Αφηρημένο

Η ακτινοθεραπεία (RT) εξακολουθεί να είναι μία από τις πιο δημοφιλείς επιλογές θεραπείας για τον εντοπισμένο καρκίνο του προστάτη (Καπάκι). Ο σκοπός της μελέτης ήταν να διερευνηθεί η

in vitro

επίδραση της μόνος LBH589 και σε συνδυασμό με RT για την ανάπτυξη και την επιβίωση των κυτταρικών γραμμών πώματος και τους πιθανούς μηχανισμούς της ραδιοευαισθητοποίησης αυτής της θεραπείας συνδυασμού. Η επίδραση της LBH589 μόνη της ή σε συνδυασμό με RT σε δύο κυτταρικές σειρές ΚΓΠ (PC-3 και LNCaP) και ένα φυσιολογικό προστάτη επιθηλιακή κυτταρική γραμμή (RWPE-1) μελετήθηκε με ΜΤΤ και κλωνογονική δοκιμασίες, ανάλυση κυτταρικού κύκλου, western αποτύπωση της απόπτωσης -σχετικών και ελέγχου του κυτταρικού πρωτεΐνες σημείο, και οι δείκτες επιδιόρθωση του DNA διπλό σπάσιμο σκέλος (ΟΕΔ). Η χρώση ανοσοφθορισμού χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω έκφραση ΟΕΔ στα επεξεργασμένα κύτταρα ΚΓΠ. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι LBH589 ανέστειλε πολλαπλασιασμό τόσο CaP και φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη σε έναν χρόνο-and-δοσο-εξαρτώμενο τρόπο? χαμηλή δόση LBH589 (IC

20) σε συνδυασμό με RT βελτίωσε σημαντικά την αποτελεσματικότητα της θανάτωσης κυττάρων σε κύτταρα CaP? σε σύγκριση με την RT μόνον, η συνδυασμένη θεραπεία με LBH589 και RT που προκαλείται περισσότερο απόπτωση και οδήγησε σε μια σταθερή αύξηση του πληθυσμού υπο-G1 και κατάργηση του τέλους ταξινόμησης που προκαλείται G2 /M σύλληψη, αυξάνεται και επίμονη DSB, λιγότερο ενεργοποίηση των μη-ομόλογο τέλος ενώνει /ομόλογος ανασυνδυασμός (HR) οδοί επισκευής (NHEJ) και μια ομάδα πρωτεϊνών που σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι LBH589 είναι ένας πιθανός παράγοντας για την αύξηση της ραδιοευαισθησίας των ανθρώπινων κυττάρων καπάκι. LBH589 χρησιμοποιηθεί είτε μόνο του, είτε σε συνδυασμό με RT είναι μια ελκυστική στρατηγική για την αντιμετώπιση της ανθρώπινης CaP

Παράθεση:. Xiao W, Graham PH, Hao J, Chang L, Ni J, Υδραυλικό CA, et al. (2013) συνδυαστική θεραπεία με το αναστολέα απακετυλασών LBH589 και η ακτινοβολία είναι ένα αποτελεσματικό σχήμα για τα κύτταρα του καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 8 (8): e74253. doi: 10.1371 /journal.pone.0074253

Επιμέλεια: Hari Κοαΐ, Πανεπιστήμιο του Κολοράντο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 8 Οκτώβρη 2012? Δεκτές: 2, Αυγούστου 2013? Δημοσιεύθηκε: 26 Αυγούστου του 2013

Copyright: © 2013 Xiao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη ήταν εν μέρει υποστηρίζεται από μια Εξέλιξης υποτροφία από το Εθνικό Συμβούλιο Υγείας Ιατρικής Έρευνας (YL), Αυστραλία? St George Αντικαρκινικό Νοσοκομείο Trust Fund Research (PHG), Σίδνεϊ, Αυστραλία? και την Κίνα Υποτροφιών του Συμβουλίου (WWX), Κίνα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

οι τρέχουσες θεραπευτικές επιλογές για την τοπική ΚΓΠ ακτινοθεραπεία (RT), χειρουργική επέμβαση και την ορμονική θεραπεία. Αν και επιθετική ακτινοβολία δεν βελτιωθεί βιοχημικό έλεγχο, μεγαλύτερη του ορθού και του ουροποιητικού τοξικότητες παρουσιάσθηκαν επίσης [1]. Τοπική ανεπάρκεια μετά από RT παραμένει το 20% -35% σε μέσης και CaP υψηλού κινδύνου ασθενείς [2], που οδηγεί σε αυξημένη μετάσταση και χαμηλότερα ποσοστά επιβίωσης. Έτσι, η έρευνα μιας προσέγγισης μυθιστόρημα συνδυασμό με ένα εκλεκτικό ραδιο-ευαισθητοποιός με RT για την ενίσχυση της CaP ακτινοευαισθησία χρειάζεται επειγόντως.

δεακετυλάσης αναστολείς της ιστόνης (HDACi) είναι μια αναδυόμενη ομάδα παραγόντων που στοχεύει δεακετυλάσης ιστόνης (HDAC) και υποσχόμενη ραδιοευαισθητοποιητές υπό διερεύνηση. Radiosensitization από HDACi, όπως βαλπροϊκό οξύ [3] έχει αποδειχθεί σε προκλινικές μελέτες. HDACi είναι ένας ισχυρός επαγωγέας ή ρυθμιστής της κυτταρικής συμπεριφοράς όπως οι διαδικασίες απόπτωση, κυτταρικό κύκλο και την επιδιόρθωση του DNA. Πιστεύεται ότι ασκούν τη δράση της κυρίως μέσω τροποποίησης της ιστόνης και χρωματίνης δομές, έτσι να ρυθμίζουν τη μεταγραφή γονιδίων [4]. Επιπλέον, αυτά τα ακετυλάσες και αποακετυλάσες μπορούν επίσης να ρυθμίζουν κυτταρικές λειτουργίες ανεξάρτητη της έκφρασης του γονιδίου δρώντας σε μη ιστόνης πρωτεΐνες όπως ρ21 [5], p53 [6], Κυ70 [6]. Δρώντας σε μια σειρά πρωτεϊνών ιστόνης και μη-ιστόνης, HDACi είναι ικανή να μεσολαβεί απόπτωση, κυτταρικό κύκλο, και οι διαδικασίες επιδιόρθωσης του DNA σε ένα καλά ενορχηστρωμένο τρόπο.

