Abstract

Η φλεγμονώδης νόσος του εντέρου (IBD) μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης ορθοκολικού καρκίνου (CRC). Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να δημιουργήσει ένα μοντέλο για τη συνδυασμένη μεταμόσχευση μυελού των οστών (ΒΜΤ) και κολίτιδα σχετιζόμενη με τον καρκίνο του παχέος εντέρου (CAC) και να καθορίσει τη συμβολή της BM-προερχόμενα κύτταρα κατά τη διάρκεια της φλεγμονής που σχετίζεται με την καρκινογένεση. Έχουμε δημιουργήσει ένα μοντέλο για την ΒΜΤ χρησιμοποιώντας πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) διαγονιδιακών ποντικών, που ακολουθείται από ΑΟΜ /DSS που προκαλείται από CAC, και εκτελούνται συνεστιακή ανάλυση μικροσκόπιο για

in vivo

ζωντανό ιστό και κατεψυγμένα τμήματα του όγκου. Οι αναλύσεις απεικόνιση μας έδειξαν ότι GFP-θετικά κύτταρα διείσδυσαν εκτεταμένα την στρώματος του όγκου και ότι ορισμένοι WGA και GFP ή CD31 και GFP διπλά θετικά κύτταρα παρατηρήθηκαν στην επένδυση των αγγείων του όγκου. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των κυττάρων του όγκου που διηθούν έδειξε ότι η GFP-θετικά CD11c + DCs κύτταρα το ένα τρίτο του GFP + /CD11C- κυττάρων, και ότι τα μισά από αυτά DCs (0,96% έναντι 1,02%) ήταν GFP-θετικά BM-προερχόμενο κύτταρα. Η πλειοψηφία των CD4

+ Τ κύτταρα GFP-αρνητικά (12,02% έναντι 1,9%), και ανακαλύψαμε ένα μυθιστόρημα CD4

+ CD 11 c

+ υποσύνολο DC (0,34% έναντι 1,64%). Εν κατακλείδι, ορίσαμε την κατανομή των BM-προερχόμενα ενδοθηλιακά κύτταρα, CD11c

+ ΑΧ και CD4

+ Τ κυττάρων σε όγκους. Το μοντέλο αυτό θα μπορούσε να είναι χρήσιμη για την κατανόηση των διαφορετικών BM-προέρχεται τύπους κυττάρων και λειτουργίες κατά τη διάρκεια της εξέλιξης της κολίτιδας που σχετίζεται με τον καρκίνο του παχέος

Παράθεση:. Xiao CX, Wang HH, Shi Υ, Li P, Liu YP, Ρεν JL, et al. (2013) Κατανομή σε μυελό των οστών-Παράγωγα Τα ενδοθηλιακά κύτταρα του ανοσοποιητικού και σε ποντικού Κολίτιδα-Associated καρκίνο του παχέος εντέρου μοντέλο. PLoS ONE 8 (9): e73666. doi: 10.1371 /journal.pone.0073666

Επιμέλεια: Shi Yu Yang, University College London, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: May 12, 2013? Αποδεκτές: 19, Ιουλίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 10 Σεπτεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Xiao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Αρ 81072013 και 91229201), Θεμελιωδών Κονδυλίων Έρευνας για τις Κεντρικές πανεπιστήμια στην Κίνα (Νο 2010111082) και Ιδρυμάτων του Γραφείου Υγείας της Xiamen στην Κίνα (Νο 3502Z200940010). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι μία από τις κύριες αιτίες θανάτου από καρκίνο σχετίζονται στο δυτικό ημισφαίριο. Η ανάπτυξή του εμφανίζεται σποραδικά ή μπορεί να είναι μια μακροχρόνια επιπλοκή χρόνιας φλεγμονής, όπως φαίνεται στην φλεγμονώδη νόσο του εντέρου (IBD) [1]. Το σωρευτικό κίνδυνο για την απόκτηση CRC μπορεί να αυξηθεί σε περίπου 20% σε ασθενείς με ΙΦΝΕ που ζουν για 30 χρόνια με τη νόσο [2,3]. Κολίτιδα σχετιζόμενη καρκίνων του παχέος εντέρου αναπτύσσονται σε χρόνια φλεγμονή βλεννογόνου και πιστεύεται να αναπτυχθεί με σταδιακό τρόπο, με τη φλεγμονώδη βλεννογόνο προκαλώντας δυσπλασία και τελικά με τον καρκίνο. Η χρόνια φλεγμονή πιστεύεται ότι προάγουν την καρκινογένεση. Κλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι οι ασθενείς με κολίτιδα έχουν μια 2- έως 8-πλάσια σχετικός κίνδυνος ανάπτυξης καρκίνου του παχέος εντέρου σε σύγκριση με το γενικό πληθυσμό. [4]

