Αφηρημένο

Ιστορικό

Η ενεργοποίηση των μονοπατιών εμβρυϊκών σηματοδότησης ηρεμίας στο ενήλικο πάγκρεας είναι ένα χαρακτηριστικό του καρκίνου του παγκρέατος (PC). Αυτές οι ανακαλύψεις οδήγησαν στην ανάπτυξη νέων αναστολέων των οδών όπως Notch και σηματοδότηση Hedgehog που είναι σήμερα σε κλινικές δοκιμές πρώιμη φάση στη θεραπεία αρκετών τύπων καρκίνου. σηματοδότηση ρετινοειδή είναι επίσης απαραίτητη για την ανάπτυξη του παγκρέατος, και η θεραπεία ρετινοειδή έχει χρησιμοποιηθεί με επιτυχία σε άλλες κακοήθειες, όπως η λευχαιμία, αλλά λίγα είναι γνωστά σχετικά με τη σηματοδότηση ρετινοειδών στο PC.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Ερευνήσαμε ο ρόλος των ρετινοειδών σηματοδότησης

in vitro

και

in vivo

στην κανονική του παγκρέατος, του παγκρέατος τραυματισμό, την αναγέννηση και τον καρκίνο. Ρητινοειδούς σηματοδότηση είναι ενεργή σε περιστασιακή κύτταρα στο ενήλικο πάγκρεας αλλά αισθητά επαυξημένη σε όλη τη διάρκεια παρέγχυμα τραυματισμό και αναγέννηση. Αμφότερα τα χημικά επαγόμενη και γενετικά μοντέλα ποντικών του PC εμφανίζουν έλλειψη δραστικότητας σηματοδότησης ρετινοειδούς σύγκριση με το κανονικό πάγκρεας. Κατά συνέπεια, διερευνήσαμε Cellular ρητινοειδούς Binding Protein 1 (CRBP1), ένα βασικό ρυθμιστή της σηματοδότησης ρετινοειδούς γνωστό ότι παίζει ένα ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου του μαστού, ως δυνητικό θεραπευτικό στόχο. Απώλεια ή σημαντική προς τα κάτω ρύθμιση της CRBP1 ήταν παρούσα στο 70% του ανθρώπινου PC, και ήταν εμφανής στα πολύ πρώιμα προκαρκινικές αλλοιώσεις (PanIN-1Α). Ωστόσο,

in vitro

κέρδος και την απώλεια των μελετών λειτουργίας και ποντίκια knockout CRBP1 πρότεινε ότι η απώλεια της έκφρασης CRBP1 από μόνη της δεν ήταν αρκετή για να προκαλέσει καρκινογένεση ή να μεταβάλει την ευαισθησία PC με ρητινοειδή θεραπείες που βασίζονται.

Συμπεράσματα /Σημασία

Εν κατακλείδι, ρετινοειδή σηματοδότησης φαίνεται να παίζει κάποιο ρόλο στην αναγέννηση του παγκρέατος και την καρκινογένεση, αλλά σε αντίθεση με τον καρκίνο του μαστού, δεν διαμεσολαβείται άμεσα από CRBP1

Παράθεση:. Colvin EK, Susanto JM , Kench JG, Ong VN, Mawson Α, Pinese M, et al. (2011) Ρετινοειδές Σηματοδοσίας σε καρκίνο του παγκρέατος, των τραυματισμών και την Αναγέννηση. PLoS ONE 6 (12): e29075. doi: 10.1371 /journal.pone.0029075

Επιμέλεια: Hidayatullah Γ Munshi, του Πανεπιστημίου Northwestern, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 24 του Οκτωβρίου 2011? Αποδεκτές: 20 του Νοέμβρη 2011? Δημοσιεύθηκε: 29 Δεκ 2011

Copyright: © 2011 Colvin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Cancer Institute της Νέας Νότιας Ουαλίας (CINSW), το Εθνικό Σύστημα Υγείας και Ιατρικής Έρευνας του Συμβουλίου της Αυστραλίας (# 427655), το Αντικαρκινικό Συμβούλιο Νέας Νότιας Ουαλίας, Ίδρυμα Κλινικής του Αγίου Βικεντίου, το Royal Australian College of Surgeons, ο Αυστραλός Ίδρυμα Έρευνας για τον Καρκίνο, το Ίδρυμα Avner Nahmani καρκίνο του παγκρέατος, και το RT Hall Trust. AVB, CJS, DKC, το ΕΑΜ και EKC υποστηρίζονται από υποτροφίες από το CINSW (06 /RSA /1-05? 08 /RSA /1-15? 07 /CDF /1-28? 09 /CDF /2-40? 10 /CRF /1-01). RLS είναι Ανώτερος κύριος συνεργάτης του NHMRC και κατέχει το Petre πρόεδρος του Breast Cancer Research. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

αύξηση ενδείξεις υποστηρίζουν έναν κεντρικό ρόλο για την ανάπτυξη του μονοπάτια σηματοδότησης όπως Notch [1] και Hedgehog [2], [3], [4] σε καρκίνο του παγκρέατος, με αναστολείς αυτών των οδών επί του παρόντος σε κλινικές δοκιμές πρώιμη φάση . Notch και hedgehog εμπλέκονται επίσης σε παγκρεατική βλάβη, την αναγέννηση και επισκευή [5], συνθήκες που είναι γνωστό ότι προδιαθέτουν σε καρκίνο. σηματοδότηση ρητινοειδούς είναι ζωτικής σημασίας για τον σχηματισμό εμβρυϊκών πάγκρεας [6], [7], [8], αλλά λίγα είναι γνωστά για το δυναμικό ρόλο της στον καρκίνο του παγκρέατος.

Τα ρετινοειδή είναι φυσικά ή συνθετικά ανάλογα της βιταμίνης Α, η οποία έχει έχουν χρησιμοποιηθεί επιτυχώς για τη θεραπεία της οξείας προμυελοκυτταρικής λευχαιμίας (APL) [9]. Παρά την επιτυχία της θεραπείας ρετινοειδών σε APL, θεραπεία των στερεών όγκων έχει ανταποκριθεί με περιορισμένη επιτυχία [10], [11], και μερικές ενδείξεις υποδεικνύουν ότι αυτή η αντίσταση να ρητινοειδούς θεραπεία μπορεί να οφείλεται σε ανωμαλίες στην σηματοδότηση ρετινοειδών. Προς τα κάτω ρύθμιση των υποδοχέων ρετινοειδών έχει αναφερθεί σε πολλούς καρκίνους, όπως του μαστού, του πνεύμονα, του προστάτη και καρκίνο του οισοφάγου [11], και προς τα κάτω ρύθμιση των ανάντη στοιχείων που συμμετέχουν στην ρετινοειδών μεταβολισμό και αποθήκευση αναδύονται δυνατόν κύριοι ρυθμιστές της καρκινογένεσης και συνεισφέρουν αντοχή σε ρετινοειδών βασίζονται θεραπείες.

