρνιτίνη, αλλά αναγνωρίζει επίσης κλινικά σημαντικό θεραπευτικά όπως ππΙάτοιίΕίε, βεραπαμίλη, πυριλαμίνη, οξαλιπλατίνη, το imatinib και κεφαλοριδίνη [9] – [13]. OCTN2 σχετίζεται με τη συσσώρευση οξαλιπλατίνη και κυτταροτοξικότητα σε OCTN2-ΗΕΚ293 επιμολυσμένα κύτταρα [11]. Οι δύο αλληλόμορφα του

OCTN2

(rs2631367 και rs2631372) μπορεί να είναι σημαντική προγνωστικούς παράγοντες σε ασθενείς με γαστρεντερικό στρωματικό όγκο που λαμβάνουν θεραπεία με imatinib [12]. Οι εκθέσεις αυτές υποδεικνύουν ότι τα λειτουργικά ελαττώματα και /ή την έκτοπον έκφρασιν OCTN2 μπορεί να επηρεάσει την διάθεση και την επακόλουθη θεραπευτική αποτελεσματικότητα των υποστρωμάτων της.

Αρκετές αναφορές υποδεικνύουν την εμπλοκή ενεργοποιείται από πολλαπλασιαστή περοξυσώματος υποδοχέα άλφα (PPARγ και) και γάμμα ( PPARG) στην μεταγραφική ρύθμιση του OCTN2 σε διάφορους ιστούς. Ωστόσο, κάτω ρύθμιση OCTN2 έχει αναφερθεί σε όγκους με υψηλή έκφραση του PPARγ και και PPARG [14] – [16]. Μια πρόσφατη μελέτη διαπίστωσε ότι τα μειωμένα επίπεδα OCTN2 σε αρκετές επιθηλιακές καρκινικές κυτταρικές γραμμές θα μπορούσε να αποκατασταθεί από το αντιδραστήριο απομεθυλίωσης 5-αζα-κυτιδίνης [17]. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι άλλα μηχανήματα συνεργάζονται με το δίκτυο παράγοντα μεταγραφής να ρυθμίζουν την έκφραση του OCTN2, όπως DNA μεθυλίωση.

μεθυλίωση του DNA είναι ένας σημαντικός μηχανισμός επιγενετική που ρυθμίζει την έκφραση του γονιδίου. Το δινουκλεοτίδιο CpG κοντά μεταγραφικές θέσεις εκκίνησης είναι άφθονη σε προαγωγούς γονιδίου και αναφέρεται ως νησίδες CpG. Η μεθυλίωση των CpG νησίδων συνδέεται με καταπιεσμένη μεταγραφή γονιδίων και ανώμαλη μεθυλίωση του DNA μπορεί να οδηγήσει σε μη φυσιολογική γονιδιακή έκφραση. Σε αντίθεση με μετάλλαξη γονιδίου, μεθυλίωση του DNA μπορεί να μεταβληθεί αναστρέψιμα με απομεθυλίωση παράγοντες όπως Decitabine (5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη, DCA) και 5-αζα-citidine. Αυτοί οι παράγοντες ενσωματώνονται στο DNA και αδρανοποιούν κυτοσίνη ϋΝΑ C5-μεθυλτρανσφεράσες [18]. Έτσι, υποθέσαμε ότι η κατάσταση διαφορική μεθυλίωση του

OCTN2

μπορεί να συσχετιστεί με την ανώμαλη έκφραση του OCTN2 σε καρκινικά κύτταρα.

Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε κατά πόσον η μεθυλίωση των CpG νησίδων δρα ως ένας πιθανός μηχανισμός υπεύθυνος για την ρύθμιση προς τα κάτω του OCTN2 σε καρκινικές κυτταρικές σειρές. Με τη χρήση μεθυλίωσης-ειδική PCR (MSP), διθειώδες γονιδιωματική αλληλούχιση, και

in vitro δοκιμασίες

μεθυλίωση, έχουμε παράσχει αποδείξεις ότι υποστηρικτής μεθυλίωση του DNA είναι ένα βασικό μηχανισμό καταστολής OCTN2 έκφρασης σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου. Εφαρμογή ενός αντιδραστηρίου απομεθυλίωσης, η οποία διαμορφώνεται η κατάσταση μεθυλίωσης του

OCTN2

υποκινητή, αύξησε την έκφραση του OCTN2 και έκανε τα καρκινικά κύτταρα πιο ευαίσθητα σε οξαλιπλατίνη.

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά και Αντιδραστήρια

Decitabine, όξινο θειικό νάτριο, υδροκινόνη και οξαλιπλατίνη αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ). αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ και Lipofectamine 2000 ελήφθησαν από την Invitrogen (Carlsbad, CA).

Κυτταροκαλλιέργεια και θεραπεία με DCA

Η κυτταρική σειρά ηπατώματος HepG2, καρκίνου του παχέος εντέρου LS174T κυτταρική γραμμή, κυτταρική γραμμή γλοιώματος U251, χοληδόχου πόρου καρκινική κυτταρική σειρά QBC-939 και πράσινου Αφρικανικού πιθήκου νεφρού κυτταρική γραμμή COS-7 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). Οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή που περιέχει 5% CO

2, εκτός της κυτταρικής γραμμής QBC-939, η οποία καλλιεργήθηκε σε RPMI 1640. Τα κύτταρα κατεργάζεται με DCA σε μια τελική συγκέντρωση 0.5 μΜ ή 1 μΜ και ανανεώνονται κάθε 24 ώρες για μία εβδομάδα.

