Αφηρημένο

ανθρακυκλίνες (όπως δοξορουβικίνη ή δαουνορουβικίνη) είναι από τα πιο αποτελεσματικά αντικαρκινικά φάρμακα, αλλά η χρησιμότητά τους παρεμποδίζεται από τον κίνδυνο μη αναστρέψιμη καρδιοτοξικότητα. Δεξραζοξάνη (ICRF-187) είναι το μόνο κλινικά εγκεκριμένο καρδιοπροστατευτικό παράγοντα έναντι ανθρακυκλίνη καρδιοτοξικότητα. Η δραστηριότητά του έχει παραδοσιακά αποδοθεί στα αποτελέσματα χηλικοποίησης σιδήρου του μεταβολίτη του με επακόλουθη προστασία από το οξειδωτικό στρες. Ωστόσο, δεξραζοξάνη είναι επίσης ένας καταλυτικός αναστολέας της τοποϊσομεράσης II (TOP2). Ως εκ τούτου, εξετάστηκε κατά πόσον δεξραζοξάνης και δύο άλλα TOP2 καταλυτική αναστολείς, δηλαδή σοβουζοξάνη (MST-16) και merbarone, προστασία καρδιομυοκύτταρα από ανθρακυκλίνη τοξικότητα και αξιολογηθούν οι επιδράσεις τους στις ανθρακυκλίνες αντινεοπλασματική αποτελεσματικότητα. Δεξραζοξάνη και δύο άλλα TOP2 αναστολείς προστατεύεται απομονωμένα καρδιομυοκύτταρα νεογνών αρουραίων κατά την τοξικότητα που προκαλείται τόσο από τη δοξορουβικίνη και η δαουνορουβικίνη. Ωστόσο, κανένα από τα TOP2 αναστολέων προστατεύονται σημαντικά καρδιομυοκύτταρα σε ένα μοντέλο υδρογόνου οξειδωτική βλάβη που προκαλείται από το υπεροξείδιο του-. Σε αντίθεση, τα καταλυτικά αναστολείς δεν θέτει σε κίνδυνο τις αντιπολλαπλασιαστικές επιδράσεις των ανθρακυκλινών στην λευχαιμική κυτταρική γραμμή HL-60? Αντ ‘αυτού, συνεργιστική αλληλεπιδράσεις παρατηρείται κυρίως. Επιπλέον, η ενεργοποίηση της κασπάσης ανθρακυκλίνη επαγόμενη διαφορικά διαμορφώνονται από τις TOP2 αναστολείς σε καρδιακά και καρκινικά κύτταρα. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η δεξραζοξάνη ήταν κατά την υδρόλυση σε θέση να σημαντικά χηλικό ενδοκυτταρική ασταθή ιόντα σιδήρου, κανένα τέτοιο φαινόμενο παρατηρήθηκε είτε για σοβουζοξάνη ή merbarone. Συμπερασματικά, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η δεξραζοξάνη μπορεί να προστατεύσει καρδιομυοκύτταρα

μέσω καταλυτικής TOP2

ανασταλτική δράση της και όχι δραστηριότητα σιδήρου-αποσιδήρωσης. Η διαφορική έκφραση ή /και τη ρύθμιση των ισομορφών TOP2 σε καρδιακά και τα καρκινικά κύτταρα με καταλυτική αναστολείς μπορεί να είναι υπεύθυνη για την επιλεκτική ρύθμιση της ανθρακυκλίνες δράσης παρατηρείται

Παράθεση:. Vavrova Α, Jansova Η, Mackova Ε, Machacek Μ, Haskova Ρ, Tichotova L, et al. (2013) Καταλυτική Αναστολείς τοποϊσομεράσης II Διαφορετικός διαμορφώνουν την τοξικότητα των ανθρακυκλινών σε καρδιακό και καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 8 (10): e76676. doi: 10.1371 /journal.pone.0076676

Επιμέλεια: Rajesh Mohanraj, Πανεπιστήμιο ΗΑΕ, Ιατρική Σχολή & amp? Επιστημών Υγείας, Ηνωμένα Αραβικά Εμιράτα

Ελήφθη: May 23, 2013? Αποδεκτές: 25 Αυγούστου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 7 Οκτωβρίου 2013

Copyright: © 2013 vavrova et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Ίδρυμα της Τσεχίας Science (έργο 13-15008S? www.gacr.cz), το Πανεπιστήμιο του Καρόλου στην Πράγα (SVV έργου 267 004? www.cuni.cz) και συγχρηματοδοτείται από το Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο και τον κρατικό προϋπολογισμό της η Τσεχική Δημοκρατία (έργο δεν CZ.1.07 /02.03.00 /30.0022?. www.msmt.cz). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ανθρακυκλίνη (ANT) αντιβιοτικά, όπως δοξορουβικίνη (ϋΟΧ, Σχήμα 1), δαουνορουβικίνη (ΕΔΕ, Σχήμα 1) ή επιρουβικίνη, συγκαταλέγονται μεταξύ των πλέον αποτελεσματικών και χρησιμοποιούνται συχνά αντινεοπλασματικών παραγόντων και εξακολουθούν να είναι απαραίτητα συστατικά των σύγχρονων πρωτοκόλλων χημειοθεραπείας για πολλές αιματολογικές κακοήθειες όπως επίσης και στερεούς όγκους. Ωστόσο, ο κίνδυνος μη αναστρέψιμων και δυνητικά θανατηφόρα τοξικότητα σε καρδιακό ιστό είναι το κύριο μειονέκτημα της ΑΝΤ χρήση στην κλινική πράξη [1].

Οι ανθρακυκλίνες δοξορουβικίνη (ϋΟΧ) και δαουνορουβικίνης (ΕΔΕ) και της τοποϊσομεράσης II καταλυτική αναστολείς δεξραζοξάνη ( DEX), σοβουζοξάνη (SOB) και merbarone (MER) χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη.