Κινητή ρητινοειδούς πρωτεΐνης δέσμευσης 1 (CRBP1) παίζει σημαντικό ρόλο στην σηματοδότηση ρετινοειδών και προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης CRBP1 εμφανίζεται στο μητρικό [12], του προστάτη [13], γαστρικό [14] και των ωοθηκών [15] καρκίνους. Απώλεια της έκφρασης CRBP1 σε επιθήλιο του μαστού οδηγεί σε απώλεια της διαφοροποίησης και της εξέλιξης του όγκου παρεμβαίνοντας αποθήκευση ρετινοειδές και το μεταβολισμό του στον ενεργό μεταβολίτη, ρετινοϊκό οξύ, παράγοντας ένα εντοπισμένο ανεπάρκεια ρετινοειδές [16], με αλλοιωμένη ρετινοειδές ανταπόκρισης [17] και κυτταρικό μετασχηματισμό .

καρκίνος του παγκρέατος (PC) είναι η τέταρτη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στις δυτικές κοινωνίες με συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών μικρότερη από 5% [18]. Οι πρόοδοι στην εισαγωγική και επικουρική χημειοθεραπευτικά σχήματα έχουν οδηγήσει σε κάποια βελτίωση στα αποτελέσματα, αλλά παγκρεατεκτομή παραμένει η πιο αποτελεσματική μέθοδος θεραπείας για PC, και προσφέρει τη μοναδική δυνατότητα για θεραπεία. Μόνο το 20% των ασθενών με εντοπισμένη παρούσης, μη-μεταστατική ασθένεια η οποία είναι κατάλληλη για εκτομή [19]. Εκείνοι που υποβάλλονται σε εκτομή και λαμβάνουν συμπληρωματική θεραπεία έχουν μια μέση επιβίωση των 12-22 μηνών και 5-ετής επιβίωση 20-25% [20]. Οι υπάρχουσες συστηματικές θεραπείες είναι μόνο μετρίως αποτελεσματική και η διάμεση επιβίωση για τους ασθενείς με μεταστατική νόσο παραμένει 6 μήνες. Κατά συνέπεια, υπάρχει μεγάλη ανάγκη να αναπτυχθούν νέες θεραπευτικές στρατηγικές για τον καρκίνο του παγκρέατος.

Εδώ έχουμε εντοπίσει έναν πιθανό ρόλο για ρητινοειδούς σηματοδότηση σε καρκίνο του παγκρέατος και του παγκρέατος αναγέννηση και ως συνέπεια μπορεί να συνιστά στόχευσης μηχανισμό για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικές στρατηγικές. Απώλεια CRBP1, ένα βασικό ρυθμιστή της σηματοδότησης ρετινοειδών και σημαντικά στον καρκίνο του μαστού, αν και συχνά στον υπολογιστή, σε αντίθεση με τον καρκίνο του μαστού δεν ήταν μόνη της αρκετή για να προκαλέσει μετασχηματισμό.

Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

η δεοντολογική έγκριση για πειράματα σε ζώα λήφθηκε από το Ινστιτούτο Επιτροπή Δεοντολογίας ζώων Garvan (αριθμοί έγκρισης 09/53? 07/10). Πολυκεντρική δεοντολογική έγκριση ελήφθη από τις Επιτροπές Ανθρωπίνων Έρευνας Ηθικής του Πανεπιστημίου διδασκαλία νοσοκομεία: Westmead Νοσοκομείο Concord Νοσοκομείο Royal Prince Alfred Hospital και το Νοσοκομείο Campus Σεντ Βίνσεντ στο Σίδνεϊ για την απόκτηση των νωπών και αρχειακό ιστό και καταγραφή των κλινικοπαθολογοανατομικών στοιχεία για τους ασθενείς με το διάγνωση του καρκίνου του παγκρέατος. Ενημέρωσε γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς.

ποντίκια ΣΠΑΝΙΟ-LacZ

ΣΠΑΝΙΑ-LacZ ποντίκια περιέχουν ένα διαγονίδιο LacZ ελέγχεται από ένα στοιχείο ρετινοϊκό οξύ απόκρισης (σπάνια). Τα κύτταρα με ενεργό ΡΑ λεκέ σηματοδότηση θετικά για β-γαλακτοσιδάση (β-gal). Τα ανεπεξέργαστα ζώα (n = 8) θυσιάστηκαν σε 10-12 εβδομάδες ηλικίας και του παγκρέατος τους συλλέχθηκαν για χρώση β-gal.

ποντικού παγκρεατίτιδα Μοντέλο

Α κερουλεΐνη επαγόμενης μοντέλο της χρόνιας παγκρεατίτιδας ήταν χρησιμοποιούνται παρόμοια με τα προηγούμενα μοντέλα [21]. Ποντίκια (n = 16) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με επαναλαμβανόμενες ενδο-περιτοναϊκή ενέσεις κερουλεΐνη (ΜΡ Biomedicals, Solon, ΟΗ) πέντε φορές την ημέρα, δύο φορές την εβδομάδα για 10 εβδομάδες. Σε αυτό το μοντέλο πλήρη αναγέννηση κυψελοειδή κύτταρο έχει αναφερθεί ότι λαμβάνει χώρα με 6 εβδομάδες μετά τη διακοπή της θεραπείας κερουλεΐνη. Ως εκ τούτου, τα ποντίκια θυσιάστηκαν σε 0, 2, 4 και 6 εβδομάδες μετά τη διακοπή της κερουλεΐνη ενέσεων και του παγκρέατος τους συγκομίζονται με σκοπό τη διερεύνηση σηματοδότηση RA σε διάφορα χρονικά σημεία κατά τη διάρκεια της περιόδου ανάρρωσης.

