Αφηρημένο

θεραπεία πρώτης γραμμής ασθενών με καρκίνο ανθεκτικό ευνουχισμού του προστάτη (CRPC) περιλαμβάνει κατά κύριο λόγο τη χορήγηση της docetaxel χημειοθεραπείας. Δυστυχώς, η αντίσταση στη θεραπεία με docetaxel είναι μια τελευταία εμφάνιση. Οι αλλαγές σε υποδοχέα ανδρογόνων (AR), την έκφραση και τη σηματοδότηση που σχετίζεται μηχανισμών που διέπουν την αντίσταση στη θεραπεία docetaxel σε CRPC. Θερμικού σοκ πρωτεΐνη 90 (Hsp90) είναι ένας μοριακός συνοδός, η οποία ρυθμίζει την ενεργοποίηση, την ωρίμανση και τη σταθερότητα των κρίσιμων σηματοδοτικών πρωτεϊνών που εμπλέκονται στον καρκίνο του προστάτη, συμπεριλαμβανομένου του AR. Αυτή η γνώση και πρόσφατες εξελίξεις στην ένωση σχεδιασμό και την ανάπτυξη ανέδειξαν Hsp90 ως ένας ελκυστικός θεραπευτικός στόχος για τη θεραπεία του CRPC. Έχουμε αναφερθεί πρόσφατα την ανάπτυξη ενός ευνουχισμού MYC-Cap ανθεκτικά (MYC-CAP /CR) μοντέλο όγκου μεταμόσχευσης, η οποία εκφράζει ενισχύεται άγριου τύπου AR. Μέσα, αναφέρουμε ότι μια δεύτερη γενιά αναστολέας της Hsp90, NVP-AUY922, αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων και διεγείρει σημαντικά τον κυτταρικό θάνατο σε κυτταρικές σειρές /CE2 PTEN-Cap MYC-Cap /CR και. NVP-AUY922 που προκαλείται υποβάθμιση του πρωτεασώματος του AR, αν και έχει ενδιαφέρον δεν απαιτεί απώλεια πρωτεΐνης AR για την αναστολή της δραστηριότητας της μεταγραφής AR. Περαιτέρω, NVP-AUY922 αυξημένη τοξικότητα της docetaxel σε κυτταρικές σειρές /CE2 PTEN-Cap MYC-Cap /CR και

in vitro

. Τέλος, NVP-AUY922 /docetaxel θεραπεία συνδυασμού σε ποντίκια που φέρουν MYC-CAP /CR όγκων οδήγησε σε μεγαλύτερη δραστικότητα κατά του όγκου σε σύγκριση με μόνο θεραπεία. Αυτή η μελέτη καταδεικνύει ότι NVP-AUY922 εκμαιεύει ισχυρή δραστικότητα προς σηματοδότηση AR και αυξάνει απόκριση χημειοθεραπεία σε ένα μοντέλο ποντικού CRPC, παρέχοντας σκεπτικό για την συνεχιζόμενη κλινική ανάπτυξη αναστολέων Hsp90 σε κλινικές δοκιμές για τη θεραπεία του CRPC ασθενών.

Citation : Ku S, Lasorsa Ε, Adelaiye R, Ramakrishnan S, Ellis L, Πύλη R (2014) Αναστολή της Hsp90 Augments Docetaxel θεραπείας σε ευνουχισμού Ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 9 (7): e103680. doi: 10.1371 /journal.pone.0103680

Επιμέλεια: Μπαντάνα Chatterjee, Πανεπιστήμιο του Τέξας Κέντρο Διάδοσης Επιστημών Υγείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 16 Ιουλίου, 2013? Αποδεκτές: 6 Ιουλίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 29 Ιουλίου του 2014

Copyright: © 2014 Ku et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη ήταν εν μέρει υποστηρίζεται από το Υπουργείο άμυνας – PC094159 (LE) και το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου – P50 CA58236 (RP). Οι χρηματοδότες δεν έχουν κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς θα ήθελαν να δηλώσει τα ακόλουθα συγκρούσεις: Roberto Πύλη υπήρξε μια πληρωμένη σύμβουλος και έλαβε χρηματοδότηση της έρευνας από τη Novartis. Ως εκ τούτου, αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

ευνουχισμού ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη (CRPC) είναι μια ανίατη και επιθετικό καρκίνο του προστάτη (PCA) φαινότυπο. Για αρκετά χρόνια, η κύρια θεραπευτική επιλογή του CRPC έχει περιοριστεί σε docetaxel χημειοθεραπεία, η οποία εκτείνεται επιβίωση αν και για περιορισμένο χρονικό διάστημα [1]. Ενώ η θεραπεία της CRPC υπήρξε εξαιρετικά δύσκολο, τα τελευταία 2 χρόνια έχει δει μια δραματική αλλαγή στις θεραπευτικές επιλογές για την ασθένεια αυτή. Η δεύτερη καμπαζιταξέλης γραμμή [2], η ανοσοθεραπεία sipuluecel-T [3], η οξική σύνθεση ανδρογόνων αναστολέα αμπιρατερόνη [4], η enzalutamide ανταγωνιστής AR [5], και το ράδιο-223 [6] έχουν λάβει όλα τα τελευταία έγκριση του FDA για το μεταχείριση των CRPC. Αν και αυτές οι νέες θεραπείες έχουν διευρύνει τις επιλογές θεραπείες για τους ασθενείς, βιώσιμη καταστολή της ανάπτυξης CRPC παραμένει ακόμη απαιτούνται πρωταρχική πρόκληση και νέες στρατηγικές θεραπείας.

Επειδή docetaxel είναι μια αποτελεσματική θεραπεία, παραμένει ακόμα ένα κρίσιμο συστατικό για την στρατηγική θεραπείας πρώτης γραμμής της CRPC. Ξεπερνώντας τόσο απέκτησε και ενδογενή ανθεκτικότητα σε docetaxel υπήρξε μια σημαντική κλινική πρόκληση και βελτίωση των αποτελεσμάτων της θεραπείας για τους ασθενείς με αντίσταση docetaxel είναι υψηλής προτεραιότητας. Με μια μεγαλύτερη κατανόηση των υποκείμενων μηχανισμών της ανθεκτικότητας στα φάρμακα, οι νέες θεραπευτικές ευκαιρίες που παρουσιάζονται. Αυτό μπορεί να δημιουργήσει προοπτικές για τη θεραπεία μονοθεραπείας docetaxel αντίστασης CRPC ή ενδεχομένως νέου ευαισθητοποιήσει CRPC ασθενείς σε θεραπεία με docetaxel με νέες στρατηγικές συνδυασμού.