Η

Πολυάριθμες υποθέσεις έχουν προταθεί όσον αφορά τους μηχανισμούς που διέπουν τόσο τα αντινεοπλασματικά και καρδιοτοξικών επιδράσεων των μυρμηγκιών [2]. Επί του παρόντος, τοποϊσομεράση II (TOP2) γενικά αναγνωρίζεται ως η κύρια μοριακός στόχος για αντικαρκινική δράση ΑΝΤ. ANTs ανήκουν στην ομάδα των «TOP2 δηλητήρια», τα οποία αποτελούνται από κυτταροτοξικών παραγόντων που σταθεροποιούν το «διασπάσιμο συγκρότημα» [3]. Από την άποψη της καρδιοτοξικότητας, ο σίδηρος (Fe) -καταλυόμενη ενδομυοκαρδιακή παραγωγή αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) έχει παραδοσιακά εμπλακεί. Ο δακτύλιος C του ΑΝΤ αγλυκόνης υφίσταται εύκολα οξειδοαναγωγής ποδηλασία, και τα ιόντα Fe μπορεί να σχηματίζουν οξειδοαναγωγής-δραστικά σύμπλοκα με μυρμήγκια, με αποτέλεσμα το σχηματισμό του υπεροξειδίου, υπεροξειδίου και τελικά υψηλής δραστικότητας και τοξικότητας ρίζες υδροξυλίου [4], [5].

Αυτό το παραδοσιακό «ROS και Fe» υπόθεση του ΑΝΤ-επαγόμενης καρδιοτοξικότητα έχει ενισχυθεί από την προστατευτική αποτελεσματικότητα της δεξραζοξάνης (DEX, ICRF-187, Εικόνα 1), το οποίο είναι το μόνο κλινικά ελεγμένα καρδιοπροστατευτικό. Οι καρδιοπροστατευτικές επιδράσεις της DEX έχουν αποδοθεί σε προϊόν υδρόλυσης του ADR-925, εντυπωσιακά παρόμοια με το γνωστό EDTA μεταλλικό χηλικό αντιδραστήριο. Μετά το μεταβολισμό των DEX σε ADR-925, το προϊόν αυτό μπορεί να συμπλέξει ελεύθερο και οξειδοαναγωγικά ενεργά ενδοκυτταρική Fe και /ή να αντικαταστήσει Fe σε ΑΝΤ-Fe σύμπλοκα, αποτρέποντας έτσι ρίζα υδροξυλίου σχηματισμό και την οξειδωτική βλάβη site-specific για καρδιακό ιστό [6].

Ωστόσο, DEX είναι επίσης ένα καθιερωμένο καταλυτικό αναστολέα της TOP2 [7], και, ως εκ τούτου, δεν μπορεί να αποκλειστεί ότι ΡΕΧ μπορεί να ασκήσει προστατευτική δράση μέσω της παρεμβολής με ΑΝΤ-που προκαλείται από δηλητηρίαση TOP2 στην καρδιά [8], [9]. Μάλιστα, μια πρόσφατη μελέτη ανέφερε ότι η διαγραφή του TOP2 βήτα ισομορφή (

Top2b

γονίδιο) προστατεύονται καρδιομυοκύτταρα από το DNA διπλό σκέλος διαλείμματα και αλλαγές μεταγραφικό προκαλείται από οξεία in vivo θεραπεία DOX, με επακόλουθη πρόληψη των ελαττωματικών μιτοχονδριακή βιογένεση και σχηματισμό ROS. Επιπλέον, καρδιομυοκυττάρων-ειδική διαγραφή του

Top2b

προστατεύεται γονίδιο ποντίκια από την ανάπτυξη της προοδευτικής καρδιακής ανεπάρκειας που προκαλείται από επαναλαμβανόμενες θεραπεία DOX, γεγονός που υποδηλώνει ότι DOX επαγόμενη καρδιοτοξικότητα κυρίως προκαλείται από καρδιομυοκυττάρων TOP2B [10].

ερωτήσεις που προκύπτουν από αυτές τις προηγούμενες μελέτες μας ενθάρρυνε να ερευνήσει τη συμμετοχή των TOP2 στο ΑΝΤ καρδιοτοξικότητα και να αξιολογήσει άλλα TOP2 καταλυτική αναστολέων ως πιθανοί καρδιοπροστατευτικών. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιώντας πρωτογενείς καλλιέργειες απομονωμένων αρουραίου κοιλιακής νεογνικά καρδιομυοκύτταρα (NVCMs), εξετάσαμε τα προστατευτικά αποτελέσματα του DEX και δύο άλλες καταλυτικές αναστολείς TOP2, σοβουζοξάνη (SOB, MST-16, Σχήμα 1) και merbarone (MER, το Σχήμα 1 ), κατά την καρδιοτοξικότητα που προκαλείται από DAU και DOX. Για σύγκριση, ερευνήσαμε επίσης τα αποτελέσματα αυτών των παραγόντων σε ένα μοντέλο H

2O

2 από τραυματισμό που προκαλείται οξειδωτική καρδιομυοκυττάρων. Επιπλέον, η λευχαιμική κυτταρική γραμμή HL-60 χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί εάν TOP2 καταλυτική αναστολείς μπορεί να επηρεάσει ΑΝΤ καρδιοτοξικότητα χωρίς να διακυβεύεται η αντιπολλαπλασιαστική αποτελεσματικότητα τους έναντι των λευχαιμικών κυττάρων καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

1. Υλικά |

τροποποιημένο μέσο Eagle του Dulbecco (DMEM), DMEM με θρεπτικό μίγμα F-12 (DMEM /F12), ορό αλόγου (HS), ορό εμβρύου μόσχου (FBS), πενικιλλίνη /διάλυμα στρεπτομυκίνη (5000 U /ml ? P /S) και διάλυμα πυροσταφυλικό νάτριο (100 mM? ΠΥΡ) αγοράστηκαν από την Lonza (Βέλγιο). Οι οροί αδρανοποιούνται με θέρμανση πριν από τη χρήση. DEX λήφθηκε από Huaren Χημικών Προϊόντων (Chang-Zhou, Κίνα). RPMI-1640 με L-γλουταμίνη και NaHCO

3, γαλακτικό οξύ, δινουκλεοτίδιο νικοτιναμιδίου αδενίνης (NAD

+), ΜΤΤ (3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου βρωμιούχο, SOB, MER, διμεθυλοσουλφοξείδιο και 4- (2-υδροξυαιθυλ) -1- πιπεραζινοαιθανοσουλφονικό οξύ (HEPES) αγοράστηκαν από την Sigma (Τσεχία) και άλλες χημικές ουσίες (π.χ., τα συστατικά των διαφόρων ρυθμιστικών διαλυμάτων) από Penta (Τσεχία) και ήταν της υψηλότερης διαθέσιμης φαρμακευτικής ή αναλυτικού βαθμού. διμεθυλοσουλφοξειδίου χρησιμοποιείται για τη διάλυση DEX, SOB και MER. Πλαστικά για την καλλιέργεια των κυττάρων ελήφθη από TPP (Ελβετία).