Μοντέλα Ποντικού καρκίνο του παγκρέατος

ποντίκια RARE-LacZ (n = 10) ηλικίας 10 εβδομάδων υποβλήθηκαν σε αγωγή με 7,12-διμεθυλοβενζανθρακένιο (DMBA? Sigma-Aldrich, St Louis, ΜΟ) όπως περιγράφεται προηγουμένως [22]. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν όταν αποδεικνύεται σημάδια της ασθένειας ή 9 μήνες θεραπείας μετά την DMBA και ιστών που συλλέγονται για χρώση β-gal.

LSL-Kras

G12D /+, LSL-Τφ

53R172H /+ ποντίκια, και Pdx1-Cre ελήφθησαν από τα μοντέλα ποντικών του Human Cancer Consortium στο Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου (Frederick, MD). Για να δημιουργήσετε όγκους του παγκρέατος στα οποία η δραστηριότητα σηματοδότησης RA θα μπορούσαν να αξιολογηθούν τα ποντίκια ΣΠΑΝΙΑ-LacZ διασταυρώθηκαν με LSL-Kras

G12D /+? LSL-Trp

53R172H /+? Pdx1-Cre ποντικών να δημιουργήσει LSL-Kras

G12D /+? LSL-Trp

53R172H /+? Pdx1-Cre? ΣΠΑΝΙΑ-LacZ απόγονοι (n = 8). Τετράκλινο διαγονιδιακά ποντίκια αφέθηκαν να ηλικία έως ότου οι όγκοι που σχηματίζονται σε ποιο σημείο ευθανατώθηκαν και ιστός συλλέχθηκε για χρώση β-gal.

χρώση β-γαλακτοσιδάσης

4 μm παγκρεατικών τομές απο-κηρωμένο και επανυδατώθηκαν πριν αποκάλυψης επετεύχθη χρησιμοποιώντας διάλυμα στόχων ανάκτησης (S2367, ρΗ 9.0: ϋΑΚΟ Corporation, Carpenteria, CA) σε ένα ζέον υδατόλουτρο επί 20 λεπτά. Η ενδογενής δραστικότητα υπεροξειδάσης αποσβέστηκε με υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% σε μεθανόλη. Οι τομές επωάστηκαν για 1 ώρα με δύο παρα δέκα αντι-β-γαλακτοσιδάσης (AB616) πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (Abcam, Cambridge, UK). Ένα επισημασμένο σύστημα ανίχνευσης αντι-κουνελιού πολυμερές υπεροξειδάση κρένου χρησιμοποιείται σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Envision + αντι-κουνελιού? ΫΑΚΟ Corporation, CA). 3,3′-διαμινοβενζιδίνη χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα. Counter-χρώση έγινε με αιματοξυλίνη Mayer του (ϋΑΚΟ Corporation, Carpenteria, CA).

Cohort Ασθενής

Εντοπίσαμε μια ομάδα από 90 ασθενείς που υποβλήθηκαν σε παγκρεατικά εκτομή ή βιοψία από αυτά τα νοσοκομεία. Αυτή η ομάδα αποτελεί ένα υποσύνολο μιας περιγράφηκε προηγουμένως ομάδα 348 ασθενών [23], [24].

CRBP1 Ανοσοϊστοχημεία

παγκρέατος ιστού μικρο-συστοιχίες (4 μm τομές) έχουν απο-κερωμένο και ενυδατωθούν εκ νέου πριν αποκάλυψη επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας διάλυμα στόχων ανάκτησης (S1699, pH 6,0: ϋΑΚΟ Corporation, Carpenteria, CA) σε μια χύτρα ταχύτητας για 5 λεπτά. Η ενδογενής δραστικότητα υπεροξειδάσης αποσβέστηκε με υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% σε μεθανόλη. Οι τομές επωάστηκαν για 1 ώρα με δύο παρα δέκα αντι-CRBP1 (FL-135) πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Ένα επισημασμένο σύστημα ανίχνευσης αντι-κουνελιού πολυμερές υπεροξειδάση κρένου χρησιμοποιείται σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Envision + αντι-κουνελιού? ΫΑΚΟ Corporation, Carpenteria, CA). 3,3′-διαμινοβενζιδίνη χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα. Counter-χρώση έγινε με αιματοξυλίνη Mayer του (ϋΑΚΟ Corporation, Carpenteria, CA).

Μέχρι τρία ξεχωριστά δείγματα παγκρέατος εξετάστηκαν ανά ασθενή. Χρώση εκτιμήθηκε από δύο ξεχωριστά παρατηρητές για κάθε περίπτωση (E.K.C. και S.A.O.). Τυποποίηση της βαθμολόγησης επιτεύχθηκε με σύγκριση των βαθμολογιών μεταξύ των παρατηρητών, και με τηλεδιάσκεψη, όπου τυχόν διαφορές επιλύθηκαν με συναίνεση. Οι βαθμολογίες δόθηκαν ως ποσοστό των κυττάρων με θετική κυτταροπλασματική χρώση εντός της αντιπροσωπευτικής περιοχής του ιστού πυρήνα μικρο-συστοιχία, και την απόλυτη ένταση της κυτταροπλασματικής χρώσης με κλίμακα από το 0 έως 3 (0 να αντιπροσωπεύει μη χρώση, 1 αντιπροσωπεύουν ετερογενείς κυτταροπλασματική χρώση, 2 που αντιπροσωπεύουν ομοιογενείς κυτταροπλασματική χρώση, και 3 αντιπροσωπεύουν την έντονη ομογενή κυτταροπλασματική χρώση). Μια θετική βαθμολογία για CRBP1 δόθηκε με βάση τα ακόλουθα κριτήρια:. & Gt? 50% των κυττάρων που έχουν ομοιογενή κυτταροπλασματική χρώση, με ένταση & gt? 1

Η ανάλυση επιβίωσης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση Kaplan-Meier, με τις διαφορές στην επιβίωση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία log-rank χρησιμοποιώντας StatView 5.0 Λογισμικό (Abacus Systems, Berkeley, CA)

παγκρέατος κυτταρικές γραμμές

χρησιμοποιήθηκαν έξι παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές:. AsPC-1, BxPC -3, Capan-2, HPAC, MIAPaCa2 και PANC1 (ATCC, VA, USA). Αυτές οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα ATCC. Ανθρώπινα κύτταρα του παγκρέατος επιθηλιακά (HPDE και HPDE-EcoR) χρησιμοποιήθηκαν ως ένα κανονικό ελέγχου (ευγενώς από Ming-Sound-Tsao, Ontario Ινστιτούτο Καρκίνου) και καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25].