Στόχευση τον άξονα ανδρογόνων-AR με οξικό αμπιρατερόνη [4] και enzalutamide [5], ως μονοθεραπεία σε ασθενείς με docetaxel ανθεκτικά CRPC έδειξε κλινικό όφελος. Ενώ η άμεση στόχευση της δράσης AR κυρίως επιθυμητό, ​​έμμεση στόχευση, μέσω αναστολής της AR που σχετίζονται πρωτεΐνες είναι μια ελκυστική προσέγγιση. Η μοριακή συνοδός Hsp90 είναι ένα μέλος της οικογένειας πρωτεϊνών θερμικού σοκ [7] και βρέθηκε να υπερεκφράζεται σε πολλούς καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου PCa. Hsp90 έχει πάνω από 200 τεκμηριωμένες πελάτες, συμπεριλαμβανομένου του AR, όπου Hsp90 αποτρέπει την υποβάθμιση του πρωτεασώματος και σταθεροποιεί AR διαμόρφωση έτοιμη για την ενεργοποίηση συνδέτη [7]. Επειδή Hsp90 αλληλεπιδρά με πολλαπλές πρωτεΐνες πελάτη, γίνεται αντιληπτό ότι η αναστολή της Hsp90 μπορεί να επαυξήσει ένα μεγαλύτερο καταστροφική επίδραση κατά του όγκου σε σύγκριση με πιο άμεση στοχευμένες θεραπείες. Σε προκλινικές μελέτες, η αναστολή Hsp90 μόνος [8], [9], ή πιο πρόσφατα, σε συνδυασμό [10], [11] που έχει παραχθεί ελπιδοφόρα αποτελέσματα στη θεραπεία των κυττάρων του προστάτη. Δυστυχώς, οι αναστολείς της HSP90 πρώτη γενιά δεν οδήγησε σε σημαντική αποτελεσματικότητα σε κλινικές δοκιμές [12] – [14]. Αυτές οι αρχικές αναστολείς Hsp90 γνωστή ως γελδαναμυκίνη ανάλογα, 17-αλλυλαμινο-17 δεμεθοξυγελδαναμυκίνη (17-ΑΑΟ) και 17- (dimethylaminotheyl-αμινο) -17-δεμεθοξυγελδαναμυκίνη (17-DMAG) αποδόθηκαν να αποτύχει στην κλινική λόγω της κακής διαλυτότητας και της φαρμακοκινητικής , ηπατοτοξικότητα, ευαισθησία σε Ρ-γλυκοπρωτεΐνη εκροή και η έλλειψη του μεταβολισμού από ένζυμα NQO1 /DT-διαφοράση [15].

NVP-AUY922 (AUY922) είναι ένα resorcinlyic ισοξαζόλη αμίδιο (Εικ. 1Α) αποδειχθεί ότι είναι ένα ισχυρός αναστολέας της Hsp90 [16]. AUY922 είναι ένα ανάλογο μη-γκελνταναμυκίνη, και δεν παρουσιάζει τους περιορισμούς των αναλόγων γκελνταναμυκίνη, γι ‘αυτό καθιστώντας παράγοντα πιο ελπιδοφόρα για την κλινική δοκιμή. AUY922 διαμεσολαβεί την δράση της με την περιοχή πρόσδεσης ΑΤΡ της Hsp90 Ν-άκρο να αναστέλλουν την λειτουργία συνοδού της Hsp90. Η ενέργεια αυτή οδηγεί στην υποβάθμιση proteosomal αρκετών καρκίνο σχετικών πρωτεϊνών πελάτης [16], συμπεριλαμβανομένων AR [17]. AUY922 απέδειξε δραστικότητα κατά του όγκου σε μια ποικιλία στερεών όγκων προ-κλινικά μοντέλα ποντικού, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη PC3 κυττάρων και ξενομοσχεύματα [16], [18]. Πιο πρόσφατα, νέα αναστολείς Hsp90 γενιάς, συμπεριλαμβανομένης AUY922 έχουν αναφερθεί για την επίτευξη βιολογικές αποκρίσεις σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη και του καρκίνου του ιστού του προστάτη του ανθρώπου σε σύγκριση με το ανάλογο γκελνταναμυκίνη 17-AAG [17]. Φάση Ι και ΙΙ μελέτες σε αιματολογικές κακοήθειες και συμπαγείς όγκους, συμπεριλαμβανομένων του καρκίνου του μαστού και πολλαπλό μυέλωμα, βρίσκονται σε εξέλιξη με AUY922.

(Α) Χημική δομή του ΚΠΑ-AUY922. (Β) ευνουχισμού ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές (MYC-CAP /CR και ΡΤΕΝ-CAP /CE2) υποβλήθηκαν σε αγωγή με υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις AUY922 για 48 ώρες. Τα προσκολλημένα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 70% EtOH. Η ανάπτυξη των κυττάρων εκτιμήθηκε με χρώση στερεωμένα κύτταρα με κρυσταλλικό ιώδες και μετρώντας την απορρόφηση στα 570 nm. Κάθε σημείο κανονικοποιήθηκε με το μη επεξεργασμένο έλεγχο (0) και αντιπροσωπεύεται από 3 ανεξάρτητα πειράματα, οι μέσες ± SE. (C) MYC-CAP /CR και ΡΤΕΝ-CAP /CE2 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις AUY922 για 48 ώρες. Προσκολλητικά και μη προσκολλητικά κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν σε 1χ PBS. Τα κύτταρα επωάστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο και ο κυτταρικός θάνατος εκτιμήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Κάθε σημείο αντιπροσωπεύει μέση ± SE από 3 ανεξάρτητα πειράματα. * Υποδηλώνει ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με το μη επεξεργασμένο μάρτυρα (0), με δύο-tailed t-test

Η

Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να δοκιμαστεί η ικανότητα του AUY922 να ανταγωνίζονται την μεταγραφική ή /και πρωτεΐνες. σταθερότητα του AR στον καρκίνο του προστάτη κυτταρικές γραμμές /CE2 ΡΤΕΝ-Cap ευνουχισμού ανθεκτικά MYC-CAP /CR και καθώς και ένα μοντέλο ποντικού μεταμόσχευσης αναπτύχθηκε πρόσφατα στο εργαστήριο μας [19], [20]. Περαιτέρω, θελήσαμε να διερευνήσουμε την αντικαρκινική και θεραπευτική αποτελεσματικότητα των AUY922 ως μονοθεραπεία και σε συνδυασμό με ντοσεταξέλη χημειοθεραπεία.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Το Ινστιτούτο των ζώων φροντίδα και Επιτροπή Χρήσης (IACUC) στο Roswell Park Cancer Institute (RPCI) ενέκρινε όλα τα πρωτόκολλα ποντικιού που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη. Μας ID έγκριση /πρωτόκολλο είναι 1137M.