Ποντίκια δοθεί DSS για να προκληθεί φλεγμονή (ΑΟΜ /DSS) δείχνουν μια αυξημένη συχνότητα και την έκταση του σχηματισμού όγκου κόλου συγκριτικά με ποντίκια άγριου τύπου [5]. Επιμέρους συστατικά του έμφυτου και προσαρμοστική ανοσοαποκρίσεων έχουν επίσης ενοχοποιηθεί στην καρκινογένεση [4]. Προφλεγμονώδεις παραγόντων από τις έμφυτη και προσαρμοστική ανοσοποιητικό σύστημα να συμβάλει στην ανάπτυξη και την ανάπτυξη της νεοπλασίας του παχέος εντέρου. Προέρχονται από μυελό οστών προγονικών κυττάρων, τα οποία συμβάλλουν στην φλεγμονώδη απόκριση και όγκου νεοαγγείωση, έχουν προταθεί για να έχουν διαφορετικούς ρόλους στην πρόοδο του όγκου. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά σχετικά με το ρόλο των κυττάρων που προέρχονται από μυελό των οστών σε κολίτιδα σχετιζόμενη καρκίνων του παχέος εντέρου (CAC) [6].

Bone κύτταρα που προέρχονται από μυελό είναι εκπληκτικά πλαστικό [7], μερικές φορές υποθέτοντας καθήκοντα εκτός του αιμοποιητικό σύστημα. Σε μεταμόσχευση μυελού (ΒΜΤ) αποδέκτες των οστών, οι ερευνητές έχουν βρει κύτταρα προερχόμενα από δότη σε διάφορους μη-αιματοποιητικούς ιστούς όπως οι σκελετικοί μύες, καρδιακό μυ, το αγγειακό ενδοθήλιο, νευρωνικά κύτταρα και επιθηλιακά κύτταρα [8]. κύτταρα προερχόμενα από τον μυελό των οστών έχουν επίσης δειχθεί να παίζει πολλαπλούς ρόλους στην ανάπτυξη του όγκου. προερχόμενα από τον μυελό των οστών ενδοθηλιακά προγονικά κύτταρα (EPCs) συμβάλλουν στην νεοαγγείωση όγκου, ενώ τα κύτταρα του ανώριμου μυελοειδούς γράμμωσης που έχουν διαφορετικούς ρόλους στην πρόοδο του όγκου ως καρκίνος-κύτταρα έναρξης δρουν ως ινοβλάστες που σχετίζονται με όγκους που ενορχηστρώνουν δεσμοπλαστικού αντίδραση [9].

Πειστική απόδειξη υποστηρίζει την ιδέα ότι τα κύτταρα που προέρχονται από μυελό των οστών παίζουν ένα σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της αγγειογένεσης των όγκων και την εξέλιξη [10-12] και μπορούν να συμβάλλουν στην αγγειογένεση όγκων εκκρίνοντας προ-αγγειογόνοι παράγοντες ή με άμεση ενσωμάτωση εντός του όγκου αγγειακό σύστημα [13,14]. έχουν κυκλοφορούντα EPCs κινητοποιηθεί από τον μυελό των οστών έχουν ανιχνευθεί στο περιφερειακό αίμα αρκετών ειδών και έχουν δειχθεί ότι εμπλέκονται σε νεοαγγειογένεσης σε όγκους, καθώς και στο σχηματισμό νέων αγγείων μετά από τραύμα, έγκαυμα τραυματισμό και έμφραγμα του μυοκαρδίου [15-17 ]. Επιπλέον, έχουμε τεκμηριωθεί προηγουμένως ότι οστών ποντικού που προέρχονται από μυελό CXCR4-θετικών προγονικών κυττάρων συμβάλλουν στην ανάπτυξη του όγκου, με την προώθηση της αγγειογένεσης των όγκων [18].

Ωστόσο, συσσωρεύοντας στοιχεία δείχνουν ότι προέρχονται από μυελό οστών τα προγονικά κύτταρα έχουν διαφορετικούς ρόλους σε φλεγμονώδεις αποκρίσεις κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του όγκου. Προέρχονται από μυελό οστών τα φλεγμονώδη κύτταρα στο μικροπεριβάλλον του όγκου προάγουν αγγειογένεση όγκου, τον πολλαπλασιασμό του όγκου, την επιβίωση και εισβολή και καταστέλλουν την ειδική κατά του όγκου ανοσοαπόκριση των CD4 και CD8 λεμφοκύτταρα [19]. Έτσι, είναι σημαντικό να καθοριστεί η σχέση μεταξύ των κυττάρων των οστών που προέρχονται από μυελό και ειδικών κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος, κυτοκίνες, χημειοκίνες και κατά τη διάρκεια της καρκινογένεσης. Όλα τα λεμφοκύτταρα προέρχονται εντός του μυελού των οστών από έναν κοινό λεμφοειδών προγονικών πριν διαφοροποιηθούν σε διακριτές κατηγορίες των λεμφοκυττάρων τους. Β κύτταρα ωριμάζουν σε Β λεμφοκύτταρα στο μυελό των οστών, ενώ τα Τ κύτταρα μεταναστεύουν προς και ωριμάζουν στο θύμο αδένα. Μετά την ωρίμανση, τα λεμφοκύτταρα εισέρχονται στην κυκλοφορία και περιφερειακών λεμφικά όργανα, όπου ψάχνουν για την εισβολή παθογόνων οργανισμών και κυττάρων του όγκου [20]. Άλλοι τύποι κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των δενδριτικών κυττάρων (DC), ουδετερόφιλα, ηωσινόφιλα και, έχουν επίσης αναφερθεί για την προώθηση της αγγειογένεσης όγκου [13,21]. ΑΧ θεωρείται ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανοσο-όγκου επιτήρηση συλλέγοντας όγκου-ειδικά Τ κύτταρα αποκρίσεις. Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι DCs μπορεί επίσης να συμβάλει στην αγγειογένεση των όγκων με την απελευθέρωση προ-αγγειογόνος παράγοντες, όπως ο VEGF και IL-8, σε απόκριση προς υποξία [22].

