Abstract

Calcyclin δέσμευσης πρωτεΐνης (CacyBP /SIP), τα οποία προσδιορίζονται με βάση την ικανότητά του να αλληλεπιδρά με πρωτεΐνες S100 σε ένα εξαρτώμενο από ασβέστιο τρόπο, είχε προηγουμένως βρεθεί ότι αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό και την ογκογένεση του γαστρικού καρκινικά κύτταρα στο εργαστήριο μας. Σημαντικά, τα αποτελέσματα της S100 πρωτεϊνών επί της βιολογικής συμπεριφοράς των CacyBP /SIP σε γαστρικό καρκίνο παραμένουν ασαφείς. Εδώ, αναφέρουμε την κατασκευή ευκαρυωτικών φορέων έκφρασης για άγριου τύπου CacyBP /SIP και κολοβωμένη μετάλλαξη που δεν έχει την περιοχή δέσμευσης της πρωτεΐνης S100 (CacyBP /SIPΔS100). Οι εκφράσεις του άγριου τύπου και κολοβωμένης ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες καταδείχθηκαν με επιμόλυνση ΜΚΝ45 γαστρικών καρκινικών κυττάρων. δοκιμασίες συν-ανοσοκαταβύθισης απέδειξαν αλληλεπίδραση μεταξύ S100A6 και άγριου τύπου CacyBP /SIP σε ΜΚΝ45 κύτταρα. Απομάκρυνση του τομέα δέσμευσης πρωτεΐνης S100 μείωσε δραματικά τη συγγένεια του CacyBP /SIP για πρωτεΐνες S100 όπως υποδεικνύεται από μειωμένη συν-ανοσοκαταβύθιση S100A6 από CacyBP /SIPΔS100. Το πείραμα ΜΤΤ δοκιμασία, δοκιμασία FACS, δοκιμασία κλωνοποίησης και ξενομοσχεύματος όγκου διεξήχθησαν για να εκτιμηθεί η επίδραση της CacyBP /SIP για την κυτταρική ανάπτυξη και ογκογένεση

in vitro

και

in vivo

. Η υπερέκφραση του CacyBP /SIP ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό και την ογκογένεση του ΜΚΝ45 γαστρικό καρκίνο κύτταρα? τα ποσοστά πολλαπλασιασμού και ογκογένεση καν μειωθεί περαιτέρω από την έκφραση των CacyBP /SIPΔS100. Δείξαμε επίσης ότι S100 πρωτεΐνες ρυθμίζουν αρνητικά CacyBP /SIP μεσολάβηση αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων γαστρικού καρκίνου, μέσω μιας επίδρασης επί της έκφρασης της πρωτεΐνης β-κατενίνης και μεταγραφική ενεργοποίηση του Tcf /LEF. Αν και ο υποκείμενος μηχανισμός της δράσης απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση, η μελέτη αυτή παρέχει νέες γνώσεις σχετικά με την αλληλεπίδραση μεταξύ των πρωτεϊνών S100 και CacyBP /SIP, που θα μπορούσαν να εμπλουτίσουν τις γνώσεις μας για τις πρωτεΐνες S100 και είναι χρήσιμη για την κατανόηση της εξέλιξης του καρκίνου του στομάχου.

Παράθεση: Ning Χ, Sun S, Zhang Κ, Liang J, Chuai Υ, Li Υ, et al. (2012) S100A6 Πρωτεΐνη Αρνητικά Ρυθμίζει CacyBP /SIP-διαμεσολαβούμενη αναστολή του γαστρικού καρκίνου κυτταρικού πολλαπλασιασμού και Ογκογένεση. PLoS ONE 7 (1): e30185. doi: 10.1371 /journal.pone.0030185

Επιμέλεια: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, Ιταλία

Ελήφθη: 27 Οκτ 2011? Αποδεκτές: 15η Δεκεμβρίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 25 Ιανουαρίου 2012

Copyright: © 2012 Ning et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φύση Επιστημών της Κίνας (Νο 30872964, Αρ 30772461). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

S100 πρωτεΐνες είναι η μεγαλύτερη υποομάδα εντός του EF-hand Ca

2 + που δεσμεύουν οικογένειας πρωτεϊνών και χαρακτηρίζονται από κύτταρο- τους και πρότυπα έκφρασης ιστού-ειδική. Αυτές οι πρωτεΐνες είναι γνωστό ότι ρυθμίζουν ενδοκυτταρικές διεργασίες, όπως η μετάβαση του κυτταρικού κύκλου και την κυτταρική ανάπτυξη, τη διαφοροποίηση και την κινητικότητα [1]. Ένα μοναδικό χαρακτηριστικό αυτών των πρωτεϊνών είναι ότι τα μεμονωμένα μέλη εντοπισμένη σε συγκεκριμένα κυτταρικά διαμερίσματα από τα οποία μερικά είναι σε θέση να μετακινηθούν κατά Ca

2 + ενεργοποίησης [2], [3]. Κατά την μετατόπιση, αυτές οι πρωτεΐνες μπορούν να μετάγουν το σήμα Ca

2+ σε μια χρονική και χωρική τρόπο αλληλεπιδρώντας με διαφορετική πρωτεΐνη-ειδικούς στόχους S100. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα περισσότερα γονίδια S100 βρίσκεται σε μια συστάδα γονιδίων στο ανθρώπινο χρωμόσωμα 1q21, μια θέση συχνής χρωμοσωμικές ανωμαλίες [4]. Αυτή η ένωση προτείνει μια σύνδεση μεταξύ χρωμοσωμικές ανωμαλίες και την απορρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης S100 σε διάφορους όγκους. Μέχρι σήμερα, έχουν πολλά μέλη της οικογένειας έχουν ταυτοποιηθεί S100 ότι συνδέονται με την ανάπτυξη και μετάσταση όγκου [5], [6]. Ωστόσο, οι ακριβείς ρόλοι και της σημασίας των πρωτεϊνών S100 στην ανάπτυξη και προώθηση του καρκίνου δεν είναι καλά κατανοητοί. Η κατανόηση της βιολογικής λειτουργίας (ες) των πρωτεϊνών S100 θα εξαρτηθεί από την ταυτοποίηση των πρωτεϊνικών στόχων S100. Μέχρι τώρα, αρκετές πιθανοί στόχοι πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων αφυδρογονάση γλυκεραλδεϋδης-3-φωσφορικής, αννεξίνης II, αννεξίνη VI, αννεξίνη XI, καλδεσμόνη και CacyBP /SIP, έχουν δειχθεί ότι αλληλεπιδρούν με πρωτεΐνες S100

in vitro

σε ένα Ca

2 + εξαρτώμενη τρόπο [5], [7].