καθαρισμό RNA, cDNA Σύνθεση και ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR

Ολικό κυτταρικό RNA απομονώθηκε από τα κύτταρα σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ. cDNA συντέθηκε από 1 μα ολικού RNA χρησιμοποιώντας το κιτ πρώτων σύνθεσης cDNA (Takara, Dalian). Ποσοτική RT-PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας SYBR Green (Bio-Rad) και οι εκκινητές που παρατίθενται στον Πίνακα S1. RT-PCR διεξήχθη επί 40 κύκλους στους 95 ° C για 30 s, στους 60 ° C για 30 s, και 72 ° C για 30 s που ακολουθείται από μια τελική επέκταση στους 72 ° C για 2 λεπτά. Η έκφραση σχετική mRNA ομαλοποιήθηκε με το γονίδιο της καθαριότητας

β-ακτίνης

και η ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του 2

-ΔΔCt μέθοδο [19].

κηλίδωση Western

Σύνολο κυτταρικές πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν και οι συγκεντρώσεις ποσοτικοποιήθηκαν με τον προσδιορισμό πρωτείνης BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL). Οι πρωτεΐνες υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα SDS-πολυακρυλαμιδίου επί πηκτωμάτων πολυακρυλαμιδίου 10% και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF. Η μεμβράνη ανιχνεύθηκε με είτε ένα αντίσωμα αντι-κουνελιού OCTN2 (1:400, Abcam Labs, Cambridge, ΜΑ) ή αντίσωμα β-ακτίνης (1:1000, Abcam Labs). Στη συνέχεια, οι μεμβράνες επωάστηκαν με αντίσωμα DyLight 800-επισημασμένο πολυκλωνικό κουνελιού (1:7500, ΚΡί Inc, Gaithersburg, MD), προστατευμένο από το φως. Οι βάφονται μεμβράνες σαρώθηκαν από την Οδύσσεια Infrared System απεικόνισης (LI-COR Biosciences). Οι αναλογίες του OCTN2 έναντι β-ακτίνης υπολογίστηκε.

Βιωσιμότητας Κυττάρων Δοκιμασία

Καρκινικές κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 1 μΜ DCA ή 0.1% DMSO για μία εβδομάδα. Ακολούθως, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 2 × 10

4 /φρεάτιο, και εκτέθηκαν σε οξαλιπλατίνη σε διάφορες συγκεντρώσεις (0, 0.3, 1, 3, 10, 33, 100 ή 330 μΜ) για 48 h. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με τη δοκιμασία MTS (Promega, Madison, WI) και IC

50 τιμές υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας SPSS 13.0 έκδοση.

ειδική της μεθυλίωσης PCR (MSP) και όξινο θειώδες Sequencing PCR (BSP)

για την πρόβλεψη περιοχές πλούσιες σε CpG δινουκλεοτίδια κοντά στην τοποθεσία

OCTN2

μεταγραφική ξεκινήσει, χρησιμοποιήσαμε μεθυλο-Primer λογισμικού (https://www.urogene.org/methprimer/) σύμφωνα με το ακόλουθα κριτήρια: το μήκος του νησιού CpG & gt? 100 bp, παρατηρείται /αναμενόμενη αναλογία CpG & gt? 0,6 και το ποσοστό του G συν C & gt? 50%. Ψάξαμε το

OCTN2

γονιδιωματικής αλληλουχίας συμπεριλαμβανομένων 1,5 kb ανάντη και 2 kb κατάντη της μεταγραφικής θέσης έναρξης (TSS). Σύμφωνα με τις προβλεπόμενες CpG νησίδες, MSP και BSP εκκινητές σχεδιάστηκαν και παρατίθενται στον Πίνακα S1. Γονιδιωματικό DNA από κυτταρικές σειρές καρκίνου του απομονώθηκε και τροποποίηση διθειώδους DNA πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται [20]. Bisulfite τροποποιημένο DNA ανακτήθηκε με Οδηγό DNA Clean Up System (Promega) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 5,5 μΙ NaOH μετά καταβυθίστηκε με αιθανόλη. Το καταβυθισμένο DNA επαναιωρήθηκε σε νερό, και στη συνέχεια ενισχύεται με MSP ή BSP εκκινητές. Η προϋπόθεση PCR ήταν ως ακολούθως: 94 ° C για 5 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους των 94 ° C για 30 s, θερμοκρασία ανόπτησης (Πίνακας S1) για 30 s, 72 ° C για 60 s, και τέλος 72 ° C για 5 min. Τα ενισχυμένα θραύσματα DNA σε πηκτώματα αγαρόζης 2% και βάφτηκαν με βρωμιούχο αιθίδιο. προϊόντα BSP καθαρίστηκαν με κιτ καθαρισμού DNA (Takara, Dalian) και εισάγεται εντός ρΟΕΜ-Τ Easy (Promega). Πέντε κλώνοι για κάθε κυτταρική σειρά επιλέχθηκαν τυχαία και η αλληλουχία τους. Η μεθυλιωμένη ακολουθία

OCTN2

ελέγχθηκε για την ευθυγράμμιση χρησιμοποιώντας MethBLAST.

Κατασκευή πλασμιδίου και

in vitro

μεθυλίωση Δοκιμασία

Σύμφωνα με τις προβλεπόμενες νησιά CpG σε η γονιδιωματική αλληλουχία, εμείς χωρίζεται τον υποκινητή σε τρεις περιοχές. Τρεις περιοχές που περιέχουν διαφορετικά νησιά CpG ενισχύθηκαν (Εναρκτήρες που απαριθμούνται στον Πίνακα S2) και εισάγεται εντός του φορέα pGL4.17 (Promega). Αυτά τα προϊόντα ανασυνδυασμού, pGL4.17-Region1, περιοχή 2 και περιοχή3 επιβεβαιώθηκαν με αυτοματοποιημένη αλληλούχιση. Το αντίστοιχο πλασμίδιο ευθυγραμμίστηκε με

Xho

Ι και υποβάλλεται σε

in vitro

τη δοκιμασία μεθυλίωσης, όπως περιγράφεται στην προηγούμενη εργασία μας [21]. Τα προϊόντα της μεθυλίωσης στη συνέχεια σε πέψη με

Κρη

Ι και εισάγεται εντός του φορέα pGL4.17. Αυτά τα νέα προϊόντα ανασυνδυασμού που περιέχει τις περιοχές υποκινητή μεθυλιωμένα ονομάστηκαν pGL4.17-mRegion 1, pGL4.17-mRegion 2 και pGL4.17-mRegion 3, αντίστοιχα.