2. απομόνωση καρδιομυοκυττάρων και αξιολογήσεις τοξικότητας

Όλες οι διαδικασίες των ζώων και η προετοιμασία των NVCMs εγκρίθηκαν και εποπτεύεται από το Πανεπιστήμιο επιτροπή Φροντίδας ζώων του Καρόλου. Πρωτοβάθμια καλλιέργειες NVCMs παρασκευάστηκαν από 2-ημερών αρουραίους Wistar. Τα ζώα αναισθητοποιούνται με CO

2, και αποκεφαλίστηκαν. οι κασέλες άνοιξαν και οι καρδιές συλλέχθηκαν σε ένα παγωμένο Ca

2 + -δωρεάν ρυθμιστικό, που περιείχε 116 mM NaCl, 5,3 mM KCl, 1,2 mM MgSO

4, 1,13 mM Ν &

2ΡΟ

4, 5 mM γλυκόζη και 20 mM HEPES (ρΗ 7.40). Οι κοιλίες ήταν καλά κιμάς και σειριακά σε πέψη με ένα μίγμα κολλαγενάσης (0,25 mg /ml? Invitrogen, USA) και παγκρεατίνη (0,4 mg /ml? Sigma) διάλυμα στους 37 ° C. Το κυτταρικό εναιώρημα τοποθετείται σε ένα μεγάλο (15 cm) δίσκο Petri (περ. 20 καρδιές ανά δίσκο) και αφέθηκαν για 2 ώρες στους 37 ° C για το διαχωρισμό των μυοκύτταρα (επιπλέει στο μέσον) από ινοβλάστες (επισυνάπτεται στο πιάτο). Η μυοκυττάρων πλούσιο σε εναιώρημα συλλέχθηκε και βιώσιμα κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας αποκλεισμό μπλε Τρυπάνης. Η διαδικασία απομόνωσης οδήγησε σε συρρέουσα κυτταρική μονοστιβάδα με -90% των καρδιομυοκυττάρων χτυπάει συγχρονικά. Για να αξιολογηθεί η κυτταροτοξικότητα, κυτταρική μορφολογία και τη δραστηριότητα της κασπάσης, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 12 φρεατίων προ-επικαλυμμένες με 1% ζελατίνη σε μία πυκνότητα 0,8 εκατομμύρια κύτταρα ανά φρεάτιο. Για τη μέτρηση του περιεχομένου της γλουταθειόνης, τα κύτταρα απλώθηκαν σε 60 mm τρυβλία Petri σε πυκνότητα 4,8 εκατομμύρια κύτταρα ανά τρυβλίο. NVCMs καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C και 5% CO

2 στο DMEM /F12 συμπληρωμένο με 10% HS, 5% FBS, 4% ΠΥΡ και 1% Ρ /δ. Πρόσφατα απομονώθηκε NVCMs αφέθηκαν για 40 ώρες, στη συνέχεια το μέσο αλλάχθηκε προς ΟΜΕΜ /Ρ12 συμπληρωμένο με 5% FBS, 4% ΠΥΡ και 1% Ρ /δ. Το μέσο αντικαταστάθηκε μία ακόμη φορά μετά άλλες 24 ώρες. Όλα τα πειράματα ξεκίνησαν την τέταρτη ημέρα μετά την απομόνωση. Χρησιμοποιώντας τόσο ορού και ΠΥΡ-μέσο ελεύθερο, NVCMs επωάστηκαν στους 37 ° C με τις δοκιμαζόμενες ουσίες είτε μόνες τους είτε σε συνδυασμό. Η δραστηριότητα της γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH) που απελευθερώνεται από καρδιομυοκύτταρα προσδιορίστηκε σε μέσα κυτταρικής καλλιέργειας ως πρότυπο δείκτη της κυτταροτοξικότητας και της κυτταρικής βλάβης χρησιμοποιώντας ένα καθιερωμένο φασματοφωτομετρική μέθοδο? σε προηγούμενες μελέτες μας, η μέθοδος αυτή συσχετίζεται καλά με την απελευθέρωση του καρδιο-ειδικών τροπονίνες Τ και Ι [11]. Η δραστικότητα της LDH αποδεσμεύεται από καρδιομυοκύτταρα εκφράστηκε ως το ποσοστό της συνολικής κυτταρικής LDH όπως μετράται μετά λύση των κυττάρων για 15 λεπτά (0.1 Μ φωσφορικό κάλιο, 1% Triton Χ-100, 1 mM DTT [(-) -1,4-διθειο -L-θρεϊτόλη], 2 mM EDTA, ρΗ 7.8) σε θερμοκρασία δωματίου. Όλα τα δείγματα καταψύχθηκαν αμέσως και διατηρήθηκαν σε -80 ° C πριν από τη μέτρηση. Δραστηριότητα της LDH αναλύθηκε σε ρυθμιστικό Tris-HCl (100 mM, ρΗ 8,9) που περιείχε 35 mM γαλακτικού οξέος και 5 mM ΝΑϋ

+. Το ποσοστό του ΝΑϋ

μείωση + παρακολουθήθηκε φασματοφωτομετρικά στα 340 nm για 2 λεπτά. Η κλίση της γραμμικής περιοχής και συντελεστή μοριακής απορρόφησης e = 6,22 * 10

3 Μ /cm χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό της δραστικότητας της LDH και τα δεδομένα εκφράζονται ως ποσοστό του συνολικού ποσού της LDH.

Οι αλλαγές στην κυτταρική μορφολογία τεκμηριώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Eclipse TS100 ανεστραμμένο μικροσκόπιο επιφθορισμού (Nikon, Ιαπωνία), και το λογισμικό ΝΑΚ-Στοιχεία AR 2.20 (Laboratory Imaging, Τσεχική Δημοκρατία). Για την οπτικοποίηση ενεργός μιτοχόνδρια, τα κύτταρα φορτώθηκαν με 0,5 μΜ JC-1 (Molecular Probes /Invitrogen, USA) για 30 λεπτά στους 37 ° C. Σε χαμηλές συγκεντρώσεις, JC-1 υπάρχει μέσα στα κύτταρα σε μια πράσινη φθορίζουσα μονομερή μορφή και συσσωρεύεται σε ενεργά αναπνοής μιτοχόνδρια. Υπάρχουν JC-1 μονομερή συσσωμάτωμα οδηγείται από το υπάρχον δυναμικό της μεμβράνης διαφορά (ΔΨ

m) μεταξύ του εσωτερικού και του εξωτερικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης. Αυτό ΔΨ

m-εξαρτώμενη σχηματισμό της «J-συσσωματώματα» αντιπροσωπεύεται από ένα εγκεφαλικό επεισόδιο μετατόπιση από πράσινο σε κόκκινο φθορισμό.

