Αφηρημένο

Ιστορικό

Η αντοχή στα φάρμακα, μια διαδικασία που προκαλείται από πολλαπλούς μηχανισμούς, είναι ένας κρίσιμος προσδιοριστής για τη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα. Ο στόχος αυτής της μελέτης είναι να προσδιοριστεί εάν ολεανολικό οξύ (ΟΑ), πεντακυκλικόν τριτερπενίου παρόν σε αρκετά φυτά, είναι σε θέση να παρακάμψουν τους μηχανισμούς αντίστασης φαρμάκου που υπάρχει σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) κυτταρικές σειρές και να επάγουν τον θάνατο τους .

Κύρια Ευρήματα

ΟΑ μείωσε την κυτταρική βιωσιμότητα του NSCLC κυτταρικές σειρές Α459 και Η460 παρά την παρουσία των ενεργών, πολυανθεκτική πρωτεΐνες MRP1 /ABCC1 (MDR) και των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2 και survivin. Αυτά τα αποτελέσματα οφείλονται σε απόπτωση, όπως αποδεικνύεται από την ικανότητα του ΟΑ να επάγει κατάτμηση του DNA και ενεργοποιούν κασπάση 3. Διέγερση κυτταρικού θανάτου NSCLC η ΟΑ δεν μπορεί να εξηγηθεί από την αναστολή των πρωτεϊνών MDR, δεδομένου ότι η επεξεργασία με τριτερπενίου είχαν μικρή ή καθόλου επίδραση σχετικά με τη δραστηριότητα ή την έκφραση της MRP1. Επιπλέον, η θεραπεία με ΟΑ δεν είχε καμία επίδραση στην έκφραση του αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη Bcl-2, αλλά αύξησε την έκφραση της προ-αποπτωτική πρωτεΐνη Bax, τροποποίηση του Bcl-2 /Bax ισορροπία προς μια προ-αποπτωτική προφίλ. ΟΑ μείωσε επίσης την έκφραση του αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη survivin. Επιπλέον, η ΟΑ μείωσε την έκφραση του αγγειογόνου αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) και μείωσε την ανάπτυξη του μελανώματος που προκαλείται μετάσταση του πνεύμονα.

Συμπέρασμα

Τα δεδομένα μας παρέχει μια σημαντική εικόνα της αντικαρκινική και αντιμεταστατική δραστηριότητα της ΟΑ στον NSCLC και δείχνουν ότι η συμπερίληψη της ΟΑ στα σχήματα NSCLC μπορεί να βοηθήσει να μειώσει τον αριθμό των υποτροπών και μείωση της ανάπτυξης των μεταστάσεων

Παράθεση:. Lúcio KA, Rocha GDG, Monção-Ribeiro LC, Fernandes J, Takiya CM, Gattass CR (2011) ολεανολικού οξέος Μύστες απόπτωση σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα Γραμμές κυττάρων και μειώνει την μετάσταση ενός Β16Ρ10 μελάνωμα Μοντέλο

In Vivo

. PLoS ONE 6 (12): e28596. doi: 10.1371 /journal.pone.0028596

Επιμέλεια: Ιωσήφ Alan Bauer, Ίδρυμα Bauer Έρευνας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 3η Ιανουαρίου του 2011? Αποδεκτές: 11 Νοέμβρη 2011? Δημοσιεύθηκε: 9 Δεκεμβρίου 2011

Copyright: © 2011 Lúcio et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP /FNDCT /NQTN Μετατρ. 01.06.0390.00), Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo ένα Pesquisa μην Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ, χορηγεί αριθμό ε-26 /110.135 /2009) , Instituto Nacional para Pesquisa Translacional em Saúde e Ambiente na Região Amazonica (INCT-INPeTAm /CNPq /MCT Μετατρ. # 57.3695 /2008-3) και Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior (κάπες, PhD υποτροφία για να KAL). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Παγκοσμίως, ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η πιο συχνή αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται [1]. Μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC) αντιπροσωπεύει πάνω από το 80% όλων των καρκίνων του πνεύμονα διαγιγνώσκονται. Η υψηλή θνησιμότητα της ασθένειας αυτής οφείλεται στις δυσκολίες της έγκαιρης ανίχνευσης. Κατά τη στιγμή της διάγνωσης, οι περισσότεροι ασθενείς έχουν μια μη χειρουργήσιμο, προχωρημένη νόσο που περιλαμβάνει λεμφαδένες ή σπλαχνικού μετάσταση, ή και τα δύο. Με βάση την πλατίνα χημειοθεραπεία, μία από τις κύριες θεραπείες για NSCLC κατά τις τελευταίες δεκαετίες, παρουσίασαν αρκετά προβλήματα: πέραν του ότι είναι πολύ τοξικά, τέτοια χημειοθεραπεία παρήγαγε μόνο μια μέτρια βελτίωση στη συνολική επιβίωση [2]. Ακόμη και μετά την ανάπτυξη φαρμάκων που στοχεύουν στην ανάπτυξη ενός όγκου, το συνολικό ποσοστό επιβίωσης των ασθενών με NSCLC παρέμεινε σε χαμηλά επίπεδα [3]. Η χημειοθεραπευτική αποτυχία στον καρκίνο του πνεύμονα μπορεί να συνεισφέρει στην μετάσταση και την υψηλή νοσηρότητα, υποδεικνύοντας ότι οι αποτελεσματικές θεραπείες χρειάζονται.