κηλίδωση Western

εκχυλίσματα πρωτεΐνης έγιναν ορατές με τη χρήση 4-12% Bis-Tris προκατασκευασμένα πηκτώματα (Invitrogen, Βικτώρια, Αυστραλία) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα φίλτρα αποκλείστηκαν με 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε ρυθμιστικό TBST. αντίσωμα αντι-CRBP1 (FL-135) χρησιμοποιήθηκε σε 1:500 τη διάρκεια της νύχτας. Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με ανοσοσφαιρίνη αντι-κουνελιού G (IgG) συζευγμένη με υπεροξειδάση (1:2000) (Amersham, (GE Healthcare), NSW, Australia) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου ακολουθούμενο από ενισχυμένη χημειοφωταύγεια αντιδραστήριο (Perkin Elmer, Waltham , ΜΑ).

εκχύλιση RNA και σύνθεση cDNA

RNA από κυτταρικές γραμμές παγκρεατικού εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Trizol® (Invitrogen, Βικτώρια, Αυστραλία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας ABgene® Reverse-IT ™ ΚΤ-άση Blend (AbGene, Surrey, UK) με ένα μείγμα από ολίγο dT και τυχαίων εξαμερών χρησιμοποιώντας το First Strand Synthesis Μέθοδος. Μετά από μετουσίωση του ΚΝΑ σε 70 ° C, αντίστροφη μεταγραφή (RT) αντιδράσεις διεξήχθησαν σε θερμοκυκλοποιητή DNA δυάδα κινητήρα ™ (MJ Research, Waltham, ΜΑ) με τη σταδιακή πρόγραμμα 25 ° C για 10 λεπτά, 35 ° C για 30 λεπτά, 47 ° C για 45 λεπτά, στη συνέχεια 75 ° C για 10 λεπτά.

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (QPCR)

αναλύσεις της γονιδιακής έκφρασης TaqMan® (Applied Biosystems, Βικτώρια, Αυστραλία) του CRBP1 (Hs00161252_m1) διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. GAPDH (4326317E, TaqMan® ενδογενής έλεγχος) χρησιμοποιήθηκε ως ένα ενδογενές ελέγχου. TaqMan® qPCR αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν χρησιμοποιώντας το ΑΒΙ Prism 7900HT Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας (Applied Biosystems, Βικτώρια, Αυστραλία). Πρότυπες καμπύλες συμπεριλήφθηκαν για να εξασφαλιστεί οι αντιδράσεις εκτελέστηκαν στη γραμμική περιοχή και χρησιμοποιήθηκαν για να ρυθμίσετε την αποτελεσματικότητα της αντίδρασης. Οι συνθήκες των κύκλων που περιλαμβάνονται αρχικό στάδιο μετουσίωσης στους 95 ° C για 4 λεπτά, ακολουθούμενη από 95 ° C (30 δευτερόλεπτα) και 72 ° C (30 δευτερόλεπτα) για 60 κύκλους.

εξόντωση CRBP1 σε κύτταρα HPDE

Δύο μικρή φουρκέτα RNA (shRNA) κατασκευές στόχευσης CRBP1, siCRBP1-Α και siCRBP1-Β, καθώς και ένα κωδικοποιημένο ελέγχου, siCRBP1-κωδικοποιημένα, (ευγενική προσφορά από Nicoletta Sacchi, Roswell Park Cancer Institute, NY) μετήχθησαν σε κύτταρα Phoenix χρησιμοποιώντας FuGENE αντιδραστήριο επιμόλυνσης (Roche, NSW, Αυστραλία). Οι ρετροϊικοί υπερκείμενα συλλέχθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για να μολύνουν κύτταρα HPDE-EcoR. Πουρομυκίνη (1 μg /mL) χρησιμοποιήθηκε για την επιλογή μολυσμένα με επιτυχία κύτταρα. Η επιτυχής νοκ ντάουν της CRBP1 προσδιορίστηκε με κηλίδα western.

3D καλλιέργεια κυττάρων HPDE

κύτταρα HPDE-ΕοοΚ μολυνθεί με shRNA αναπτύχθηκαν σε πλακίδια θαλάμου επιστρωμένα με αυξητικό παράγοντα μειώνεται matrigel (BD Biosciences, San Μάνικα, CA) σε κερατινοκυττάρων μέσο άνευ ορού (Invitrogen, Victoria, Australia) συμπληρωμένο με επιδερμικό αυξητικό παράγοντα, εκχύλισμα υπόφυσης βοοειδούς, 10% ορό εμβρύου μόσχου και 2% matrigel για 20 ημέρες. Τα μέσα αλλάζονται κάθε 4 ημέρες. 3D δομές ανακτήθηκαν σε 3, 7, 10, 15 και 20 ημερών χρησιμοποιώντας λύση αποκατάστασης των κυττάρων BD (BD Biosciences, San Hose, CA) και πρωτεΐνη εξάγεται για κηλίδα western.

Σταθερή επιμόλυνση των κυττάρων MIAPaCa2

Τέσσερις διαφορετικοί κλώνοι κυττάρων που εκφράζουν MIAPaCa2 διαφορετικά επίπεδα CRBP1 (MP2

κύτταρα CRBP1) και των αντίστοιχων τους ελέγχους τους δημιουργήθηκαν για να αξιολογηθεί η επίδραση της έκφρασης σε κύτταρα CRBP1 MIAPaCa2. Τα κύτταρα που δημιουργούνται χρησιμοποιώντας το pcDNA ™ 6.2 /GFP πλασμίδιο (Invitrogen, Βικτώρια, Αυστραλία) και το πλασμίδιο pQCXIP (Clontech Laboratories, βουνό, Θέα, CA) που περιέχει το γονίδιο CRBP1. Οι φορείς επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας Amaxa Nucleofector® Τεχνολογίας (Lonza AG Κολωνία, Κολωνία, Γερμανία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με pcDNA ™ πλασμίδιο 6.2 /GFP περαιτέρω διαλογή για έκφραση GFP με χρήση κυτταρομετρίας ροής για τον εμπλουτισμό του πληθυσμού των κυττάρων που εκφράζουν GFP /CRBP1. Η έκφραση του CRBP1 σε κάθε πληθυσμό επιβεβαιώθηκε με κηλίδα western. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 2, 5 ή 10 mM από all-

trans

ρητινοϊκό οξύ (ATRA? Sigma-Aldrich, St Louis, ΜΑ) την Ημέρα 1. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και μετρήθηκαν την Ημέρα 1, 2, 4 και 6 για τη μέτρηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού.