παροδική επιμόλυνση και Λουσιφεράσης Δοκιμασία Έκθεση

κύτταρα COS-7 εμβολιάστηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων σε μια πυκνότητα των 10

5 /φρεάτιο σε 500 μΐ DMEM και 10% FBS. Μετά από 8 ώρες, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με φορείς που κατασκευάστηκαν λουσιφεράσης (0.2 μg /φρεάτιο) χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000. Ο φορέας pGL4.17 λείπει ένας προαγωγός χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος. Εσωτερικός έλεγχος φορέα ρΡΙ_-ΤΚ (0,02 μg /φρεάτιο) χρησιμοποιήθηκε για να ομαλοποιήσει δραστικότητα λουσιφεράσης. Μετά από 8 ώρες, το κάθε φρεάτιο των επιμολυσμένων κυττάρων εκπλύθηκε δύο φορές στη συνέχεια 100 μΙ ρυθμιστικού λύσης ανταποκριτή προστέθηκαν σε λύση των κυττάρων. Κάθε ομάδα είχε τριπλούν φρεάτια και επαναλήφθηκε περισσότερες από τρεις φορές. Διπλή δραστικότητα λουσιφεράσης (σχετικές μονάδες φωτός, RLU) προσδιορίστηκε με ένα φωτόμετρο.

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με μονόδρομη ANOVA για σημαντικότητα ακολουθείται από δοκιμή post-hoc χρησιμοποιώντας SPSS 13.0 λογισμικού. συγκρίσεις των δεδομένων με ένα

σ

αξία μικρότερη από 0,05 (

σ

& lt? 0,05). θεωρήθηκαν σημαντικά διαφορετικές

Αποτελέσματα

OCTN2 mRNA και πρωτεΐνης Επίπεδα σε διαφορετικές γραμμές Cancer Cell

Ολικό κυτταρικό RNA και πρωτεΐνη εκχυλίστηκαν από καρκινικές κυτταρικές γραμμές και OCTN2 έκφραση μετρήθηκε με ποσοτική RT-PCR και κηλίδωση Western, αντιστοίχως. Η υψηλότερη έκφραση του OCTN2 ήταν σε QBC-939, που ακολουθείται από U251, LS174T και κύτταρα HepG2 (εικ. 1). Οι εκφράσεις του OCTN2 σε QBC-939 και τα κύτταρα U251 ήταν σημαντικά υψηλότερες από ότι σε U251, κύτταρα LS174T (

σ

& lt? 0,05).

(Α), η ανάλυση των επιπέδων mRNA των OCTN2 σε κυτταρικές σειρές καρκίνου. Ολικό RNA σε καρκινικά κύτταρα καθαρίστηκε με αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ για σύνθεση cDNA και τα επίπεδα mRNA του OCTN2 αναλύθηκαν με ποσοτική RT-PCR. (Β), ανάλυση των επιπέδων της πρωτεΐνης του OCTN2 σε καρκινικά κύτταρα. Σύνολο πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν και τα επίπεδα πρωτεΐνης του OCTN2 αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. Η σχετική έκφραση του mRNA και της πρωτεΐνης ομαλοποιήθηκε σε β-ακτίνη. Η έκφραση του HepG2 ορίστηκε ως 1. Όλες mRNA και ανάλυση πρωτεϊνών διεξήχθησαν τρεις φορές. Σημαντική διαφορά από HepG2 ή κυττάρων LS174T συμβολίζεται με αστερίσκο (*,

σ

& lt? 0,05) ή σύμβολο αριθμού (#,

σ

& lt? 0.05), αντίστοιχα

Επιδράσεις της DCA για την Έκφραση της OCTN2 στον καρκίνο γραμμές κυττάρων

για να εξεταστεί αν οι αντιφατικά εκφράσεις OCTN2 σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές οφειλόταν σε μεθυλίωση υποκινητή, έχουμε αντιμετωπίζεται κυτταρικές σειρές καρκίνου με DCA και καθορίζεται η επαναφορά έκφραση OCTN2. Στο Σχ. 2, DCA αξιοσημείωτα επάνω ρυθμισμένη η σχετική έκφραση OCTN2 mRNA και πρωτεΐνης σε κύτταρα HepG2 με 0,5 μΜ (1,38-φορές, 1,61 φορές) και 1 θεραπεία μΜ (1,52-φορές, 2,07 φορές) (

p

& lt? 0,05), σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Παρομοίως, κατεργασία του DCA να οδηγήσει σε αύξηση των επιπέδων OCTN2 σε κύτταρα LS174T. Ωστόσο, DCA δεν άλλαξε την έκφραση του OCTN2 σε QBC-939 και τα κύτταρα U251, τα οποία είχαν ήδη επίπεδα έκφρασης υψηλού OCTN2.