Αυτά τα ευρήματα, μαζί με την εγγενή πλαστικότητα του οστού marrow- προερχόμενα κύτταρα και φλεγμονώδη κύτταρα σε απόκριση σε ερεθίσματα μικροπεριβάλλοντος και την εμμονή της πόλωσης σημάτων στο μικροπεριβάλλον του όγκου, υποδεικνύουν ότι τα κύτταρα που προέρχονται από μυελό των οστών εντός του μικροπεριβάλλοντος του όγκου θα μπορούσε να παράγει τελικά προ-αγγειογενετική και pro-επεμβατική παράγοντες που προωθούν την εξέλιξη του όγκου [19] .

σε αυτή τη μελέτη, ιδρύσαμε συνδυασμό ΒΜ μεταμόσχευση και ένα μοντέλο καρκίνου του παχέος κολίτιδα σχετιζόμενη να καθορίσει την κατανομή των BM-προερχόμενα ενδοθηλιακά κύτταρα, CD11c

+ DC και CD4

+ Τ κύτταρα όγκων. Το μοντέλο αυτό παρέχει ένα ισχυρό εργαλείο για τη μελέτη των συνεισφορών των διαφόρων BM-προερχόμενα κύτταρα κατά τη διάρκεια κολίτιδα που σχετίζεται με την εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου και μπορεί να αποκαλύψει νέα BM-προέρχεται τύπους κυττάρων και τις λειτουργίες που θα μπορούσαν να εφαρμοστούν σε μελλοντικές θεραπευτικές στρατηγικές.

Υλικά και Μέθοδοι

Ζώα και κύτταρα

C57BL /6, ποντίκια GFP BALB /c και αγοράστηκαν από το κέντρο πειραματόζωο, Σαγκάη της Κίνας. Όλες οι διαδικασίες που αφορούν τα πειραματόζωα διεξήχθησαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που εγκρίθηκε από την επιτροπή των ζώων Ερευνών του Πανεπιστημίου Xiamen και συμμόρφωση με τον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου (ΝΙΗ δημοσίευση Νο 86-23, αναθεωρημένη 1985). Οι ποντικοί διατηρήθηκαν σε ένα ειδικό άνευ παθογόνου (συμπεριλαμβανομένης

Helicobacter

-δωρεάν και παρβοϊό ελεύθερο) περιβάλλον και γενικά χρησιμοποιούνται μεταξύ 6 και 8 εβδομάδων. CT26-WT και CMT93 κύτταρα προερχόμενα από BALB /c και C57BL /6 ποντίκια, αντίστοιχα. CT26-WT και CMT93 κύτταρα (εμπορικώς αγοράστηκε από την ATCC, USA) καλλιεργήθηκαν σε DMEM και συμπληρώθηκε με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 100 U /ml πενικιλλίνη, 100 mg /ml στρεπτομυκίνη, 2 mM γλουταμίνη, 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο και 0,1 mM μη ουσιώδη αμινοξέα στους 37 ° C και 5% CO2.

μεταμόσχευση μυελού των οστών

Ο μυελός των οστών θανατηφόρα ακτινοβοληθέντων ποντικών C57BL /6 ανασυστάθηκε με μεταμόσχευση με κύτταρα μυελού των οστών από GFP χιμαιρικό ποντίκια (ποντίκια GFP-ΒΜΤ). Εν συντομία, άγριου τύπου C57BL /6 ποντίκια θανατηφόρα ακτινοβοληθεί με μια δόση 950 rads, μετά την οποία 2×10

κύτταρα μυελού των οστών 6 από ποντικούς GFP εγχύθηκαν μέσα στις φλέβες της ουράς των ακτινοβολημένων ποντικών δεκτών. Τα κύτταρα του μυελού των οστών από τους ποντικούς GFP-ΒΜΤ αξιολογήθηκαν σε 4 εβδομάδες μετά τη μεταμόσχευση μυελού των οστών, και ο βαθμός χιμαιρισμού μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Περισσότερο από το 90% των κυττάρων στα κυκλοφορούντα μονοπύρηνα κύτταρα αντικαταστάθηκαν από GFP-θετικά κύτταρα κάτω από αυτές τις πειραματικές συνθήκες.