DNA εκχύλιση

1 mm πλάτους πυρήνες ιστού αφαιρέθηκαν από δείγματα ανθρώπινο PC εγκλεισμένα σε παραφίνη σταθεροποιημένα με φορμαλίνη και DNA εκχυλίζεται με τη χρήση της Gentra Puregene Kit Tissue (Qiagen, Valencia, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. DNA από τις κυτταρικές σειρές εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ εκχύλισης DNA (Stratagene, Santa Clara, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

κατεργασία όξινου θειώδους

κατεργασία όξινου θειώδους διεξήχθη με τη χρήση των προηγουμένως περιγραφείσες μεθόδους [ ,,,0],26] με μικρές τροποποιήσεις. Συνοπτικά, 1 μg DNA μετουσιώθηκε με κατεργασία με 0,3 Μ ΝαΟΗ και τροποποιημένο με 3 διθειώδες Μ νάτριο για 6 ώρες. Τροποποιημένο ϋΝΑ καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας QIAEX II Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA). Κατεργασία όξινου θειώδους ολοκληρώθηκε με την προσθήκη 5,5 ml 3 Μ NaOH, καταβυθίστηκε με αιθανόλη, και επαναιωρήθηκε σε 50 ml διαλύματος DNA Ενυδάτωση (Kit Tissue Gentra Puregene, Qiagen, Valencia, CA).

μεθυλίωσης ειδική PCR (MSP )

μοτίβα μεθυλίωσης του DNA στο νησί CpG του CRBP1 σε ανθρώπινο παγκρεατικό κυτταρικές γραμμές και ανθρώπινα δείγματα προσδιορίστηκαν με MSP, χρησιμοποιώντας προηγουμένως δημοσιευθέντα εκκινητές [26], [27]. ενισχύσεις PCR εκτελέστηκαν σε 12,5 μΙ μίγματα αντίδρασης που περιέχει 1 έως 5 μΙ κατεργασμένου με όξινο θειώδες DNA, dNTPs (κάθε στα 200 μΜ), εκκινητές (0.4 mM κάθε αντίδραση), 1.5 mM MgCl

2, 0,75 μονάδα AmpliTaq DNA Gold® πολυμεράσης (Applied Biosystems, Βικτώρια, Αυστραλία), και 1 × PCR Buffer II (Applied Biosystems, Βικτώρια, Αυστραλία). MSP εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες συνθήκες: 95 ° C (30 δευτερόλεπτα), 58 ° C (30 δευτερόλεπτα), 72 ° C (30 δευτερόλεπτα) για 40 κύκλους. Οι συνθήκες των κύκλων που περιλαμβάνονται ένα αρχικό στάδιο αποδιάταξης στους 95 ° C για 10 λεπτά και τελική επιμήκυνση στους 72 ° C για 10 λεπτά. Όλα τα προϊόντα της PCR έγιναν ορατά με τη χρήση πηκτώματος αγαρόζης 1,5%. εκκινητές myod [28] χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος για την ποιότητα του κατεργασμένου με όξινο θειώδες DNA. Αυτά τα εναύσματα δεν περιέχουν αλληλουχίες CpG

5-ΑΖΑ και TSA θεραπεία

MIAPaCa2 κύτταρα αντιμετωπίζονται ως εξής:. (1) Το επεξεργασμένο την ημέρα 1 με 300 mM 5-ΑΖΑ-2’δεοξυκυτιδίνη (5-ΑΖΑ) (Sigma-Aldrich, St Louis, ΜΟ) και η συγκομιδή για την Ημέρα 4? (2) Το επεξεργασμένο την ημέρα 1 με 100 ηΜ Τριχοστατίνη Α (TSA) (Sigma-Aldrich, St Louis, ΜΟ) και η συγκομιδή για την Ημέρα 4? (3) Το επεξεργασμένο τις Ημέρες 1 και 3 με TSA και η συγκομιδή για την Ημέρα 4? (4) Το επεξεργασμένο την Ημέρα 1 με 5-ΑΖΑ, Ημέρες 2 και 3 με TSA και η συγκομιδή για την Ημέρα 4? (5) Το επεξεργασμένο κατά την Ημέρα 1 με 5-ΑΖΑ, Ημέρες 2, 3 και 5 με TSA και συλλέχθηκαν κατά την Ημέρα 6. Τα ανεπεξέργαστα MIAPaCa2 και HPDE κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Κατά τη διάρκεια της θεραπείας, το μέσο αλλάχθηκε καθημερινά, και τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό PBS πριν από νουκλεϊκό οξύ ή /και εκχύλιση πρωτεΐνης.

Αποτελέσματα

ρητινοειδούς σηματοδότηση σε φυσιολογικά πάγκρεας, παγκρεατική βλάβη και αναγέννηση

ρετινοϊκό οξύ Response Element (RARE-LacZ) ποντίκια δημοσιογράφος που σηματοδοτούν τα κύτταρα με ενεργό ρετινοειδή σηματοδότησης [29] έδειξε ότι το κανονικό πάγκρεας, ενεργό σηματοδότησης ρετινοειδή περιορίζεται στις νησίδες του Langerhans και σπάνια μόνο, ή μικρές συστάδες των εξωκρινών κυττάρων με ένα κυψελοειδή ή Centro-acinar με βάση την τοποθεσία και την μορφολογία (Σχήμα 1). Επαναλαμβανόμενες ενδοπεριτοναϊκή ενέσεις της ανάλογης cholecystokinin κερουλεΐνης [30] προκαλεί χρόνιας παγκρεατίτιδας σε ποντίκια με μορφολογικές αλλαγές, όπως η απώλεια μάζας acinar κυττάρων και την αύξηση της παγκρεατικής ίνωσης παρόμοιο με αυτό που παρατηρείται στην ανθρώπινη κατάσταση. Για να διερευνήσουν ρετινοειδή σηματοδότησης στη ρύθμιση του παγκρέατος τραυματισμό και αναγέννηση, εμείς παγκρεατίτιδας σε ποντίκια ΣΠΑΝΙΑ-LacZ. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή για 10 εβδομάδες με ενδοπεριτοναϊκές ενέσεις κερουλεΐνη, θυσιάστηκαν μετά την παύση της θεραπείας, ή αφέθηκαν να ανανήψουν για 2, 4 ή 6 εβδομάδες. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν αμέσως μετά την τελική ένεση κερουλεΐνης (κατά το χρόνο οξείας βλάβης) είχαν σημαντικά μικρότερη παγκρέατα λόγω ατροφίας κυψελιδωτών κυττάρων και ίνωση με τον σχηματισμό του «σωληνοειδούς συμπλοκών», ένα εκδήλωση της acinar να πόρου μεταπλασία, οι πρώτες μορφολογικές αλλαγές που σχετίζονται με παγκρεατική καρκινογένεση (Εικόνα 2Α) [31], [32].