(Α), ανάλυση των επιπέδων mRNA του OCTN2 σε DCA-αγωγή καρκινικών κυτταρικών γραμμών. Μετά τη θεραπεία με 0.5 και 1 μΜ DCA, το συνολικό RNA σε καρκινικά κύτταρα καθαρίστηκε με αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ για σύνθεση cDNA και τα επίπεδα mRNA του OCTN2 αναλύθηκαν με ποσοτική RT-PCR. (Β), ανάλυση των επιπέδων της πρωτεΐνης του OCTN2 σε DCA-αγωγή καρκινικών κυτταρικών γραμμών. Σύνολο πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν και τα επίπεδα πρωτεΐνης του OCTN2 αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. Η σχετική έκφραση του mRNA και της πρωτεΐνης ομαλοποιήθηκε σε β-ακτίνη. Τα στοιχεία που παρουσιάζονται αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο ± S.D. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Σημαντική διαφορά από την ομάδα ελέγχου της τάξης του 0,1% DMSO υποδηλώνεται με αστερίσκους (*,

σ

& lt? 0,05? **,

σ

& lt? 0,01).

Η

OCTN2 γονιδιωματική αλληλουχία Λιμάνια Τρεις CpG νησιά

Ψάξαμε το

OCTN2

γονιδιωματικής αλληλουχίας για τη θέση των δινουκλεοτιδίων CpG χρησιμοποιώντας Μεθυλ-αστάρι λογισμικού. CpG δινουκλεοτίδια βρέθηκαν εκτενώς βρίσκεται κοντά στο TSS (Εικ. 3Α). Σύμφωνα με την ένταση τοποθεσία δινουκλεοτιδίων CpG, παρατηρήσαμε τρεις υποθετικές CpG νησίδες που βρίσκονται στην

OCTN2

γονιδιωματική αλληλουχία. CpG νησί-2 βρίσκεται κοντά στην UTR και το εξώνιο 1, CpG νησί-3 βρίσκεται στο ιντρόνιο 1, και CpG νησί-1 βρίσκεται ανοδικά του TSS (Εικ. 3Α).

(Α), υπολογιστική ανάλυση αποκάλυψε τρεις υποθετικές CpG νησίδες εντός της γονιδιωματικής αλληλουχίας OCTN2 με μεθυλο-εκκινητή λογισμικό, όπως περιγράφεται στο

Υλικά και Μέθοδοι

. (Β), ανάλυση MSP για CpG νησίδες του OCTN2 σε 1 κατεργασμένα και μη κατεργασμένα κυτταρικές σειρές καρκίνου μΜ DCA. MSP εκτελέστηκε με τα ειδικά εναρκτήρια για να ενισχυθεί ο στόχος CpG κλάσματα νησιά και σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 2%. Όλα τα MSP και BSP ανάλυση επαναλήφθηκαν σε τρεις φορές. U: μη μεθυλιωμένη ακολουθία? Μ:. Μεθυλιωμένη ακολουθία

Η

Η μεθυλίωση Κατάσταση των CpG νησίδων εντός OCTN2 από MSP

Για την περαιτέρω διαλεύκανση της κατάστασης μεθυλίωσης των CpG νησίδων εντός

OCTN2

σε διαφορετικές καρκινικών κυττάρων γραμμές, αναλύσαμε τρεις νησίδες CpG από MSP που διακρίνει μεθυλιωμένο DNA από un-μεθυλιωμένο DNA. Στο Σχ. 3Β, CpG νησί-1 (CPG1) ήταν εντελώς μετουσιωμένο στα κύτταρα HepG2, μερικώς μετουσιωμένο σε LS174T και U251 κύτταρα, και un-μεθυλιωμένη στο QBC-939 κύτταρα. Μερικώς μεθυλιωμένα προϊόντα της νησίδας CpG-2 (CPG2) βρέθηκαν σε LS174T και QBC-939 κύτταρα, αλλά αυτά ήταν un-μεθυλιωμένη σε HepG2 και τα κύτταρα U251. Σε όλες σχεδόν τις κυτταρικές σειρές, CpG νησί-3 είχε περισσότερο μεθυλιωμένα προϊόντα από μη μεθυλιωμένα. Στο Σχ. 3C, μετά από θεραπεία με DCA, un-μεθυλιωμένο προϊόντα CPG1 αυξήθηκαν σε HepG2, LS174T και κύτταρα U251. Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι το DCA μπορεί να προκαλέσει de-μεθυλίωση στο CPG1. Ένα παρόμοιο αποτέλεσμα παρατηρήθηκε εντός CPG2. επεξεργασία DCA αυξημένη un-μεθυλιωμένα προϊόντα CpG3 στα κύτταρα HepG2, αλλά δεν προκάλεσε σημαντικές μεταβολές σε άλλα κύτταρα.

Επίδραση των Methylated και Un-μεθυλιωμένη Ανάδοχος Περιφερειών για μεταγραφή Δραστηριότητα της OCTN2 χρησιμοποιώντας ένα

in vitro

λουσιφεράσης Δοκιμασία

Για να προσδιορίσετε ποια μεθυλιωμένο CpG νησιά παίζουν ουσιαστικό ρόλο στην ρύθμιση προς τα κάτω των OCTN2, κατασκευάσαμε πλασμίδια αναφοράς της λουσιφεράσης που φέρουν είτε un-μετουσιωμένο ή μετουσιωμένο περιοχές (Εικ. 4). Κατασκευασμένο πλασμίδια επιμολύνθηκαν σε κύτταρα COS-7 και χρησιμοποιούνται για την αξιολόγηση μεταγραφική δραστηριότητα. Σε σύγκριση με pGL4.17 (Control), pGL4.17-Region1 παρουσίασαν σημαντικά αυξημένη δραστηριότητα λουσιφεράσης των 102,5 φορές (

σ

& lt? 0,01), ενώ η δραστηριότητα της λουσιφεράσης από pGL4.17-περιοχή 2 και περιοχή3 ήταν μόνο αυξήθηκε 11,4 φορές και 3,5 φορές (