κυτταρικής καλλιέργειας και αντιδραστηρίων

Απομόνωση ενός ευνουχισμού ανθεκτική κυτταρική γραμμή MYC-Cap.

Η MYC-CAP /CR κυτταρική γραμμή ήταν που παράγεται από τα προηγουμένως αναφερθεί μοντέλο [19] μας MYC-Cap ευνουχισμού ανθεκτικά μεταμόσχευση του όγκου. MYC-Cap /τεμάχια όγκου CR (~ 4 mm

2) τοποθετήθηκαν σε μια πλάκα καλλιέργειας 6 φρεατίων και απομακρύνεται αφού καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες σε συμπληρωμένο ϋΜΕΜ μέσα υψηλής γλυκόζης (10% FBS? 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη). Τα προσκολλημένα κύτταρα ήταν ένας μεικτός πληθυσμός κυττάρων όγκου MYC-CAP /CR και ινοβλάστες. Αυτά τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν μέχρι περίπου το 80% συρροή. Σειριακό πέρασμα αυτών των ετερογενών πολιτισμών έγινε, μέχρι ένα ομοιογενές μονοστιβάδα MYC-CAP /κυττάρων CR ήταν παρούσα. MYC-Cap κυτταρικές γραμμές /CR διαπιστώθηκε στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν σε μέσο DMEM (Gibco) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη στους 37 ° C, 5% CO

2. ΡΤΕΝ-Cap /κυττάρων cE2cE2 ήταν ένα είδος δώρο από τον Dr. Roy-Burman (Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνιας, Λος Άντζελες) και καλλιεργήθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ (Gibco) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη στους 37 ° C, 5% CO

2. PC3 κύτταρα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC) και διατηρήθηκε σε RPMI 1640 (Gibco) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη στους 37 ° C, 5% CO

2.

για

in vitro

πειράματα, NVP-AUY922 (Novartis) διαλύθηκε σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) για την παρασκευή διαλυμάτων αποθέματος (10 mM). Το συνθετικό ανδρογόνο, μεθυλοτριενολόνη (R1881? Sigma-Aldrich), διαλύθηκε σε αιθανόλη για την παρασκευή διαλυμάτων αποθέματος (10 mM). Ο αναστολέας πρωτεασώματος, MG132 (Sigma-Aldrich), διαλύθηκε σε DMSO για την παρασκευή διαλυμάτων αποθέματος (10 mM). Ο αναστολέας μετάφρασης, κυκλοεξιμίδη (Sigma-Aldrich), διαλύθηκε σε αιθανόλη για την παρασκευή διαλυμάτων αποθέματος (5 mg /ml). Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν για την ανοσοκηλίδωση και /ή ανοσοϊστοχημεία (IHC) ήταν αντι-υποδοχέα ανδρογόνου (Santa Cruz), GAPDH (Cell Signaling), c-MYC (Epitomics) και ενεργοποιημένου κασπάσης 3 (Cell Signaling). Για

in vivo μελέτες

, docetaxel λήφθηκε από το φαρμακείο Roswell Park Cancer Institute και αραιώνονται σε 1 mg /ml σε PBS πριν από τη χορήγηση στα ζώα. NVP-AUY922 διαλύθηκε σε 5% δεξτρόζη σε απεσταγμένο νερό (D5W) σε μια συγκέντρωση 4 mg /ml.

Δοκιμασίες

Η κυτταρική ανάπτυξη και τον κυτταρικό θάνατο

MYC-CAP /CR ή Pten- κύτταρα καπάκι /CE2 (4 × 10

4 /ml) αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύχτα σε πλάκες 24 φρεατίων (Βϋ Biosciences) και επωάστηκαν με δεικνυόμενες συγκεντρώσεις του NVP-AUY922 για 24 και 48 ώρες. Η κυτταρική ανάπτυξη μετρήθηκε με στερέωση και χρώση των προσκολλημένων κυττάρων με 10% μεθανόλη σε κρυσταλλικό ιώδες επί 30 λεπτά. Χρωματισμένα κύτταρα έγιναν διαλυτά σε απόλυτη μεθανόλη και η απορρόφηση ανιχνεύθηκε σε μήκος εκπομπής 570 nm. Η βιωσιμότητα (κυτταρικός θάνατος) μετρήθηκε με επώαση προσκολλημένων και μη προσκολλημένων κυττάρων με 1 μg /ml ιωδιούχου προπιδίου (Sigma-Aldrich) πρόσληψη και ποσοτικά με ένα FACS Caliber κυτταρόμετρο ροής.

κηλίδος Western

MYC-Cap /CR ή ΡΤΕΝ-CAP /CE2 κύτταρα πλύθηκαν σε PBS και λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA (Sigma-Aldrich) που περιείχε 1 χ αναστολείς πρωτεάσης και φωσφατάσης (Sigma-Aldrich). Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιώντας 4-15% πηκτές βαθμίδωσης SDS-PAGE (Bio-Rad) και η πρωτεΐνη μεταφέρθηκε σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Biometra). Δευτερογενής HRP συζευγμένα αντισώματα ήταν από την Dako. Η ανίχνευση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια χημειοφωταύγειας (PerkinElmer).