Η

δραστηριότητα σηματοδότησης RA στο πάγκρεας από ΣΠΑΝΙΑ-LacZ ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με κερουλεΐνης (Ε), και η επακόλουθη ανάκαμψη για 2 εβδομάδες (F) , 4 εβδομάδες (G) και 6 εβδομάδες (Η). Αυξημένη δραστηριότητα σηματοδότησης ρετινοειδών παρατηρήθηκε σε ένα σημαντικό ποσοστό των κυψελιδικών κυττάρων αμέσως μετά τη διακοπή της θεραπείας κερουλεΐνη (Ε), με δραστικότητα ρητινοειδούς κορυφώθηκε σε 2 εβδομάδες (Ρ), μειώνεται με 4 εβδομάδες (G) και η επιστροφή σε σχεδόν κανονικά επίπεδα μετά 6 εβδομάδες ανάκτησης (H).

η

σε 2 εβδομάδες μετά τη διακοπή της θεραπείας κερουλεΐνης, αναγέννηση εξωκρινών είχε αρχίσει με την αύξηση της μάζας κυψελωτά τηλέφωνα, αλλά με εναπομένουσα συγκροτήματα σωληνοειδή και επίμονα φλεγμονώδης διήθηση (Εικόνα 2Β ). Στις 4 και 6 εβδομάδες, εξωκρινές πάγκρεας είχε κοντά πλήρως, αλλά όχι πλήρως αναγεννηθεί, με περιστασιακές κυψελοειδή μονάδες ακόμη εμφανίζοντας διευρυμένη Lumena και μια ευρύτερη ήπια φλεγμονώδη διήθηση (Σχήματα 2C και 2D). χρώση β-γαλακτοσιδάσης του παγκρέατα από κερουλεΐνη επεξεργασμένο RARE-LacZ ποντικούς έδειξαν αυξημένη δραστικότητα σηματοδότησης ρητινοειδούς σε ένα μεγάλο ποσοστό των κυψελοειδή κύτταρα αμέσως μετά την παύση της θεραπείας κερουλεΐνη (Σχήμα 2Ε). Ρετινοειδή δραστηριότητα κορυφώθηκε σε 2 εβδομάδες και μειώνεται σε 4 εβδομάδες με σχεδόν φυσιολογικά επίπεδα σε 6 εβδομάδες (Σχήματα 2F, G, H).

ρετινοειδών σηματοδότησης στον καρκίνο του παγκρέατος

Για να προσδιορίσετε αν ρετινοειδών σηματοδότησης το πάγκρεας μεταβλήθηκε κατά τη διάρκεια της καρκινογένεσης ερευνήσαμε ρετινοειδούς δραστικότητα σηματοδότησης σε χημικά επαγόμενη (DMBA) [22] και γενετικά μοντέλα ποντικών του καρκίνου του παγκρέατος [33]. DMBA αγωγή RARE-LacZ ποντίκια ανέπτυξαν πτωχά διαφοροποιημένο, sarcomatoid όγκοι (Σχήμα 3Α) με μια ξεχωριστή Ελλείψει κυττάρων που έδειξαν δραστική σηματοδότηση ρητινοειδούς παρά εξέταση του πολλαπλά τμήματα (Σχήμα 3Β). Πάγκρεας ειδικού προαγωγού οδηγείται Cre ανασυνδυάση (Pdx1-CRE) που προκαλείται από την έκφραση του ενεργοποιημένου KRAS και μεταλλαγμένα ρ53 εντός του παγκρέατος είναι σήμερα η πλέον κατάλληλη γενετική μηχανική μοντέλο ποντικού καρκίνου του παγκρέατος. Αυτά LSL-Kras

G12D /+ /LSL-Trp53

R172H /+ /Pdx1-Cre ποντίκια αναπτύσσουν παγκρέατος προκαρκινικές αλλοιώσεις (PanIN) ότι η πρόοδος σε ιδιαίτερα επεμβατική και μεταστατικό παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα, κατά μέσον όρο πέντε μήνες [33 ]. Αυτά τα ποντίκια διασταυρώθηκαν με ποντίκια δημοσιογράφο ΣΠΑΝΙΑ-LacZ να δημιουργήσει LSL-Kras

G12D /+ /LSL-Trp53

ποντίκια R172H /+ /Pdx1-Cre /RARE-LacZ. Όγκους του παγκρέατος, η οποία ήταν κυρίως μετρίως διαφοροποιημένων και περιείχε άφθονη δεσμοπλαστικού στρώματος που σχηματίζεται σε όλα τα ποντίκια. Υπήρχε και πάλι μια πλήρη απουσία της δραστηριότητας σηματοδότησης ρετινοειδών σε αυτούς τους όγκους και προκαρκινικές αλλοιώσεις, παρά τις πολλές τομές και αξιολόγηση από 2 ανεξάρτητους παρατηρητές, ένας από τους οποίους ήταν ειδικός παθολόγος του παγκρέατος (Σχήμα 3D, E, F).