σ

& gt? 0,05). Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι Region1 εκτείνονται -354 να +85 bp παίζει ουσιαστικό ρόλο στην δραστηριότητα προαγωγέα. Είναι ενδιαφέρον, μόνο η λουσιφεράσης δραστηριότητα un-μεθυλιωμένο Περιφέρεια-1 ήταν υψηλότερη από μετουσιωμένο φορέα του (29,7 φορές,

σ

& lt? 0,01). Un-μεθυλιωμένο Περιφερειών-2 και -3 δεν έδειξαν σημαντικές διαφορές στη δραστηριότητα της λουσιφεράσης σε σύγκριση με το αντίστοιχο μετουσιωμένο περιοχές τους. Είναι πιθανό ότι οι καταστάσεις μεθυλίωση της Περιφέρειας-2 και -3 περιέχουν CpG νησί-2 και -3, αντίστοιχα, είναι άσχετη με

OCTN2

έκφρασης. Έτσι, αυτά τα ευρήματα καταδεικνύουν ότι η αυξημένη μεθυλίωση μπορεί να αναστέλλει δραστικότητα προαγωγού του Region-1.

κατασκευασμένος φορέας λουσιφεράσης pGL4.17 περιέχουν μη μεθυλιωμένα και μεθυλιωμένα περιοχές προαγωγού επιμολύνθηκαν σε COS-7 κύτταρα με τον φορέα ελέγχου ρΡΙ_-ΤΚ. Σαράντα οκτώ ώρες αργότερα, τα κύτταρα πλύθηκαν και προσδιορίστηκαν για δραστικότητα λουσιφεράσης. Σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε σε φρεάτια εις τριπλούν. Τα στοιχεία που παρουσιάζονται αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο ± S.D. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Σημαντική διαφορά από την ομάδα θεραπείας του pGL4.17 συμβολίζεται με αστερίσκους (*,

ρ

& lt? 0,05? **

ρ

& lt? 0,01). Σημαντική διαφορά από την ομάδα της μεθυλιωμένης περιοχής στην ίδια περιοχή σημειώνεται με ένα σύμβολο (#,

σ

& lt? 0,05).

Η

Προσδιορισμός της μεθυλίωσης του DNA προφίλ των OCTN2 από BSP

Για την αξιολόγηση του προφίλ μεθυλίωσης των CpG θέσεων στην περιοχή-1, όξινο θειώδες γονιδιωματικής αλληλουχίας σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές πραγματοποιήθηκε. Στο Σχ. 5Α, η γονιδιωματική αλληλουχία του υποκινητή OCTN2 επιδείχθηκε και CpG θέσεις σημαδεύτηκαν. Ένα μεθυλιωμένο ακολουθία

OCTN2

εκτείνονται -325 έως -92 bp σε κύτταρα HepG2 ελέγχθηκε για την ευθυγράμμιση με τη χρήση MethBLAST και παρουσιάζεται στο Σχ. 5Β. Άλλα μεθυλιωμένες αλληλουχίες από LS174T, κύτταρα U251 QBC-939 και παρουσιάζονται στο Σχήμα S1, S2 και S3. Στο Σχ. 5C, τα προφίλ μεθυλίωση έδειξαν ότι τα ποσοστά του μεθυλιωμένου CpG θέσεων (mCpG /συνολικός αριθμός CpG) ήταν 72,2% και 60,0% σε HepG2 και LS174T κύτταρα, αντίστοιχα, το οποίο είναι πολύ υψηλότερο από τα ποσοστά μεθυλίωση που μετράται σε QBC-939 (20,0%) και U251 κύτταρα (11,1%). Επιπλέον, μετά από 1 μΜ θεραπεία DCA σε HepG2, τα ποσοστά των μεθυλιωμένων CpG θέσεων μειώθηκε σε 13,3% (Εικ. 6). Δεδομένου ότι οι υπερμεθυλιωμένων CpG θέσεις εντός OCTN2 διασωθούν με κατεργασία DCA σε HepG2 και LS174T κύτταρα, τα ευρήματα αυτά παρέχουν άμεση απόδειξη ότι η ατομική μεθυλιωμένες θέσεις CpG στον υποκινητή μπορεί να ρυθμίζει με ακρίβεια την έκφραση του OCTN2.

(Α), το γονιδιωματική αλληλουχία που εκτείνεται -325 έως -92 bp στο υποστηρικτής Περιφέρεια-1

OCTN2

. Δεκαοκτώ CpG θέσεις βρίσκονταν και σήμανση. (Β), διθειώδες ανάλυση γονιδιωματική αλληλούχιση του Region-1 του

OCTN2

σε κύτταρα HepG2. Bisulfite τροποποιημένου DNA ενισχύθηκε με BSP, όπως περιγράφεται στο

Υλικά και μέθοδοι

και, στη συνέχεια, η αλληλουχία τους. Πεντάκτινο αστέρι αντιπροσωπεύει μεθυλιωμένη CpG θέσεις. (C), προφίλ μεθυλίωσης του DNA των ατομικών μεθυλιωμένων δινουκλεοτιδίων CpG σε τέσσερις κυτταρικές σειρές καρκίνου. Μετά BSP, πέντε κλώνοι επιλέχθηκαν τυχαία και η αλληλουχία τους. Οι ακολουθίες μεθυλιωμένου ελέγχθηκαν για την ευθυγράμμιση χρησιμοποιώντας MethBLAST. Οι ανοικτές και μαύροι κύκλοι αντιπροσωπεύουν μη μεθυλιωμένο ή μεθυλιωμένο κυτοσίνες, αντίστοιχα.