Calcyclin-δεσμευτική πρωτεΐνη (CacyBP /SIP), μια πρωτεΐνη 30 kDa που προσδιορίζονται με βάση την ικανότητά του να αλληλεπιδρά με S100A6 σε ένα Ca

2 + -εξαρτώμενη τρόπο με τον Ehrlich ασκίτης όγκου (ΕΑΤ) κύτταρα [8], πιστευόταν παλαιότερα ως-σχετικών μόριο αντίσταση σε πολλαπλά φάρμακα (MDR) σε γαστρικό καρκίνο στο εργαστήριο μας [9]. Μέσω της χρήσης ενός μονοκλωνικού αντισώματος εναντίον CacyBP /SIP [10], έχουμε δείξει ότι η υπερέκφραση του CacyBP /SIP αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό και την ογκογένεση του καρκίνου του νεφρού κύτταρα [11]. Περαιτέρω μελέτη προτείνει ότι CacyBP /SIP καταστέλλει την ανάπτυξη του καρκίνου του στομάχου [12]. Παρά την πρόοδο αυτή, τα αποτελέσματα των S100 πρωτεϊνών σε CacyBP /SIP σε καρκίνο του στομάχου παραμένουν ασαφείς. Επιπλέον, CacyBP /SIP βρέθηκε επίσης να είναι ένα συστατικό ενός συμπλόκου ουβικιτινίωση μέσω δέσμευσης Siah1 και Skp1 [13]. Και αυτή η λιγάση περιγράφηκε για τη ρύθμιση της αποδόμησης των μη-φωσφορυλιωμένη β-κατενίνης [13].

CacyBP /SIP θα μπορούσε να συνδεθεί S100, Siah1 και Skp1 από διαφορετικές περιοχές. Η Ν-τερματική περιοχή (αα 1-80) του CacyBP /SIP έχει δειχθεί ότι έχουν συγγένεια για Siah1. Η Ο-τερματική περιοχή του CacyBP /SIP (aa178-229) είναι γνωστό για το σχηματισμό ενός α-έλικα? Αυτή η περιοχή μπορεί να αλληλεπιδρά με πρωτεΐνες S100, συμπεριλαμβανομένων S100A6 [14]. περιοχή πρόσδεσης Skp1 δεν συμπίπτουν με την περιοχή δέσμευσης S100 και Skp1 συνδέεται με το μεσαίο τμήμα (aa78-155) της CacyBP /SIP [15], [16]. Για να παρατηρήσουμε τις επιδράσεις των πρωτεϊνών S100 επί της βιολογικής συμπεριφοράς των CacyBP /SIP σε γαστρικό καρκίνο, ευκαρυωτικοί φορείς έκφρασης για άγριου τύπου CacyBP /SIP και περικομμένο μετάλλαγμα του λείπει το πεδίο σύνδεσης πρωτεΐνης S100 (CacyBP /SIPΔS100) κατασκευάστηκαν επιτυχώς και εκφράζονται αποτελεσματικά σε ΜΚΝ45 κύτταρα. πείραμα Μία δοκιμασία ΜΤΤ, FACS δοκιμασία, κλωνογονική δοκιμασία και ξενομοσχεύματος όγκου διεξήχθησαν για να αξιολογηθούν οι επιδράσεις των CacyBP /SIP στην κυτταρική ανάπτυξη και ογκογένεση τόσο

in vitro

και

in vivo

. Τα αποτελέσματα αυτών των μελετών μπορεί να συμβάλει στην διαλεύκανση των επιδράσεων των πρωτεϊνών S100 επί της βιολογικής συμπεριφοράς των CacyBP /SIP σε γαστρικό καρκινικά κύτταρα.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και τα ζώα

Η γαστρική κυτταρική σειρά καρκίνου ΜΚΝ45, το οποίο βρέθηκε να είναι το χαμηλότερο έκφραση του CacyBP /SIP σε προηγούμενη μελέτη μας [12], διατηρήθηκε στο εργαστήριο μας. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 (GIBCO, Grand Island, ΝΥ, USA) συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο ορρό εμβρύου μόσχου, πενικιλλίνη (100 U /ml), και στρεπτομυκίνη (100 μg /ml) σε ένα CO

2 θερμοκοιτίδα (Forma Scientic, Marjetta, OH, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). BALB /c γυμνά ποντίκια σε 4-6 εβδομάδες της ηλικίας που προβλέπεται από το Ινστιτούτο Καρκίνου της Σαγκάης για το

in vivo

μελέτη ογκογένεσης. Αυτή η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας των πειραμάτων σε ζώα της τέταρτης Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο (Αριθμός Άδειας: 11016). Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις έγινε υπό αναισθησία πεντοβαρβιτάλης νατρίου, και έγινε κάθε δυνατή προσπάθεια για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

ανοσοφθορισμού χρώση

Τα κύτταρα απλώθηκαν σε καλυπτρίδες καθαρίζονται και σταθερά με 95% αλκοόλ για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου θερμοκρασία. Τα κύτταρα στις καλυπτρίδες πλύθηκαν με PBS και διαπερατά για 10 λεπτά με 0,5% Triton Χ-100 σε PBS. Τα κύτταρα επωάστηκαν με αντι-S100A6 αντίσωμα (αραιωμένο 1:2000) μετά τον αποκλεισμό με 3% αλβουμίνη βόειου ορού για 1 ώρα. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με συζευγμένο με FITC αντι-ποντικού IgG (Santa Cruz Biotech., Santa Cruz, USA) και τοποθετήθηκαν σε γυάλινες πλάκες με ένα μίγμα γλυκερίνης και πολυβινυλική αλκοόλη που περιέχει DABCO (1,4- diazobicylo- [2,2 , 2,] – οκτάνιο). Ανοσοφθορισμός αναλύθηκε με MRC-1024 Laser Scanning Ομοεστιακή Σύστημα απεικόνισης (Bio-Rad).