αντίσταση σε πολλαπλά φάρμακα (MDR) διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην αποτυχία της χημειοθεραπείας του καρκίνου του πνεύμονα. Παρά το γεγονός ότι διάφοροι μηχανισμοί μπορούν να μεσολαβήσουν MDR, οι ερευνητές έχουν αφιερώσει ένα μεγάλο μέρος της προσοχής στην υπερέκφραση των πρωτεϊνών μεταφορέων της 5′-τριφωσφορική αδενοσίνη (ΑΤΡ) που δεσμεύουν κασέτας (ABC) οικογένεια και σε μεταβολές των παραγόντων που εμπλέκονται στην αποπτωτική διαδικασία. Η έκφραση των πρωτεϊνών MDR θεωρείται η κύρια αιτία της υποτροπής του ασθενούς μετά τη θεραπεία? στοιχεία από τη βιβλιογραφία [4], [5] έχουν περιγράψει μια σχέση μεταξύ της έκφρασης των πρωτεϊνών ABC και την κακή έκβαση των ασθενών που έλαβαν θεραπεία με NSCLC χημειοθεραπεία. πρωτεΐνες MDR, όπως P-γλυκοπρωτεΐνης (P-gp) /ABCB1 και πολλαπλών ναρκωτικών Ανθεκτική πρωτεΐνη 1 (MRP 1) εργασία ως αντλίες εκροής που είναι ικανά να εξαλείψουν μια ποικιλία φαρμάκων από το κύτταρο, εμποδίζοντας έτσι τον κυτταρικό θάνατο [6]. Μεταβολές των μηχανισμών που εξασθενούν προ-αποπτωτικών οδών και /ή ενισχύουν αντι-αποπτωτικών οδών είναι επίσης σημαντικοί παράγοντες για την ανάπτυξη των χημειοθεραπευτικών αντοχής σε όγκους [7], [8]. Αρκετές μελέτες έδειξαν ότι η αναστολή των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών της Β-κυττάρου λέμφωμα 2 (Bcl-2) [9], [10] ή αναστολέας της απόπτωσης (ΙΑΡ) οικογένειες [11], [12] ευαισθητοποιεί κύτταρα NSCLC στη χημειοθεραπεία.

Ένα άλλο χαρακτηριστικό των κακοήθων καρκινικών κυττάρων είναι η ικανότητά τους να καθιερώσουν μετάσταση. Από μεταστατική νόσο, παρά την τοπική ανάπτυξη του όγκου, καθορίζει την θνησιμότητα των ασθενών, η στόχευση μετάσταση όγκου έχει την υψηλότερη προτεραιότητα στη θεραπεία του καρκίνου. Ένα ουσιαστικό σώμα των στοιχείων προέκυψε γεγονός που υποδηλώνει ότι ο άξονας μεταξύ του υποδοχέα του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) και τον υποδοχέα ένθετου τομέα Flk-1 κινάσης (ΚΟΚ) (VEGF-Flk-1 /KDR) είναι το κυρίαρχο οδού μεταγωγής σήματος που ρυθμίζουν όγκου αγγειογένεση και μετάσταση [13]. Ωστόσο, επειδή η κύρια απαίτηση για την ανάπτυξη μετάστασης είναι η παρουσία ζωντανών κυττάρων όγκου, οι μηχανισμοί που εμπλέκονται στην ανθεκτικότητα του φαρμάκου, όπως έκφραση των πρωτεϊνών MDR και αντι-αποπτωτικών παραγόντων, έχουν προταθεί ως ευνοϊκές συνθήκες για την ανάπτυξη της μετάστασης [14], [15].

Πολλές ενώσεις φυσικής προέλευσης είναι σε θέση να διαμορφώνουν αντοχής φαρμάκου. Ολεανολικού οξέος (ΟΑ), μία πεντακυκλική τριτερπενοειδείς βρεθεί σε μια ποικιλία φυτικών ειδών, παρουσιάζει αρκετές βιολογικές ιδιότητες, συμπεριλαμβανομένης της αντι-φλεγμονώδη [16], [17], ηπατοτοξικότητα και nefrotoxicity προστασίας [18], [19], η ανάκτηση του αιμοποιητικού συστήματος μετά την ακτινοβόληση [20] και κυτταροτοξικότητα έναντι διαφόρων κυτταρικών γραμμών καρκίνου [21], [22], [23]. Σε μια προηγούμενη μελέτη, δείξαμε ότι η ΟΑ είναι επίσης αποτελεσματικό κατά ερυθρολευχαιμική MDR κύτταρα που υπερεκφράζουν P-gp και ευαίσθητο ομόλογό του [24]. Η παρούσα μελέτη διεξήχθη για να εξετάσει τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα της ΟΑ για NSCLC κύτταρα (Α549 και Η460) που εκφράζεται τόσο MRP1 [25], [26] και συντελεστές αντι-αποπτωτική [7], [8], και να διερευνηθούν οι επιδράσεις του αυτό τριτερπενίου επί οδών που εμπλέκονται στην αντοχή φαρμάκου και την ανάπτυξη της μετάστασης.

ΟΑ επαγόμενη απόπτωση σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. Η θεραπεία με αυτό το τριτερπενίου μείωσε την έκφραση της survivin και αύξησε την έκφραση του Bax, χωρίς να επηρεάζει την έκφραση του Bcl-2 ή MRP1. Επιπλέον, η ΟΑ μείωσε την έκφραση του VEGF και ανέστειλε την ανάπτυξη του μελανώματος που προκαλείται μετάσταση πνεύμονα. Μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η ΟΑ μπορεί να είναι ένας καλός υποψήφιος για την θεραπεία όγκων με εγγενή έκφραση των μηχανισμών αντίστασης, όπως οι όγκοι του πνεύμονα.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