3. Μελέτες Πολλαπλασιασμός

Η κυτταρική γραμμή HL-60, που προέρχεται από έναν ασθενή με οξεία προμυελοκυτταρική λευχαιμία [12], αγοράστηκε από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS και 1% Ρ /δ σε 75-cm

2 φιάλες καλλιέργειας ιστού) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2. Για τις δοκιμασίες πολλαπλασιασμού, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία 96 φρεατίων σε πυκνότητα 10.000 κυττάρων ανά φρεάτιο. Οι μελέτες συνδυασμού σχεδιάστηκαν σύμφωνα με την Chou – μέθοδος Talalay [13]. Εν συντομία, οι συγκεντρώσεις των χηλικοποιητών επάγει μείωση κατά 50% του πολλαπλασιασμού (IC

50) όλων μεμονωμένες ουσίες προσδιορίστηκαν για πρώτη φορά. Στη συνέχεια, τόσο οι μεμονωμένες ουσίες και τα μείγματα συνδυασμό δοκιμάστηκαν σε συγκεντρώσεις που αντιστοιχούν σε διάφορα κλάσματα και πολλαπλάσια. (1/8? 1/4? 1/2? 1? 2? 4) των επιμέρους IC

50 τιμές τους

ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία βιωσιμότητας βασίζεται στην ικανότητα των ενεργών μιτοχονδρίων να αλλάξει κίτρινο 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-difenyltetrazolium βρωμιούχο τετραζόλιο (ΜΤΤ? Sigma) σε μωβ φορμαζάνης σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή εν συντομία, 25 μΐ 3 mg /ml ΜΤΤ διαλύματος σε φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικό άλας προστέθηκαν στο μέσο καλλιέργειας (100 μΐ) και μετά από 2 ώρες επώασης σε 37 ° C τα κύτταρα λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (ισοπροπανόλη , 0,1 Μ HCl, 10% Triton Χ-100) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά τη διάλυση, η οπτική πυκνότητα του διαλυτού ΜΤΤ μετρήθηκε χρησιμοποιώντας αναγνώστη πλάκας Tecan Μ άπειρη 200 σε λ = 570 nm, αφαιρώντας το λ = 690 nm φόντο. Τα ποσοστά πολλαπλασιασμού των πειραματικών ομάδων εκφράστηκαν ως ποσοστά των μη επεξεργασμένων ελέγχων (100%).

4. Αξιολόγηση της δραστηριότητας κασπάσης

Οι δραστηριότητες των κασπασών 3/7, 8 και 9 προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα εμπορικά διαθέσιμο κιτ (Caspase Glo Δοκιμασίες, Promega, USA) με βάση την ικανότητα των κασπασών γιά την διάσπαση ειδικών αλληλουχιών αμινοξέων που υπάρχουν σε ένα υπόστρωμα για λουσιφεράση. δραστηριότητες κασπάσες «προσδιορίστηκαν σε σχέση με την περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη, η οποία αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας την μέθοδο δικιγχονινικού οξέος σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Sigma). Τα προϊόντα λύσης αραιώθηκαν σε ίσες συγκεντρώσεις πρωτεΐνης.

5. Προσδιορισμός του ολικού και οξειδωμένης γλουταθειόνης

NVCMs πλύθηκαν με PBS (2 χ 2,5 ml, 4 ° C), συλλέχθηκαν με ένα ξέστρο κυττάρων, και φυγοκεντρήθηκαν (10 λεπτά στα 700 χ g, 4 ° C), και το σφαιρίδιο επαναιωρήθηκε σε 250 μΐ 4 ° C ψυχρό σουλφοσαλικυλικό οξύ (Sigma) και στη συνέχεια υφίσταται κατεργασία με υπερήχους σε πάγο για 10 s (Bandelin Sonoplus, Bandelin Instruments, Germany). Τα δείγματα στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν για 15 λεπτά σε 18,000 χ g, και τα υπερκείμενα χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί το ποσό του ανηγμένη και οξειδωμένη γλουταθειόνη (GSH /GSSG) σύμφωνα με Tietze [14] χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της ανακύκλωσης ενζυματική με 5,5′-διθειο δις (2-νιτροβενζοϊκό οξύ) (Sigma) και GSH αναγωγάσης (Sigma) σε μορφή μικροπλάκας. Ο ρυθμός σχηματισμού 2-νιτρο-5-μερκαπτοβενζοϊκό οξύ καταγράφηκε στα 405 nm για 2 λεπτά και η κλίση συγκρίθηκε με εκείνη της πρότυπης καμπύλης οξειδωμένης γλουταθειόνης (GSSG). Η συγκέντρωση του συνόλου της γλουταθειόνης (GSH + GSSG) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της γραμμικής παλινδρόμησης, τα αποτελέσματα διορθώθηκαν ως προς την περιεκτικότητα πρωτεΐνης και εκφράζεται ως ποσοστό του συνολικού γλουταθειόνης σε ένα δείγμα ελέγχου (100%). περιεχόμενο GSSG στο δείγμα προσδιορίστηκε μετά από παραγοντοποίηση GSH με 2-βινυλοπυριδίνης (Sigma). Τα αποτελέσματα διορθώθηκαν για την περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη προσδιορίστηκε φασματοφωτομετρικά χρησιμοποιώντας τη μέθοδο δικιγχονινικού οξέος σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Sigma).