κατασκευή πλασμιδίου και επιμόλυνσης των κυττάρων

εκκινητών ολιγονουκλεοτιδίων που περιέχει το

Eco

RI ή

θέση περιορισμού Eco RV

συντέθηκαν, αντίστοιχα, για την ενίσχυση της αλληλουχίας του CDS CacyBP /SIP ή ένα Ο-τερματική διαγραφή (aa178-229) μετάλλαξη του CacyBP /SIP (Accession AF_314752). Οι δύο εκκινητές ήταν: 5 ‘gggaattcgaatatggcttcagaagagcta 3’ (νοηματικό) και 5 ‘gcgatatctcaaaattccgtgtctcctttg 3’ (αντι-νόημα)? 5 ‘gggaattcgaatatggcttcagaagagcta 3’ (νοηματικό) και 5 ‘ccgatatcacacaatataagaactgta 3’ (αντι-νόημα), αντίστοιχα. Οι συνθήκες PCR ήταν: 5 λεπτά στους 94 ° για την αρχική μετουσίωση, ακολουθούμενη από 35 κύκλους των 45 sec στους 94 °, 45 δευτερόλεπτα στους 60 °, και 60 sec στους 72 °, με μια τελική επέκταση 10 λεπτών σε 72 °. Τα μήκη των προϊόντων PCR ήταν 687 bp για CDS, και 534 bp για το C-τερματική διαγραφή. Κάθε προϊόν PCR αποκόπηκε με

EcoR

Ι και

EcoR

πέψη περιορισμού V και κλωνοποιήθηκε σε παρομοίως σε πέψη pFLAG-CMV. Οι νέοι φορείς ονομάστηκαν pFLAG-CacyBP (άγριου τύπου) και pFLAG-ΔS100 (CacyBP /SIPΔS100). Οι αλληλουχίες ενθέτου επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση του DNA.

διαμόλυνση κυττάρων πραγματοποιήθηκε με Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα επιστρώθηκαν και αναπτύχθηκαν σε 70-90% συρροή χωρίς αντιβιοτικά. Αυτά στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με 1 μα pFLAG-CacyBP ή pFLAG-ΔS100. Στις 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, G418 (350 mg /ml) προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας για την επιλογή των επιμολυσμένων κυττάρων. Μικτά κλώνοι επεκτάθηκαν για επιπλέον 6 εβδομάδες. Κύτταρα επιμολυσμένα με άδειο φορέα, pFLAG-CMV, χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικός έλεγχος. Αυτές οι σταθερές κυτταρικές σειρές ονομάστηκαν ΜΚΝ45-CacyBP, ΜΚΝ45-ΔS100 και ΜΚΝ45-pFLAG για τον άγριο τύπο, κολοβωμένη και αρνητικές επιμολύνσεις ελέγχου, αντίστοιχα.

συνανοσοκαθίζησης

Οι μορφομετατροπείς ΜΚΝ45 ήταν πλύθηκαν σε PBS, συλλέχθηκαν και λύθηκαν σε πάγο σε ένα ρυθμιστικό που περιέχει 20 mM Tris-HCl (ρΗ 7,5), 8 mM MgCl

2, 150 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, και 1% Nonidet Ρ-40. Τα εκχυλίσματα φυγοκεντρήθηκαν στα 12.000 rpm για 25 λεπτά στους 37 ° σε μικροφυγόκεντρο. Τα υπερκείμενα χρησιμοποιήθηκαν για μία δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης μετά την προσθήκη αναστολέων πρωτεάσης (10 mg /L λευπεπτίνη, 5 mg /L απροτινίνη, 20 mg /L αναστολέα θρυψίνης σόγιας, 1 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο) και ποσοτικοποιούνται με τη μέθοδο Bradford. Τα υπερκείμενα επωάστηκαν με 30 μΐ πρωτεΐνης A /G-Sepharose και 1 μg άσχετο αντίσωμα για 1-3 ώρες στους 37 ° (προ-κάθαρση). Τα μη συνδεδεμένα κλάσματα στη συνέχεια επωάστηκαν με ορό που περιέχει αντισώματα έναντι CacyBP /SIP για 1,5 ώρες στους 4 °. Το μίγμα στη συνέχεια επωάστηκε με επιπρόσθετη πρωτεΐνη A /G-Sepharose όλη τη νύκτα στους 4 °. Η ρητίνη στη συνέχεια πλύθηκε τρεις φορές σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 20 mM Tris- HCl (ρΗ 7.5) και 150 mM NaCl, δύο φορές σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 20 mM Tris-HCl (ρΗ 7.5) και 500 mM NaCl, και τέλος σε 20 mM Tris -ΗΟΙ σε ρΗ 7.5. Όλα τα ρυθμιστικά διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν συμπληρώθηκαν με αναστολείς πρωτεάσης. Οι πρωτεΐνες ρητίνη και το δεσμευμένο διαλυτοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό δείγμα SDS, έβρασαν για 5 λεπτά στους 98 °, και εφαρμόστηκε σε μια γέλη πολυακρυλαμιδίου SDS. Η έκφραση του S100A6 αναλύθηκε με κηλίδωση Western με αντίσωμα κατά S100A6.

κηλίδος Western

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν σε πάγο σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε [50 mmol /L Tris-Cl (ρΗ 7.5), 150 mmol /L NaCl, 0,2 mmol /L EDTA, 1 mmol /L PMSF και 1% ΝΡ 40], και στη συνέχεια ποσοτικοποιούνται με τη μέθοδο Bradford. Ένα μέτρο των 100 μg προϊόντων λύσης υποβλήθηκε σε ηλεκτροφόρηση σε 10% SDS-PAGE και στυπώθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 10% αποβουτυρωμένο γάλα σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες και επωάστηκαν με αντι-CacyBP (1:1500) και αντι-β-ακτίνης αντίσωμα (Sigma, 1:5000) στους 4 ° όλη τη νύκτα. Μετά από τρεις πλύσεις για 15 λεπτά το καθένα σε TBS συμπληρωμένο με 0,1% Tween 20 (TBST), η μεμβράνη επωάστηκε με /αντίσωμα IgG κουνελιού συζευγμένο με υπεροξειδάση κατσίκας αντι-ποντικού (Amersham-Pharmacia Biotech, Beijing, Κίνα) για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου θερμοκρασία. Ενισχυμένη χημειοφωταύγειας (Amersham, Freiburg, Γερμανία) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση.