Κολίτιδα σχετιζόμενη με ορθοκολικό καρκίνο (CAC) και όγκου μοντέλο εμφύτευση

Η GFP -BMT ποντίκια ενέθηκαν ε.π. με 10 mg /kg του ΑΟΜ σε 0,2 ml φυσιολογικού ορού. Μία εβδομάδα μετά τη χορήγηση του ΑΟΜ, 3% DSS χορηγήθηκε στο πόσιμο νερό για 7 ημέρες και στη συνέχεια άλλαξαν σε κανονικό πόσιμο νερό για 14 ημέρες. Αυτή η διαδικασία επαναλήφθηκε για 3 κύκλους, που ακολουθείται από μια μεταβολή στα κανονικό νερό. Οι όγκοι επάγονται από s.c. ένεση 2×10

6 CT26-WT και CMT93 κυττάρων εντός του πλευρά κατά 4 εβδομάδες μετά τη μεταμόσχευση μυελού των οστών. Μεγάλες όγκοι τυπικά παρατηρήθηκαν από 4 εβδομάδες μετά την εμφύτευση του όγκου, και οι ιστοί του όγκου συλλέχθηκαν για ιστολογική ανάλυση.

συνεστιακή μικροσκοπία

Σε ποντικούς GFP-ΒΜΤ CAC, τα αιμοφόρα αγγεία χρωματίστηκαν με 50 μg Alexa Fluor® 647 WGA (Molecular Probes, Invitrogen), το οποίο εγχύθηκε retrorbitally. Επτά λεπτά μετά Alexa Fluor® 647 χορήγηση WGA, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία με ασφυξία με CO2. Όλες οι διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν υπό αναισθησία (0,5 κ.εκ. Avertin, ί.ρ.). Οι ιστοί αμέσως απομακρύνθηκαν, ανοίχθηκε με επιμήκη τομή και ξεπλένεται με PBS. Ζώντας δείγματα ιστού του όγκου απεικονίστηκαν με Bio-Rad Radiance 2000 ομοεστιακό μικροσκόπιο (Bio-Rad, Hercules, CA). απόκτησης εικόνας διεξήχθη με Laser Sharp λογισμικό σάρωσης (Bio-Rad) και 3D αναπαραστάσεις ολοκληρώθηκαν με λογισμικό Volocity (Waltham, ΜΑ).

κυτταρομετρία ροής

Ιστός όγκου απομονώθηκε από GFP-ΒΜΤ CAC ποντίκια και τα κόβουμε σε κομμάτια σε 1 mg /ml κολλαγενάσης ⅳ. πέψη κολλαγενάσης διεξήχθη σε διάλυμα κολλαγενάσης για 45 λεπτά στους 37 ° C. Εκλούεται κύτταρα στη συνέχεια διέρχονται μέσω 70 μΙ κυττάρων σουρωτήρι. Τα κύτταρα περιδινίστηκαν επί 10 λεπτά στις 1400 rpm σε θερμοκρασία δωματίου και συλλέγεται. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν σε 10% ορό γαϊδάρου και Fc δεσμευμένο (BD Pharmingen, San Jose, CA) για 20 λεπτά στους 4 ° C, μετά την οποία βάφτηκαν με φθορίζοντα αντισώματα συζευγμένα. APC-συζευγμένη CD11c αντι-ποντικού (HL-3) και ΡΕ-συζευγμένο αντι-ποντικού CD4 (ΟΧ-38) αγοράστηκαν από Βϋ Pharmingen (San Diego, CA) και χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση FACS. Τα κύτταρα αναλύθηκαν σε κυτταρόμετρο FACSCaliber (BD Bioscience, San Diego, CA) και στη συνέχεια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό FlowJo (Tree Star, Ashland, OR).

χρώση ανοσοφθορισμού

C57BL /6 ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία με

2 ασφυξία CO, και οι ιστοί του παχέος εντέρου απομακρύνθηκαν αμέσως, σταθερό για 4 έως 5 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου σε ρυθμιστικό διάλυμα στερέωσης GFP, ενσωματωμένο σε Tissue-Tek OCT ένωση (Miles Inc., Elkhart, ΙΝ), και καταψύχθηκαν και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C, μετά την οποία 5-10 μm τομές κόπηκαν σε κρυοστάτη και μεταφέρθηκε σε ποτήρι πλάκες μικροσκοπίου προ-επικαλυμμένα με πολυ-λυσίνη (Sigma-Aldrich). Οι τομές στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με ψυχρή ακετόνη επί 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Σταθερή τομές πλύθηκαν τρεις φορές με PBS και επωάζονται με 5% φυσιολογικό ορό γαϊδάρου και 0,02% BSA-PBS επί μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Τα πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ειδικά για CD31 (αρχική συγκέντρωση, 0,5 mg /ml? Αραίωσης, 1/500? EBioscience), CD4 (αραίωση, 1/200? BD), CD11c (αραίωση, 1/1000? BD), και Ly6C (αραίωση, 1/100? BD). DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA) χρησιμοποιήθηκε για την πυρηνική χρώση.