6. Κυτταρομετρία ροής του κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Μετά την επώαση, τα κύτταρα HL60 υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 300 χ g, πλύθηκαν σε PBS με 5% FBS (PBS + FBS) και αιωρείται σε μία μικρή ποσότητα του PBS + FBS. Στη συνέχεια, παγωμένο 70% αιθανόλης προστέθηκε στάγδην, και τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν για 3 ώρες στους – 20 ° C. Μετά τη σταθεροποίηση, η αιθανόλη απομακρύνθηκε με φυγοκέντρηση? κύτταρα πλύθηκαν σε PBS + FBS και αιωρήθηκαν σε 4 mM κιτρικό νάτριο σε PBS + FBS. Τέλος, τα κύτταρα επωάστηκαν με 200 μg /ml RNAse Α (Sigma) και 30 μg /ml ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) για 20 λεπτά στους 37 ° C. Τα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής Accuri C6 (Accuri Κυτταρόμετρα Europe Ltd., U.K.) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. ΡΙ διεγείρεται στα 488 nm, και ο φθορισμός αναλύθηκε σε 585 nm (FL-2). Ανά ανάλυση, 10.000 γεγονότα συλλέχθηκαν. ανάλυση του κύκλου των κυττάρων εκτιμήθηκε με τη χρήση πολλαπλών κύκλων AV Λογισμικού (Systems Phoenix Flow, USA). στοιχεία του κυτταρικού κύκλου δημιουργήθηκαν με λογισμικό Cyflogic (CyFlo Ltd, Φινλανδία).

7. Calcein-ΑΜ δοκιμασία για προσδιορισμούς ενδοκυτταρικών Fe-χηλικό ιδιότητες

Τα πειράματα αναλύοντας τα Fe-χηλικού ενδοκυτταρική αποδοτικότητες των εξεταζόμενων παραγόντων πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με Glickstein et al. [16] με μικρές τροποποιήσεις. Η κυτταρική σειρά H9c2 προέρχονται από εμβρυϊκά καρδιά αρουραίου ιστό [17] αγοράστηκε από την American Type Culture Collection (USA). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS, 1% Ρ /δ και 10 mM HEPES σε 75 cm

2 φιάλες καλλιέργειας ιστού στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2. Υποσυρρέοντα κύτταρα υποκαλλιεργήθηκαν κάθε 3-4 ημέρες. H9c2 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων (10,000 κύτταρα ανά φρεάτιο) και αφέθηκαν για 24 ώρες για να προσκολληθούν. Στη συνέχεια το μέσο καλλιέργειας αντικαταστάθηκε με ελεύθερο ορού και πυροσταφυλικό-free DMEM. Μετά από 24 ώρες στέρηση ορού, τα κύτταρα ήταν ουσιαστικά μη-πολλαπλασιαζόμενα, και χρησιμοποιήθηκαν για πειράματα. Τα κύτταρα φορτώθηκαν με 100 μΜ κιτρικός σίδηρος-αμμώνιο (FAC) σε μέσο 24 ώρες χωρίς ορό πριν από το πείραμα. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλένονται, και για την αποτροπή πιθανών παρεμβολών (ειδικά σε σχέση με διάφορα ιχνοστοιχεία), το μέσο αντικαταστάθηκε με ένα ρυθμιστικό που παρασκευάζεται από την Millipore-φιλτραρισμένα (απιονισμένο) νερό, το οποίο περιέχει 116 mM NaCl, 5,3 mM ΚΟΙ, 1 mM ΟαΟ

2, 1,2 mM MgSO

4, 1,13 mM Ν &

2 ΡΟ

4, 5 mM γλυκόζη και 20 mM HEPES (ρΗ 7,4). Τα κύτταρα φορτώθηκαν στη συνέχεια για 30 λεπτά στους 37 ° C με 1 μΜ κυττάρων διαπερατό ακετοξυμεθυλεστέρα καλσεΐνης πράσινο (Molecular Probes /KRD, Czech Republic), και πλένεται. Cellular εστεράσες διασπούν τις ομάδες ακετοξυμεθυλ να καταστήσει τη μεμβράνη αδιαπέραστη από πράσινο καλσεΐνης κύτταρο, το οποίο φθορισμός αποσβέστηκε με FAC. Η ενδοκυτταρική φθορισμού (λ

ex = 488 nm? Λ

em = 530 nm) στη συνέχεια παρακολουθήθηκαν για 24 ώρες στους 37 ° C χρησιμοποιώντας ένα άπειρο αναγνώστη Μ πλάκα 200 (Tecan, Αυστρία). DEX, SOB και MER συγκρίθηκαν με την ισχυρή λιπόφιλη Fe χηλικοποιητή SIH που χρησιμοποιήθηκε ως παράγοντας αναφοράς.

8. Η ανάλυση των δεδομένων

Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± SD. Τα δεδομένα υποβλήθηκαν σε μονόδρομη ή αμφίδρομη ANOVA με post-test του Dunnett χρησιμοποιώντας GraphPad Prism 5.00 (GraphPad Software, California, USA) με p ≤ 0,05 ως το επίπεδο σημαντικότητας. Όλες οι μετρήσεις έγιναν σε περισσότερα από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα. IC

50 τιμές (συγκέντρωση παραγόντων επαγωγής 50% μείωση του πολλαπλασιασμού σε σύγκριση με μη κατεργασμένους μάρτυρες) καθώς επίσης και τιμές δείκτη συνδυασμού (

CI

-a ποσοτικό μέτρο του βαθμού αλληλεπίδρασης φαρμάκου) υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας CalcuSyn 2.0 λογισμικό (Biosoft, Cambridge, UK)

το IC

50 τιμές (συγκέντρωση των παραγόντων που επάγουν 50% μείωση του πολλαπλασιασμού σε σύγκριση με μη επεξεργασμένους μάρτυρες ή η διάμεση δόση αποτέλεσμα) υπολογίστηκαν ως εξής:.

όπου

F

μια

είναι το κλάσμα που πλήττονται (πολλαπλασιασμός αναστέλλεται) με φαρμακευτική αγωγή?

F

u

είναι η ανεμπόδιστη κλάσμα?

D

x

είναι η δόση του φαρμάκου?