LBH589 είναι ένα παράγωγο υδροξαμικού οξέος και μια νέα πανευρωπαϊκή HDACi [7]. Qian et al. ανέφεραν ότι LBH589 μόνο μείωσε την αγγειογένεση και την ανάπτυξη του όγκου σε ένα PC-3 ξενομοσχεύματος ζωικό μοντέλο [8]. Μια μελέτη φάσης Ι έχει διεξαχθεί με τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη (CRPC) ασθενείς ευνουχισμό ανθεκτικό χρησιμοποιώντας το στόμα LBH589 με ή χωρίς docetaxel, επιδεικνύοντας πολλά υποσχόμενα αποτελέσματα για τη μελλοντική κλινική εφαρμογή [9]. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν την υπόθεση ότι LBH589 μπορεί να είναι χρήσιμη σε συνδυασμό με RT για τη θεραπεία εντοπισμένης πώμα.

Σε αυτή τη μελέτη, υποθέσαμε ότι LBH589 θα μπορούσε να σκοτώσει τα κύτταρα ΚΓΠ και κατεργασία των κυττάρων με CaP LBH589 πριν RT θα αυξήσει την ευαισθησία κυττάρων καπάκι για να RT.

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά και αντισώματα

LBH589 (panobinostat) αγοράστηκε από Σέλεκ Χημικών Προϊόντων (Σέλεκ Χημικά South Loop West, Houston, TX, ΗΠΑ). Άλλες χημικές ουσίες που χρησιμοποιούνται αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, Pty Ltd, Κάστρο Hills, Νέα Νότια Ουαλία, Αυστραλία), εκτός αν ορίζεται διαφορετικά. Τα πρωτογενή και δευτερογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη παρατίθενται στον Πίνακα 1.

αντισωμάτων

Πηγή

Πληκτρολογήστε

Αραίωση

χρόνος επώασης

Θερμοκρασία

αντι-ανθρώπινο Εφαρμογή

Κουνέλι κασπάσης-3 (Pro) EpitomicsMAb1: 1000o /Ν4

° CWBRabbit αντι-ανθρώπινο κασπάσης-3 (Active) EpitomicsMAb1: 1000o /Ν4

° CWBRabbit αντι-ανθρώπινο ιστόνης Η3 (ακετυλο Κ9) AbcamPAb1: 500o /Ν4

° CWBRabbit αντι-ανθρώπινης ιστόνης Η4 (ακετυλο Κ8) AbcamPAb1: 500o /Ν4

° CWBRabbit αντι-ανθρώπινο p21AbcamPAb1: 1000o /Ν4

° CWBRabbit αντι-ανθρώπινο π-p53AbcamPAb1: 1000o /Ν4

° CWBMouse αντι-ανθρώπινο p53AbcamMAb1: 1000o /Ν4

° CWBRabbit αντι-ανθρώπινου φωσφο-CDK1 (Tyr15) Cell Signaling TechnologyPAb1: 1000o /Ν4

° CWBRabbit αντι-ανθρώπινο Cdk1 (cdc2) AbcamPAb1: 10000o /Ν4

° CWBRabbit αντι-ανθρώπινο π-Chk-1AbcamPAb1: 1000o /Ν4

° CWBRabbit αντι-ανθρώπινο Chk-1AbcamPAb1: 1000o /Ν4

° CWBRabbit αντι-ανθρώπινο π-Chk-2AbcamPAb1: 500o /Ν4

° CWBRabbit αντι-ανθρώπινο Chk-2AbcamPAb1: 500o /Ν4

° CWBRabbit αντι-ανθρώπινου φωσφο-Rb (Ser795) Cell Signaling TechnologyPAb1: 1000o /Ν4

° CWBRabbit αντι-ανθρώπινου φωσφο-Rb (Ser807 /811) κυτταρική σηματοδότηση TechnologyPAb1: 1000o /Ν4

° CWBMouse αντι-ανθρώπινο RbAbcamMAb1: 1000o /Ν4

° CWBMouse αντι-ανθρώπινο γH2AXAbcamMAb 1: 500 (IF) 1: 1000 (WB) o /Ν4

° CIF WBRabbit αντι- ανθρώπινο Ku70EpitomicsPAb1: 1000o /Ν4

° CWBRabbit αντι-ανθρώπινο Ku80EpitomicsPAb1: 1000o /Ν4

° CWBMouse αντι-ανθρώπινο BRCA1AbcamMAb1: 200 (IF) 1: 200 (WB) o /Ν4

° CWB, IFRabbit αντι -ανθρώπινη BRCA2AbcamPAb1: 200 (IF) 1: 1000 (WB) o /Ν4

° CWB, IFMouse αντι-ανθρώπινο RAD51AbcamPAb1: 100 (IF) 1: 1000 (WB) o /Ν4

° CWB, IFMouse αντι -ανθρώπινη GAPDHMilliporeMAb1: 500o /Ν4

° CWBMouse αντι-ανθρώπινης IgG 1-αρνητικών controlDakoIgG11: 1000o /Ν4

° CIFGoat αντι-κουνελιού IgG-HRPSanta Cruz BiotechnologyIgG1: 500045 minroom temperatureWBGoat αντι-ποντικού IgG-HRPSanta Cruz BiotechnologyIgG1: 500045 . minroom temperatureWBGoat αντι-ποντικού Alexa Fluor® 488 Dye ConjugateInvitrogenIgG1: 100045 minroom temperatureIFTable 1. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν για την κηλίδωση Western και χρώση ανοσοφθορισμού

Σημειώσεις: MAb: μονοκλωνικό αντίσωμα? o /n: όλη τη νύχτα? PAb: πολύκλωνο αντίσωμα? WB: western αποτύπωση? ΕΑΝ: ανοσοφθορισμού? HRP: peroxidas χρένο CSV Λήψη CSV

Κυτταρική καλλιέργεια

Τα ανδρογόνα δεν ανταποκρίνεται PC-3 και αποκρίνονται στο ανδρογόνο κυτταρικές σειρές LNCaP καπάκι, και το φυσιολογικό ανθρώπινο προστάτη RWPE-1 κυτταρική γραμμή ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD, USA). PC-3 και LNCaP κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% (ο /ο) θερμαίνεται-αδρανοποιημένο εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS), 50 U /mL πενικιλίνη, και 50 μg /mL στρεπτομυκίνης ενώ RWPE-1 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο Κ-SFM συμπληρώνονται με 0,2 ng /mL ανασυνδυασμένου επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (rEGF) και 25 μg /mL εκχύλισμα βόειας υπόφυσης χωρίς FBS. Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε ένα υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C και 5% CO

2.