Η στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. Οι συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Φοιτητών

t-test

.

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

Η δημιουργία ενός συνδυασμού μεταμόσχευση μυελού των οστών και κολίτιδα σχετιζόμενη μοντέλο καρκίνου του παχέος

άγριου τύπου C57BL /6 ποντίκια ήταν θανατηφόρα ακτινοβολημένων με μια συνολική δόση 950 rads, μετά την οποία 2×10

κύτταρα μυελού των οστών 6 από ποντικούς GFP εγχύθηκαν μέσα στις φλέβες της ουράς των ακτινοβολημένων ποντικών δεκτών. Τέσσερις εβδομάδες μετά τη μεταμόσχευση μυελού των οστών, ιστός κόλον απομονώθηκε από GFP-ΒΜΤ ποντικών για συνεστιακή μικροσκοπία ανάλυση, και ο βαθμός χιμαιρισμού μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Βρήκαμε ότι το έντερο ήταν γεμάτη με πράσινο φθορισμό, και περισσότερο από το 90% των κυκλοφορούντων μονοπύρηνων κυττάρων στο δέκτη ποντίκια ήταν GFP-θετικά (Σχήμα 1 C, D).

(Α) Μακροσκοπική όψη δείχνει έναν αριθμό του κολονικού όγκοι στα άπω κόλον του μοντέλου ποντικών. (Β) Η &? Ε λεκέδες διαδοχικών τομών ιστών κόλου ποντικού. (Γ) συνεστιακή μικροσκοπία ανάλυση κατεψυγμένων τομών κόλου έδειξε τα κύτταρα που προέρχονται από μυελό των οστών (πράσινο) στο κόλον. (Δ) Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των περιφερικών μονοπύρηνων κυττάρων στο μοντέλο GFP-ΒΜΤ.

Η

Οι ποντικοί GFP-ΒΜΤ συνέχεια εγχύθηκαν ε.π. με 10 mg /kg ΑΟΜ σε 0,2 ml φυσιολογικού ορού. Μία εβδομάδα μετά τη χορήγηση του ΑΟΜ, 3% DSS χορηγήθηκε στο πόσιμο νερό για 7 ημέρες, που ακολουθείται από 14 ημέρες κανονικής νερού? αυτό εναλλαγή επαναλήφθηκε για 3 κύκλους. Παρατηρήσαμε εντερική όγκων στην πλειονότητα των ποντικών, καθώς και τους τύπους όγκου επιβεβαιώθηκε με ιστολογική ανάλυση (Σχήμα 1Α, Β).

μυελού των οστών που προέρχονται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα συνέβαλαν στην αγγειογένεση κατά τη διάρκεια κολίτιδα σχετιζόμενη με ορθοκολικό καρκίνο

για να διερευνηθεί κατά πόσο BM-προερχόμενα ενδοθηλιακά κύτταρα συνέβαλαν στην αγγειογένεση του όγκου σε αυτό το μοντέλο, αναλύσαμε την έκφραση της GFP στο ενδοθήλιο των όγκων σε ποντικούς GFP-ΒΜΤ μετά την επαγωγή της κολίτιδας που σχετίζεται με τον καρκίνο του παχέος εντέρου. Συνεστιακής μικροσκοπίας ανάλυση σε ζωντανά δείγματα ιστών έδειξε ότι οι GFP-θετικά κύτταρα εκτενώς διεισδύσει στο στρώμα του όγκου, και ορισμένα από τα κύτταρα στρίφωμα με WGA-θετικό περιθώριο στο ενδοθήλιο του όγκου. WGA και GFP διπλά θετικά κύτταρα παρατηρήθηκαν επενδύουν τα αιμοφόρα (Σχήμα 2Α). Κατεψυγμένες τομές όγκου χρωματίστηκαν με αντι-CD31 αντίσωμα (n = 5), και όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, GFP-θετικά κύτταρα διεισδύσει στο ενδοθήλιο του όγκου. Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι BM προερχόμενα ενδοθηλιακά κύτταρα συνέβαλαν στην κολίτιδα σχετιζόμενη με αγγειογένεση καρκίνου του παχέος εντέρου.

(Α) Τα αιμοφόρα αγγεία βάφτηκαν με 647 WGA (μπλε), η οποία εγχύθηκε retrorbitally. Συνεστιακής μικροσκοπίας ανάλυση από ζωντανούς δείγματα ιστών έδειξε ότι οι ΒΜ-προερχόμενα κύτταρα (πράσινο) διείσδυσε στο στρώμα, και ένα τμήμα των κυττάρων στριφωμένες με WGA-647-θετικών (μπλε) περιθώριο στο ενδοθήλιο του όγκου. Double-θετικά κύτταρα παρατηρήθηκαν ευθυγραμμίζουν τα αγγεία. (Β) Τα τμήματα κατεψυγμένων όγκων βάφτηκαν με ένα αντι-CD31 αντίσωμα για την ανίχνευση BM προερχόμενα ενδοθηλιακά κύτταρα (πράσινο). GFP-θετικά κύτταρα (πράσινο) με CD31-θετικά περιθώρια παρατηρήθηκαν στο ενδοθήλιο του όγκου. C (CMT93) και D (CT26) σε ιστούς ξενομοσχεύματος όγκου που απομονώνονται από ποντίκια μεταμόσχευση ΒΜ χρωματίστηκαν με αντι-CD31 (κόκκινο) αντισώματα. GFP-θετικά κύτταρα παρατηρήθηκαν γύρω από τα αγγεία του όγκου, και μερικοί επένδυση στο ενδοθήλιο.