μεταγραφική δραστηριότητα των υποδοχέων ανδρογόνων

Η ανδρογόνων κατάσταση ανταπόκριση του MYC-Cap κύτταρα /CR προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα εμπορικά διαθέσιμο κιτ λουσιφεράσης αναφερθεί λεντοϊού που βασίζονται (Cignal Lenti AR Reporter (Luc) κιτ? SABioscience) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή

Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

Το συνολικό RNA εξήχθη από ΤΚΙζοΙ (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.. Ένα μικρογραμμάριο RNA χρησιμοποιήθηκε για να εκτελέσει σύνθεση cDNA με κιτ σύνθεσης cDNA iScript (Bio-Rad). Ένα μικρολίτρο της αντίδρασης σύνθεσης cDNA στη συνέχεια υποβλήθηκε σε ενίσχυση PCR με τη χρήση iQ SYBR πράσινο kit (Bio-Rad). σήματα PCR καταγράφηκαν και αναλύθηκαν με σύστημα ανίχνευσης PCR πραγματικού χρόνου Bio-Rad CFX Connect. Οι αλληλουχίες των εκκινητών είναι: FKBP5 προς τα εμπρός, 5 ‘GCCGACTGTGTGTGTAATGC 3’, και αντίστροφη, 5 ‘CACAATACGCACTTGGGAGA 3’? GAPDH προς τα εμπρός, 5 ‘GTCTTCACCACCATGGAGAAG 3’, και να αντιστραφεί, 5’CAAAGTTGTCATGGATGACCTTGG 3 ‘. τιμές ΔΔCt υπολογίστηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό φορές μεταβολές του mRNA.

Ιστολογία /Ανοσοϊστοχημεία

Τα ποντίκια θυσιάστηκαν με CO

2 ασφυξία κατά καθορισμένα χρονικά σημεία. Ιστός όγκου καθορίστηκε σε ρυθμισμένη φορμαλίνη 10% για όλη τη νύχτα ακολουθούμενη από επιπλέον 24 ώρες σε 70% αιθανόλη. Για ανάκτηση αντιγόνου, διαφάνειες έβρασαν για 10 λεπτά σε 10 mM κιτρικού νατρίου ρΗ 6 λύση για όλα τα αντισώματα. ImmPRESS σύστημα ανίχνευσης (Vector Laboratories) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση όλων των πρωτογενών αντισωμάτων. Η χρώση έγινε ορατή χρησιμοποιώντας 3,3′-διαμινοβενζιδίνη (DAB) (Sigma, Saint Louis, ΜΟ, FAST 3,3′-διαμινο βενζιδίνη) και πλακίδια με αιματοξυλίνη. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό της χρώσης IHC αντιπροσωπευτικών εικόνων (3-6) ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα ελαφρύ μικροσκόπιο Zeiss (Zeiss). Θετική πυρηνική χρώση για c-myc και της ενεργοποιημένης κασπάσης 3 ποσοτικά με Aperio ImageScope (v11.1.2.760).

In vivo μελέτες σε ζώα

Το Ινστιτούτο Φροντίδας Ζώων και Χρήση επιτροπής σε Roswell Park Cancer Institute εγκριθεί όλα τα πρωτόκολλα ποντικού που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη. Οι ποντικοί στεγάστηκαν σε μια εγκατάσταση ζώο διατηρήθηκαν σε ένα κύκλο φωτός /σκότους 12-h φως, σε μια σταθερή θερμοκρασία (22 ± 2 ° C) και σχετική υγρασία (55 ± 15%). Το νερό της βρύσης και τα τρόφιμα ήταν διαθέσιμα

κατά βούληση

. FVB αρσενικά ποντίκια (ηλικίας 4-6 εβδομάδων) αγοράστηκαν από την NCI Frederick (Maryland, USA). SCID ποντίκια αγοράστηκαν από το σπίτι αποικία διατηρήθηκε στο Roswell Park Cancer Institute. Όλοι οι ποντικοί χειρουργική ευνουχισμένοι μέχρι 10 ημέρες πριν από τον εμβολιασμό του όγκου. Χειρουργικός ευνουχισμός πραγματοποιήθηκε με ξύρισμα της χειρουργικής θέσης. Μια τομή έγινε στο όσχεο και στο χιτώνα των όρχεων με το ψαλίδι. Η όρχεων, σπερματικού πόρου και επισυνάπτεται το λίπος των όρχεων μαξιλάρι απομακρύνθηκαν μέσω του site τομής. Η θέση της τομής θα κλείσει με χειρουργικούς συνδετήρες. Η ανεξάρτητη μοντέλο LuCaP23 ανδρογόνων (AI) ξενομόσχευμα [21] ήταν ένα γενναιόδωρο δώρο από τον Dr Robert Vessella (University of Washington, Seattle WA). Το μοντέλο αυτό διατηρήθηκε από σειριακό πέρασμα του ιστού του όγκου σε προ-ευνουχισμένα SCID αρσενικά ποντίκια.

μελέτες θεραπείας.

Pre-ευνουχισμένα αρσενικά FVB αρσενικά ποντίκια εμβολιάστηκαν με MYC-CAP /κύτταρα CR ( 1 × 10

6) σε PBS με υποδόρια ένεση. Ομοίως, προ-ευνουχισμένα αρσενικά SCID ποντίκια εμβολιάστηκαν με PC3 (1 × 10

6) κύτταρα αιωρούμενα σε PBS με υποδόρια ένεση, ή εμφυτεύεται με ένα κομμάτι όγκου LuCaP 23 AI (4 mm

2) υποδορίως. Για τις μελέτες docetaxel μόνο θεραπεία, τα ποντίκια που φέρουν όγκο έλαβαν θεραπεία με docetaxel (10-50 mg /kg μία φορά την εβδομάδα? Ενδοπεριτοναϊκή ένεση). Για τις μελέτες συνδυασμού, τα ζώα που φέρουν όγκο έλαβαν όχημα (D5W), docetaxel (10 mg /kg, μία φορά την εβδομάδα? Ενδοπεριτοναϊκή ένεση), NVP-AUY922 (40 mg /kg, 5 ημέρες σε 2 ημέρες μακριά? Ενδοπεριτοναϊκή ένεση) ή συνδυασμό. Σε όλες τις μελέτες, οι ποντικοί ζυγίστηκαν εβδομαδιαίως για την παρακολούθηση για την τοξικότητα. Η ανάπτυξη του όγκου εκτιμήθηκε με διαδοχικές μετρήσεις καλίμπρας δύο φορές την εβδομάδα.