D

m

είναι η μέση δόση επίδραση (IC

50) και m είναι η κλίση της καμπύλης. Το τελευταίο λογισμικό χρησιμοποιήθηκε επίσης για να αποκτήσετε το δείκτη συνδυασμού (

CI

) -ένα αυστηρό ποσοτικό μέτρο του βαθμού της αλληλεπίδρασης φαρμάκου:

όπου

D

ένα

και

D

β

είναι οι δόσεις των φαρμάκων που χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό, ενώ

D

xa

και

D

xb

είναι οι isoeffective δόσεις. Chou και Talalay περιγράψει τις αλληλεπιδράσεις φαρμάκων από την άποψη της σχεδόν πρόσθετη επίδραση (

CI

0,9 έως 1,1), ελαφρά συνέργεια (

CI

0,85 – 0,90), μέτρια συνεργία (

CI

0,7 – 0,85), συνέργεια (

CI

0,3 έως 0,7), ισχυρή συνέργεια (

CI

0,1 έως 0,3), πολύ ισχυρή συνέργεια (

CI

& lt? 0.1) , ελαφρά ανταγωνισμός (

CI

1.1 – 1.2), μέτρια ανταγωνισμό (

CI

1,20 – 1,45), ο ανταγωνισμός (

CI

1,45 έως 3,3), ισχυρό ανταγωνισμό (

CI

3,3 έως 10) ή πολύ ισχυρό ανταγωνισμό (

CI

& gt? 10). Επιπλέον, για να αξιολογήσει τις αλλαγές των αλληλεπιδράσεων φαρμάκου-φαρμάκου ως συνάρτηση της συγκέντρωσης ή της δραστηριότητας, κλασματική επηρεάζουν (

F

α

) – ο δείκτης συνδυασμού (

CI

) οικόπεδα υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας οι προσομοιώσεις σε υπολογιστή CalcuSyn.

Αποτελέσματα

1. Μελέτες in vitro καρδιοτοξικότητα

Πρώτον, αξιολογήθηκαν οι καρδιοτοξικές επιδράσεις των μυρμηγκιών και πιθανή προστατευτική παρεμβάσεις χρησιμοποιώντας ένα προηγουμένως δημοσιευμένο πρωτόκολλο [18] που αποτελείται από μια έκθεση 3 ωρών από NVCMs να DAU ή DOX, που ακολουθείται από εκπλύσεις για να απομακρυνθεί μυρμήγκια και επώαση μυοκυττάρων σε ΑΝΤ-ελεύθερο μέσο? κυτταρική βλάβη προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας έναν προσδιορισμό απελευθέρωσης LDH. Όπως παρατηρήθηκε στην Εικόνα 2Α-Β, η έκθεση των απομονωμένων καρδιομυοκυττάρων σε DAU ή DOX για 3 ώρες ακολουθούμενη από μία περίοδο έκπλυσης 48-h οδήγησε σε στατιστικά σημαντική απώλεια βιωσιμότητας (που προσδιορίζεται ως το ποσοστό της συνολικής απελευθέρωσης LDH) που κυμαίνεται από -20 % στα 0,6 μΜ και για τις δύο ANTs να -55% στα 2,0 μΜ. Η προ-επώαση των κυττάρων με 10, 100 και 1000 μΜ ϋΕΧ για 3 ώρες επάγεται σημαντική προστασία από την τοξικότητα των δύο ANTs σε συγκεντρώσεις μέχρι 1,2 μΜ (DAU) και 1,4 μΜ (DOX). Αυτό το αποτέλεσμα δεν φαίνεται να είναι δοσοεξαρτώμενη, όπως στα περισσότερα πειράματα οι 10 μΜ και 100 μΜ συγκεντρώσεις ϋΕΧ προσφέρεται καλύτερη προστασία από 1.000 μΜ (Σχήμα 2Α-Β). Σε καρδιομυοκύτταρα που εκτίθενται σε οξειδωτικό στρες που προκαλεί παράγοντας H

2O

2, η τοξικότητα που κυμαίνονται από -36% στα 200 μΜ έως περίπου 50% στα 500 μΜ H

2O ανιχνεύθηκε

2. Ωστόσο, σημαντική προστασία έναντι H

2O

2 επαγόμενη τοξικότητα βρέθηκε με οποιαδήποτε δοκιμιών συγκέντρωση του DEX (Σχήμα 2C). Για περαιτέρω εξετάσεις, 1.2 μΜ ΕΔΕ ή DOX επιλέχθηκαν, όπως και σε αυτή τη συγκέντρωση δύο ANTs προκάλεσαν σημαντική τοξικότητα που προλαμβάνονται με DEX προ-επώαση. Ως εκ τούτου, 300 μΜ H

2O

2 επελέγη για τη σύγκριση, όπως η συγκέντρωση αυτή προκάλεσε συγκρίσιμα τοξικότητα στα 1.2 μΜ ΕΔΕ ή DOX. Από τις τρεις TOP2 καταλυτική αναστολείς που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη, DEX (10 – 1000 μΜ) και SOB (σε συγκεντρώσεις μέχρι το όριο διαλυτότητας του 300 μΜ) δεν προκάλεσε οποιαδήποτε σημαντική απώλεια NVCM βιωσιμότητας. Αντίθετα, MER παρουσίασαν σημαντική τοξικότητα σε συγκεντρώσεις ≥60 μΜ (Σχήμα 3D). DEX, SOB και MER στη συνέχεια συγκρίθηκαν για καρδιοπροστατευτική δυναμικό τους σε μια συγκέντρωση 30 μΜ, δηλαδή, η υψηλότερη συγκέντρωση στην οποία κανένα από τα φάρμακα που επάγεται δική τοξικότητά του. Και οι τρεις TOP2 καταλυτική αναστολείς ήταν σε θέση να μερικώς αλλά σημαντικά την προστασία έναντι NVCMs 1,2 μΜ DAU ή DOX με ~ 10 – μείωση της τοξικότητας 15% σε σύγκριση με το DAU ή DOX τοξικότητα μόνο, αλλά οι αναστολείς TOP2 δεν είχε σημαντική επίδραση στην τοξικότητα που προκαλείται από 300 μΜ h

2O

2 (Σχήμα 3Α-Γ).