Methyl θειαζολυλίου τετραζολίου (ΜΤΤ)

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα 96-φρεατίων σε 2.5 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο σε RPMI 1640 μέσο που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου απενεργοποιημένο με θέρμανση. Κάθε δείγμα είχε τρεις επαναλήψεις. Το μέσο αντικαταστάθηκε κάθε 2 ημέρες, για 6 ημέρες. Τα κύτταρα επωάστηκαν με 50 μΙ 0,2% ΜΤΤ για 4 ώρες στους 37 ° C σε ένα 5%

2 ατμόσφαιρα CO. Μετά την επώαση ΜΤΤ, ένα κλάσμα 150 μΙ 100% DMSO προστέθηκαν σε κάθε καλλιέργεια για να διαλυθούν οι κρύσταλλοι. Βιώσιμα κύτταρα μετρήθηκαν καθημερινά με ανάγνωση της απορρόφησης στα 490 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη 96-πλάκα, BP800 (Dynex Technologies, Chantilly, VA).

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Υποσυρρέοντα κύτταρα πλύθηκαν με παγωμένο PBS, αιωρήθηκαν σε 0.5 ml αιθανόλης και στη συνέχεια διατηρήθηκε στους 4 ° C για 30 λεπτά. Το εναιώρημα διηθήθηκε μέσω ενός νάιλον πλέγματος 50-μm, και το περιεχόμενο DNA των χρωματισμένων πυρήνων αναλύθηκε με κυτταρόμετρο ροής (EPICS XL, Coulter, Miami, FL). Το προφίλ κύκλου κυττάρου αναλύθηκε χρησιμοποιώντας Multicycle-DNA Cycle κυττάρων αναλύονται Λογισμικού. Οι πολλαπλασιαστικές δείκτες (PI) υπολογίστηκαν ως εξής:. PI = (G2 + S) /(G1 + S + G2)

Κλωνογόνος δοκιμασία

Για τη μέτρηση του ρυθμού πολλαπλασιασμού ενός μόνο κυττάρου

in vitro

, πλάκα κλωνογόνο και μαλακό άγαρ κλωνογονική δοκιμασίες διεξήχθησαν [17]. Για την πλάκα κλωνογονική δοκιμασία, 1 × 10

3 κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα πιάτο 9 cm και καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 για δύο εβδομάδες για να επιτραπεί ο σχηματισμός αποικιών. Οι αποικίες σταθεροποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη, χρωματίστηκαν με διάλυμα Giemsa και μετρώνται. Για το μαλακό άγαρ κλωνογονική δοκιμασία, τα κύτταρα αποκολλήθηκαν και τοποθετήθηκαν σε 0.3% αγαρόζη, με υπόστρωμα αγαρόζης 0,5% (1 χ 10

3 /φρεάτιο σε πλάκα 24-φρεατίων). Ο αριθμός των εστιών & gt? 100 μm μετρήθηκε μετά από 20 ημέρες

Η ανάπτυξη του όγκου σε γυμνά ποντίκια

λογαριθμικά αναπτυσσόμενα κύτταρα (1 χ 10

7 κύτταρα) τρυψινοποιήθηκαν, επαναιωρήθηκαν σε 0,1. ml διάλυμα D’Hanks, και εγχέεται στο hypodermia λαιμό του κάθε αθυμικών γυμνών ποντικών. Οι ποντικοί στη συνέχεια παρακολουθούνται για τον όγκο του όγκου, τη γενική υγεία, και το συνολικό σωματικό βάρος. Το μέγεθος της μάζας υποδόριου όγκου μετρήθηκε με παχύμετρο για πέντε εβδομάδες. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε σύμφωνα με τον τύπο: 0.5 × μήκος × πλάτος

2. Κάθε πειραματική ομάδα αποτελείτο από πέντε ποντίκια.

Reporter δοκιμασία γονιδιακής

Για να προσδιοριστεί η επίδραση της CacyBP /SIP και CacyBP /SIPΔS100 για την μεταγραφική δραστηριότητα των τρισεκατομμυρίων κυβικών μέτρων /LEF, η δοκιμασία γονιδίου αναφοράς εκτελέστηκε όπως περιγράφεται [18]. Εν συντομία, τα κύτταρα σε μια πλάκα 24 φρεατίων (50,000 κύτταρα ανά φρεάτιο) συν-επιμολύνθηκαν με ή χωρίς pFLAG-CMV, pFLAG-CacyBP, pFLAG-ΔS100 και το πλασμίδιο αναφοράς, pTOPFLASH, που περιέχει θέσεις Tcf /LEF πρόσδεσης άγριου τύπου χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000? ρΡΙ_-ΤΚ

Renilla

αναφοράς λουσιφεράσης χρησίμευσε ως έλεγχος για την αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης. Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε και ποσοτικά σε ένα φωτόμετρο χρησιμοποιώντας το Dual-Luciferase Reporter System Assay (Promega, Southampton, U.K.). Τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκε δύο φορές. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ο μέσος όρος της αναλογίας μεταξύ της δραστηριότητας της λουσιφεράσης της πυγολαμπίδας και τη δραστηριότητα λουσιφεράσης Renilla.

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το πακέτο στατιστικού λογισμικού SPSS (SPSS, Inc., Σικάγο, Ιλινόις), και

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Η σημασία της διαφοράς στη συχνότητα του CacyBP /SIP-θετική χρώση μεταξύ γειτονικών δείγματα όγκου και οι όγκοι αναλύθηκαν με το τεστ chi-square. Του Student

t

δοκιμής και μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης ακολουθούμενη από πολλαπλές δοκιμές σύγκρισης Dunnett χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση των άλλων δεδομένων.