Στατιστική Ανάλυση

Τα δεδομένα εμφανίζονται ως η μέση ± SE. Οι διαφορές προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας έναν ή αμφίδρομη ΑΝΟνΑ και δίπλευρη ζευγαρωμένα t τεστ όπου υποδεικνύεται, με τη χρήση του λογισμικού GraphPad Prism. Οι τιμές Ρ μικρότερη από 0,05 ανατέθηκαν στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

Ανταπόκριση από ανθεκτικό ευνουχισμού κυττάρων καρκίνου του προστάτη σε θεραπεία AUY922

in vitro

Η

MYC-Cap ευνουχίσει ανθεκτικά ανθεκτικά κύτταρα (MYC-CAP /CR) και PTEN-cap ευνουχισμού (PTEN-CAP /CE2) εκτέθηκαν για 48 ώρες σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις AUY922. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Β, χαμηλές συγκεντρώσεις nanomolar του AUY922 ήταν επαρκή για να αναστείλει την ανάπτυξη των MYC-Cap /CR και ΡΤΕΝ-cap κύτταρα /CE2. Περαιτέρω, AUY922 προκάλεσε μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση στον κυτταρικό θάνατο του MYC-Cap /CR και PTEN-CAP /κυττάρων CE2 σε συγκεντρώσεις 50-500 nM με βάση την ανάλυση της πρόσληψης ΡΙ (p & lt? 0,05? Εικ. 1Γ).

AUY922 προκαλεί υποβάθμιση του πρωτεασώματος των AR και αναστέλλει AR μεταγραφική δραστηριότητα στην MYC-Cap /CR και PTEN-CAP /cE2Pten κεφαλαιοποίησης κύτταρα /CE2

είναι τεκμηριωμένο ότι η αναστολή Hsp90 οδηγεί συχνά στην υποβάθμιση πρωτεασώματος της πρωτεΐνες πελάτης [16]. Εμείς γι ‘θέλησε να προσδιορίσει τη σταθερότητα της πρωτεΐνης AR ή /και μεταγραφική δραστηριότητα εξασθενημένος από AUY922 σε ανθεκτικά ευνουχισμού μοντέλα μας. MYC-Cap /CR και ΡΤΕΝ-cap /κυττάρων CE2 σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις AUY922 επί 48 ώρες έδειξε μια εξαρτώμενη απώλεια δόση AR πρωτεΐνης, πιο αξιοσημείωτο σε συγκεντρώσεις 100 ηΜ και 500 ηΜ (Σχ. 2Α και 2C). Ταυτόχρονη θεραπεία με AUY922 και τον αναστολέα πρωτεασώματος, MG132 (0,5 μΜ), επιβεβαίωσε ότι AUY922 μεσολάβηση απώλεια AR πρωτεΐνης ήταν από την υποβάθμιση πρωτεασώματος (Εικ. 2Α). Η επίδραση της AUY922 επί AR μεταγραφική δραστικότητα αξιολογήθηκε με τη χρήση MYC-CAP /κυττάρων CR με σταθερή έκφραση ενός ανταποκριτή λουσιφεράσης καθοδηγείται από στοιχεία απόκρισης ανδρογόνων (ARE-Luc). MYC-Cap /κυττάρων CR /ARE-Luc επωάστηκαν με αυξανόμενες συγκεντρώσεις AUY922 και 1 ηΜ R1881 ταυτόχρονα την διάρκεια της νύχτας ή σε προεπεξεργασία με 1 ηΜ R1881 για 4 ώρες ακολουθούμενη από αυξανόμενες συγκεντρώσεις AUY922 τη διάρκεια της νύχτας. Λόγω της συστατική έκφραση λουσιφεράσης σε κύτταρα ΡΤΕΝ-Cap /CE2, αξιολογήσαμε το επίπεδο έκφρασης του mRNA του AR κατάντη γονιδίου, FKBP5, να διερευνηθεί η επίδραση της AUY922 επί AR μεταγραφική δραστηριότητα. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι AUY922 αναστέλλει τη δράση μεταγραφικής AR σε χαμηλές συγκεντρώσεις nanomolar τόσο ευνουχισμού ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές (Σχ. 2Β και 2C). Περαιτέρω, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν επίσης ότι η υποβάθμιση του AR πρωτεΐνη δεν απαιτείται για AUY922 να ανταγωνίζονται μεταγραφή AR. Επιπλέον, χρησιμοποιήσαμε κυκλοεξιμιδίου να μπλοκάρουν νέα πρωτεϊνική σύνθεση που να υποδηλώνουν περαιτέρω ότι η χαμηλή νανομοριακή AUY922 είναι σε θέση να μειώσει μεταγραφική δραστηριότητα AR χωρίς να επηρεάζουν το επίπεδο της πρωτεΐνης AR (Σχ. 2D).

(Α) MYC-Cap ευνουχισμού ανθεκτικά κυττάρων υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 48 ώρες με αυξανόμενες συγκεντρώσεις AUY922 ή αυξανόμενων συγκεντρώσεων AUY922 ταυτόχρονα με την MG132 αναστολέα πρωτεασώματος [0,5 μΜ]. Η έκφραση της πρωτεΐνης AR αξιολογήθηκε με κηλίδα western. κυτταρικές γραμμές (Β) MYC-CAP /CR με σταθερή επιμόλυνση ενός πλασμιδίου AR ανταποκριτή (ARE-Luc) επωάστηκαν σε συνθήκες κυτταρικής καλλιέργειας ανδρογόνων εξαντλημένο για 6 ώρες. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή ταυτόχρονα με 1 ηΜ R1881 και υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις AUY922 τη διάρκεια της νύχτας ή προ-επεξεργασία με 1 ηΜ R1881 για 4 ώρες πριν από την προσθήκη των υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις της έντασης AUY992 φωταύγεια μετρήθηκε και ποσοτικοποιείται. Στήλες αντιπροσωπεύουν 3 ανεξάρτητα πειράματα? μέση τιμή ± SE. κύτταρα (C) ΡΤΕΝ-CAP /CE2 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις AUY922 για 48 ώρες. Η έκφραση της πρωτεΐνης AR αξιολογήθηκε με κηλίδα western. Η μεταγραφική δραστικότητα του AR διεξήχθη με μέτρηση επίπεδο έκφρασης FKBP5 mRNA. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε ανδρογόνο εξαντλημένο συνθήκες κυτταρικής καλλιέργειας για 6 ώρες, και στη συνέχεια κατεργάζεται ταυτόχρονα με 1 ηΜ R1881 και ενδεικνυόμενες συγκεντρώσεις AUY922 τη διάρκεια της νύχτας. Πειράματα αντιπροσωπεύουν 3 ανεξάρτητα πειράματα, μέσος όρος ± SE. (D) MYC-CAP /CR και PTEN-CAP /CE2 κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή ταυτόχρονα με 5 μg /ml κυκλοεξιμιδίου και αυξανόμενες συγκεντρώσεις AUY922. Η έκφραση της πρωτεΐνης AR αξιολογήθηκε με κηλίδα western. GAPDH χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης πρωτεΐνης. Η πυκνομετρία διεξήχθη με ανάλυση εικόνας j. Οι αριθμοί εμφανίζονται κάτω από τις ζώνες σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου.