τα κύτταρα προ-επωάστηκαν με τρεις συγκεντρώσεις του δεξραζοξάνη για 3 ώρες και στη συνέχεια συν-επωάστηκαν με αυξανόμενες συγκεντρώσεις ανθρακυκλίνες δαουνορουβικίνης (DAU, Α) ή δοξορουβικίνη (ϋΟΧ, Β) για 3 ώρες μετά από μια περίοδο ανθρακυκλίνη δωρεάν 48-h ή για 48 ώρες με h

2O

2 (C). Η τοξικότητα εκτιμήθηκε ως η% του συνολικού γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH) που απελευθερώνεται από καρδιομυοκύτταρα στο μέσο κυτταρικής καλλιέργειας. Τα δεδομένα που λαμβάνονται από ≥4 ανεξάρτητα πειράματα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD, η στατιστική σημασία: c – σε σύγκριση με χωρίς φάρμακο ελέγχου (DMSO)? δ – σε σύγκριση με το ΕΔΕ ή DOX? σελ. – σε σύγκριση με H

2O

2 (one-way ANOVA με post-test του Dunnett, p ≤ 0,05)

Η

Νεογνών καρδιομυοκύτταρα αρουραίου ήταν προ-επωάστηκαν με δεξραζοξάνη (ΡΕΧ) , σοβουζοξάνη (SOB) ή merbarone (MER) επί 3 ώρες και στη συνέχεια επωάστηκαν με ανθρακυκλίνες δαουνορουβικίνη (DAU, Α) ή δοξορουβικίνη (ϋΟΧ, Β) για 3 ώρες μετά από μια περίοδο ανθρακυκλίνη δωρεάν 48-h ή για 48 ώρες με υπεροξείδιο του υδρογόνου (H

2O

2, C). DEX, SOB και MER επιμέρους τοξικότητα μετά από 48-ώρες επώασης δείχνονται στο πλαίσιο D. Επιπτώσεις του DEX προεπεξεργασίας για 3 ώρες με έναν DAU επώαση 3 ωρών και εν συνεχεία 48-h περίοδος DAU-free στην κυτταρική οξειδώνεται και μειωμένη περιεκτικότητα γλουταθειόνης φαίνονται στον πίνακα Ε δεδομένα που λαμβάνονται από ≥ 4 ανεξάρτητα πειράματα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD, η στατιστική σημασία: c – σε σύγκριση με τον έλεγχο? d – σε σύγκριση με DAU ή DOX (μονόδρομη ANOVA με post-test του Dunnett, p ≤ 0,05)

Η

Όπως παρατηρήθηκε στην Εικόνα 3Ε, την επώαση του NVCMs με 1,2 μΜ DAU για 3 ώρες που ακολουθείται. από 48 h σε DAU μέσο άνευ δεν οδήγησε σε μια στατιστικά σημαντική αύξηση σε είτε GSH ή GSSG, παρά τη σημαντική τοξικότητα που προκαλείται από αυτή τη συγκέντρωση και επώαση χρονοδιάγραμμα. Η προ-επώαση των καρδιομυοκυττάρων με 30 μΜ ϋΕΧ για 3 ώρες που ακολουθείται από συν-επώαση με DAU έδειξε ένα ασήμαντο τείνοντας αύξηση της GSH, αλλά αυτό συνέβη σε απουσία αλλαγών GSSG. Η επώαση ελέγχου με ϋΕΧ μόνο του δεν προκάλεσε καμία σημαντική διαφορά από τις τιμές ελέγχου για είτε GSH ή GSSG (Σχήμα 3Ε).

Μια έκθεση τρίωρη του NVCMs έως 1,2 μΜ DAU ή DOX προκαλέσει εμφανείς μεταβολές στη μορφολογία των καρδιακών , συμπεριλαμβανομένων κυτταροπλασματική κενοτοπιώδη κατάσταση και κοκκοποίηση, η οποία προχώρησε σε διακοπή του κυτταρικού μονοστιβάδας και κυτταρική και πυρηνική συρρίκνωση. Καρδιομυοκύτταρα χρωματίστηκαν με τον ανιχνευτή JC-1, και το σήμα της ήταν ορατά με μικροσκοπία φθορισμού. Μετά την έκθεση σε DAU ή DOX, υπήρξε μια ευδιάκριτη μετάπτωση της κανονικής κόκκινο χρωματισμένο μιτοχόνδρια με πολωμένο εσωτερικές μεμβράνες να διαχυθεί πράσινο φθορισμό υποδεικνύοντας θνήσκοντα κύτταρα με αποπολώνεται μιτοχόνδρια. Η προ-επώαση με 30 μΜ DEX, SOB και, σε μικρότερο βαθμό, MER, μερικώς εμπόδισε τόσο ΑΝΤ επαγόμενη αλλαγές στην κυτταρική μορφολογία, καθώς και η διάχυση της μιτοχονδριακής εσωτερικής μεμβράνης δυναμικό (Σχήμα S1).

2. Μελέτες Πολλαπλασιασμός

Μετά από επώαση για 72-h, όλες οι ουσίες που εξετάστηκαν είχαν σημαντική και δοσοεξαρτώμενη αντιπολλαπλασιαστικά αποτελέσματα επί κυττάρων HL-60. Τα μυρμήγκια (DAU και DOX) ήταν αποτελεσματικές σε συγκεντρώσεις που ήταν τρεις τάξεις μεγέθους χαμηλότερες από τις καταλυτικές αναστολείς? το IC

50 τιμές για όλα τα φάρμακα ήταν ως ακολούθως: 19 ηΜ για DAU, 38 ηΜ για DOX, 25 μΜ για DEX, 48 μΜ για SOB και 38 μΜ για MER. Ενιαία παράγοντες και συνδυασμούς των μυρμηγκιών και TOP2 καταλυτική αναστολείς στη συνέχεια επωάστηκαν για 72 ώρες σε συγκεντρώσεις που αντιστοιχούν στο IC

50 τιμές τους, και των αλληλεπιδράσεών τους αναλύθηκαν σύμφωνα με την μέθοδο Chou-Talalay. Επιπλέον, όπως οι αλληλεπιδράσεις φαρμάκου-φαρμάκου μπορεί να αλλάξει ως μία συνάρτηση της συγκέντρωσης ή της δραστηριότητας, εξετάσαμε επίσης συνδυασμοί των χηλικοποιητών και αντικαρκινικά φάρμακα σε κλάσματα και πολλαπλάσια (1/8? 1/4? 1/2? 1? 2? 4) του τους IC

50 αξίες, και το κλάσμα που πλήττονται (

Fa

) – συνδυασμός δείκτη (

CI

) οικόπεδα υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας προσομοιώσεις σε ηλεκτρονικό υπολογιστή (Σχήμα 4). Τα δεδομένα πολλαπλασιασμό φαίνονται στους πίνακες Α και Β στα σχήματα S2-S4, και ο δείκτης συνδυασμού (

CI

) υπολογίζονται οι τιμές συνοψίζονται στους Πίνακες S1-S3. Αυτές οι αναλύσεις αποκάλυψαν ότι DEX, SOB και MER ενίσχυσε τις αντιπολλαπλασιαστικές επιδράσεις των δύο DAU και DOX όταν οι ουσίες αυτές συν-επωάστηκαν ταυτόχρονα, καθώς η αντίστοιχη

CI

τιμές κυμαίνονταν από μέτρια έως ισχυρή συνέργεια.