ολεανολικού οξέος (ΟΑ), μοριακό βάρος 456,7, που παρέχεται από την Sigma Chemical Co. (Saint Louis, ΜΟ, USA), διαλύθηκε σε 10 mM διμεθυλοσουλφοξειδίου (DMSO), φυλαγμένο στους -20 ° C και αραιώνεται σε μέσο καλλιέργειας για χρήση. DMSO, 3- (4,5 dimethylthiozol-2-υλ) -2,5-διφαινυλ-τετραζολίου (ΜΤΤ), ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) και ροδαμίνη 123 (rho123) αγοράστηκαν από τη Sigma. 5-carboxifluorescein διοξεικό (5-CFDA) λήφθηκε από την Calbiochem (San Diego, CA, USA). Dulbecco τροποποιημένο μέσο Eagle (DMEM), ορό εμβρύου μόσχου (FCS), πενικιλίνη και στρεπτομυκίνη ήταν από την Life Technologies, Inc. (USA). FACS διάλυμα λύσης ήταν από την BD Biosciences (San Jose, CA). Κασπασών-3 κιτ δοκιμασίας (CaspGlow) ήταν από Biovision (Mountain View, CA, USA). Αντισώματα έναντι Βαχ (κλώνος Ρ-19), VEGF (κλώνος C-1) και της τουμπουλίνης (κλώνος Β-7) αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). αντίσωμα Bcl-2 (κλώνος 124) ήταν από ϋΑΚΟ (Carpinteria, CA, USA) και το αντίσωμα survivin (ab24479) αγοράστηκε από την Abcam (Cambridge, ΜΑ, USA). Βιοτινυλιωμένο αντι-ποντικού IgG και CY3 στρεπταβιδίνη σημασμένη ήταν από την Sigma. Βιοτινυλιωμένο IgG αντι-κατσίκας, αντι-κουνελιού IgG και μέσο στερέωσης Vectashield® αγοράστηκαν από Vector Laboratories (Burlingame, CA, USA). 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ) και ΡΕ-επισημασμένο αντι-MRP1 (QCRL-2) ήταν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Αντι-MRP1 (κλώνος Α23, Axxora, San Diego, CA), Bcl-2 (κλώνος bcl2-100, Zymed, San Francisco, CA), αντι-ποντικού HPR (Amersham, Arlington, IL) και HPR αντι-κουνελιού (GE Healthcare, Piscataway, NJ) χρησιμοποιήθηκαν για την κηλίδα western.

Cells και συνθήκες καλλιέργειας

το ανθρώπινο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικών σειρών Α549 και Η460 και η γραμμή μελανώματος μυοειδούς Β16Ρ10 αναπτύχθηκαν σε μέσο Dulbecco τροποποιημένο Eagle (ϋΜΕΜ), συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο ορό εμβρύου μόσχου (FCS), 100 U πενικιλλίνη και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη σε πλαστικές φιάλες μιας χρήσης στους 37 ° C με 5% CO

2. Τα κύτταρα υπο-καλλιεργήθηκαν χρησιμοποιώντας θρυψίνη-EDTA κάθε 3-4 ημέρες.

Κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

Κυτταρική βιωσιμότητα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ. Εν συντομία, 180 μι του καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικό εναιώρημα (10

4 /κύτταρα ανά φρεάτιο) διανεμήθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και επωάστηκαν για 24 ώρες στους 37 ° C /5% CO

2 για να επιτραπεί η καλλιέργεια να σταθεροποιώ. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με 20 μι μέσου, διάφορες συγκεντρώσεις ΟΑ (10, 25, 40 ή 50 μg /mL ή 21.9, 54.7, 87.6 ή 109.5 μΜ, αντίστοιχα)? Οι συγκεντρώσεις DMSO για κάθε δόση χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Μετά από 48 ώρες επώαση, η καλλιέργεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 20 μι ΜΤΤ (5 mg /mL) και διατηρήθηκε για 4 ώρες στους 37 ° C στο σκοτάδι πριν από την φυγοκέντρηση και το υπερκείμενο απορρίφθηκε. Η φορμαζάνης που παράγεται από την αναγωγή του ΜΤΤ από βιώσιμα κύτταρα διαλύθηκε σε DMSO και η οπτική πυκνότητα μετρήθηκε σε αναγνώστη ELISA (BenchMark, Bio-Rad, CA) στα 570 nm (φίλτρο αναφοράς 630 nm). Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως η μέση τιμή ± SD της επί τοις εκατό αναστολή της κυτταρικής βιωσιμότητας. Για να ελέγξει αν οι υψηλές συγκεντρώσεις ΟΑ θα παρεμβαίνει με αναγνώσεις ΜΤΤ, ΟΑ επωάστηκαν με ΜΤΤ υπό τις ίδιες συνθήκες που χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό της βιωσιμότητας των κυττάρων. Δεν παρατηρήθηκε παρεμβολή.

κατακερματισμού του DNA δοκιμασία

Η απόπτωση εκτιμήθηκε με ανάλυση κυτταρικού κύκλου χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Μετά από 24 ώρες ηρεμίας, τα επιμεταλλωμένα πνευμονικά κύτταρα (2 χ 10

4 /φρεάτιο) υποβλήθηκαν σε αγωγή με μέσο ή διάφορες συγκεντρώσεις ΟΑ (10, 25, και 50 μg /ml) και επωάστηκαν για άλλες 48 ώρες. Μετά το διάστημα αυτό, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, επαναιωρήθηκαν σε ένα υποτονικό διάλυμα φθορισμού (50 μg /mL ΡΙ και 0,1% Triton Χ-100 σε 0.1% ρυθμιστικό κιτρικό νάτριο) για 1 ώρα, στους 4 ° C στο σκοτάδι. Το κυτταρικό κύκλο αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής (FL-2) (FACSCalibur, Becton Dickinson, San Jose, CA) για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε DNA υπο-G0 /G1. Υπο-διπλοειδή πληθυσμούς θεωρήθηκαν αποπτωτικά. απόκτηση και ανάλυση δεδομένων που ελέγχονται από Cellquest λογισμικό, έκδοση 3.1στ. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές. Τα αποτελέσματα παρουσιάστηκαν ως αντιπροσωπευτικά ιστογράμματα και ως μέση τιμή ± SD από το ποσοστό του DNA που ήταν κατακερματισμένη.