ΜΤΤ δοκιμασία

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων αξιολογήθηκε σε CaP και φυσιολογικό κύτταρο προστάτη γραμμές μετά τη θεραπεία LBH589 χρησιμοποιώντας ΜΤΤ δοκιμασία μετά από μια δημοσιευμένη μέθοδο [10]. Εν συντομία, τα κύτταρα 2000 σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων επωάζονται σε μέσα καλλιέργειας για 24 ώρες. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με ένα εύρος συγκεντρώσεων του LBH589 (0 ~ 20 μmol /L) ή ο ίδιος όγκος του DMSO ελέγχου σε φρέσκα μέσα για άλλες 24, 48 και 72 ώρες, αντίστοιχα. Η απορρόφηση (OD) μετρήθηκε στα 560 nm σε έναν αναγνώστη BIO-TEC μικρο-πλάκα (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως ο λόγος OD των επεξεργασμένων και ελέγχου κυττάρων. IC

20 (ανασταλτική συγκέντρωση 20%) της LBH589 στις 24 ώρες υπολογίστηκε και επιλέγεται για τα ακόλουθα πειράματα.

σχηματισμού αποικίας

δοκιμασία

PC-3, LNCaP και RWPE-1 κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για προσδιορισμούς σχηματισμού αποικίας όπως περιγράφηκε προηγουμένως με ελάσσονες τροποποιήσεις [10]. Εν συντομία, 1,5 ~ 2 × 10

6 PC-3, LNCaP και RWPE-1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σε 6 cm τρυβλίου με LBH589 στο αντίστοιχο IC

20 συγκεντρώσεις ή ίδιο όγκο DMSO (έλεγχος) επί 24 ώρες και τότε 200 ~ 2 × 10

5 κύτταρα σπάρθηκαν σε 6 πιάτα cm. Μετά από 8 ώρες ανάκτηση, τα κύτταρα LBH589 αγωγή και τον έλεγχο DMSO-αγωγή εκτέθηκαν σε μία μόνο δόση ακτινοβόλησης (0-8 Gy) σε θερμοκρασία δωματίου χρησιμοποιώντας ένα γραμμικό επιταχυντή (Elekta, Στοκχόλμη, Σουηδία) σε ρυθμό δόσης 2,7 Gy /min με 6 MV φωτόνια (Cancer Care Centre, Αγίου Γεωργίου Νοσοκομείο, Σίδνεϊ, Αυστραλία). Μετά RT, όλα τα κύτταρα πλύθηκαν αμέσως με μέσο χωρίς φάρμακο. Μετά από 14 ημέρες επώασης, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες. Οι αποικίες, ορίζονται ως ομάδες & gt? 50 κύτταρα, βαθμολογήθηκαν με το χέρι με τη βοήθεια ενός Ολύμπου INT-2 ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Τόκιο, Ιαπωνία). κύτταρα τα δεδομένα από την RT μόνον ή συνδυασμό αγωγή (LBH589 και RT) ομαλοποιήθηκαν ενάντια στα κύτταρα un-ακτινοβολημένα (βαθμολογείται ως ικανότητα σχηματισμού 100% αποικία).

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής για

κατανομή του κυτταρικού κύκλου

0.5 ~ 2 × 10

6 κύτταρα PC-3 και LNCaP CaP απλώθηκαν σε cm δίσκο 10 για 24 ώρες, στη συνέχεια κατεργάζεται με LBH589 στο αντίστοιχο IC

20 συγκεντρώσεις ή DMSO (έλεγχος) για άλλες 24 ώρες πριν υποβληθούν 2 Gy RT. Σε συγκεκριμένα χρονικά σημεία (pre-RT, 2, 6, 12, 24, 48 και 72 ώρες μετά από 2 Gy), σε επεξεργασία με θρυψίνη προσκολλημένα και επιπλέοντα κύτταρα συλλέχθηκαν και σταθεροποιήθηκαν σε ψυχρή 70% (ν /ν) αιθανόλης στους 4 ° C. Ιστογράμματα του περιεχομένου DNA αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό FlowJo (V.7.6.1, Tree Star, Inc., Oregon, USA) για να προσδιοριστεί κατανομή κύκλου κυττάρου (subs G1, G1, S, και G2 /M).

πρωτεΐνες χρώση ανοσοφθορισμού για γH2AX και επισκευή HR μονοπάτι

κύτταρα PC-3 και LNCaP CaP υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το ίδιο πρωτόκολλο όπως περιγράφεται στην ανάλυση του κυτταρικού κύκλου (βλέπε παραπάνω). Μετά την παραλαβή 2 Gy RT, LBH589 επεξεργασμένου και DSMO-επεξεργασμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε χρώση ανοσοφθορισμού σε συγκεκριμένα χρονικά σημεία (pre-RT, 24, και 72 ώρες μετά από 2 Gy). Η προετοιμασία των κυττάρων για χρώση ανοσοφθορισμού όπως περιγράφηκε προηγουμένως με τροποποιήσεις [11,12]. Τα χρωματισμένα κύτταρα εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας ένα FV300 /FV500 Ολύμπου σάρωση με λέιζερ ομοεστιακό μικροσκόπιο (Olympus, Tokyo, Japan) και οι εικόνες συλλήφθηκαν. Για κάθε συνθήκη θεραπείας, γH2AX, BRCA1, BRCA2 και RAD51 εστίες προσδιορίστηκαν σε τουλάχιστον 50 κύτταρα. Η καταμέτρηση των γH2AX, BRCA1, BRCA2 και RAD51 πυρηνική εστίες σε αυτά τα κύτταρα διεξήχθη από δύο ανεξάρτητους παρατηρητές (WWX και JLH).

κηλίδωση Western

PC-3 και LNCaP CaP κύτταρα κατεργάζεται με το ίδιο πρωτόκολλο όπως περιγράφεται στην ανάλυση του κυτταρικού κύκλου (βλέπε παραπάνω). LBH589 επεξεργασία και έλεγχος κύτταρα υποβλήθηκαν σε 2 Gy RT. Αμφότερα τα επιπλέοντα και τα προσκολλημένα κύτταρα συλλέχθηκαν σε συγκεκριμένα χρονικά σημεία (pre-RT, 2, 6, 12, 24, 48 και 72 ώρες μετά από 2 Gy) για κηλίδωση Western, όπως περιγράφεται προηγουμένως [13]. Οι μεμβράνες επωάστηκαν με διαφορετικές πρωτογενή αντισώματα και peroxidise χρένο (HRP) δευτερεύοντα αντισώματα σε συγκεκριμένες συνθήκες (Πίνακας 1). ImageQuant LAS4000 σύστημα (GE υγειονομική περίθαλψη, USA) χρησιμοποιήθηκε για την καταγραφή της εικόνας.