Σε όγκους από DMBA ποντίκια με αγωγή RARE-LacZ, μια ξεχωριστή απουσία οποιωνδήποτε κυττάρων που εμφανίζουν δραστική σηματοδότηση ρητινοειδούς παρατηρήθηκε (Β). Σε LSL-KrasG12D /+? LSL-Trp53R172H /+? Pdx1-Cre? ΣΠΑΝΙΑ-LacZ παγκρεατικών όγκων και προκαρκινικές βλάβες, υπήρχε επίσης μια πλήρης απουσία των ρετινοειδών σηματοδότησης δραστηριότητας (D και F αντίστοιχα)

Η

απώλεια έκφρασης CRBP1 είναι μια κοινή και πρώιμο συμβάν στον παγκρεατικό καρκίνο

Κινητή ρητινοειδούς πρωτεΐνης Δέσμευσης 1 (CRBP1), ένας ρυθμιστής κλειδί της σηματοδότησης ρετινοειδών θεωρείται ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση του μαστού [16], [34]. Προκαταρκτικές παρατηρήσεις εντοπίστηκαν επίσης προς τα κάτω ρύθμιση των επιπέδων μεταγραφής CRBP1 στον υπολογιστή [35] και PanIN [36]. Κατά συνέπεια, διερευνήσαμε την απώλεια CRBP1 ως δυνητικού αιτία της μειωμένης σηματοδότησης ρετινοειδούς στο PC, και έναν ρόλο σε παγκρεατικά καρκινογένεση.

Σε μια σειρά 90 ασθενών, ανοσοϊστοχημεία έδειξε σημαντική προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης πρωτεΐνης CRBP1 σε 70 %, με πλήρη απώλεια της έκφρασης σε 50% από αυτά (35% της συνολικής? Εικόνα 4Α, Β, C, D). Απώλεια ή προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης CRBP1 συνέβη νωρίς στην ανάπτυξη του υπολογιστή και ήταν παρούσα στο 100% του PanIN-1Α και 1Β βλάβες των ασθενών που είχαν ανώμαλη έκφραση εντός του καρκίνου τους (Σχήμα 4Ε, F). Η απώλεια της έκφρασης CRBP1 εμφανίστηκε επίσης σε 50% της πρόωρης πρόδρομες βλάβες (PanIN1A και 1Β) που συνδέονται με τη χρόνια παγκρεατίτιδα, ένα γνωστό παράγοντα κινδύνου για PC. Ούτε η απώλεια, ούτε προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης συνδεόταν με την έκβαση των ασθενών (Log-Rank

P

= 0,3539? Σχήμα S1). Επιπλέον, το 4 από τα 6 κυτταρικές σειρές PC κατέδειξε απώλεια ή προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης CRBP1 (Σχήμα 5Α και Β).

Η

(C) CRBP1 κατάσταση μεθυλίωσης σε κυτταρικές σειρές PC και (δ) την αποκατάσταση της CRBP1 έκφραση με συνδυασμένη θεραπεία των κυττάρων MIAPaCa2 με 5-Αζα και TSA. (Ε) CRBP1 νοκ ντάουν σε σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα HPDE-EcoR. (F) κύτταρα HPDE καλλιεργούνται σε 3D αποδεικνύει καμία αλλαγή στη μορφολογία των κυττάρων siCRBP1 και κωδικοποιημένα ελέγχου.

Η

Η απώλεια της έκφρασης CRBP1 σχετίζεται με αναστρέψιμη προαγωγός υπερμεθυλίωση

μεθυλίωσης ειδική PCR (MSP ) και όξινο θειώδες γονιδιωματική αλληλούχιση (BSG) προσδιόρισε υπερμεθυλίωση προαγωγού CRBP1 σε 27,3% των 33 δειγμάτων ανθρώπινο PC λείπει έκφραση CRBP1 σε αντίθεση με 5 5 συμφωνημένα φυσιολογικά δείγματα παγκρέατος τα οποία δεν είχαν μεθυλιωθεί. υπερμεθυλίωση προαγωγού CRBP1 ανιχνεύθηκε σε κύτταρα MIAPaCa2 (Σχήμα 5C), και η αγωγή με τον παράγοντα απομεθυλίωσης 5-ΑΖΑ μόνο, ή σε συνδυασμό με την TSA αναστολέα HDAC, επαγόμενη έκφραση του CRBP1 mRNA (Σχήμα 5D). Η ικανότητα να αντιστρέψει CRBP1 φίμωση φαρμακολογικά παρουσίασε την πιθανή ευκαιρία να χρησιμοποιήσει τα ρετινοειδή και αναστολείς HDAC ως συνδυασμός θεραπειών με στόχο θεραπευτικά CRBP1.

Η ελαττωμένη έκφραση της CRBP1 σε κυτταρικές σειρές και τα μοντέλα του ποντικιού

Για να εκτιμηθεί η ρόλος του CRBP1 αρνητική ρύθμιση σε παγκρεατικά καρκινογένεση, αθανατοποιημένα ανθρώπινα παγκρεατικά κύτταρα επιθηλιακά εκφράζουν τον οικοτροπικό ρετροϊικό υποδοχέα ποντικού (HPDE-EcoR) έχουν ρετροϊικώς με δύο shRNA κατασκευάσματα στόχευσης CRBP1 καθώς και ένα κωδικοποιημένο ελέγχου. Τα κύτταρα στη συνέχεια αναπτύχθηκαν σε καλλιέργεια 3D για 20 ημέρες. κηλίδος Western κατέδειξε το 50% knockdown έκφρασης CRBP1 (Σχήμα 5Ε), όμως, δεν υπήρχε αισθητή διαφορά στη μορφολογία σύγκριση με τους ελέγχους (Σχήμα 5F). Επιπλέον, παγκρέατα από 12 μηνών ποντικών CRBP1 knockout [37] (ευγενώς από τον καθηγητή Pierre Chambon) αποκάλυψε εμφανή μορφολογικές διαφορές σε σύγκριση με τους ποντικούς ελέγχου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

CRBP1 υπερέκφραση σε κύτταρα MIAPaCa2

για να εξετάσει τα αποτελέσματα της αποκατάστασης της έκφρασης CRBP1, κύτταρα MIAPaCa2, τα οποία κανονικά δεν εκφράζουν CRBP1 επιμολύνθηκαν σταθερά να δημιουργήσει αρκετούς κλώνους που εκφράζουν διαφορετικά επίπεδα CRBP1 (χαμηλή, μεσαία, υψηλή και πολύ υψηλή) με καμία επίδραση στις τιμές του πολλαπλασιασμού σε σχέση με τον κενό φορέα ελέγχου (Σχήμα S2A) και δεν μετέβαλε την ευαισθησία να ρητινοειδή θεραπεία όταν έλαβαν θεραπεία με all-trans ρετινοϊκό οξύ (ATRA) (Εικόνες S2B και S2C).