Η ενεργοποίηση της κασπάσης δοκιμασία

Caspase-3 ενεργοποίησης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα εμπορικό κιτ, σύμφωνα με την τις οδηγίες του κατασκευαστή (Biovision, Mountain View, CA). Εν συντομία, τα κύτταρα επιστρώθηκαν όπως περιγράφεται στο

προσδιορισμό κυτταρικής βιωσιμότητας (Μ & amp? Μ) επωάστηκαν για 48 ώρες με μέσο (έλεγχος) ή διάφορες συγκεντρώσεις του ΟΑ (10, 25 ή 50 μg /mL) προτού η συγκομιδή , φυγοκεντρούνται και αιωρούνται σε διάλυμα δοκιμασίας κασπάσης-3. Αυτό το διάλυμα δοκιμασίας περιέχει έναν ισχυρό αναστολέα κασπάσης συζευγμένο με FITC που είναι κύτταρο διαπερατό, μη τοξικό και, μη αναστρέψιμα με ενεργοποιημένη κασπάση. Μετά από 1 ώρα επώασης (37 ° C, 5% CO

2), τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με ρυθμιστικό διάλυμα έκπλυσης και το ποσοστό της κασπάσης-3-ενεργοποιημένα κύτταρα αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής (FL-1). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως ιστογράμματα αντιπροσωπευτικά τριών διαφορετικών πειραμάτων.

δράση των πρωτεϊνών MDR

Η δραστικότητα των πρωτεϊνών MDR προσδιορίστηκε από τη συσσώρευση ειδικών υποστρωμάτων. Rho123 και διοξική 5-καρβοξυφλουορεσκεΐνη (CFDA), ένα μη φθορίζον μόριο που μετατρέπεται στο φθορίζον καρβοξυ-φλουορεσκεΐνη (CF) από ενδοκυτταρικές εστεράσες, χρησιμοποιήθηκαν για να μετρηθεί η δραστικότητα της Ρ-gp /ABCB1 και MRP1 /ABCC1, αντίστοιχα [ ,,,0],27], [28].

για κάθε πείραμα, τα κύτταρα (1 χ 10

5 /φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων και προ-επωάστηκαν για 24 ώρες στους 37 ° C /5% CO

2 για να επιτραπεί η καλλιέργεια να σταθεροποιηθεί. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 30 λεπτά με μέσο (αυτοφθορισμό)? 400 ηΜ rho123 ή 5 μΜ CFDA παρουσία μέσου, οι αναστολείς της Ρ-gp (25 μΜ βεραπαμίλη) ή MRP1 (50 μΜ ΜΚ-571)? ή τις επιθυμητές συγκεντρώσεις της ΟΑ. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν σε PBS, συλλέχθηκαν και διατηρήθηκαν σε πάγο μέχρι ανάλυση κυτταρομετρίας ροής (FACSCalibur, Beckton-Dickinson κυτταρόμετρο). Τα αποτελέσματα παρουσιάστηκαν ως αντιπροσωπευτικά ιστογράμματα ή ως η μέση τιμή ± SD από αυθαίρετες μονάδες μέσης έντασης φθορισμού (MIF).

Η έκφραση των πρωτεϊνών MDR

έκφραση MRP1 αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής και στύπωμα western. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν και υποβλήθηκε σε επεξεργασία για 24 ώρες με μέσο ή ΟΑ (είτε 25 ή 50 μg /mL). Για την κυτταρομετρία ροής, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, κατέστησαν διαπερατά με FACS διαλύματος λύσεως και επωάζονται με ΡΕ-επισημασμένο αντι-MRP1 (κλώνος QCRL-2) για 30 λεπτά στους 4 ° C. Μετά από δύο πλύσεις PBS, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε διάλυμα FACS και ο φθορισμός αξιολογούνται. Τα αποτελέσματα παρουσιάστηκαν ως αντιπροσωπευτικά ιστογράμματα. Για στύπωμα western, εκχυλίσματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν με αραίωση των σφαιριδίων κυττάρου άμεσα σε RIPA (50 mM Tris-HCl, ρΗ 8.0, 150 mM NaCl, 0.5% δεοξυχολικό νάτριο, 0.1% SDS και 1% Kit αναστολέα πρωτεάσης (Amersham, Arlington , IL). Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PDF) μεμβράνες. στυπώματα αποκλείστηκαν για 2 ώρες σε PBS /0.05% Tween που περιέχει 5% άπαχο ξηρό γάλα, ανιχνεύθηκαν με ειδικά αντισώματα προς MRP1 ( κλώνος Α23, 1:1000) ή τουμπουλίνης (κλώνος β-7, 1:500) όλη τη νύχτα και επωάστηκαν με HPR-συζευγμένο δευτερογενή αντισώματα (1:2000 αραίωση?. Amersham Biosciences, UK) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου κηλίδες αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας το ενισχυμένο σύστημα χημειοφωταύγειας (ECL, Amersham, Arlington, IL) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. ένταση Band ποσοστώθηκε χρησιμοποιώντας την έκφραση Λογισμικό Image και πρωτεΐνη Scion κανονικοποιήθηκε σε σχέση με την α-τουμπουλίνης.

δοκιμασίες ανοσοκυτταροχημεία

Α459 κύτταρα (3 χ 10

4 /φρεάτιο) σπάρθηκαν σε καλυπτρίδες σε πλάκες 24 φρεατίων, αφήνεται να ξεκουραστεί για 24 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με μέσο ή 50 μg /mL ΟΑ. Μετά από 24 ώρες επώασης, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με φωσφορικό αλατούχο ρυθμιστικό διάλυμα (PBS), ρΗ 7,4, και στερεώθηκαν με ένα ρυθμισμένο διάλυμα παραφορμαλδεΰδης 4% που περιέχει 4% σακχαρόζη για 40 λεπτά στους 4 ° C. Μετά από τρεις πλύσεις σε PBS, οι καλυπτρίδες επωάστηκαν για 30 λεπτά σε 50 mM ΝΗ