Η

(Α), διθειώδες γονιδιωματική ανάλυση αλληλουχίας του DCA επεξεργασμένου HepG2 κύτταρα. Μετά την επεξεργασία του DCA, DNA εκχυλίστηκε και υποβλήθηκε σε όξινο θειώδες τροποποίηση. Bisulfite τροποποιημένου DNA ενισχύθηκε με BSP, όπως περιγράφεται στο

Υλικά και μέθοδοι

και, στη συνέχεια, η αλληλουχία τους. Πεντάκτινο αστέρι αντιπροσωπεύει μεθυλιωμένη CpG θέσεις. (Β), τα προφίλ μεθυλίωσης του DNA των ατομικών μεθυλιωμένων δινουκλεοτιδίων CpG σε DCA-επεξεργασμένα κύτταρα HepG2. Μετά BSP, πέντε κλώνοι επιλέχθηκαν τυχαία και η αλληλουχία τους. Οι ακολουθίες μεθυλιωμένου ελέγχθηκαν για την ευθυγράμμιση χρησιμοποιώντας MethBLAST. Οι ανοικτές και κλειστές κύκλοι αντιπροσωπεύουν μη μεθυλιωμένο ή μεθυλιωμένο κυτοσίνες, αντίστοιχα.

Η

Επιδράσεις της DCA σε ενισχύοντας την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων στην οξαλιπλατίνη

Για να κατανοηθεί περαιτέρω εάν η κατάσταση μεθυλίωσης του

OCTN2

γονίδιο επηρεάζει την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων να οξαλιπλατίνη, καρκινικά κύτταρα προ-αγωγή με DCA ακολουθείται από έκθεση σε οξαλιπλατίνη. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε και το IC

50 τιμές υπολογίστηκαν. Στο Σχήμα 7. Α, όταν τα κύτταρα εκτέθηκαν σε οξαλιπλατίνη σε 3, 10, 33 και 100 μΜ, βιωσιμότητα κυττάρου των DCA επεξεργασμένου HepG2 και LS174T μειώθηκε σε σύγκριση με κύτταρα DMSO-αγωγή (

ρ

& lt? 0,05 ), αλλά δεν αλλάζουν το U251 και QBC-939 κύτταρα. Στο Σχ. 7Β, το IC

50 τιμές για DCA-θεραπεία HepG2 και LS174T κύτταρα μειώθηκε σε 51,6% και 44,8% (

σ

& lt? 0.05), αντίστοιχα, σε σύγκριση με τα κύτταρα DMSO-θεραπεία, αλλά ήταν αμετάβλητες σε QBC-939 και τα κύτταρα U251. Ως εκ τούτου, είναι πιθανό ότι DCA ευαισθητοποιεί HepG2 και LS174T κύτταρα να οξαλιπλατίνη μέσω της αύξησης OCTN2 έκφραση και την ενίσχυση της πρόσληψης των οξαλιπλατίνη.

Τα καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε προ-αγωγή με 1 μΜ DCA για 1 εβδομάδα, σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων πλάκες σε 1 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο σε 100 μΙ ϋΜΕΜ και 10% FBS. Μετά από 8 ώρες, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε οξαλιπλατίνη σε διάφορες συγκεντρώσεις (0.1, 0.3, 1.0, 3.3, 10, 33, 100 ή 330 μΜ) για 48 ώρες σε φρέσκο ​​μέσο καλλιέργειας. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίζεται με MTS πολλαπλασιασμός κυττάρων κιτ δοκιμασίας. Κάθε συγκέντρωση προσδιορίστηκε σε τρία φρεάτια. Τα στοιχεία που παρουσιάζονται αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο ± S.D. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Α), εμφανίστηκε η βιωσιμότητα των κυττάρων σε κάθε συγκέντρωση. Οι σημαντικές διαφορές από τη θεραπεία DMSO σημειώνονται με αστερίσκο (*,

σ

& lt? 0,05). (Β), IC

50 τιμές υπολογίστηκαν με SPSS 13.0 λογισμικού. Τα στοιχεία που παρουσιάζονται αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο ± S.D. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Οι σημαντικές διαφορές από μη επεξεργασμένα κύτταρα σημειώνονται με αστερίσκο (*,

σ

& lt? 0,05).

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι υπερμεθυλίωση εντός του

OCTN2

υποκινητής είναι υπεύθυνη για την ρύθμιση προς τα κάτω των

OCTN2

σε HepG2 και LS174T κύτταρα. Εμείς ανιχνευθεί με ακρίβεια ο βαθμός της μεθυλίωσης των μεμονωμένων μεθυλιωμένων CpG θέσεων στην περιοχή προαγωγού από MSP και BSP, η οποία αντιστρόφως ανάλογη με την έκφραση της OCTN2 σε διαφορετικά καρκινικά κύτταρα. Επιπλέον, DCA προ-επεξεργασία των HepG2 και LS174T κυττάρων αυξήθηκε οξαλιπλατίνη που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο μέσω OCTN2 απομεθυλίωση.