Η

Co-θεραπεία AUY922 και docetaxel αυξάνει τον κυτταρικό θάνατο του MYC-Cap /CR και PTEN κεφαλαιοποίησης κύτταρα /CE2

Θα διερευνηθεί για πρώτη φορά την ευαισθησία του MYC-Cap /CR και PTEN κεφαλαιοποίησης κύτταρα /CE2 στις ικανότητες αναστολής της ανάπτυξης της docetaxel. Η φαρμακευτική αγωγή εμφάνισαν την ικανότητα να αναστέλλουν την ανάπτυξη των κυττάρων σε χαμηλές συγκεντρώσεις nanomolar σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (Σχ. 3Α-Β).

ευνουχισμού ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε θεραπεία με δεικνυόμενες συγκεντρώσεις του docetaxel ή /και AUY922 για 48 ώρες. MYC-Cap /CR (Α) και ΡΤΕΝ-cap /CE2 (Β) κυτταρικές γραμμές κατεργάστηκαν με δεικνυόμενες συγκεντρώσεις του docetaxel για 48 ώρες. Τα προσκολλημένα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 70% EtOH. Η ανάπτυξη των κυττάρων εκτιμήθηκε με χρώση στερεωμένα κύτταρα με κρυσταλλικό ιώδες και μετρώντας την απορρόφηση στα 570 nm. MYC-Cap /CR (C) και ΡΤΕΝ-CAP /CE2 κύτταρα (D) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις AUY922 και /ή ντοσεταξέλη για 48 ώρες. Τα κύτταρα trypinized και πλύθηκαν σε 1χ PBS και επωάστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ). Τα ποσοστά των νεκρών κυττάρων (θετικά κύτταρα ΡΙ) προσδιορίσθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Οι στήλες αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SE, * υποδηλώνει σημαντικά μεγαλύτερη στο συνδυασμό σε σύγκριση με τη θεραπεία με κάθε φάρμακο μόνο (ρ = 0,03, όπως προσδιορίζεται με μονόδρομη ANOVA).

Η

επιλέγονται για τη θεραπεία MYC-Cap /κυττάρων CR για 48 ώρες με 10 ηΜ AUY922 (συγκέντρωση όπου AR πρωτεΐνη δεν αποικοδομείται αλλά AR μεταγραφική δραστηριότητα αναστέλλεται) και 100 ηΜ AUY922 (συγκέντρωση όπου AR πρωτεΐνης είναι υποβαθμισμένη και το Ar μεταγραφική δραστηριότητα αναστέλλεται) με 500 ηΜ docetaxel. Σύκο. 3C δείχνει ότι ο συνδυασμός των 10 ηΜ AUY922 με docetaxel αυξάνει σημαντικά τον κυτταρικό θάνατο σε σύγκριση με τη θεραπεία με κάθε φάρμακο μόνο του. Συνδυασμός 100 ηΜ AUY922 με docetaxel ακόμη αυξημένη δυνατότητα θανάτωσης κυττάρων σε σύγκριση με κάθε απλή θεραπεία αν και δεν ήταν σημαντική. Περαιτέρω, υποβάλλαμε σε αγωγή ΡΤΕΝ-CAP /κυττάρων CE2 με 30 και 40 ηΜ AUY922 (συγκεντρώσεις AUY922 που δεν επηρεάζουν δραστικά την πρωτεϊνική έκφραση AR) με 500 ηΜ docetaxel, δείχνοντας ότι αυτές οι θεραπείες συνδυασμού AUY922 και docetaxel είναι ικανά να επάγουν μεγαλύτερη κυτταρικού θανάτου σε σύγκριση με κάθε μονή αγωγή (Σχ. 3D). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι Hsp90 είναι δυνητικά εμπλέκονται στην μεταγραφική δραστηριότητα του AR και ότι διαταράσσοντας την αλληλεπίδραση AR με Hsp90 μέσω αναστολής της ανταγωνίζεται σημαντικά τη δραστικότητα AR στο MYC-Cap /CR και PTEN-CAP /κύτταρα CE2 ανεξάρτητη της έκφρασης AR πρωτεΐνης, επιτρέποντας μεγαλύτερη επαγωγή κυτταρικού θανάτου σε συνδυασμό με ντοσεταξέλη.

MYC-CAP /CR όγκοι είναι ανθεκτικοί στη θεραπεία με docetaxel

in vivo

η

για να αξιολογηθεί η ικανότητα των αντι-καρκινικών docetaxel

in vivo

προς MYC-CAP /CR όγκους, ευνουχισμένα ποντίκια FVB φέρουν MYC-CAP /CR όγκοι υποβλήθηκαν σε θεραπεία με διάφορες δόσεις docetaxel. Ως μάρτυρες, έχουμε αντιμετωπίζεται επίσης ευνουχισμένα ποντίκια SCID που φέρουν όγκους ανθρώπινου ξενομοσχεύματος, LuCaP23.1 AI και PC3, που είναι γνωστό ότι ανταποκρίνονται σε θεραπεία με docetaxel

in vivo

. Σύκο. 4Β και 4Γ δείχνουν ότι LuCaP23.1 AI και οι όγκοι PC3 ήταν ευαίσθητα στη θεραπεία docetaxel. Περαιτέρω, η κάθε δόση δεν παράγουν σημαντική τοξικότητα κατά τη διάρκεια της θεραπείας (Εικ. 4Ε και 4F). Σε αντίθεση, MYC-cap /CR όγκοι ήταν ανθεκτικά σε όλες τις δόσεις της αγωγής με docetaxel (Σχ. 4Α), και τοξικότητα αναφέρεται σε ποντίκια με αγωγή με 50 mg /kg docetaxel (Εικ. 4D).