τα κύτταρα επωάστηκαν είτε συνεχώς με δεξραζοξάνη (DEX, Α), σοβουζοξάνη (SOB, Β) ή merbarone (MER, C) και η δαουνορουβικίνη (DAU) ή δοξορουβικίνη (ΔΟΞ) για 72 ώρες ή προ-επωάστηκαν με DEX (Α), SOB (Β) ή MER (C) για 3 ώρες ή 6 ώρες και στη συνέχεια επωάστηκαν για 72 ώρες με όλα τα φάρμακα σε συγκεντρώσεις που αντιστοιχούν στο IC

50 αξίες και IC τους

50 κλάσματα και πολλαπλάσια (1/8? 1 /4? 1/2? 1? 2? 4). Εναλλακτικά, τα κύτταρα είτε συν-επωάστηκαν για 72 ώρες ή προ-επωάστηκαν με ϋΕΧ για 3 ώρες και στη συνέχεια συν-επωάζονται με DAU για 72 ώρες σε μία αναλογία 1:20 DAU: DEX (Α). προσομοιώσεις σε υπολογιστή του δείκτη συνδυασμού (

CI

) – κυτταρικό πολλαπλασιασμό (κλάσμα επηρεάζονται –

Φα

). εξαρτήσεις ελήφθησαν χρησιμοποιώντας CalcuSyn 2.0 λογισμικό

Η

Σε μια άλλη σειρά πειράματα, DEX, SOB και MER προ-επωάστηκαν για 3 ή 6 ώρες πριν από την προσθήκη του DAU με επακόλουθη 72-h συν-θεραπεία (πάνελ C και D στα σχήματα S2-S4, πίνακες S1-S3). Όπως παρατηρήθηκε σε αυτά τα σχήματα και τους πίνακες, αυτοί οι συνδυασμοί φαρμάκου παρέμεινε συνεργιστική με την εξαίρεση των συνδυασμών DAU με DEX στο υψηλότερο συγκέντρωση του? σε αυτή την περίπτωση, οι

CI

τιμές ήταν προσθετική ή σε μία σπάνια περίπτωση μέτρια ανταγωνιστική. Επιπλέον, εκτός από το πρότυπο Chou-Talalay σχεδιασμός μελέτης συνδυασμού (όπου οι παράγοντες εφαρμόζονται σε ισοδύναμες δόσεις), DAU και DEX εξετάστηκαν επίσης τη χρήση του σταθερού 1:20 αναλογία σε συγκέντρωση που χρησιμοποιείται στην κλινική πράξη [19]. Ενώ μάλλον λιγότερο έντονη συνεργιστική δράση ανιχνεύθηκε για χαμηλότερες συγκεντρώσεις, εδώ, δεν υπήρξε ανταγωνισμός, ακόμη και μετά από προεπώαση με ϋΕΧ για 3 ώρες, και σε αυτή τη ρύθμιση, όλες οι συγκεντρώσεις του DEX ενίσχυσε την αντιπολλαπλασιαστική δραστικότητα DAU προς κύτταρα HL-60 (Σχήμα S2E- F, Πίνακας S1).

3. αναλύσεις δραστικότητας της κασπάσης

Οι συνδυασμοί των μυρμηγκιών και TOP2 καταλυτική αναστολείς εξετάστηκαν επίσης για την ικανότητά τους να ενεργοποιούν κασπάσες, οι οποίες αποτελούν βασικούς διαμεσολαβητές της απόπτωσης. Η επώαση των NVCMs με 1,2 μΜ DAU για 3 ώρες που ακολουθείται από 48 ώρες από DAU-free περιόδου προκάλεσε σημαντική ενεργοποίηση κασπασών 8 και 9, οι οποίες αποτελούν το κλειδί εξωγενούς (μεσολάβηση υποδοχέα) και ενδογενή (μιτοχονδριακή) αποπτωτικά εκκινητές μονοπάτι, αντίστοιχα, όπως καθώς και η εκτέλεση κασπάσες 3/7 έως -200% των τιμών ελέγχου. Η επώαση με 30 μΜ συγκεντρώσεις όλων των τριών TOP2 καταλυτική αναστολείς δεν προκάλεσε καμία σημαντική αύξηση στην δραστηριότητα κάθε κασπάσης, αλλά DEX και SOB σημαντικά προστατεύονται καρδιομυοκύτταρα κατά την ενεργοποίηση της κασπάσης με DAU. Αν και MER προεπεξεργασίας έδειξαν επίσης μία τάση προς μειωμένη ενεργοποίηση όλων των κασπασών, αυτό δεν έφθασε στατιστική σημασία σε σύγκριση με την ομάδα DAU. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα της δοκιμασίας διαρροής LDH, η ενεργοποίηση των κασπασών μετά από επώαση με DOX ήταν γενικά λιγότερο έντονη από ό, τι μετά από επώαση DAU. Η ενεργοποίηση και των δύο κασπασών έναρξης ήταν ασήμαντος σε σχέση με τον έλεγχο (Σχήμα 5Ε-F), αν και υπήρξε μια μικρή αύξηση. Συνολικά, προ-επώαση των κυττάρων με DEX, SOB ή MER δεν μεταβλήθηκε σημαντικά την έναρξη της ενεργοποίησης της κασπάσης, παρά την τάση μείωσης της δραστηριότητας. Ωστόσο, η δραστηριότητα του εκτελεστικού κασπάσης 3/7 αυξήθηκε σημαντικά μετά τη θεραπεία DOX, ενώ TOP2 καταλυτική αναστολείς εμπόδισε αποτελεσματικά την αλλαγή αυτή (Σχήμα 5D)

Νεογνών καρδιομυοκύτταρα αρουραίου (Α – ΣΤ). Προ-επωάστηκαν με 30 μΜ δεξραζοξάνη (ϋΕΧ), σοβουζοξάνη (SOB) και merbarone (MER) για 3 ώρες και στη συνέχεια συν-επωάζονται με 1,2 μΜ δαουνορουβικίνη (DAU? Α – C) ή δοξορουβικίνη (ΔΟΞ? D – F) για 3 ώρες, που ακολουθείται από μια περίοδο 48-h ανθρακυκλίνες δωρεάν.