Αφηρημένο

Ιστορικό

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται με όλο τον κόσμο. Μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC) αντιπροσωπεύει το μεγαλύτερο μέρος των περιπτώσεων καρκίνου του πνεύμονα και η πρόγνωση της νόσου παραμένει φτωχή παρά τις δεκαετίες εντατικής έρευνας. Έτσι νέες γνώσεις που διέπουν τους μηχανισμούς με τους οποίους NSCLC αναπτύσσει τα αχόρταγα που απαιτούνται ως βάση για την ανάπτυξη νέων γραμμών των θεραπευτικών στρατηγικών. Η τελευταία δεκαετία έχει παρατηρηθεί μια αυξανόμενο ενδιαφέρον σχετικά με τις ρυθμιστικές τους ρόλους των πολύ μικρών RNAs στις διάφορες κατηγορίες των κακοηθειών. Σχετικά δεδομένα έχει τεκμηριωθεί καλά στην καρκινογένεση και παθοφυσιολογία μίας ποικιλίας κακοηθειών. Ακόμα κι έτσι, υπάρχει μια σχετική έλλειψη στοιχείων σχετικά με τους ρόλους των mir-144 στη βιολογία του όγκου και δεν υπήρξε καμία αναφορά που δείχνει την εμπλοκή του mir-144 στην ανάπτυξη NSCLC.

Μέθοδοι /Principal Ψάχνοντας

από δείγματα ιστού όγκου ανθρώπινου NSCLC και τα δείγματα κυτταρικής καλλιέργειας, βρήκαμε ότι η έκφραση του Mir-144 συνδέεται με κακοήθη φαινότυπο του NSCLC. Περαιτέρω έρευνες έδειξαν ότι η έκτοπη έκφραση mir-144 αναστέλλει σημαντικά την ανάπτυξη των κυττάρων του όγκου NSCLC και επάγει την απόπτωση, όπως εκδηλώνεται με αυξημένες δείκτες αποπτωτική πρωτεΐνη και την αλλαγή κυτταρομετρία ροής. Επιπλέον, βρήκαμε επίσης ότι η έκφραση ZFX πρωτεΐνη συνδέεται επίσης με κακοήθη φαινότυπο του NSCLC και νοκ ντάουν του ZFX αποτελέσματα πρωτεΐνης σε ένα παρόμοιο αποτέλεσμα από έκτοπη έκφραση mir-144. Τέλος, βρήκαμε ότι η έκφραση ZFX είναι εξαιρετικά ρυθμιζόμενο κατά την παρουσία του mir-144 και έκτοπη έκφραση του ZFX μειώνει δραματικά mir-144 δράση της αναστολής των όγκων.

Συμπεράσματα

Τα αποτελέσματά μας για πρώτη φορά έδειξε μονοπάτι mir-144-ZFX εμπλέκεται στην ανάπτυξη του NSCLC, η οποία ρίχνει φως για περαιτέρω έρευνες σχετικά με τους υποκείμενους μηχανισμούς προς την καλύτερη κατανόηση και διαχείριση των NSCLC

Παράθεση:. Zha W, Cao L, Shen Υ, Huang Μ (2013) Ρόλος του Mir-144-ZFX Διαδρομή στη ρύθμιση της ανάπτυξης των μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 8 (9): e74175. doi: 10.1371 /journal.pone.0074175

Επιμέλεια: Alfons Navarro, Πανεπιστήμιο της Βαρκελώνης, Ισπανία

Ελήφθη: 16 του Απριλίου 2013? Αποδεκτές: 29 του Ιούλη, 2013? Δημοσιεύθηκε: 16 Σεπτέμβρη 2013