(Α ) MYC-CAP /κύτταρα CR (5 × 10

6), (Β) κομμάτι του όγκου LuCaP23.1 AI (~ 5 mm

2) και (C) κύτταρα PC3 (5 × 10

6) χορηγήθηκαν με ένεση ή τοποθετούνται υποδορίως στο πλευρό των ευνουχισμένων αρσενικών FVB (MYC-CAP /CR) ή SCID (LuCaP23.1 AI και PC3) ποντίκια. Η θεραπεία ξεκίνησε όταν οι όγκοι μετρήθηκαν περίπου 50 mm

2. Docetaxel ελήφθη από το φαρμακείο στο RPCI ως ένα υδατικό διάλυμα (20 mg /ml) και αραιώνεται σε 1 mg /ml σε 1 × PBS καθημερινά. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε θεραπεία με δόσεις docetaxel των 10, 25 και 50 mg /kg εβδομαδιαίως από ενδο-περιτοναϊκή (ε.π.) ένεση για διάρκεια 2 κύκλων (MYC-CAP /CR) ή 3 κύκλους (LuCaP23.1 AI και PC3). Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε με διαδοχικές μετρήσεις δαγκάνα δύο φορές την εβδομάδα. Το μέγεθος του όγκου υπολογίστηκε με L × W. Όλες οι ομάδες θεραπείας αποτελούνταν από 3-4 ποντικούς. Κάθε ομάδα θεραπείας ομαλοποιήθηκε με τις μετρήσεις προεπεξεργασίας και μετατρέπεται σε ανάπτυξη του όγκου τοις εκατό. Κάθε σημείο αντιπροσωπεύει το μέσο μέγεθος του όγκου ± SE. (D-F) Όλα τα ποντίκια ζυγίστηκαν 2 φορές /εβδομάδα για την παρακολούθηση της τοξικότητας της docetaxel. Η τοξικότητα θεωρείται ότι συμβαίνουν όταν το βάρος σώματος ποντικού μειώθηκε ≥20%. Κάθε στήλη αντιπροσωπεύεται από 3-4 μεμονωμένα ποντίκια /θεραπεία και παριστάνεται ως εκατοστιαία μεταβολή σωματικού βάρους σε σύγκριση με τις μετρήσεις προ-επεξεργασία, μέσος όρος ± SE.

Η

AUY922 μειώνει την έκφραση AR στο MYC-Cap όγκους /CR και συνδυάζει με docetaxel για την αύξηση της θεραπευτικής αποτελεσματικότητας

η αντινεοπλασματική δραστικότητα των AUY922 και docetaxel

in vivo

διερευνήθηκε με κατεργασία ευνουχισμένα ποντίκια FVB με MYC-CAP /CR όγκους. Ποντικών που φέρουν όγκο υπέστησαν αγωγή με φορέα (D5W? 5d επί 2d εκτός), AUY922 (40 mg /kg ίρ: 5d επί 2d εκτός), docetaxel (10 mg /kg ίρ: άπαξ εβδομαδιαίως) ή συνδυασμός για 2 κύκλους (14 ημέρες) . Καμία σημαντική τοξικότητα παρατηρήθηκε σε όλες τις ομάδες θεραπείας, όπως φαίνεται από τις μετρήσεις του σωματικού βάρους (Σχ. 5Β). Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Α, σε σύγκριση με θεραπεία οχήματος, ένας θεραπείας των δύο εβδομάδων με AUY922 ή ντοσεταξέλη μόνη της δεν μειώνουν σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου. Αξίζει να σημειωθεί ότι, ο συνδυασμός του AUY922 με θεραπεία docetaxel κατήργησε σημαντικά την ανάπτυξη του MYC-Cap όγκων /CR σε σύγκριση με κάθε μονή αγωγή (AUY922, ρ = 0.002? Docetaxel, ρ = 0.009). Περαιτέρω, ιστοχημική ανάλυση των επεξεργασμένων MYC-CAP /CR ιστό του όγκου για την έκφραση AR αποκάλυψε ότι τόσο σε οχήματα όσο και docetaxel όγκοι αντιμετωπίζονται εμφανίζεται ισχυρή AR πυρηνική χρώση (Εικ. 5C). Είναι ενδιαφέρον, AUY922 ως ενιαία θεραπεία και σε συνδυασμό με ντοσεταξέλη έδειξαν ότι η αναστολή Hsp90 είχε ένα ετερογενές επίδραση επί της έκφρασης συνολική AR όγκου. Σύκο. 5D και 5Ε παρουσιάζουν αντιπροσωπευτικά ανοσοχρώση τομών όγκου /CR MYC-Cap, που αποδεικνύουν τμήματα του όγκου thatremained θετικά για AR πυρηνική έκφραση, ενώ παρακείμενα τμήματα των όγκων παρουσίασαν απώλεια της έκφρασης πυρηνικών AR.

(Α) MYC- κύτταρα καπάκι /CR (5 × 10

6) ενέθηκαν υποδορίως στο πλευρό των ευνουχισμένων αρσενικών FVB ποντίκια. Η θεραπεία ξεκίνησε όταν οι όγκοι μετρήθηκαν περίπου 50 mm

2 (L × W). Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε θεραπεία με όχημα (D5W, IP,

n = 6

), docetaxel (10 mg /kg, εβδομαδιαία, ip,

n = 7

), AUY922 (40 mg /kg, 5d για 2d off, ip,

n = 5

) ή συνδυασμός (

n = 6

) για 2 εβδομάδες. Το μέγεθος του όγκου παρακολουθήθηκε με διαδοχικές μετρήσεις δαγκάνα δύο φορές την εβδομάδα. Το μέγεθος του όγκου υπολογίστηκε με L × W. Κάθε ομάδα θεραπείας ομαλοποιήθηκε με τις μετρήσεις προεπεξεργασίας και μετατρέπεται σε ανάπτυξη του όγκου τοις εκατό. Κάθε σημείο αντιπροσωπεύει το μέσο μέγεθος του όγκου ± SE. Αμφίδρομη ANOVA: ** ρ = 0.009 docetaxel έναντι συνδυασμού, ρ = 0,002 έναντι AUY922 συνδυασμό. (Β) εβδομαδιαίες μετρήσεις σωματικού βάρους δείχνουν ότι η θεραπεία δεν ήταν τοξικά. Κάθε σημείο αντιπροσωπεύει μέση τιμή ± SE. (Ο-Ε) Ιστός όγκου συλλέχθηκε κατά την ολοκλήρωση της θεραπείας, σταθεροποιήθηκαν σε 10% φυσιολογικό ρυθμιστικό διάλυμα φορμαλίνη και εγκλείστηκαν σε παραφίνη. Τέσσερις micron (4 μΜ) τμήματα του ιστού του όγκου αξιολογήθηκαν με ανοσοϊστοχημεία για έκφραση υποδοχέα ανδρογόνων. Μεγέθυνση (x40), γραμμή κλίμακας = 500 μΜ. Θετική πυρηνική χρώση για AR προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας ανάλυση APERIO imagescope των 6 τυχαίων πεδίων σε x40 μεγέθυνση. Κλίμακα bar = 500 μΜ. Αταίριαστα δύο-tailed t-test με διόρθωση του Welch: **** p & lt? 0,0001 συνδυασμό έναντι docetaxel? ** P = 0,0016 docetaxel έναντι AUY922.