διάλυμα 4Cl, ρΗ 8,0, και στη συνέχεια πλύθηκαν και πάλι σε PBS (3Χ). Η μη ειδική πρόσδεση των ανοσοσφαιρινών αποκλείστηκε για 60 λεπτά με ένα διάλυμα PBS που περιέχει 5% BSA, 0.1% Triton Χ-100, 0,05% Tween 20 και 0,01% ζελατίνη. Το επόμενο βήμα ήταν να αναστέλλει την ενδογενή βιοτίνη χρησιμοποιώντας ένα κιτ αποκλεισμού βιοτίνης (Vector Lab.), Σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Μετά από αυτό, τα κύτταρα επωάστηκαν με αραίωση 1:50 ενός μονοκλωνικού αντισώματος ποντικού αντι-ΒοΙ -2 αντίσωμα, 2 μg αντι-Βαχ αντισώματος /mL κουνελιού πολυκλωνικό, 2 γκου /mL μονοκλωνικού αντισώματος αντι-νΕΟΡ ή 5 μg /mL survivin αντίσωμα, όλα αραιωμένα σε PBS που περιείχε 3% BSA και 0,05% Tween και διατηρήθηκε όλη τη νύχτα στους 4 ° C σε υγρό θάλαμο. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν σε PBS που περιέχει 0,25% Tween 20 και επωάστηκαν για 1 ώρα με 10 μg /mL του δευτερογενούς αντισώματος που επιλέγεται για την εν λόγω δοκιμή: βιοτινυλιωμένη IgG αντι-κατσίκας, αντι-κουνελιού IgG ή αντι-ποντικού IgG. Μετά από αυτό το στάδιο, οι καλυπτρίδες πλύθηκαν (3 φορές) με PBS /0.25% Tween και επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με 10 μg /mL στρεπταβιδίνη συζευγμένη σε Cy3. Στη συνέχεια, οι καλυπτρίδες πλύθηκαν και στη συνέχεια χρωματίζονται με 0,5 μg /mL DAPI για 5 λεπτά. Μετά από δύο επιπλέον πλύσεις, το ένα με PBS και μία σε απεσταγμένο νερό, οι καλυπτρίδες στερεώθηκαν με μέσο στερέωσης Vectashield® και παρατηρήθηκαν με μικροσκοπία επι-φθορισμού (Eclipse Ε-800, Nikon, Ιαπωνία). Οι DAPI-βάφονται καλυπτρίδες υποβλήθηκαν σε επιθεώρηση για να αποκλειστεί η πιθανότητα μόλυνσης από Mycoplasma.

Η ποσοτική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ανάλυσης εικόνας (Image-Pro® Plus 4.5, Media Cybernetics, Inc, Silver Spring, MD, ΗΠΑ) που αποτελείται από μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή (Εξέλιξη, Media Cybernetics, Inc, Silver Spring, MD, USA) συζευγμένο με ένα μικροσκόπιο φθορισμού. Υψηλής ποιότητας εικόνες των κυττάρων συλλήφθηκαν (2048 × 1536 pixels ρυθμιστικό), χρησιμοποιώντας το 40 × αντικειμενικό φακό. Τουλάχιστον είκοσι πεδία ανά καλυπτρίδα μετρήθηκαν και το ποσοστό των ανοσοαντιδραστικών κυττάρων υπολογίστηκε από τις θετικά κύτταρα DAPI.

Η έκφραση Bax, Bcl-2, VEGF και survivin αξιολογήθηκαν επίσης με western blot χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα . Plated κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μέσο ή 50 mg /mL ΟΑ για 24 ώρες και τα εκχυλίσματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται στο

Η έκφραση των πρωτεϊνών MDR

(Μ & amp? Μ). Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PDF και ανιχνεύθηκαν με ειδικά αντισώματα για Βαχ (κλώνος Ρ-19, 1:1000), Bcl-2 (κλώνος Bcl2-100, 1:500), VEGF (κλώνος C1, 1 :100), survivin (κλώνος ab469, 1: 1000) ή τουμπουλίνης (κλώνος β-7, 1:500). Οι κηλίδες αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας το ενισχυμένο σύστημα χημειοφωταύγειας (ECL, Amersham, Arlington, IL) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. ένταση Band ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας την έκφραση Λογισμικό Image και πρωτεΐνη Scion κανονικοποιήθηκε σε σχέση με την α-τουμπουλίνης.

Ανάπτυξη με μετάσταση στους πνεύμονες που προκαλείται από B16F10 κύτταρα μελανώματος

Όλες οι πειραματικές διαδικασίες ζώο διεξήχθησαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές της Επιτροπής Δεοντολογίας για την Αξιολόγηση των ζώων Χρήση σε πειραματισμός από την IBCCF /CCS /UFRJ (CAUAP-IBCCF) και εγκρίθηκε με την ονομασία, το Project # 1005.

την ημέρα 0, αρσενικοί C57BL /6 ποντίκια (10 έως 12 εβδομάδων ηλικίας) εγχύθηκαν εντός των φλεβών της ουράς τους με B16F10 κύτταρα μελανώματος (1 χ 10

6 κύτταρα /ζώο). Καρκινικών κυττάρων που φέρουν τα ποντίκια χωρίστηκαν σε τέσσερις ομάδες των πέντε και 3 ημέρες μετά τον εμβολιασμό, θεραπεία καθημερινά για δύο εβδομάδες (από Δευτέρα έως Παρασκευή) με 20 μL αλατούχου διαλύματος, DMSO ή της ΟΑ (5 mg kg

-1 ή 10 mg kg

-1). Η δόση του τριτερπενίου για την τρίτη και τέταρτη ομάδες αποφασίστηκε με αναφορά σε μια προηγούμενη αναφορά [29]. Το σωματικό βάρος κάθε ποντικού καταγράφηκε κάθε 4 ημέρες για να προσδιοριστεί αν η θεραπεία επηρεάζεται η κατάσταση της υγείας του ζώου. Δεκαοκτώ ημέρες μετά τον εμβολιασμό των κυττάρων του όγκου, οι ποντικοί θανατώθηκαν με αυχενική εξάρθρωση υπό αναισθησία με CO

2. Οι πνεύμονες απομακρύνθηκαν, και δύο ανεξάρτητους παρατηρητές προσδιορίζεται ο αριθμός των μεταστατικών οζιδίων στους πνεύμονες εκάστου ποντικού. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD του αριθμού των μεταστάσεων.