Copyright: © 2013 Zha et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την Εθνική Μείζονος Επιστημονικής και Τεχνολογικής ειδικό πρόγραμμα για «σημαντική ανάπτυξη νέων φαρμάκων» (2011ZX09302-003-02). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται με όλο τον κόσμο [1]. Μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC) αντιπροσωπεύει περίπου το 80% του συνόλου των περιπτώσεων καρκίνου του πνεύμονα. Επίσης, αυτή η ασθένεια είναι εμφανώς καταστροφικές σε προχωρημένο στάδιο [2]. Ως εκ τούτου, μια καλύτερη κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην ανάπτυξη NSCLC είναι avidly απαιτείται ως βάση για την ταυτοποίηση νέων θεραπευτικών στόχων και ανάπτυξη νέων στρατηγικών για τη θεραπεία αυτών των ασθενειών.

Οι

Τα microRNAs εκφράζεται παντού μικρών RNAs τα οποία ασκούν αρνητική ρυθμιστικά αποτελέσματα επί της έκφρασης γονιδίων σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο [3], [4]. Δεδομένου του γεγονότος ότι microRNAs στοχεύουν θεωρητικά οποιοδήποτε mRNA, είναι πιθανό ότι microRNAs διαθέτουν ένα πολύ ευρύ φάσμα λειτουργικών η οποία περιλαμβάνει ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, την κυτταρική ανάπτυξη, την απόπτωση, τη διαφοροποίηση των κυττάρων και την απόκριση στρες [5] – [9]. Σύμφωνα με αυτή την έννοια, δεν αποτελεί έκπληξη ότι οι microRNAs είναι σε μεγάλο βαθμό εμπλέκονται στην ανάπτυξη του ανθρώπινου καρκίνου. Παρά το γεγονός ότι πολλοί miRNAs έχουν αναφερθεί ότι εμπλέκονται στην αιτιολογία και παθογένεση του καρκίνου με τη στόχευση ογκογονίδια ή καταστολείς των όγκων [10] – [12], οι μελέτες που ασχολούνται με τους ρόλους των miRNAs στην ανάπτυξη του καρκίνου είναι ακόμη σε πρώιμο στάδιο

Πρόσφατα, υπάρχει ένα αυξανόμενο ερευνητικό ενδιαφέρον για το ρόλο της microRNA-144 στην ογκογένεση και τη θεραπεία του καρκίνου. Αρκετές ερευνητικές ομάδες έχουν αναφέρει τα κάτω ρύθμιση του mir-144 σε διάφορους τύπους καρκίνων συμπεριλαμβανομένων οστεοσαρκώματος και μεσοθηλιώματος που συνεπάγεται Mir-144 ως μια πιθανή καταστολέας όγκου [13], [14]. Πιο συγκεκριμένα, μια πρόσφατη μελέτη αποκάλυψε μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ του επιπέδου mir-144 και την ανάπτυξη γαστρικού καρκίνου [15]. Δύο πρόσφατα έγγραφα από την ομάδα Courtney έδειξε ότι νοκ ντάουν DCAMKL-1 μπορεί να αυξήσει microRNA-144 το οποίο με τη σειρά του συμβάλλει στην παρεμπόδιση του ορθοκολικού καρκίνου και του καρκίνου του παγκρέατος [16], [17]. Ωστόσο, υπάρχουν επίσης αντιφατικές αναφορές. Όσο για τον ορθοκολικό καρκίνο, μια άλλη ομάδα ανέφεραν αυξημένο επίπεδο mir-144 στα ανθρώπινα κόπρανα και ιστών του καρκίνου [18]. Μια έκθεση από Fu et al ισχυρίστηκε ότι mir-144 προάγει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή στο καρκίνωμα του ρινοφάρυγγα μέσω της καταστολής της PTEN. Η λειτουργία του mir-144 στην ογκογένεση και την ανάπτυξη του καρκίνου του φαίνεται να είναι περίπλοκη και άκρως ιστο-ειδική [19].