Ο ουσιαστικός ρόλος της μεθυλίωσης του DNA έχει προσελκύσει μεγάλο ενδιαφέρον ως πιθανός μηχανισμός βασίζεται η ανώμαλη έκφραση των ογκογονιδίων, ογκοκατασταλτικών γονιδίων και των γονιδίων επιδιόρθωσης του DNA σε κύτταρα καρκινώματος. Πρόσφατα ευρήματα δείχνουν ένα ρόλο για μεθυλίωσης του DNA στη ρύθμιση της έκφρασης των μεταφορέων, όπως SLC22A1, Α2, Α3 (OCT1, OCT2, OCT3), SLC22A18, SLC5A8, Ntcp, Oatp1b2, BSEP, ABCG2, ABCG5 /G8 [22] – [ ,,,0],27]. Για να κατανοήσουμε το μηχανισμό με τον οποίο OCTN2 έκφραση καταστέλλεται σε HepG2 και LS174T κύτταρα, που αντιμετωπίζονται αυτές τις κυτταρικές σειρές με το DCA αντιδραστήριο απομεθυλίωσης και παρατηρείται μια αύξηση στην OCTN2 mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης σε HepG2 και LS174T κύτταρα, ενώ δεν σημειώθηκαν αλλαγές στο QBC-939 και τα κύτταρα U251. Μια πρόσφατη μελέτη διαπίστωσε επίσης ότι τα χαμηλά επίπεδα της OCTN2 αυξήθηκαν κατά DCA σε ανθρώπινο papillomavirus16 E6- και Ε7 εκφράζοντας κερατινοκυττάρων [17]. DCA αναστέλλει DNA μεθυλοτρανσφεράση ένζυμα (DNMTs) και περαιτέρω διαφθείρει την ακεραιότητα της αποτύπωμα μεθυλίωσης, οδηγώντας έτσι στην διατάραξη των επιγενετικών υπογραφές και τη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης [28]. Έτσι, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η προς τα κάτω ρύθμιση των OCTN2 σε HepG2 και τα κύτταρα LS174T μπορεί να οφείλεται σε παρεκκλίνουσα μεθυλίωση του υποκινητή.

Αναλύοντας τις τρεις υποθετικές CpG νησίδες μέσα στο

OCTN2

, παρατηρήσαμε ότι CpG νησιά εμφανίζονται διαφορετικές καταστάσεις μεθυλίωσης σε διάφορα καρκινικά κύτταρα, και ότι υπερμεθυλίωση θα μπορούσε να μειωθεί κατά DCA. Ως εκ τούτου, επιδιώξαμε να προσδιορίσει ποιο νησί CpG διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στη ρύθμιση της έκφρασης OCTN2. Στην δοκιμασία λουσιφεράσης, μόνο ο υποκινητής Περιφέρεια-1 που εκτείνονται σε -354 με 85 bp έδειξε αυξημένη δραστηριότητα του υποκινητή. Επιπλέον, η μεθυλίωση του Region-1 που μιμείται τα μοτίβα μεθυλίωσης σε κύτταρα, ανέστειλε πλήρως την δραστηριότητα προαγωγέα. Αυτό το αποτέλεσμα παρέχει την απόδειξη ότι Region-1 είναι ένας πιθανός καθοριστικός παράγοντας της έκφρασης OCTN2, επειδή υπερμεθυλίωση Region-1 ανέστειλαν την μεταγραφική δραστικότητα OCTN2 σε LS174T και HepG2 κύτταρα.

Bisulfite γονιδιωματική αλληλούχιση ανιχνευθεί με ακρίβεια τις μεμονωμένες μεθυλιωμένες CpG θέσεις εντός υποκινητή Region-1, η οποία ήταν σημαντικά υπερμεθυλίωση σε HepG2 και LS174T συγκριτικά με QBC-939 και τα κύτταρα U251. Ο βαθμός της μεθυλίωσης του DNA ήταν αντιστρόφως ανάλογη με την έκφραση της OCTN2 σε αυτά τα καρκινικά κύτταρα. Αυτά τα ευρήματα μπορούν εύλογα να εξηγήσει τα χαμηλότερα επίπεδα OCTN2 σε HepG2 και LS174T κύτταρα, σε σύγκριση με την έκφραση σε QBC-939 και τα κύτταρα U251. Επιπλέον, DCA αντέστρεψε την μεθυλίωση των CpG θέσεων στην περιοχή-1 σε κύτταρα HepG2 συνάδει με την αύξηση στην έκφραση OCTN2.

δινουκλεοτίδια CpG μεθυλιωμένος εντός υποκινητή Region-1 αναστέλλουν την έκφραση του

OCTN2

πιθανώς μέσω δύο μηχανισμών. Πρώτον, πολλές συνδέσεις μεταγραφικού παράγοντα μπορεί να μπλοκαριστεί από μεθυλιωμένων δινουκλεοτιδίων CpG εντός του

OCTN2

υποκινητή. Αναλύσαμε υποστηρικτής Περιφέρεια-1

OCTN2

από το λογισμικό TFSEARCH (https://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html), και διαπίστωσε ότι οι θέσεις της πρωτεΐνης ειδικότητας μεταγραφικού παράγοντα 1 δεσμευτική συναίνεση (SP1) και μυελοειδούς δακτύλου ψευδαργύρου 1 (MZF-1) επικαλύπτονται ορισμένα βασικά περιοχές CpG (Σχ S4). Περαιτέρω εργασίες είναι σε εξέλιξη για να διερευνήσει κατά πόσον η μεθυλίωση των συγκεκριμένων CpG τοποθεσίες μπλοκ αυτοί οι παράγοντες μεταγραφής. Ένας δεύτερος πιθανός μηχανισμός είναι η παρεκκλίνουσα ρύθμιση των ενζύμων μεθυλτρανσφεράση DNA και μεθυλίωση εξαρτώμενη πρόσληψη νουκλεοπρωτεΐνης παράγοντες, όπως η πρωτεΐνη δέσμευσης μεθυλο-CpG MeCP1 και MeCP2 [29] – [31]. Εμείς θα διερευνήσει το πώς οι υπερμεθυλιωμένων CpG θέσεις της OCTN2 πρόσληψη αυτών των πρωτεϊνών μεθυλίωσης συνδέονται και να καταστέλλουν την έκφραση της OCTN2.