Αποτελέσματα

Η ενδογενής έκφραση του S100A6 σε γαστρικό καρκίνο κυτταρική σειρά ΜΚΝ45

επιλέχθηκε S100A6 ως μοντέλο για να παρατηρήσει την επίδραση των πρωτεϊνών S100 για την βιολογική λειτουργία της CacyBP /SIP. Η ενδογενής έκφραση του S100A6 του γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή ΜΚΝ45 εντοπίστηκε για πρώτη φορά από κηλίδα western και χρώση ανοσοφθορισμού. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α, S100A6 εκφράστηκε σε ΜΚΝ45 κύτταρα. χρώση ανοσοφθορισμού δείχνει ότι S100A6 κατανεμήθηκε κυρίως στην πυρηνική μεμβράνη με πολύ μικρή βρέθηκαν στην πυρηνική πλάσμα των κυττάρων ΜΚΝ45 (Εικ. 1Β).

(Α) ενδογενούς έκφρασης του S100A6 σε ΜΚΝ45 γαστρικά καρκινικά κύτταρα ανιχνεύθηκε με κηλίδα western. (Β) χρώση ανοσοφθορισμού των S100A6 σε ΜΚΝ45 κύτταρα. (Α) χρώση ανοσοφθορισμού των S100A6 με αντι S100A6-αντίσωμα (με πράσινο χρώμα)? (Β) Ανίχνευση των πυρήνων με ιωδιούχο προπίδιο (σε κόκκινο)? (Γ) Συγχωνεύεται εικόνα.

Η

Αλληλεπίδραση S100A6 και CacyBP /SIP στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα ΜΚΝ45

Σε μια προηγούμενη έκθεση, CacyBP /SIP, η οποία εκφράστηκε σε σχετικά χαμηλό επίπεδο σε ΜΚΝ45 κύτταρα, εκφράζονται ευρέως σε αρκετούς διαφορετικούς τύπους κυτταρικών γραμμών γαστρικού καρκίνου [12]. Προκειμένου να αξιολογηθεί η αλληλεπίδραση μεταξύ S100A6 και CacyBP /SIP, άγριου τύπου και μεταλλαγμένου (aa178-229) CacyBP /SIP cDNAs κλωνοποιήθηκαν εντός του φορέα pFLAG-CMV και σταθερά επιμολύνθηκε σε ΜΚΝ45 κύτταρα. Εκτιμήσαμε την έκφραση του CacyBP /SIP σε αυτές τις σταθερές κυτταρικές σειρές με κηλίδα western. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α, FLAG-tagged CacyBP /SIP ανιχνεύθηκε σε άγριου τύπου και μεταλλαγμένων επιμολυντές CacyBP /SIP με αντι-Flag αντίσωμα, ενώ κανένα σήμα βρέθηκε σε κύτταρα επιμολυσμένα με άδειο φορέα.

(Α) κηλίδας Western ανάλυση των μορφομετατροπέων CacyBP /SIP και CacyBP /SIPΔS100 επιμολύνσεις με αντισώματα αντι-ΡΕΑΟ και αντι-CacyBP. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) δοκιμασία συνανοσοκαθίζησης να ανιχνεύσει μια αλληλεπίδραση μεταξύ S100A6 και CacyBP /SIP σε ΜΚΝ45 κύτταρα. Μετά από επώαση με αντι-CabyBP αντίσωμα, οι θέσεις πρόσδεσης ανιχνεύτηκαν με αντι-S100A6 αντίσωμα.

Η

Η αλληλεπίδραση μεταξύ S100A6 και CacyBP /SIP σε μορφομετατροπέα ΜΚΝ45 κύτταρα στη συνέχεια αξιολογήθηκε με συν-ανοσοκαταβύθιση. Μετά από επώαση με αντι-CacyBP αντίσωμα, ανοσοΐζημα ανιχνεύθηκαν με S100A6 αντίσωμα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Β, μία αλληλεπίδραση μεταξύ S100A6 και άγριου τύπου CacyBP /παρατηρήθηκε SIP στα κυτταρολύματα ΜΚΝ45-CacyBP? Ωστόσο, μεταλλαγμένο CacyBP /SIP που περικόπηκε από το aa178-229 περιοχή, παράγεται λίγο σήμα εις τον ποσοτικό προσδιορισμό συν-ανοσοκαταβύθιση. Ως εκ τούτου, το ακρωτηριασμένο μεταλλαγμένο CacyBP /SIP ονομάστηκε CacyBP /SIPΔS100 και παρέχει ένα χρήσιμο εργαλείο για τη διερεύνηση των επιπτώσεων της S100A6 για την βιολογική συμπεριφορά των CacyBP /SIP στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα.

Επιδράσεις της S100A6 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων που προκαλείται από CacyBP /SIP στο γαστρικό κυτταρική σειρά καρκίνου ΜΚΝ45

in vitro

η

ΜΤΤ και FACS προσδιορισμοί πραγματοποιήθηκαν για να εξετασθούν τα αποτελέσματα του S100A6 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων που προκαλείται από CacyBP /SIP σε ΜΚΝ45 κύτταρα

in vitro

. Σε σύγκριση με τις κενές μορφομετατροπείς φορέα, ΜΚΝ45-pFLAG, αμφότερα άγριου τύπου και CacyBP /SIPΔS100 μορφομετατροπείς έδειξαν σημαντικά μειωμένα ποσοστά του πολλαπλασιασμού των κυττάρων με τη δοκιμασία ΜΤΤ (

P

& lt? 0,05) (Εικ. 3Α). Ωστόσο, CacyBP /SIPΔS100 επιμολύνσεις παρουσίασαν σημαντικά περισσότερο μειωμένο ρυθμό ανάπτυξης σε σύγκριση με το αγρίου τύπου επιμολύνσεις CacyBP /SIP (

P

& lt? 0,05).

(Α) Ανίχνευση του ρυθμού ανάπτυξης των κυττάρων

in vitro

. Ο αριθμός των κυττάρων εκτιμήθηκε με απορρόφηση στα 490 nm με χρήση της ανάλυσης ΜΤΤ στους χρόνους που υποδεικνύονται. Η τιμή που εμφανίζεται είναι ο μέσος όρος των τριών προσδιορισμών. (Β) Η κατανομή κυτταρικού κύκλου και πολλαπλασιαστικών δεικτών (PI) των επιμολυσμένων κυττάρων. Τα κύτταρα εκχυλίζονται απορρυπαντικό, χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο, και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. PI = (G2 + S) /(G1 + S + G2).