Η στατιστική ανάλυση

Όλα τα πειράματα εκτελέστηκαν τουλάχιστον τρεις φορές (n = 3). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD). Για πειράματα ακτινοβολία, κλάσματα επιβίωση υπολογίστηκαν ως ακολούθως: SF = [μέση ικανότητα επίστρωσης της ακτινοβολίας (± LBH589) κατεργασμένα κύτταρα διαιρούμενη με μέση ικανότητα επίστρωσης του ελέγχου (± LBH589)]% επιβίωση κλάσματα των κυττάρων συνδυασμός επεξεργασμένου διορθώθηκαν για την κυτταροτοξικότητα της LBH589. Καμπύλες επιβίωσης RT είχαν τοποθετηθεί σύμφωνα με τη γραμμική-τετραγωνική μοντέλο χρησιμοποιώντας GraphPad Prism 4.0 λογισμικό (GraphPad, San Diego CA):

Επιβίωση = e

– (αο + βD

2)

Η

Οι ακόλουθες παράμετροι υπολογίστηκαν: τιμή α, β αξία, τιμή α /β, ID90, ID

50, και ID10 (RT δόση που παράγει ένα κλάσμα επιβίωσης του 10%, 50%, και 90%, αντίστοιχα) ? και SF2 (κλάσμα επιβίωσης στα 2 Gy). Η ραδιοευαισθητοποίησης επίδραση της LBH589 εκπροσωπήθηκε από τον παράγοντα ενίσχυσης της δόσης (DEF), υπολογίζεται ως το αναγνωριστικό

50 για RT επεξεργασμένα κύτταρα διαιρούνται με το αναγνωριστικό

50 για τα κύτταρα συνδυασμό αγωγή [14]. Αμφίδρομη ANOVA χρησιμοποιήθηκε για να μελετηθεί η επίδραση της δόσης RT και LBH589 στις παραμέτρους αποτέλεσμα (π.χ., κλάσμα επιβίωσης, διανομή του κυτταρικού κύκλου, γH2AX εστίες αριθμό). Μια δοκιμή t δύο δειγμάτων χρησιμοποιήθηκε για να συγκριθεί η μέση ποσοστό subs G1, G1, S, G2 και /κυττάρων Μ φάση και η μέση γH2AX, BRCA1, BRCA2, RAD51 εστίες αριθμός μεταξύ συγκεκριμένων δύο συνθήκες θεραπείας. Πιθανές σημαντικές διαφορές (

σ

& lt? 0,05) αξιολογήθηκαν με τη χρήση του SPSS v 16.0 λογισμικού (SPSS, Chicago, IL, USA)

Αποτελέσματα

Η επίδραση της LBH589 μόνο. επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού χρησιμοποιώντας κύτταρα ΚΓΠ και φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη

Ο χρόνος και η εξαρτώμενη από την δόση ανασταλτική επίδραση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων βρέθηκε σε δύο κύτταρα CaP (PC-3 και LNCaP) και φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη (RWPE-1) (Σχήμα 1Α). IC

20 τιμή στις 24 ώρες για PC-3, LNCaP και RWPE-1 ήταν 10 mmol /L, 2,5 μmol /L, και 15 mmol /L, αντίστοιχα, υποδεικνύοντας ότι δύο κυτταρικές σειρές CaP είναι πιο ευαίσθητα στην LBH589 από . ο φυσιολογικό προστάτη επιθηλιακή κυτταρική γραμμή

(Α) κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με ένα εύρος συγκεντρώσεων του LBH589 για 24, 48 και 72 ώρες? (Β) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με RT ή συνδυασμό με RT και LBH589 για την ανάλυση της αποδοτικότητας που σχηματίζουν αποικίες. κλάσματα επιβίωσης ήταν σημαντικά μειωμένες σε PC-3 και LNCaP CaP κυττάρων (

ρ

& lt? 0,01), αλλά όχι σε φυσιολογικά REWP-1 κύτταρα (

σ

& gt? 0,05)? (γ) Τυπικές εικόνες που παρουσιάζονται για την ανάπτυξη αποικιών σε RT και θεραπεία συνδυασμού (LBH589 και RT) στην ΚΓΠ και φυσιολογικά κύτταρα του προστάτη. Όλα τα αποτελέσματα ήταν από τρία ανεξάρτητα πειράματα (Ν = 3). Σημεία, σημαίνει? μπαρ, SD.

Η

Το αποτέλεσμα της θεραπείας συνδυασμού για σχηματισμό αποικιών με τη χρήση της ΚΑΠ και τα φυσιολογικά κύτταρα του προστάτη

Το αποτέλεσμα ραδιοευαισθητοποίηση των LBH589 στο PC-3 και LNCaP υποδείχθηκε από σημαντικά μειωμένη επιβίωση κλάσματα (

σ

= 0,0075 για PC-3,

σ

= 0,0074 για LNCaP) και DEF σε αυτές τις δύο κυτταρικές σειρές & gt? 1 (1,77 για PC-3 και 1.29 για LNCaP) ( Σχήμα 1Β-C). Ραδιοευαισθησία δεν αυξήθηκε σημαντικά σε RWPE-1 με LBH589 προεπεξεργασία με DEF 1,18 (

σ

= 0.0823) (Σχήμα 1Β-C). Οι παράμετροι RT για RT μόνο και θεραπεία συνδυασμού σε κάθε κυτταρική σειρά συνοψίζονται στον Πίνακα 2. SF2, ID90, ID

50 και ID10 μειώθηκαν σημαντικά σε όλες PC-3 και LNCaP με LBH589 προεπεξεργασίας (

p

& lt?. 0,05), αλλά κανένα από αυτά δεν αλλάξει σημαντικά για RWPE-1

γραμμή κυττάρων

υποομάδα

α αξία (Gy

-1)

β αξία (Gy

-2 )

α /β αξίας (Gy)

SF2

ID90

ID

50

ID10

DEF (αναλογία ID

50)

PC-3Radiation0.2590.0644.047*0.46*4.31*1.84*0.37*1.77LBH589-radiation0.5420.1194.5550.212.681.040.19LNCaPRadiation0.0280.0750.373*0.70*5.35*2.86*1.01*1.29LBH589-radiation0.0530.1180.4240.564.202.210.75RWPE-1Radiation1.0E-070.0382.6E-060.867.784.271.671.18LBH589-radiation0.0390.0420.9180.786.923.611.18Table 2. ραδιοβιολογικές παραμέτρους για την ακτινοβολία και τη θεραπεία LBH589 ακτινοβολία