Συζήτηση

Ο αναδυόμενος ρόλος απορρυθμισμένης οδών εμβρυϊκών σηματοδότησης, όπως Notch και Hedgehog [4] παρέχει ευκαιρίες για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών στρατηγικών για τον καρκίνο του παγκρέατος. Ρητινοειδούς σηματοδότηση είναι απαραίτητη για τη φυσιολογική εμβρυϊκή ανάπτυξη, συμπεριλαμβανομένου του σχηματισμού των εν τω γεννάσθαι παγκρέατος [6], [7], [8]. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η δραστηριότητα σηματοδότησης σε φυσιολογικά πάγκρεας περιορίζεται σε παγκρεατικά νησίδια και σπάνια κύτταρα στο εξωκρινές πάγκρεας, πολλά από τα οποία έμοιαζαν με centro-κυψελοειδή κύτταρα, τα βλαστικά κύτταρα υποθετική του παγκρέατος. Μια πρόσφατη μελέτη διαπίστωσε ότι τα κύτταρα στο πάγκρεας που εκφράζουν το ένζυμο RA-σύνθεση, αφυδρογονάση αλδεΰδης 1 (ΑΙ_ϋΗ1), είναι centroacinar κύτταρα που εμφανίζουν χαρακτηριστικά προγονικών κυττάρων [38]. Αυτό το πρότυπο της δραστηριότητας είναι παρόμοια με την έκφραση του Pdx1 παράγοντα μεταγραφής η οποία είναι επίσης πιστεύεται ότι σηματοδοτούν εξωκρινή προγονικά ή «πόδι» κύτταρα. Λειτουργική αναγνώσεις του

in vivo δραστικότητα

σηματοδότηση ρετινοειδών χρησιμοποιώντας ποντίκια ρεπόρτερ στη μελέτη μας δείχνουν ότι επαυξημένης σηματοδότηση παίζει ένα ρόλο στην αναγέννηση του παγκρέατος μετά από τραυματισμό. Ενεργός σηματοδότηση, κανονικά περιορίζεται σε συγκεκριμένους τύπους κυττάρων γίνεται εκτεταμένη μέχρι διαφοροποίηση νέων εξωκρινών acini είναι πλήρης. Η αγωγή των ποντικών με επαναλαμβανόμενες δόσεις κερουλεΐνης οδηγεί σε δραματική αύξηση των ΑΙ_ϋΗ1-θετικά κύτταρα, τα οποία θεωρείται ότι αντιπροσωπεύει αυξημένη ρετινοειδούς σηματοδότηση [38], υποστηρίζοντας περαιτέρω τα ευρήματά μας.

Η απορρύθμιση σηματοδότηση ρετινοειδούς έχει ταυτοποιηθεί σε πολλά τύπους καρκίνου [11], και αν και προηγούμενες μελέτες έχουν εντοπίσει ανώμαλη έκφραση των συστατικών του ρετινοειδούς σηματοδότησης καθώς και οι μεταγενέστεροι στόχων σε PC [35], [39], [40], [41], [42], [43], λίγα ήταν γνωστά σχετικά με τη δραστηριότητα σηματοδότησης ρετινοειδών. Αξιολόγηση της δραστηριότητας ρεπόρτερ σηματοδότησης ρετινοειδών σε αμφότερα χημικά επαγόμενη καρκίνο του παγκρέατος, και σε γενετικά μοντέλα στη μελέτη μας έδειξε ότι δεν είναι σηματοδότησης ρετινοειδών. Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις, υποθέσαμε ότι η έλλειψη σηματοδότησης ρετινοϊκό οξύ μπορεί να εμποδίζουν την κανονική διαφοροποίηση σε απόκριση σε ερεθίσματα καρκινογόνες και να συμβάλλουν στην παγκρεατική καρκινογένεση, και ότι η αποκατάσταση της σηματοδότησης ρετινοειδούς μπορεί να παρέχει μία νέα θεραπευτική επιλογή.

Ως κατά συνέπεια, διερευνήσαμε το ρόλο της CRBP1, ένα βασικό συστατικό της σηματοδότησης ρετινοειδή, και πιστεύεται ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση του μαστού [16], [34]. Προσδιορίσαμε απώλεια, ή προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης CRBP1 (η οποία ενδεχομένως θα προσέδιδε απώλεια δραστικότητας σηματοδότησης ρετινοειδών) στο 70% των παγκρεατικών δειγμάτων καρκίνου, με υψηλό ποσοστό οφείλεται σε μεθυλίωση προαγωγού. Απώλεια ή προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης CRBP1 ήταν παρούσα στις πρώτες πρόδρομες βλάβες του PC, τόσο σε σχέση με το PC και σε χρόνια παγκρεατίτιδα, παράγοντας κινδύνου για την ανάπτυξη των PC. Ωστόσο, knockdown έκφρασης CRBP1 σε αθανατοποιημένα παγκρεατικού πόρου επιθηλιακά κύτταρα δεν προκάλεσε μετασχηματισμό. Ομοίως, CRBP1 knockout ποντίκια δεν επιδεικνύουν παγκρέατος φαινότυπο σε πάνω από 12 μηνών. Επιπλέον, επανεισαγωγή CRBP1 σε κύτταρα PC ανεπαρκή σε CRBP1 δεν μετέβαλλε αναισθησία σε ρετινοειδές θεραπεία. Σημαντικά, πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι η παγκρεατική αστεροειδή κύτταρα μπορεί να παίζει βασικό ρόλο στην σηματοδότηση ρετινοειδών και αντίσταση στην θεραπεία ρητινοειδούς

in vivo

[44]. Αυτό πρέπει να ληφθεί υπόψη, ιδίως σε ό, τα δεδομένα που παρουσιάζονται εδώ επικεντρώθηκε στην παγκρεατική επιθηλιακών συστατικό.

Εν περιλήψει, παγκρεατική βλάβη διεγείρει δραστικότητα σηματοδότησης ρετινοειδούς εντός του παγκρέατος, η οποία είναι ευρέως διαδεδομένη κατά τη διάρκεια βλάβης και την αναγέννηση και ενδεχομένως παίζει ένα σημαντικό ρόλο στη διαδικασία αυτή.