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD. t-test του Student πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού Instat. Η τιμή του

σ

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Α549 και Η460 κυτταρικές σειρές εκφράζουν ενεργό MRP1 αντλία

Το Α549 και Η460. κυτταρικές σειρές εκφράζουν σημαντικά επίπεδα των πρωτεϊνών μεταφορέων MDR [25], [26]. Για να διερευνηθεί η παρουσία των ενεργών αντλιών σε αυτές τις γραμμές, τα κύτταρα επωάστηκαν με υποστρώματα φθορισμού για P-gp (rho123) ή MRP1 (CFDA) παρουσία ή απουσία αναστολέων για αυτές τις πρωτεΐνες και στη συνέχεια μετρήθηκε η ενδοκυτταρική φθορισμού. Η έλλειψη μεταβολής φθορισμού που παρατηρείται με την παρουσία βεραπαμίλη, ένας αναστολέας ειδική P-gp [30], και η υψηλή αύξηση του φθορισμού που λαμβάνεται όταν Α549 και Η460 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με MK571, έναν αναστολέα ειδικού MRP1 [31], έδειξαν ότι αυτά γραμμές έχουν πολύ χαμηλή ή καθόλου δραστηριότητα P-gp, αλλά εμφανίζει μια έντονη δραστηριότητα MRP1 (Σχήμα 1).

για την P-gp /δραστηριότητας ABCB1, Α549 ή Η460 κύτταρα επωάστηκαν για 30 λεπτά με το μέσο (AF) ή 400 ηΜ Rhodamine 123 απουσία (Rho) ή παρουσία 50 μΜ βεραπαμίλη (VP), Για MRP1 /ABCC1, τα κύτταρα επωάστηκαν με 5 μΜ CFDA απουσία (CF) ή παρουσία 50 μΜ ΜΚ-571 (ΜΚ) . Μετά την πλύση, η κυτταρική φθορισμός μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Τα ιστογράμματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων που εκτελούνται εις διπλούν.

Η

ολεανολικού οξέος αναστέλλει τη βιωσιμότητα και επάγει κασπάσης-εξαρτώμενη κατάτμηση του DNA σε γραμμές NSCLC

Για να αξιολογηθεί η κυτταροτοξική δράση της ΟΑ επί Α549 και Η460, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις ΟΑ ή σε συνδυασμό με σισπλατίνη (παραδοσιακό χημειοθεραπευτικό φάρμακο για NSCLC) και, στη συνέχεια, 48 ώρες αργότερα? βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με μία δοκιμασία ΜΤΤ. Ολεανολικού οξέος μείωσε την βιωσιμότητα των κυτταρικών γραμμών σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 2Α). Μικροσκοπική παρατήρηση των κυττάρων προτείνει ότι η επίδραση του ΟΑ οφειλόταν σε απόπτωση. Για να διερευνηθεί περαιτέρω αυτή την παρατήρηση, κατεργασμένα κύτταρα επωάστηκαν με ένα υποτονικό διάλυμα που περιέχει ΡΙ και στη συνέχεια μια ανάλυση κυτταρικού κύκλου διεξήχθη με κυτταρομετρία ροής (FCM). Υπο-διπλοειδή πληθυσμούς θεωρήθηκαν αποπτωτικά. Το αυξημένο ποσοστό κατακερματισμένου DNA κυττάρων και την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 δραστικότητα που επάγεται από τη θεραπεία της ΟΑ (Σχήματα 2Β και 2C), ενίσχυσε την αποπτωτική φύση της ΟΑ κυτταροτοξικότητας. Αυτή η παρατήρηση επιβεβαιώθηκε από δεδομένα /PI Αηηβχίην (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Α549 ή Η460 κύτταρα επωάστηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις ΟΑ (10, 25, 40 ή 50 μg /mL ή 21.9, 54.7, 87.6 ή 109.5 μΜ) ή σισπλατίνη για 48 ώρες. βιωσιμότητας (Α) κυττάρων εκτιμήθηκε με ΜΤΤ και σχεδιάζονται ως ποσοστό αναστολής κυτταρικής βιωσιμότητας. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν μέσες ± SD 4 πειραμάτων που εκτελούνται εις τριπλούν. (Β) Παράλληλα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ένα υποτονικό διάλυμα που περιέχει ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) και DNA-περιεχόμενο αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Πάνω πίνακας: αντιπροσωπευτικό ιστόγραμμα του κυτταρικού κύκλου. Κάτω πίνακας: το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων υπο-G1. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέσο όρο ± SD 3 πειραμάτων που εκτελούνται εις τριπλούν. (C) κασπάσης 3-ενεργοποιημένων κυττάρων προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας ένα κιτ CaspGlow όπως περιγράφεται στο Μ &? Μ. Τα ιστογράμματα είναι αντιπροσωπευτικά δύο ανεξάρτητων πειραμάτων που εκτελούνται εις διπλούν.

Η

Επιδράσεις ελαιανολικού οξέος επί της δραστικότητας MDR και έκφραση

Για να διερευνηθεί αν η κυτταροτοξική δράση της ΟΑ επί Α549 και Η460 επιτεύχθηκε με τη μεσολάβηση διαμόρφωση της αντλίας MDR, αναλύσαμε τα αποτελέσματα της ΟΑ για τη δραστηριότητα MRP1 και της έκφρασης. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 30 λεπτά με CFDA σε παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων ΟΑ (6,25, 12,5, 25 ή 50 μg /mL) και η συσσώρευση CF μετρήθηκε με φθορισμό. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, η αγωγή με ΟΑ δεν μετέβαλε τη συσσώρευση CF με Α549. Μια μικρή αλλά σημαντική αύξηση στο φθορισμό παρατηρήθηκε σε Η460, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ΟΑ μπορεί να είναι σε θέση να ρυθμίζουν τη δράση MRP1. Από την άλλη πλευρά ήταν επίσης δυνατό, αντίθετα, ότι η ΟΑ τροποποιεί την έκφραση του MRP1. Η δυνατότητα αυτή αναλύθηκε με FCM και στύπωμα Western σε κύτταρα επωάστηκαν με μέσο ή ΟΑ (25 ή 50 μg /ml, το καθένα για 24 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με αντι-MRP1. Όπως φαίνεται στα σχήματα 3Β και 3C, καμία μεταβολή της έκφρασης MRP1 ήταν παρατηρούμενη.