Συντομογραφίες:. SF2 = κλάσμα επιβίωσης στα 2 Gy? ID90 = δόση της ακτινοβολίας που παράγουν ένα κλάσμα επιβίωσης του 90%? ID50 = δόση της ακτινοβολίας που παράγουν ένα κλάσμα επιβίωσης του 50%? ID10 = δόση ακτινοβολίας που παράγουν ένα κλάσμα επιβίωσης του 90%? DEF = αυξητικός συντελεστής δόση? *

σ

& lt?. 0,05 έναντι αντίστοιχης κύτταρα επεξεργασμένα LBH589-ακτινοβολία CSV Λήψη CSV

LBH589 μόνη της μπορεί να προκαλέσει απόπτωση και των ιστονών ακετυλίωση σε κύτταρα CaP

χαμηλής δόσης θεραπεία LBH589 (IC

20) για 24 ώρες επαγόμενη διάσπαση του πλήρους μήκους κασπάσης-3 και ακετυλίωση ιστόνης 3 (Η3) και ιστόνη 4 (Η4) και στις δύο PC-3 και LNCaP κύτταρα (Σχήμα S1), γεγονός που υποδηλώνει LBH589 μπορεί να ξεκινήσει απόπτωση μονοπάτι που σχετίζονται με την ακετυλίωση των ιστονών.

Επίδραση της θεραπείας συνδυασμού ή RT μόνον σε κυτταρικό κύκλο

διανομή

Ποσοστό του πληθυσμού subG1 αυξημένη σταθερά και σημαντικά στα κύτταρα συνδυασμού σε σύγκριση με το RT-επεξεργασμένα κύτταρα σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές ΚΓΠ (Σχήμα 2 και τα σχήματα S2-S5), δείχνοντας περισσότερο κυτταρικό θάνατο συμπεριλαμβανομένης απόπτωσης σε κύτταρα συνδυασμό φάρμακο. Κατά την θεραπεία RT μόνον, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προσωρινή καθυστέρηση του κυτταρικού κύκλου /G2 /M σύλληψης μεταξύ 2-24 ώρες, και στη συνέχεια, τελικά ανακτάται μετά από 24 ώρες. Κατά συνέπεια, RT μείωση του πληθυσμού G1 μεταξύ 2-24 ώρες, και το G1 επαναλαμβάνεται μετά από 24 h (Σχήμα 2). Εκτιμώντας ότι, σε συνδυασμένη θεραπεία (LBH589 + RT), ο LBH589 προ-επεξεργασία σε κύτταρα προκάλεσε αρχικά μια Επαυξημένης της G2 /M σύλληψη συνοδεύεται με τη μείωση των G1 και τμημάτων S. Η θεραπεία συνδυασμού προκάλεσε τότε η επακόλουθη και σταδιακή κατάργηση όλων των G1, S και G2 /M πληθυσμών κατεργασμένων κυττάρων με ελάχιστη ανάκτηση (Σχήμα 2).

Το ποσοστό των subs G1, G1, S, G2 και /πληθυσμοί Μ αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής από την προ-RT για 72 h μετά την RT?

ρ

& lt? 0,01 (*): σημαντική διαφορά στο ποσοστό των φάσεων του κυτταρικού κύκλου μεταξύ της ενδεικνυόμενης χρονικό σημείο και το «Pre-RT» χρονικό σημείο σε ομάδες RT?

σ

& lt? 0,01 (

#): σημαντική διαφορά στο ποσοστό της φάσης του κυτταρικού κύκλου μεταξύ της ομάδας RT και στην ομάδα συνδυασμού στο χρονικό σημείο «Pre-RT»?

σ

& lt? 0.01 (

& amp?): Σημαντική διαφορά στο ποσοστό των φάσεων του κυτταρικού κύκλου μεταξύ της ενδεικνυόμενης χρονικό σημείο και το «Pre-RT» χρονικό σημείο σε συνδυασμό ομάδα. Όλα τα αποτελέσματα ήταν από τρία ανεξάρτητα πειράματα (Ν = 3). Σημεία, σημαίνει? μπαρ, SD.

Η

Οι διαφορές στην G2 /M υποπληθυσμό μεταξύ συνδυασμός επεξεργασμένου και RT-αγωγή ομάδες σε κάθε κάλυμμα κυτταρική γραμμή παρατηρήθηκαν επίσης. Κύτταρα που έλαβαν μόνο 2 Gy RT είχαν σημαντικές G2 /M σύλληψης 6 ~ 12 ώρες μετά RT σε δύο γραμμές PC-3 και LNCaP κυττάρων και G2 /M σύλληψη επέμενε στα κύτταρα LNCaP μέχρι 48 ώρες μετά RT. Για τα κύτταρα σε επεξεργασία συνδυασμού, η αρχική θεραπεία LBH589 προκάλεσε σημαντική αύξηση του ποσοστού του πληθυσμού G2 /M πριν από την RT και στις δύο κυτταρικές σειρές καπάκι, και κατήργησε περαιτέρω G2 /M σύλληψης μετά επακόλουθη 2 Gy RT (Σχήμα 2 και τα Σχήματα S2-S5).

Η συνδυασμένη θεραπεία μπορεί να αναστείλει την ενεργοποίηση RT-επαγόμενη σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα CaP

Τα πρότυπα έκφρασης για τα εν λόγω σημείο ελέγχου πρωτεΐνες διέφεραν σε δύο κυτταρικές σειρές καπάκι μετά RT μόνη ή συνδυασμένη θεραπεία με LBH589 και RT είναι φαίνεται στο Σχήμα 3. Όπως p53 είναι αρνητική σε PC-3 κύτταρα, την έκφραση και των δύο p21 και p53 αυξήθηκε μετά από 2 Gy RT ή θεραπεία συνδυασμού σε κύτταρα LNCaP, αλλά είναι πιο ανθεκτικές σε θεραπεία RT μόνον σε σύγκριση με τη θεραπεία συνδυασμού. Τα πρότυπα έκφρασης p21 σε μονές ή συνδυασμό θεραπειών σε PC-3 κύτταρα είναι πολύ παρόμοια με εκείνα σε κύτταρα LNCaP. ρ21 είτε 3-PC ή LNCaP κύτταρα και ρ53 σε κύτταρα LNCaP δεν ήταν ανιχνεύσιμα 24 ώρες μετά τη θεραπεία συνδυασμού επειδή LBH589 προεπεξεργασία οδήγησε σε σταδιακή μείωση της p21 και της έκφρασης p53 (Σχήμα 3). Η έκφραση του ρ-CDK1 παρατηρήθηκε σε RT-επεξεργασμένα κύτταρα πριν από RT και ήταν επίμονος μέχρι 72 ώρες μετά από 2 Gy RT και στα δύο κύτταρα PC-3 και LNCaP? Αντίθετα, η έκφραση της ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω και ακόμα και έγινε μη ανιχνεύσιμο στις ομάδες που έλαβαν συνδυασμό (Σχήμα 3). Η έκφραση του συνολικού-Cdk1 (t-Cdk1) δεν άλλαξε με το χρόνο, και παρέμεινε σε παρόμοιο επίπεδο μετά από εφάπαξ RT και θεραπεία συνδυασμού (Σχήμα 3).