Η

Τα αποτελέσματα της ανάλυσης του κυτταρικού κύκλου με FACS παρόμοια δείχνουν ότι η υπερέκφραση του είτε άγρια ​​ή μεταλλαγμένο CacyBP /SIP μειώνει τον πολλαπλασιασμό ΜΚΝ45. Ωστόσο, οι μέσες πολλαπλασιαστική ευρετήρια (ΡΙ) των κυττάρων ΜΚΝ45-ΔS100 (0,19 ± 0,03) ήταν χαμηλότερη από εκείνη των κυττάρων ΜΚΝ45-CacyBP (0.29 ± 0.02) (

P

& lt? 0,05) (Εικ. 3Β) . Στο σύνολό τους, αυτά τα στοιχεία δείχνουν έντονα ότι άγριου τύπου CacyBP /SIP αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ΜΚΝ45, ενώ CacyBP /SIPΔS100 εντείνει αυτή την αναστολή του πολλαπλασιασμού.

Επιδράσεις της S100A6 στην ογκογένεση προκαλείται από CacyBP /SIP στην ΜΚΝ45 γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή

in vitro

και

in vivo

η

Anchorage-ανεξάρτητη ανάπτυξη είναι ένα σημαντικό χαρακτηριστικό του

in vitro

ανάπτυξη του όγκου. Επομένως, εξετάσαμε αν τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης /SIP CacyBP ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων ΜΚΝ45 σε μέσα και μαλακό άγαρ. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Α και Β, η έκφραση /SIP CacyBP οδήγησε σε αξιοσημείωτη μείωση της κυτταρικής ανάπτυξης ΜΚΝ45 σε μια δοκιμασία σχηματισμού αποικίας, με μέση μείωση του 32,1% σε μέσο και 62,0% σε μαλακό άγαρ (

P

& lt? 0,05) . Ωστόσο, η επιμόλυνση των CacyBP /SIPΔS100 είχε ως αποτέλεσμα την ακόμη μεγαλύτερη μείωση στην ανάπτυξη με μια μέση μείωση στα ποσοστά του 84,2% σε μεσαίες και 82,8% σε μαλακό άγαρ (

P

& lt? 0,01).

(Α) Ανίχνευση του σχηματισμού κλωνογονικού σε μέσο. (Β) Ανίχνευση του σχηματισμού κλωνογονικού σε μαλακό άγαρ. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε μέσα που περιέχουν μαλακό άγαρ ή σε ένα πιάτο και επωάστηκαν για 20 ημέρες. Ο αριθμός των εστιών & gt? 100 μm μετρήθηκε. Κατακόρυφες ράβδοι παριστάνουν την μέση ± SD από τρία τουλάχιστον ξεχωριστά πειράματα, κάθε διεξήχθησαν εις τριπλούν. (C)

In vivo

ογκογονικότητα αξιολογήθηκε με ένα γυμνό δοκιμασία ποντικούς. Ποντίκια ενέθηκαν υποδορίως με 1 χ 10

7 επιμολυσμένα κύτταρα. Ο όγκος κάθε όγκου υπολογίστηκε σύμφωνα με τον τύπο 0.5 × μήκος × πλάτος

2. Δύο ανεξάρτητα πειράματα και κάθε πειραματική ομάδα αποτελείτο από πέντε ποντικούς.

*

P

& lt? 0,05

vs

ΜΚΝ45-pFLAG,

**

P

& lt?.. 0.01

vs

ΜΚΝ45 -pFLAG,

#

P

& lt?.. 0.05

vs

ΜΚΝ45-CacyBP

Η

Για να επιβεβαιώσετε αυτό το φαινόμενο

in vivo

, μπορούμε υποδόρια ένεση ΜΚΝ45-CacyBP, ΜΚΝ45-ΔS100 και τα κύτταρα ΜΚΝ45-pFLAG μέσα στο hypodermia λαιμό των άτριχων ποντικών. Μετά από τρεις εβδομάδες, ο μέσος όγκος του όγκου σε κάθε ομάδα ήταν σημαντικά διαφορετική από εκείνη των άλλων. Στο 5

ης εβδομάδας, ο μέσος όγκος του όγκου στην ομάδα ΜΚΝ45-pFLAG ήταν 776,9 ± 90,9 χιλιοστά

3, το οποίο είναι σημαντικά περισσότερο από εκείνη της ομάδας ΜΚΝ45-CacyBP (578,9 ± 51,2 χιλιοστά

3 ) (

P

& lt? 0,05), και ακόμη περισσότερο από εκείνη της ομάδας ΜΚΝ45-ΔS100 (364,9 ± 71,9 mm

3) (

P

& lt? 0,05) (Σχ. 4C).

Επιδράσεις της S100A6 για CayBP /SIP-μεσολάβηση β-κατενίνης υποβάθμιση

Ως ένα συστατικό της ουβικιτίνης συγκρότημα λιγάσης, CacyBP /SIP εμπλέκεται στην υποβάθμιση των μη φωσφορυλιωμένη β-κατενίνης μέσω δεσμευτική Skp1 και Siah1. Έτσι, η έκφραση της β-κατενίνης ανιχνεύθηκε για την αξιολόγηση έμμεσα την επιρροή του S100 για Siah1-CacyBP /SIP-Skp1 unbiquitin λιγάση. Πρώτον, δοκιμασία συνανοσοκαθίζησης έδειξε ότι περικομμένη μετάλλαξη CacyBP /SIP δεσμεύουν τόσο Skp1 και Siah1 (Εικ. 5Α), γεγονός που υποδηλώνει S100A6 δεν επηρεάζουν το σχηματισμό των Siah1-CacyBP /SIP-Skp1 συγκρότημα unbiquitin λιγάση. Δεύτερον, β- πρωτεΐνη κατενίνης στα κύτταρα ΜΚΝ45-ΔS100 είναι σημαντικά μειωμένη, σε σύγκριση με τα κύτταρα ΜΚΝ45-CacyBP, ενώ με δεν σημειώθηκαν αλλαγές στο mRNA (Εικ. 5Β). Επιπλέον, επειδή β-κατενίνης απαιτείται ως συμπαράγοντας για την ενεργοποίηση του παράγοντα μεταγραφής, Tcf /LEF, προσδιορίσαμε τις επιδράσεις της CayBP /SIPΔS100 στη δραστηριότητα /LEF Tcf χρησιμοποιώντας δοκιμασίες γονιδίου ανταποκριτή παροδική επιμόλυνση. Έκφραση των CacyBP /SIPΔS100 οδήγησε σε μείωση των δραστηριοτήτων /LEF τρισεκατομμυρίων κυβικών μέτρων από άγριου τύπου CacyBP /SIP (Εικ. 5C). MG132, αναστολέας του πρωτεασώματος, θα μπορούσε να εξαλείψει την επίδραση τόσο του άγριου τύπου CacyBP /SIP και CacyBP /SIPΔS100 σχετικά με τη δραστηριότητα /LEF τρισεκατομμυρίων κυβικών μέτρων. Στο σύνολό τους, έχουμε υποθέσει ότι S100A6 θα μπορούσε να επηρεάσει CayBP /SIP μεσολάβηση β-κατενίνης αποικοδόμησης μέσω αλληλεπίδρασης με CayBP /SIP.