(Α) για τον προσδιορισμό δραστικότητας MRP1, Α549 ή Η460 κύτταρα επωάστηκαν για 30 λεπτά με μέσο (AF), 5 μΜ CFDA απουσία (CF) ή παρουσία 50 μΜ ΜΚ-571 (ΜΚ -571), ή με CFDA σε παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων της ΟΑ (6,25, 12,5, 25 ή 50 μg /mL). Cellular φθορισμός μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής. τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD της μέση ένταση φθορισμού που λαμβάνεται . σε 3 διαφορετικά πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν * και ** δείχνουν

σ

& lt? 0,05 και

σ

& lt?. 0.01, αντίστοιχα, σε σχέση με τον έλεγχο (CF) (Β) για τον προσδιορισμό έκφραση MRP1, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μέσο ή ΟΑ (25 ή 50 μg /mL) για 24 ώρες πριν από τη συγκομιδή, διαπερατά και επωάστηκαν με ΡΕ-επισημασμένο αντι-MRP1 για 30 λεπτά στους 4 ° C. Μετά από δύο PBS πλύσεις, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε διάλυμα FACS και ο φθορισμός αξιολογήθηκε. Τα ιστογράμματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Γ) Για τον προσδιορισμό MRP1 με κηλίδα western, ολόκληρων κυττάρων εκχυλίσματα που λαμβάνονται από κύτταρα σε επεξεργασία όπως περιγράφεται στο Β Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με δωδεκυλοθειικό νάτριο (SDS) -gels, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PDF και ανιχνεύθηκαν με ένα αντίσωμα προς MRP1 όπως περιγράφηκε στο M & amp? ενότητα Μ. Οι αριθμοί αντιπροσωπεύουν ένταση της ζώνης σε σχέση με την α-τουμπουλίνης.

Η

ολεανολικού οξέος αναστέλλει την έκφραση των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην αντίσταση απόπτωσης και πρόκληση αγγειογένεσης στην Α549 κυτταρική γραμμή

Για να διερευνηθεί αν η κυτταροτοξική δραστηριότητα της ΟΑ θα μπορούσε να οφείλεται στη ρύθμιση των οδών που εμπλέκονται στην αντοχή απόπτωση, κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε αγωγή για 24 ώρες με 50 μg /mL αυτού του τριτερπενίου και στη συνέχεια η έκφραση του Bcl-2, Βαχ και survivin αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ανοσοκυτταροχημικές τεχνικές. Εμείς δεν βρήκε μυκόπλασμα σε καλυπτρίδες προετοιμασμένοι για ανοσοκυτταροχημεία. Παρατηρήσαμε ότι η έκφραση του Bcl-2 δεν άλλαξε μετά από θεραπεία με ΟΑ (Σχήματα 4Α-Β)? υπήρξε μια σημαντική (

σ

& lt? 0.005) αύξηση Βαχ (Σχήματα 4C-D) και σημαντική μείωση (

σ

& lt? 0.0001) στην έκφραση της πρωτεΐνης survivin (Εικόνες 4ε- ΦΆ). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι η θεραπεία με ΟΑ μετέβαλε το κυτταρικό μέσο προς μια αποπτωτικό προφίλ και ότι αυτή η διαδικασία μπορεί επίσης να συμβάλει στη μείωση του αριθμού των μεταστατικών εστιών. Για να διερευνηθεί αυτή η πιθανότητα περαιτέρω, το αποτέλεσμα της ΟΑ για την έκφραση του VEGF [13], ένας παράγοντας που εμπλέκεται στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την αγγειογένεση, αξιολογήθηκε με ανοσοκυτταροχημεία. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται στα Σχήματα 4 (G-Η) έδειξε ότι η θεραπεία με ΟΑ οδήγησε σε σημαντική μείωση (

ρ

& lt? 0,05) του VEGF-θετικά κύτταρα. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν όταν τα αποτελέσματα της ΟΑ για την έκφραση αυτών των πρωτεϊνών αναλύθηκαν με στύπωμα Western (Σχήμα 5). Συνολικά, αυτά τα δεδομένα ενισχύουν μια πιθανή ανασταλτική επίδραση της ΟΑ σχετικά με τις οδούς και την ανάπτυξη της μετάστασης αντοχής φαρμάκου.

(άνω πάνελ) ανοσοφθορισμού των κυττάρων Α549 χρωματίστηκαν για Bcl2 (Α-Β), Βαχ (C-D), survivin (Ε-Ρ) και VEGF (G-Η). Κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μέσο (A, C, E, G) ή με 50 μg /mL ΟΑ (Β, D, F, Η) για 24 ώρες, σταθερό, χρωματίστηκαν με τα πρωτεύοντα αντισώματα, απεκάλυψε με βιοτινυλιωμένης IgG ακολουθούμενη από στρεπταβιδίνη -CY3 και μετρητής χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ, όπως περιγράφεται στο Μ &? Μ. Αντιπροσωπευτικά μικρογραφήματα ανοσοφθορισμού τριών πειραμάτων. Bar: 100 μm. (Κάτω πίνακας) Γραφική αναπαράσταση των Ιστομορφομετρική αποτελέσματα της ανοσοκυτταροχημική δοκιμασίας. Το ποσοστό των ανοσοδραστικών κυττάρων υπολογίστηκε από τις θετικά κύτταρα DAPI. Bcl-2 δεν διαμορφώνεται από την ΟΑ (p & gt? 0.05), αλλά Bax αυξήθηκε σημαντικά (*