σχετίζονται με τον κύκλο των κυττάρων πρωτεΐνες (ρ21, ρ-ρ53, ρ53, ρ-Cdk1, t-Cdk1, ρ-Chk1, t-Chk1, ρ-Chk2, t-Chk2, ρ-Rb795, ρ-Rb807 /811, τ-Rb) και της βλάβης του DNA και των πρωτεϊνών που σχετίζονται με την επισκευή (γH2AX, Ku70, Ku80, BRCA1, BRCA2 και RAD51) προσδιορίστηκαν με κηλίδωση Western. t: μεταβολές στα ολικά επίπεδα πρωτεΐνης με βλάβη του DNA? p: ενεργοποίηση των πρωτεϊνών σημείου ελέγχου του DNA ή του κυτταρικού κύκλου (φωσφορυλιωμένη μορφή). Τυπικές εικόνες παρουσιάζονται από τρία ανεξάρτητα πειράματα (Ν = 3).

Η

Τα επίπεδα έκφρασης του συνολικού-Chk-1 (t-Chk-1) και το συνολικό-Chk-2 (t-Chk- 2) (δύο σημαντικές οδοφράγματος κινασών στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου) με την βλάβη του DNA αυξάνονταν με τη θέση του χρόνου RT στη μόνη ομάδα RT. Η προσθήκη LBH589 δεν μετέβαλε την ακτινοβολία που προκαλείται από αύξηση του t-Chk-1 και Τ-Chk-2, αλλά κατήργησε την αύξηση σε όλα τα χρονικά σημεία (Σχήμα 3). Η συνδυασμένη αγωγή του LBH589 και RT οδήγησε σε σημαντικά μειωμένη επίπεδο του ενεργοποιημένου Chk-1 και Chk-2 (ρ-Chk-1 και ρ-Chk-2) μετά από 6 ώρες μετά τη θεραπεία RT, σε σύγκριση με την θεραπεία RT μόνον (Σχήμα 3) . Η έκφραση του οδοφράγματος πρωτεϊνών αναμένεται να προστατεύουν τα κύτταρα από την ακτινοβολία. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι LBH589 μπορεί να επηρεάσει τόσο την έκφραση και τη δραστηριότητα των Chk-1 και Chk-2 παρεμβαίνοντας έτσι τη διαχείριση του κύκλου των κυττάρων όταν συνδυάζεται με θεραπεία RT. ρ-Rb795 και ρ-Rb807 /811 πρωτεΐνες είναι σημαντικές σημεία ελέγχου υπεύθυνα για G2 /M σύλληψη των καρκινικών κυττάρων σε RT. Η ενεργοποίηση αυτών των δύο πρωτεϊνών ανιχνεύθηκε σε RT-επεξεργασμένα κύτταρα ενώ καθόλου ή πολύ ασθενή έκφραση αυτών των δύο πρωτεϊνών ανιχνεύθηκαν σε κύτταρα συνδυασμό αγωγή, ενώ δεν υπήρξε καμία προφανής αλλαγή ανιχνεύεται για την έκφραση της συνολικής-Rb (t-Rb) (Σχήμα 3), το οποίο σημαίνει ότι LBH589 προεπεξεργασία ανέστειλε RT-επαγόμενη ενεργοποίηση του π-Rb795 και ρ-Rb807 /811. Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η έκφραση και η ενεργοποίηση αυτών των κυττάρων κύκλου σχετίζονται σημείο ελέγχου πρωτεΐνες μεταβάλλονται σε ομάδες που έλαβαν συνδυασμό, σε σύγκριση με RT ομάδες μόνη αγωγή.

Η συνδυασμένη θεραπεία μπορεί να προκαλέσει επίμονη DNA διάλειμμα διπλό έλικα (DSB ) σε κύτταρα CaP

DNA DSB εξετάστηκε χρησιμοποιώντας γH2AX ως δείκτης με κηλίδωση Western και χρώση φθορισμού. Σε 2 Gy RT-αγωγή CaP κύτταρα, η έκφραση του γH2AX άρχισε να αυξάνεται από 10-15 λεπτά μετά την RT, κορυφώθηκε σε 48 ώρες και 2 ώρες, για PC3 και LNCaP αντίστοιχα, όπως φαίνεται με κηλίδωση Western (Σχήμα 3). Τα αποτελέσματα γH2AX από κηλίδωση Western επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με χρώση ανοσοφθορισμού (Σχήμα 4). Αντίθετα, για τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία συνδυασμού, γH2AX ήταν μέτριας εκφράσεως κατά την προ-RT χρονικό σημείο και ήταν επάνω ρυθμισμένα στην κλίμακα χρόνου στις δύο PC-3 και LNCaP κυττάρων έως 72 ώρες (Εικόνα 3). Αριθμός γH2AX εστιών σε πυρήνες ποσοτικοποιήθηκε όπως φαίνεται στο Σχήμα 4. Θετικά γH2AX εστιών ήταν ακόμη ανιχνεύσιμες 72 ώρες μετά από 2 Gy RT σε PC-3 και LNCaP κύτταρα με θεραπεία συνδυασμού. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το DNA DSB επιμένει μετά την θεραπεία συνδυασμού σε σύγκριση με την RT μόνον.

(Α) Μετά από 2 Gy RT, μέσος αριθμός γH2AX εστιών αυξήθηκε σημαντικά στις 24 ώρες και στις δύο κύτταρα PC-3 και LNCaP και μειώθηκε σε ένα χαμηλότερο επίπεδο σε 72 ώρες, ενώ ο μέσος αριθμός γH2AX εστιών σε κύτταρα συνδυασμό φάρμακο (LBH589 + 2 Gy RT) ήταν σημαντικά υψηλότερη από ότι σε RT-κατεργασμένων κυττάρων σε οποιαδήποτε χρονικά σημεία και συνέχισε να αυξάνει μέχρι 72 ώρες. (Β) Εκπρόσωπος εικόνες της χρώσης γH2AX μετά από 2 Gy RT ή θεραπείας συνδυασμού (LBH589 + 2 Gy RT) στο PC-3 και LNCaP κύτταρα.