Η

AUY922 μειώνει AR μεταγραφική δραστηριότητα στην MYC-Cap όγκους /CR και συνδυάζει με docetaxel για την αύξηση του όγκου κυτταρικό θάνατο

Για την αξιολόγηση της δραστηριότητας της AUY922 για την εξασθένηση της μεταγραφικής δραστικότητας

in vivo

, χρησιμοποιήσαμε ανοσοχρώση για να προσδιοριστεί η έκφραση του διαγονιδίου c-myc, το οποίο σε αυτό το μοντέλο όγκου οδηγείται από μεταγραφή AR μέσω ενός υποκινητή probasin [22], [23 ]. θεραπεία Docetaxel δεν προκάλεσε απώλεια της έκφρασης c-myc (42,3%) σε σύγκριση με τους όγκους όχημα αγωγή (41,2%? Σχ. 6Α), το οποίο ήταν σύμφωνο με έκφραση AR σε ιστούς όγκων. Αντίθετα, οι όγκοι αντιμετωπίζονται με AUY922, εμφανίζεται σημαντική μείωση της έκφρασης c-myc σε σύγκριση με τη θεραπεία του οχήματος (42,3% στίχο 24,6%? P & lt? 0.0001) και θεραπεία με docetaxel (41,2% στίχο 24,6%? P = 0,006). Περαιτέρω, ο συνδυασμός θεραπείας παρουσίασαν παρόμοια απώλεια της έκφρασης c-myc σε σύγκριση με AUY922 μόνο θεραπεία, και ήταν σημαντική σε σύγκριση με docetaxel μόνη αγωγή (28.7% στίχος 41,2%? Ρ = 0,03? Εικ. 6Α).

( Α) Εκπρόσωπος ανοσοχρώση c-myc. Θετική πυρηνική χρώση για c-myc ήταν ποσοτικά με τη χρήση APERIO ανάλυση imagescope των 6 τυχαίων πεδίων σε x40 μεγέθυνση. Κλίμακα bar = 500 μΜ. Δύο-tailed t-test: **** p & lt? 0,0001 AUY922 έναντι του οχήματος? ** P = 0,006 AUY922 έναντι docetaxel? * P = 0.03 συνδυασμό σχέση με docetaxel. (Β) Εκπρόσωπος διασπαστεί κασπάσης-3 ανοσοχρώση. Θετική πυρηνική χρώση για διασπασμένη κασπάση 3 ποσοστώθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση imagescope APERIO 6 τυχαίων πεδίων στο x20 μεγέθυνση. Κλίμακα bar = 500 μΜ. Δύο-tailed t-test: **** p & lt? 0,0001 συνδυασμό έναντι μόνο θεραπείες

Η

Οι ιστοί επόμενο αξιολογήθηκαν για την επαγωγή του κυτταρικού θανάτου από immunstaining για διασπασμένης κασπάσης-3.. Παρατηρήθηκε Ένα χαμηλό επίπεδο κυτταρικού θανάτου σε ιστό που έλαβαν φορέα (3,3%), χωρίς σημαντική αύξηση του κυτταρικού θανάτου μετά docetaxel (2,1%) ή AUY922 (4,4%) και μόνο θεραπείες. Ωστόσο, ο συνδυασμός θεραπείας αύξησε σημαντικά τον αριθμό των διασπαστεί κασπάσης-3 θετικά καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με docetaxel (14,5% στίχο 2,1%? P & lt? 0.0001) και AUY922 (14,5% στίχο 4,4%? P & lt? 0.0001) και μόνο θεραπείες (Εικ. 6Β) .

Συζήτηση

η docetaxel χημειοθεραπείας παραμένει ένα κύριο πρότυπο για τη φροντίδα για τους ασθενείς με ανθεκτική ευνουχισμού καρκίνο του προστάτη. Δυστυχώς, η νόσος εξελίσσεται παρά τη θεραπεία με ντοσεταξέλη ή δεν ανταποκρίνεται καθόλου. Ως εκ τούτου, η αναγνώριση νέων φαρμάκων, τα οποία μπορούν να ενισχύσουν ή να ευαισθητοποιήσει τους ασθενείς να δοκεταξέλη, χημειοθεραπεία, είναι άκρως απαραίτητος. Οι μηχανισμοί που βρίσκονται πίσω αντίσταση σε docetaxel έχει αποδειχθεί ότι είναι πολυπαραγοντική σε κυτταρικές σειρές και κλινικών δειγμάτων διαφόρων τύπων όγκου [24]. Προσδιορίζονται μηχανισμοί περιλαμβάνουν τη μειωμένη κυτταρική συσσώρευση λόγω της εκροής πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων των P-γλυκοπρωτεΐνης (P-gp) /MDR1 και MDR2 [25] και οι μεταλλάξεις που αναστέλλουν docetaxel από άμεσα δεσμευτική β-τουμπουλίνης [26]. Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι η δεύτερη γενιά Hsp90 αναστολέα AUY922 επάγει ισχυρή αναστολή της μεταγραφής AR που συνδέονται με αντικαρκινική δράση, και αυξάνει τον κυτταρικό θάνατο σε συνδυασμό με docetaxel σε ευνουχισμού καρκινικές κυτταρικές γραμμές ανθεκτικές προστάτη. Περαιτέρω, δείχνουμε ότι τα αποτελέσματα συνδυασμός AUY922 /ντοσεταξέλη θεραπεία σε σημαντική αντικαρκινική δραστηριότητα.