δοκιμασίας (Α) Συν-ανοσοκατακρήμνιση έδειξε ότι περικομμένη μετάλλαξη CacyBP /SIPΔS100 δεσμεύουν τόσο Skp1 και Siah1, προτείνοντας S100A6 δεν επηρέασε το σχηματισμό Siah1-CacyBP /SIP-Skp1 συγκρότημα unbiquitin λιγάση. (Β) στύπωμα Western και ημι-ποσοτική RT-PCR χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση της πρωτεΐνης β-κατενίνης και mRNA σε επιμολυσμένα κύτταρα, αντίστοιχα. β-κατενίνης πρωτεΐνη στα κύτταρα ΜΚΝ45-ΔS100 είναι σημαντικά μειωμένη, σε σύγκριση με τα κύτταρα ΜΚΝ45-CacyBP, ενώ με δεν σημειώθηκαν αλλαγές στο mRNA. (Γ) Οι λουσιφεράσης δοκιμασίες γονιδίου ανταποκριτή χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση της επίδρασης CacyBP /SIPΔS100 σχετικά με τη δραστηριότητα ανταποκριτή Tcf /LEF. Η επιμόλυνση του άγριου τύπου CacyBP /SIP μειώνουν τη δραστικότητα /LEF Tcf, σε σύγκριση με τον έλεγχο του πλασμιδίου. Και έκφραση CacyBP /SIPΔS100 οδήγησε σε χαμηλότερη δραστηριότητα τρισεκατομμυρίων κυβικών μέτρων /LEF από άγριου τύπου CacyBP /SIP. MG132 (αναστολέας του πρωτεασώματος) θα μπορούσε να εξαλείψει την επίδραση τόσο του άγριου τύπου CacyBP /SIP και CacyBP /SIPΔS100 σχετικά με τη δραστηριότητα /LEF τρισεκατομμυρίων κυβικών μέτρων. *

P

& lt? 0,01, σε σύγκριση με τον έλεγχο?

#

P

& lt? 0,05, CacyBP /SIPΔS100

vs

άγριου τύπου CacyBP /SIP.. Αυτά τα πειράματα επαναλήφθηκαν εις τριπλούν

Η

Συζήτηση

Η οικογένεια πρωτεϊνών S100 έχουν κερδίσει το ενδιαφέρον, λόγω της διαφορικής έκφρασης τους σε ιστούς όγκων και τη συμμετοχή τους στην εξέλιξη του καρκίνου και μετάσταση [19] -. [ ,,,0],22]. S100 πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν με ορισμένες πρωτεΐνες-στόχους σε ασβέστιο-εξαρτώμενη ή ασβέστιο-ανεξάρτητο τρόπο και περαιτέρω ρύθμιση της λειτουργίας αυτών των στόχων [5], [23]. CacyBP /SIP είναι μια νέα πρωτεΐνη-στόχο που μπορεί να αλληλεπιδράσει με S100 πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένης S100A6, S100A1, S100B, και S100P, αλλά όχι να S100A4, καλβιδίνη D, παρβαλβουμίνη ή καλμοδουλίνη [8], [16]. Προηγούμενες εργασίες στο εργαστήριο μας έδειξαν ότι η υπερέκφραση του CacyBP /SIP θα μπορούσε να αναστείλει τον πολλαπλασιασμό και την ογκογένεση του καρκίνου του στομάχου και του καρκινώματος νεφρικών κυττάρων [11], [12]. Παρά την πρόοδο αυτή, απομένει να ερευνώνται οι επιδράσεις των S100 πρωτεϊνών σε CacyBP /SIP.

Για να διευκρινιστεί η ρύθμιση των S100 πρωτεϊνών σε λειτουργία /SIP CacyBP, κατασκευάσαμε το περικομμένο μεταλλαγμένο CacyBP /SIP, χωρίς δεσμευτική περιοχή πρωτεΐνης S100 , έτσι ώστε μεταλλαγμένη πρωτεΐνη δεν θα μπορούσαν να αλληλεπιδράσουν πρωτεΐνες S100 και διατηρεί την ικανότητα να αλληλεπιδρούν με Siah1 και Skp1. Σε αυτή τη μελέτη, ευκαρυωτικοί φορείς έκφρασης για άγριου τύπου CacyBP /SIP και περικομμένο μετάλλαγμα του ήταν ουσιαστικά εκφράζεται σε ΜΚΝ45 κύτταρα. Συν-ανοσοκατακρήμνιση κατέδειξε μία αλληλεπίδραση μεταξύ S100A6 και άγριου τύπου CacyBP /SIP σε ΜΚΝ45 κύτταρα. Ωστόσο, CacyBP /SIPΔS100 έδειξε μικρή σήμα με την δοκιμασία συν-ανοσοκαταβύθιση, υποδεικνύοντας μία ασθενή ή καθόλου αλληλεπίδραση με S100A6. πείραμα ΜΤΤ δοκιμασία, FACS δοκιμασία, κλωνογονική δοκιμασία και ξενομοσχεύματος όγκου σε γυμνούς ποντικούς πραγματοποιήθηκαν για να ελεγχθεί η επίδραση των άγριων και μεταλλαγμένων CacyBP /SIP στην κυτταρική ανάπτυξη και ογκογένεση τόσο

in vitro

και

in vitro

. Αυτά τα πειράματα έδειξαν ότι η υπερέκφραση του CacyBP /SIP θα μπορούσε να αναστείλει τον πολλαπλασιασμό και την ογκογένεση του ΜΚΝ45 γαστρικών καρκινικών κυττάρων. Σημαντικά, τα κύτταρα επιμολυσμένα με CacyBP /SIPΔS100 επέδειξαν πιο έντονη επιδράσεις σε σχέση με προϊόντα επιμόλυνσης άγριου τύπου, υποδηλώνοντας ότι S100 πρωτεΐνες μπορεί να ρυθμίζουν αρνητικά την αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων που προκαλείται από CacyBP /SIP σε γαστρικό καρκινικά κύτταρα.