σ

& lt? 0.005), ενώ survivin και VEGF μειώθηκαν σημαντικά μετά τη θεραπεία (**

p

& lt? 0,0001 και ***

ρ

& lt?. 0.05, αντίστοιχα)

Η

κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε αγωγή με μέσο ή με 50 μg /mL ολεανολικού οξέος για 24 ώρες και εκχυλίσματα ολόκληρων κυττάρων ελήφθησαν όπως περιγράφεται στο Μ &? Μ. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PDF, ανιχνεύθηκαν με αντισώματα προς Bcl-2, Βαχ, Survivin, VEGF ή α-τουμπουλίνης και αναπτύχθηκαν με ECL, όπως περιγράφεται στο Μ &? Μ. Οι αριθμοί αντιπροσωπεύουν ένταση της ζώνης σε σχέση με την α-τουμπουλίνης.

Η

ολεανολικού οξέος αναστέλλει την ανάπτυξη του μελανώματος που προκαλείται μετάσταση πνεύμονα

Μετάσταση θεωρείται γενικά η ανάπτυξη του όγκου που προέρχεται από κύτταρα τα οποία έχασαν προσκόλληση , άρχισε την κυκλοφορία, και στη συνέχεια μετανάστευσε στην συγκεκριμένη μεταστατικό κόγχες? στην περίπτωση του καρκίνου του πνεύμονα, οι κόγχες είναι ο εγκέφαλος, το ήπαρ και τα οστά. Σε περίπτωση απουσίας ενός μοντέλου για μετάσταση ειδικά για το συγκεκριμένο τύπο καρκίνου του πνεύμονα, χρησιμοποιήσαμε το μοντέλο μελανώματος, που χρησιμοποιούνται συχνά στην βιβλιογραφία για να διερευνηθεί η επίδραση των φαρμάκων επί της μετάστασης, να έχουν πρόσβαση στα αποτελέσματα της ΟΑ για την ανάπτυξη της μετάστασης

in vivo

. Για το σκοπό αυτό, οι μεταστάσεις πνεύμονα που προκαλείται από

ενδοφλεβίως.

Ενοφθαλμισμό των κυττάρων μελανώματος B16F10 όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29]. Με έναν τρόπο παρόμοιο με Α549 και Η460, αυτά τα κύτταρα εμφανίζουν επίσης μια ενεργή αντλία MRP1 (τα αποτελέσματα δεν φαίνονται). Ξεκινώντας 3 ημέρες μετά τον εμβολιασμό του όγκου, ομάδες ποντικών υποβλήθηκαν σε αγωγή ενδορινικά για 2 εβδομάδες με 10 δόσεις PBS (έλεγχος) ή διάφορες συγκεντρώσεις ΟΑ (5 ή 10 mg kg

-1 ημέρα

-1). Οι ποντικοί θυσιάστηκαν κατά την ημέρα 17 και ο αριθμός των πνευμονικών μετάστασης μετρήθηκε. Η υψηλότερη συγκέντρωση αγωγή με ΟΑ σημαντικά (

ρ

& lt? 0,05). Μείωσε τον αριθμό των μεταστάσεων σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα δείγματα αναφοράς (Σχήμα 6)

Ομάδες ποντικών, εγχύθηκαν στην ουραία φλέβες με Β16Ρ10 κύτταρα μελανώματος, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αλατούχο διάλυμα, DMSO, ΟΑ (5 mg kg

-1 ημέρα

-1) ή ΟΑ (10 mg kg

-1 ημέρα

-1), όπως που περιγράφονται στο Μ & amp? τμήμα Μ και στο άνω φύλλο? ο αριθμός των μεταστάσεων πνεύμονα μετρήθηκε την ημέρα 18 (κάτω πίνακας). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD του αριθμού των μεταστάσεων. * Υποδηλώνει

σ

& lt?. 0.001 σε σχέση με τον έλεγχο (DMSO)

Η

Συζήτηση

Η παρουσία εγγενής ή επίκτητη αντοχή σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες είναι ένα σημαντικό εμπόδιο για την αποτελεσματική αντιμετώπιση του NSCLC. Πράγματι, η παρατήρηση ότι το ήμισυ περίπου των ασθενών πεθαίνουν επειδή ο όγκος εξαπλώνεται σε απομακρυσμένα όργανα έχει αποδοθεί στην ανάπτυξη της MDR. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται εδώ έδειξαν ότι, εκτός του ότι είναι δραστικές εναντίον γραμμές NSCLC που εκφράζουν ενδογενή δραστηριότητα MRP1 /ABCC1, ΟΑ διαμορφωμένο παράγοντες που ενέχονται στην αντίσταση απόπτωσης και ανέστειλε την ανάπτυξη του μελανώματος που προκαλείται μετάσταση του πνεύμονα.

Επειδή MDR πρωτεΐνες είναι βρέθηκε στο φυσιολογικό επιθήλιο πνεύμονα, όγκους που προέρχονται από αυτόν τον ιστό αυξήσει τα επίπεδα αυτών των πρωτεϊνών μετά από χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία [32], [33] και είναι συχνά ευαίσθητα στην κυτταροτοξικών παραγόντων. Τα στοιχεία που παρουσιάζονται στο παρόν έγγραφο αποδεικνύεται ότι η ΟΑ είναι κυτταροτοξικά και προκάλεσε απόπτωση των δύο κυττάρων NSCLC που εκφράζουν ιδιοσυστατικά MRP1 [25], [26] και το παρόν υψηλή δραστηριότητα MRP1 (Σχήμα 1). Ολεανολικού οξέος με μεσολάβηση κυττάρων θάνατος οφείλεται σε απόπτωση, όπως αποδεικνύεται από την ικανότητα της ΟΑ να επάγει κατάτμηση του DNA και για την ενεργοποίηση της κασπάσης 3 (Εικόνα 2).