Με δεδομένο τον ουσιαστικό ρόλο των OCTN2 στην πρόσληψη των καρκινικών κυττάρων και έτσι την αποτελεσματικότητα της θεραπείας της οξαλιπλατίνη, η μεθυλίωση του

OCTN2

θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως στόχος για την ενίσχυση της θεραπευτικής αποτελεσματικότητας. Μετά τη θεραπεία με 1 μΜ DCA, HepG2 και LS174T κύτταρα έγιναν πιο ευαίσθητα σε οξαλιπλατίνη, αλλά όχι τα κύτταρα QBC-939 και U251. Επιπλέον, σε DCA επεξεργασμένα κύτταρα, η αυξημένη έκφραση του OCTN2 ανατίθενται μεγαλύτερη πρόσληψη οξαλιπλατίνη και περισσότερο κυτταροτοξικότητα από τους μη-κατεργασμένα κύτταρα DCA. Αν και DCA σε υψηλές συγκεντρώσεις προκαλεί την παγκόσμια γενωμική αστάθεια και την κυτταροτοξικότητα, DCA σε χαμηλές συγκεντρώσεις δρα κυρίως για να αναστείλει DNMT αντί να επάγει κυτταρικό θάνατο [32]. Έτσι, DCA χορηγήθηκε ταυτόχρονα με οξαλιπλατίνη, και η προκύπτουσα αποκατάσταση της έκφρασης OCTN2 ενίσχυσε την πρόσληψη και την αποτελεσματικότητα των οξαλιπλατίνη.

Συμπέρασμα

Εν κατακλείδι, έχουμε αποκάλυψε την επιγενετική μηχανισμός της ρύθμισης προς τα κάτω του

OCTN2

σε διάφορα καρκινικά κύτταρα. Η περιοχή του υποκινητή που εκτείνονται σε -354 με 85 ήταν ένας καθοριστικός παράγοντας της έκφρασης OCTN2. Ο βαθμός μεθυλιωμένων CpG θέσεων εντός της περιοχής ήταν αντιστρόφως ανάλογη με τα επίπεδα του OCTN2 σε καρκινικά κύτταρα. Εφαρμογή του παράγοντα απομεθυλίωσης, DCA, αντέστρεψε την κατάσταση υπερμεθυλίωση του

OCTN2

υποκινητή και αυξημένη OCTN2 έκφρασης, οδηγώντας έτσι σε αυξημένη πρόσληψη της οξαλιπλατίνης που προκαλούν τα καρκινικά κύτταρα για να είναι πιο ευαίσθητα σε οξαλιπλατίνη. Με δεδομένο το σημαντικό ρόλο της OCTN2 στην πρόσληψη των καρκινικών κυττάρων και έτσι την αποτελεσματικότητα της θεραπείας των διαφόρων χημειοθεραπευτικών, η προεπεξεργασία ενός αντιδραστηρίου απομεθυλίωσης είναι μια πιθανή στρατηγική για τη βελτιστοποίηση της φαρμακοθεραπείας εναντίον καρκίνων.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

μεθυλίωση προφίλ γύρω από τη θέση έναρξης της μεταγραφής

OCTN2

στα κύτταρα LS174T. DNA εκχυλίστηκε και υποβλήθηκε σε όξινο θειώδες τροποποίηση. Bisulfite τροποποιημένου DNA ενισχύθηκε με BSP και αλληλουχήθηκαν όπως περιγράφεται στο

Υλικά και μέθοδοι

. Πεντάκτινο αστέρι αντιπροσωπεύει μεθυλιωμένη CpG θέσεις

doi:. 10.1371 /journal.pone.0076474.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

μεθυλίωση προφίλ γύρω από τη θέση έναρξης της μεταγραφής

OCTN2

σε QBC-939 κύτταρα. DNA εκχυλίστηκε και υποβλήθηκε σε όξινο θειώδες τροποποίηση. Bisulfite τροποποιημένου DNA ενισχύθηκε με BSP και αλληλουχήθηκαν όπως περιγράφεται στο

Υλικά και μέθοδοι

. Πεντάκτινο αστέρι αντιπροσωπεύει μεθυλιωμένη CpG θέσεις

doi:. 10.1371 /journal.pone.0076474.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

μεθυλίωση προφίλ γύρω από τη θέση έναρξης της μεταγραφής

OCTN2

στα κύτταρα U251. DNA εκχυλίστηκε και υποβλήθηκε σε όξινο θειώδες τροποποίηση. Bisulfite τροποποιημένου DNA ενισχύθηκε με BSP και αλληλουχήθηκαν όπως περιγράφεται στο

Υλικά και μέθοδοι

. Πεντάκτινο αστέρι αντιπροσωπεύει μεθυλιωμένη CpG θέσεις

doi:. 10.1371 /journal.pone.0076474.s003

(ΔΕΘ)

Εικόνα S4.

δέσμευσης παράγοντα μεταγραφής ανάλυσης του χώρου της περιοχής του υποκινητή του

OCTN2

από το λογισμικό TFsearch. Για να αποκαλυφθεί ο μηχανισμός με τον οποίο αναστέλλει μεθυλιωμένο CpG θέσεις

OCTN2

μεταγραφή, θα χαρτογραφηθεί τις υποθετικές αλληλουχίες συναίνεση για τους παράγοντες μεταγραφής. CpG θέσεις είναι στις κόκκινες γραμμές. Οι υποθετικές αλληλουχίες συναίνεση υποδεικνύεται με διακεκομμένες γραμμές

doi:. 10.1371 /journal.pone.0076474.s004

(ΔΕΘ)

Πίνακα S1.

Αστάρια για ποσοτική RT-PCR, MSP και BSP

doi:. 10.1371 /journal.pone.0076474.s005

(PDF)

Πίνακας S2.

Αστάρια για την κατασκευή των φορέων αναφοράς λουσιφεράσης

doi:. 10.1371 /journal.pone.0076474.s006

(PDF)

Ευχαριστίες

Είμαστε ευγνώμονες στον Δρ . Jie Liu και ο Δρ Helen Renaud, ο οποίος παρείχε τη γλώσσα βοήθεια.