ρ

& lt? 0,05 (†) υποδεικνύει σημαντική διαφορά μεταξύ RT-κατεργασμένα κύτταρα και κύτταρα συνδυασμός επεξεργασμένου στο ίδιο χρονικό σημείο.

σ

& lt? 0,05 (*) υποδεικνύει σημαντική διαφορά μεταξύ των κυττάρων σε συγκεκριμένα χρονικά σημεία και τα κύτταρα που έλαβαν την ίδια μεταχείριση στο «Pre-RT» χρονικό σημείο. Σημεία, σημαίνει? μπαρ, SD. Ν = 50. Τυπικές εικόνες παρουσιάζονται από τρία ανεξάρτητα πειράματα (Ν = 3). Μεγέθυνση × 60 σε όλες τις εικόνες.

Η

Η συνδυασμένη θεραπεία μπορεί να μειώσει την ενεργοποίηση των μη-ομόλογο τέλος ενώνει (NHEJ) επισκευής στα κύτταρα CaP

Από επίμονη DNA DSB παρατηρήθηκαν σε συνδυασμός- επεξεργασμένα κύτταρα, δύο πρωτεΐνες μονοπάτι NHEJ (Κυ70 και Κυ80) οι οποίες είναι υπεύθυνες για την επισκευή του RT-επαγόμενης DSB εξετάστηκαν περαιτέρω με κηλίδωση Western σε RT- και τα κύτταρα συνδυασμός επεξεργασία. πρότυπα έκφρασης των Κιι70 και Κυ80 ήταν διαφορετικοί για PC-3 και LNCaP κύτταρα (Σχήμα 3). Στο PC-3 κύτταρα, θετική έκφραση Κιι70 και Κυ80 βρέθηκε 6 ώρες μετά RT και αυξήθηκε σταδιακά μέχρι 72 ώρες μετά την RT ενώ η έκφραση του Κιι70 και Κυ80 ήταν ανιχνεύσιμη μετά από 48 ώρες σε συνδυασμένη θεραπεία (Σχήμα 3). Σε κύτταρα LNCaP, θετική έκφραση του Κιι70 και Κυ80 βρέθηκε σε όλα τα χρονικά σημεία για την RT μόνο και θεραπεία συνδυασμού με LBH589 και RT, αλλά τα επίπεδα έκφρασης των Κιι70 και Κυ80 ήταν πολύ υψηλότερα μετά την RT μόνον σε σύγκριση με τη θεραπεία συνδυασμού σε όλα τα χρονικά σημεία (Εικόνα 3). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν μονοπατιού NHEJ είχε εμπλακεί σε RT σε κύτταρα ΚΓΠ και ότι η προ-θεραπεία με LBH589 μπορεί να μειώσει την ενεργοποίηση του σε σύγκριση με την RT μόνον.

Η συνδυασμένη θεραπεία μπορεί να μειώσει την ενεργοποίηση του ομόλογου ανασυνδυασμού (HR) οδού επιδιόρθωσης σε κύτταρα CaP

BRCA-1, BRCA-2 και Rad-51 είναι οι πρωτεΐνες επιδιόρθωσης DSB στην οδό ΥΕ. Η έκφραση αυτών των πρωτεϊνών ήταν όλο και επάγεται από 2 ώρες μέχρι 72 ώρες μετά από εφάπαξ RT με κηλίδωση Western (Σχήμα 3). Σε σύγκριση με την μόνη ομάδα RT, η έκφραση των πρωτεϊνών BRCA-2 BRCA-1 και στις ομάδες θεραπείας συνδυασμού ακολούθησε την ίδια τάση, αλλά καταργήθηκε μετά από 6 ώρες μετά τη RT και στις δύο κυτταρικές σειρές. Ειδικά, η έκφραση της πρωτεΐνης RAD51 διατηρήθηκε σε ένα χαμηλότερο επίπεδο μέχρι 72 ώρες σε PC-3 κύτταρα και ήταν σημαντικά μειωμένη έως τις 24 h σε κύτταρα LNCaP στις ομάδες συνδυασμού (Σχήμα 3). Τα BRCA-1, BRCA-2 και Rad-51 αποτελέσματα από τη δυτική αποτύπωση επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με χρώση ανοσοφθορισμού (Εικόνες 5-7). Αριθμός των εστιών από τους τρεις δείκτες επισκευή πρωτεΐνη σε πυρήνες ποσοτικοποιήθηκε όπως φαίνεται στα Σχήματα 5-7. Τα αποτελέσματα από την κηλίδα western ήταν σύμφωνα με τα αποτελέσματα χρώσης ανοσοφθορισμού. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι εκτός από την επηρεάζουν ΝΗΕΙ οδό επισκευής, LBH589 μπορεί επίσης να ευαισθητοποιήσει RT μέσω παρεμβολής οδού HR αποδυναμώνοντας έτσι την ικανότητα επιδιόρθωσης DSB των κυττάρων Κεφ.

(Α) Μετά από 2 Gy RT, αριθμητικό μέσο BRCA1 εστιών αυξήθηκε σημαντικά στις 24 ώρες και στις δύο κύτταρα PC-3 και LNCaP και να διατηρείται αυξημένη σε 72 ώρες, ενώ ο μέσος αριθμός BRCA1 εστιών σε κύτταρα συνδυασμό φάρμακο (LBH589 + 2 Gy RT) επίσης αυξήθηκε σε 24 και 72 ώρες, αλλά ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ό, τι ότι σε RT-επεξεργασμένα κύτταρα. (Β) Εκπρόσωπος εικόνες της χρώσης BRCA1 μετά από 2 Gy RT ή θεραπεία συνδυασμού (LBH589 + 2 Gy RT) στο PC-3 και LNCaP κύτταρα.

ρ

& lt? 0,05 (†) υποδεικνύει σημαντική διαφορά μεταξύ RT-κατεργασμένα κύτταρα και κύτταρα συνδυασμός επεξεργασμένου στο ίδιο χρονικό σημείο.

σ

& lt? 0,05 (*) υποδεικνύει σημαντική διαφορά μεταξύ των κυττάρων σε συγκεκριμένα χρονικά σημεία και τα κύτταρα που έλαβαν την ίδια μεταχείριση στο «Pre-RT» χρονικό σημείο. Σημεία, σημαίνει? μπαρ, SD. Ν = 50. Τυπικές εικόνες παρουσιάζονται από τρία ανεξάρτητα πειράματα (Ν = 3). Μεγέθυνση × 60 σε όλες τις εικόνες.