Η

Επιπλέον, σύμφωνα με προηγούμενη αναφορά μας (22), ανιχνεύσαμε GFP-θετικά ενδοθηλίου σε CMT93 και CT26 όγκων ξενομοσχεύματος σε GFP-ΒΜΤ ποντικών (Σχήμα 2C, D).

Κατανομή μυελού των οστών που προέρχεται CD11c

+ δενδριτικά κύτταρα και CD4

+ Τ κυττάρων σε κολίτιδα σχετιζόμενη με ορθοκολικό καρκίνο

Για να προσδιοριστεί η κατανομή των BM-προερχόμενα φλεγμονωδών κυττάρων στο μικροπεριβάλλον του όγκου, αναλύσαμε τα ποντίκια που υποβλήθηκαν σε μεταμόσχευση μυελού των οστών που ακολουθείται από την επαγωγή της κολίτιδας που σχετίζεται με ορθοκολικό καρκίνο με συνεστιακή μικροσκοπία. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 3Α, Β και Γ, οι ιστοί του όγκου εκτενώς διεισδύσει CD11c

+, Ly-6C και CD4

+ κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, τα περισσότερα εκ των οποίων εξέφρασαν GFP. Επιπλέον, εντοπίσαμε το GFP-θετικά CD11c + DCs και CD4 + Τ κύτταρα στον όγκο των όγκων ξενομοσχεύματος CMT93 και CT26 σε ποντικούς GFP-ΒΜΤ (Εικόνα 3D, E, F και G).

(Α- χρώση C) ανοσοφθορισμού της συνδυασμένης ΒΜΤ και τα δείγματα με ορθοκολικό καρκίνο κολίτιδα σχετιζόμενη με αντι-Οϋ11ο, Ly-6C και CD4-ειδικά αντισώματα (κόκκινο). ιστούς όγκων (D-Ε) CMT93 απομονώθηκαν από ποντίκια μεταμόσχευση ΒΜ χρωματίστηκαν με αντι-Οϋ11ο και CD4-ειδικό αντίσωμα (κόκκινο). ιστούς όγκων (F-G) CT26 απομονώθηκε από ποντίκια μεταμοσχευμένα με ΒΜ χρωματίστηκαν με αντι-Οϋ11ο και CD4-ειδικό αντίσωμα (κόκκινο).

Η

Για τον καθορισμό ποσοτικά την κατανομή των BM-προερχόμενο CD11c + DC και CD4 + Τ κυττάρων σε κολίτιδα σχετιζόμενη μοντέλο καρκίνου του παχέος μας, απομονώσαμε τα κύτταρα που διηθούν όγκο από τους ιστούς όγκου ποντικού και πραγματοποιήθηκε ανάλυση FACS. Τα δεδομένα μας πρωτόκολλο απομόνωσης έδειξαν ότι μεταξύ των κυττάρων που διηθούν όγκο, 4,16 ± 0,12% ήταν GFP-θετικά κύτταρα, 14,2 ± 0,34% ήταν CD4 + κύτταρα, και 2,05 ± 0,23% ήταν CD11c + DCs (Σχήμα 4Α). Παραδόξως, η GFP-θετικά CD11c + κυττάρων DCs ήταν το ένα τρίτο των + /CD11C- κύτταρα GFP, και το ήμισυ του DCs (0,96% έναντι 1,02%) ήταν GFP-θετικά του μυελού των οστών αρχικά κύτταρα. Η πλειονότητα των CD4 + Τ κύτταρα ήταν GFP-αρνητικά (12,02% έναντι 1,9%). Είναι ενδιαφέρον, έχουμε βρει ένα νέο CD11c + DC υποσύνολο (0,34% έναντι 1,64%) CD4 + σε αυτό το μοντέλο (σχήμα 4Β, C).

(Α) Απομόνωση κυττάρων από ιστό όγκου που ακολουθείται από ανάλυση FACS έδειξε ότι το ποσοστό των τα κύτταρα που προέρχονται από μυελό των οστών, CD4

+ κύτταρα και CD11c

+ DCs στον ιστό του όγκου του παχέος εντέρου. (Β-Ο) Σύνθεση του CD11c

+ και CD4

+ Τ κυττάρων που προέρχονται από μυελό των οστών. (Γ) Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD? αναλύσεις δειγμάτων διεξήχθησαν εις τριπλούν.