Ο μηχανισμός που χρησιμοποιείται από S100A6 να διαμορφώνει CacyBP λειτουργία /SIP μπορεί να βρίσκονται σε αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών και των λειτουργιών. CacyBP /SIP προσδιορίζεται ότι εμπλέκεται στην ουβικιτινίωση και την υποβάθμιση του β-κατενίνης [24] – [28]. β- κατενίνης βρέθηκε να υπερεκφράζεται ή ενεργοποιείται σε πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα και σε πολλούς όγκους [29] – [31]. Fukushima et al. [32] βρήκαν ότι κύτταρα CacyBP /SIP knockout εμφανίζουν διαταραγμένη (β-κατενίνης και της υποβάθμισης ενός σημείου ελέγχου G1 ελαττωματικό κυτταρικού κύκλου, υποδεικνύοντας ότι η β-κατενίνης οδός αποδόμησης που προκαλείται από CacyBP /SIP ορίζει ένα ουσιαστικό σημείο ελέγχου για την ανάπτυξη των θυμοκυττάρων και την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου. Μας προηγούμενες μελέτες έδειξαν επίσης ότι CacyBP /SIP αναστέλλει την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό των γαστρικών καρκινικών κυττάρων εν μέρει μέσω της υποβάθμισης του β-κατενίνης. Είτε S100 ρυθμίζει CacyBP /SIP μεσολάβηση ουμπικιτίνης λιγάση διατηρεί άγνωστη. Συσσωρευμένα αποδείξεις έδειξαν ότι πολλά μέλη της οικογένειας πρωτεϊνών S100 θα μπορούσε να ρυθμίσει η ενεργοποίηση των πρωτεϊνών στόχων τους [33], [34]. Ένα πρόσφατα ανακαλύφθηκε ομόλογο μαγιά της CacyBP /SIP, Sgt1, δεν αλληλεπιδρά μόνο με πρωτεΐνες S100 σε ασβέστιο ρυθμίζονται-τρόπο, αλλά συνδέει επίσης με Skp1 να σχηματίσουν Skp1 /cullin1 /F -.. συγκρότημα ουβικιτίνη κουτί λιγάσης [35] έχει βρεθεί ότι S100A6 θα μπορούσε να αναστείλει την φωσφορυλίωση Sgt1 από κινάσης καζεΐνης II να επηρεάσει την δραστηριότητα [36] το παρόν πείραμα μας, εντοπίσαμε επίσης ότι CacyBP /SIPΔS100 διατηρούν την ικανότητα να συνδέσουν με Skp1 και Siah1, προτείνοντας S100 μόριο δεν μπορεί να επηρεάσει το σχηματισμό της Siah1 /Skp1 /CacyBP συγκρότημα ουβικιτίνης λιγάση. Παρ ‘όλα αυτά, η πρωτεΐνη β-κατενίνης χωρίς αλλαγή του επιπέδου mRNA σε /SIPΔS100 επιμολυσμένα κύτταρα CacyBP είναι αισθητά χαμηλότερη από κύτταρα επιμόλυνσης άγριου τύπου. Η μεταγραφική δραστικότητα του Tcf /LEF, ενός γονιδίου στόχου της β-κατενίνης, μειώθηκε σε συνδυασμό με το μεταλλαγμένο CacyBP /SIP χωρίς δεσμευτικό S100, σε σύγκριση με τα άγρια ​​CacyBP /SIP. Accoding σε αυτά τα αποτελέσματα, έχουμε υποθέτουν ότι S100 πρωτεΐνη μπορεί να ρυθμίζει αρνητικά τη δραστηριότητα των Siah1-CacyBP /SIP-Skp1 ουβικιτίνης λιγάση από την αλληλεπίδραση με CacyBP /SIP. Έτσι μπλοκάροντας τον συνδυασμό S100 και CacyBP /SIP θα μπορούσε να προωθήσει β-κατενίνης αποικοδόμηση, να οδηγήσει σε αναστολή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων. Αυτή η κερδοσκοπία μπορεί να υποστηρίζονται μερικώς από τον Lee et al ότι σε κύτταρα με μειωμένη στάθμη του S100A6 η ποσότητα του β-κατενίνης μειώνεται [26]. Τα αποτελέσματα είναι σε συμφωνία με τα δεδομένα που αφορούν την αυξητική ρύθμιση των πρωτεϊνών S100 και ανεπαρκή αποικοδόμηση της β-κατενίνης β στον όγκο και πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα [37]. Επιπλέον, CacyBP /SIP δείχθηκε να αλληλεπιδρά με τουμπουλίνη και ERK1 /2 και παίζουν σημαντικό ρόλο στην αναδιατάξεις του κυτταροσκελετού, κυτταρική διαφοροποίηση ή εκφυλισμό [38] – [42].

Συμπεράσματα

πρωτεΐνη S100A6 ρυθμίζει αρνητικά CacyBP /SIP μεσολάβηση αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων γαστρικού καρκίνου, εν μέρει μέσω επίδραση στην αποικοδόμηση β-κατενίνης και μεταγραφική ενεργοποίηση του Tcf /LEF. Ωστόσο, οι υποκείμενοι μηχανισμοί για τη ρύθμιση των S100A6 σε πρωτεΐνη ουμπικουιτίνωση και άλλες λειτουργίες μέσω CacyBP /SIP-εξαρτώμενο μονοπάτι απαιτούν περαιτέρω διερεύνηση.