Η

(Α) Μετά από 2 Gy RT, ο μέσος αριθμός BRCA2 εστιών αυξήθηκε σημαντικά σε 24 ώρες και στα δύο κύτταρα PC-3 και LNCaP και διατηρείται αυξημένη σε 72 ώρες, ενώ η μέση BRCA1 αριθμός εστιών σε κύτταρα συνδυασμό φάρμακο (LBH589 + 2 Gy RT) επίσης αυξήθηκε σε 24 και 72 ώρες, αλλά ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ότι στην RT-επεξεργασμένα κύτταρα. (Β) Εκπρόσωπος εικόνες της χρώσης BRCA2 μετά από 2 Gy RT ή θεραπεία συνδυασμού (LBH589 + 2 Gy RT) στο PC-3 και LNCaP κύτταρα.

ρ

& lt? 0,05 (†) υποδεικνύει σημαντική διαφορά μεταξύ RT-κατεργασμένα κύτταρα και κύτταρα συνδυασμός επεξεργασμένου στο ίδιο χρονικό σημείο.

σ

& lt? 0,05 (*) υποδεικνύει σημαντική διαφορά μεταξύ των κυττάρων σε συγκεκριμένα χρονικά σημεία και τα κύτταρα που έλαβαν την ίδια μεταχείριση στο «Pre-RT» χρονικό σημείο. Σημεία, σημαίνει? μπαρ, SD. Ν = 50. Τυπικές εικόνες παρουσιάζονται από τρία ανεξάρτητα πειράματα (Ν = 3). Μεγέθυνση χ 60 σε όλες τις εικόνες.

Η

(Α) Μετά από 2 Gy RT, μέσος αριθμός RAD51 εστιών αυξήθηκε σημαντικά κατά 24 και 72 ώρες σε δύο κύτταρα PC-3 και LNCaP, ενώ ο αριθμός μέσος BRCA1 εστιών σε κύτταρα συνδυασμός φάρμακο (LBH589 + 2 Gy RT) επίσης αυξήθηκε σε 24 και 72 ώρες, αλλά ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ότι στην RT-επεξεργασμένα κύτταρα. (Β) Εκπρόσωπος εικόνες της χρώσης RAD51 μετά από 2 Gy RT ή θεραπεία συνδυασμού (LBH589 + 2 Gy RT) στο PC-3 και LNCaP κύτταρα.

ρ

& lt? 0,05 (†) υποδεικνύει σημαντική διαφορά μεταξύ RT-κατεργασμένα κύτταρα και κύτταρα συνδυασμός επεξεργασμένου στο ίδιο χρονικό σημείο.

σ

& lt? 0,05 (*) υποδεικνύει σημαντική διαφορά μεταξύ των κυττάρων σε συγκεκριμένα χρονικά σημεία και τα κύτταρα που έλαβαν την ίδια μεταχείριση στο «Pre-RT» χρονικό σημείο. Σημεία, σημαίνει? μπαρ, SD. Ν = 50. Τυπικές εικόνες παρουσιάζονται από τρία ανεξάρτητα πειράματα (Ν = 3). Μεγέθυνση × 60 σε όλες τις εικόνες.

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, αποδείξαμε ότι LBH589 ανέστειλε την ανάπτυξη των PC-3, τα κύτταρα LNCaP ΚΓΠ και RWPE-1 φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη σε μία δόση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο, το οποίο είναι παρόμοιο με προηγουμένως αναφερθεί τοξικότητες των άλλων υδροξαμικά [15]. Η κανονική προστατική επιθηλιακή κυτταρική γραμμή RWPE-1 ήταν η πιο ανθεκτική σε LBH589 ενώ LNCaP ήταν η πιο ευαίσθητη από τις τρεις κυτταρικές γραμμές, γεγονός που υποδηλώνει κύτταρα CaP είναι σχετικά ευαίσθητα σε LBH589.

Έχει αναγνωρισθεί ότι α /β τιμή είναι σημαντικά χαμηλότερη σε CaP από τις περισσότερες άλλες μορφές καρκίνου. Οι τιμές α /β της PC-3 και LNCaP κύτταρα στην παρούσα μελέτη είναι σύμφωνη με προηγούμενες εκθέσεις, οι οποίες είναι μεταξύ 0,5 και 4 Gy [16]. Όταν τα κύτταρα έλαβαν θεραπεία συνδυασμού (LBH589 και RT), οι τιμές α /β από PC-3 και LNCaP κύτταρα αυξήθηκε σε 4,555 και 0,424 Gy, αντίστοιχα. DEF ήταν 1,77 για PC-3 και 1.29 για LNCaP. Η τιμή α /β του RWPE-1 κανονικό προστάτη κυτταρική γραμμή ήταν 0,243 και 0,257 Gy μετά RT μόνα ή σε συνδυασμό θεραπεία, η οποία είναι αντίστοιχα χαμηλότερη από τις δύο κυτταρικές σειρές καπάκι. DEF ήταν 1,18 η οποία είναι μικρότερη από ότι σε κυτταρικές σειρές LNCaP PC-3 και. Τα αποτελέσματα αυτά χρήζουν περαιτέρω

in vivo

μελέτη και κλινικές δοκιμές.

Στην παρούσα μελέτη, τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι ακόμα και χαμηλή δόση LBH589 (IC

20) για 24 ώρες θεραπείας θα μπορούσε να προκαλέσει απόπτωση σε κύτταρα CaP (Σχήμα S1) και το ποσοστό των κυττάρων του πληθυσμού subG1 σε συνδυασμό θεραπεία του LBH589 και RT αυξάνεται σταδιακά, ενώ ήταν σταθερά αρκετά χαμηλή στα RT επεξεργασμένα κύτταρα, πράγμα που σημαίνει ότι η θεραπεία συνδυασμού μπορεί να προκαλέσει περισσότερο κυτταρικό θάνατο.

η ανάλυση κυτταρικού κύκλου επιβεβαίωσε περαιτέρω ότι περισσότερο PC-3 και LNCaP κύτταρα αποκλείστηκε σε G2 /M φάση, μετά από 24 ώρες θεραπείας LBH589 και το ποσοστό των κυττάρων στη φάση G1 μειώθηκαν σημαντικά. Επιπλέον, η θεραπεία με LBH589 για 24 ώρες μείωσε την περιεκτικότητα φάσης S των κυττάρων LNCaP σε χαμηλότερο επίπεδο. Σε όλες τις φάσεις του κυτταρικού κύκλου, G2 Μ κύτταρα /φάση είναι τα πιο ευαίσθητα στην ακτινοβολία και τα κύτταρα φάσης S είναι το πιο ανθεκτικό [17]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η αναστολή του κυτταρικού κύκλου στην G2 /M και μείωση του ποσοστού της S φάσης μπορεί να είναι υπεύθυνα για το φαινόμενο ραδιοευαισθητοποίηση LBH589.