Η

Συζήτηση

Η φλεγμονώδης νόσος του εντέρου (IBD) μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης ορθοκολικού καρκίνου (CRC). Η μοριακή παθογένεση της IBD που σχετίζεται με τον καρκίνο του παχέος διαφέρει από εκείνη της σποραδικής CRC [23]. Η φλεγμονή είναι ένας βασικός παράγοντας που συμβάλλει στην καρκινογένεση και χρόνιες φλεγμονώδεις νόσους, όπως IBD ξεκινήσει πολύπλοκες διαδρομές σε νεοπλασία [24]. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε ένα ισχυρό καρκινογόνο παράγοντα, ΑΟΜ, που επάγει προσαγωγές DNA μέσω ειδών αλκυλίωσης. Αυτά τα προϊόντα προσθήκης σχηματίζουν ομοιοπολικούς δεσμούς μεταξύ του αντιδραστικού καρκινογόνο και το γενωμικό DNA, οδηγώντας σε μεταλλάξεις κατά τη διάρκεια της επιδιόρθωσης του DNA και την προώθηση της ανάπτυξης του όγκου. Τέτοιες μεταλλάξεις περιλαμβάνουν ποντικού γενετικές μεταλλάξεις στις οδούς ογκογένεση (APC, ρ53, MSH2) [25]. Η μακροχρόνια χορήγηση ή επαναλαμβανόμενους κύκλους του Σ.Α.Τ., μια χημική ουσία που προκαλεί επιθηλιακό τραυματισμό, μπορεί να προκαλέσει χρόνιες κολίτιδες και μετέπειτα δυσπλασία σε τρωκτικά [26].

Κατά την τελευταία δεκαετία, σημαντική πρόοδος έχει γίνει στην κατανόηση της βλαστικών κυττάρων βιολογία και το ρόλο των βλαστικών κυττάρων σε ασθένειες όπως CRC [27]. Ειδικότερα, οι ανακαλύψεις που αφορούν τον έλεγχο του πολλαπλασιασμού των αρχέγονων κυττάρων και για το πώς η απορύθμιση του πολλαπλασιασμού οδηγεί σε ογκογένεση έχουν στην πρώτη γραμμή. Έτσι, καθιέρωσε ένα συνδυασμένο μεταμόσχευση μυελού των οστών και κολίτιδα σχετιζόμενη μοντέλο καρκίνου του παχέος να καθορίσει τη διανομή και τη λειτουργία των ΒΜ-προερχόμενα κύτταρα στον καρκίνο του παχέος εντέρου.

Πρόσφατα, κυκλοφορεί EPCs κινητοποιείται από το ΒΜ έχουν ανιχνευθεί στο περιφερικού αίματος αρκετών ειδών και έχουν δειχθεί ότι εμπλέκονται σε νεοαγγειογένεσης σε όγκους, καθώς και στο σχηματισμό νέων αγγείων μετά από τραύμα, έγκαυμα τραυματισμό και έμφραγμα του μυοκαρδίου [28,29]. Οι περισσότεροι συμπαγείς όγκοι απαιτούν μια προμήθεια αγγειακή την παροχή οξυγόνου και θρεπτικών ουσιών για την ενίσχυση της εξέλιξης του όγκου και την εισβολή. Ο όγκος μπορεί να είναι είτε εκμεταλλευτούν τα υπάρχοντα πλοία, ή να προσλαμβάνουν και να κινητοποιήσει BM-Προέρχεται κυττάρων να προκαλέσει νεοαγγείωση [30]. EPCs προέρχονται από ΒΜ-Προερχόμενο κυττάρων και έχουν την ικανότητα να διαφοροποιούνται σε ώριμα ενδοθηλιακά κύτταρα, συμβάλλοντας στην περίπλοκη διαδικασία της νεοαγγείωσης του όγκου. Υπάρχουν ενδείξεις ότι η αγγειογένεση των όγκων μπορεί να διεγερθεί από καρκινικών κυττάρων εκκρίνονται CXC χημειοκινών συνδετήρες CXCL5 και CXCL8, μέσω του κοινού υποδοχέα τους CXCR2 [31]. Audollent et al δείχνουν ότι προέρχονται από μυελό οστών ενδοθηλιακών και αιμοποιητικών προδρόμων κυττάρων ενισχύουν την μετάσταση του καρκίνου του παχέος εντέρου σε ένα ορθοτοπικό γυμνό μοντέλο ποντικών [32]. προηγούμενη αναφορά μας έδειξαν ότι BM προερχόμενα ενδοθηλιακά κύτταρα ανιχνεύθηκαν σε ξενομοσχεύματος όγκων χρησιμοποιώντας Colon38 και κυττάρων Panco2 [18]. Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε μέσω συνεστιακής μικροσκοπίας ανάλυση ότι BM προερχόμενα ενδοθηλιακά κύτταρα συμμετείχαν σε κολίτιδα που σχετίζεται με αγγειογένεση καρκίνου του παχέος εντέρου. Επιπλέον, ανιχνεύσαμε την έκφραση της GFP στο ενδοθήλιο των ξενομοσχευμάτων όγκου CMT93 και CT26 σε ποντικούς GFP-ΒΜΤ, συνεπές με προηγούμενη αναφορά μας [18].

Παρόμοια με άλλα στερεά κακοήθειες, του παχέος εντέρου και όγκων κολίτιδα σχετιζόμενη οι διεισδύσει από διάφορους τύπους κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος [33]. Κύτταρα του έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος, όπως ουδετερόφιλα, μαστοκύτταρα, κύτταρα φυσικοί φονείς (ΝΚ), δενδριτικά κύτταρα και μακροφάγα που σχετίζονται με όγκους, μπορούν εύκολα να ανιχνευθούν σε αυτούς τους όγκους. Επιπλέον, προχωρημένους όγκους προσλάβει ειδικό μυελοειδή υποσύνολα που αντιπροσωπεύουν μια φαινοτυπικά ετερογενή αλλά λειτουργικά παρόμοιο πληθυσμό των CD11b

+ Gr1

+ κύτταρα, ονομαζόμενα μυελοειδή που προέρχονται κατασταλτικών κυττάρων [34,35]. Αυτά τα κύτταρα έχουν ορισμένα κοινά χαρακτηριστικά με τα μονοκύτταρα, μακροφάγα, ουδετερόφιλα, και DCs και να βοηθήσει την καταστολή κατά του όγκου ανοσοαποκρίσεων και αγγειογένεση όγκου. Προηγούμενες μελέτες έχουν αποδείξει ότι BM-προερχόμενα APCs είναι κυρίως υπεύθυνα για την επαγωγή της προκαλούμενης από όγκο ανοχή Τ κυττάρου [36]. BM-προερχόμενα DC, κλασική δείκτη CD11c, μπορεί να συλλάβει και να παρουσιάσει περιφερικού ιστού-ειδικά αντιγόνα σε παρθένα CD8

+ Τ κύτταρα, οδηγώντας σε διαγραφή τους [37]. Υπάρχει μια παρόμοια απαίτηση για την επεξεργασία του εαυτού αντιγόνου παρεγχύματος από υποδοχής DC στην επαγωγή των CD4

+ ανοχή Τ κυττάρων σε καρκινικά. BM-προέρχεται δενδριτικά κύτταρα από ποντίκια BALB /c είναι σε θέση να προωθήσουν την επέκταση των CD4

+ CD25

+ Foxp3

+ Τ κυττάρων

in vitro

και ότι αυτό συμβαίνει ανεξάρτητα από την κατάσταση ωρίμανσης οι ΑΧ ως ώριμα και ανώριμα κύτταρα είναι ικανά να επεκτείνει το Foxp3

+ κυτταρικό πληθυσμό [38,39]. Αυτή η ανοσολογική άγνοια και το ανοσοποιητικό τους μηχανισμούς ανοχής συμβάλλουν στην ανάπτυξη των όγκων. Δείξαμε την κατανομή των BM-προερχόμενα φλεγμονωδών κυττάρων (CD11c

+, Ly-6C και CD4

+ Τ κύτταρα) στο μικροπεριβάλλον του όγκου. Παραδόξως, η GFP-θετικά CD11c + κυττάρων DCs ήταν το ένα τρίτο των + /CD11C- κύτταρα GFP, και το ήμισυ όλων των DCs ήταν ΒΜ αρχικά κύτταρα GFP-θετικά. Ανακαλύψαμε επίσης μια νέα CD4

+ CD 11 c

+ DC υποσύνολο (0.34 vs 1.64) στην κολίτιδα σχετιζόμενη με το μοντέλο του καρκίνου του παχέος εντέρου μας. Τα κύτταρα του προσαρμοστικού ανοσοποιητικού συστήματος προσλαμβάνονται σε ορθοκολικό και κολίτιδα σχετιζόμενη όγκους, όπου παίζουν είτε προ- ή αντιογκογένεσης ρόλους [40]. Τ κύτταρα, για παράδειγμα, απαιτούνται όχι μόνο για τη φλεγμονή, την ανάπτυξη του καρκίνου, και την εξέλιξη του όγκου, αλλά και για την αντικαρκινική ανοσία [41].

δημιουργήσει με επιτυχία μια συνδυασμένη μεταμόσχευση ΒΜ και κολίτιδα σχετιζόμενη μοντέλο καρκίνου του παχέος. Αυτό το μοντέλο παρέχει ένα ισχυρό εργαλείο για τη μελέτη των συνεισφορών των διαφορετικών ΒΜ-προερχόμενα κύτταρα κατά τη διάρκεια της εξέλιξης της κολίτιδας που σχετίζεται με τον καρκίνο του παχέος εντέρου και μπορεί να αποκαλύψει νέα BM προερχόμενων κυτταρικών τύπων και τις λειτουργίες που θα μπορούσαν να εφαρμοστούν σε μελλοντικές θεραπευτικές στρατηγικές.