Μέχρι σήμερα, εξ όσων γνωρίζουμε, δεν έχει υπάρξει έγγραφο έκθεση απευθύνεται ειδικά το ρόλο του mir-144 στον καρκίνο του πνεύμονα. Ωστόσο, υπάρχουν πολλά χαρτιά απαιτητικούς τη σημαντική λειτουργία της mir-451, μια άλλη που μοιράζονται την ίδια θέση με mir-144 microRNA, στην ογκογένεση και την ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα [20] – [23]. Mir-451 έχει αναφερθεί να ρυθμίζεται προς τα κάτω στον καρκίνο του πνεύμονα, και σε μια αντίστροφη σχέση με την εμφάνιση και την ανάπτυξη της νόσου. Δεδομένου ότι συμπλέγματος miRNA είναι συνήθως συντονισμένα μεταγραφεί, υποθέτουμε ότι mir-144 επίπεδο είναι επίσης χαμηλότερη σε καρκίνο του πνεύμονα [24], [25]. Είναι ενδιαφέρον ότι ένα πρόσφατο έγγραφο ανέφερε κάτω-ρυθμιζόμενη έκφραση Mir-144 σε πλήρες αίμα ασθενών με αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα [26]. Αυτά τα δεδομένα μας ώθησε να υποθέσει ότι η έκφραση Mir-144 είναι επίσης ρυθμίζεται προς τα κάτω στον καρκίνο του πνεύμονα, και έχει μία ανασταλτική λειτουργία στον πολλαπλασιασμό και τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα.

δάκτυλο ψευδαργύρου X-χρωμοσωμική πρωτεΐνη (ZFX) ανήκει στην οικογένεια πρωτεϊνών ZFY [18] και είναι ένα από τα λίγα γονίδια στο ανθρώπινο χρωμόσωμα Χ που είναι γνωστές για να ξεφύγουν X αδρανοποίηση. Προηγούμενη έρευνα έδειξε ότι ZFX έχει ένα σημαντικό ρόλο στην αυτο-ανανέωση και συντήρηση των δύο εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων και αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων [27] – [30]. Λίγες αναφορές έδειξαν ότι ZFX χρησιμεύει ως στόχος για Mir-144 και ασκεί ρυθμιστικές επιδράσεις στην ανάπτυξη του όγκου [31], [32]. Ωστόσο, υπάρχει ακόμα έλλειψη στοιχείων σχετικά με το ρόλο των ZFX στη συμπεριφορά του καρκίνου του πνεύμονα και mir-144-ZFX μονοπάτι δεν έχει ποτέ αναφερθεί σε αυτό το πλαίσιο των NSCLC.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια και αντισώματα

κιτ έκφρασης μικρο-RNA για mir451 (001.105), mir144 (002.676) και RUN48 (001.006) αγοράστηκαν από την Applied Biosystems. αντισώματος κυτοχρώματος c (6Η2Ο) ελήφθη από την Santa Cruz Biotechnology. Αντι-ZFX αντίσωμα (ab85483), αντι-κασπάσης 3 αντίσωμα (ab44976) και αντι-GAPDH αντίσωμα (ab9485) αγοράστηκαν από Abcam. ΤπζοΙ Αντιδραστήρια αγοράστηκε από την Invitrogen. TaqMan Gene Expression Κιτ Δοκιμασία αγοράστηκαν από την Applied Biosystems (Hs01017881_m1 για ZFX και 4.308.313 για GAPDH). Άλλα αντιδραστήρια περιλαμβάνουν αντιδραστήριο Lipofectamine 2000 (Invitrogen), το σύστημα SuperSignal Υποστρώματος κηλίδωση Western ανίχνευση (Pierce, USA), Αντιδραστήριο νεξίνη γκουάβα (Millipore). RPMI 1640 και ορό εμβρύου βοός αγοράστηκαν από τη Σαγκάη Haoran Βιολογική Technology Co. λουσιφεράσης Assay Kit και pMIR-ΕΚΘΕΣΗ Σύστημα αγοράστηκαν από την Applied Biosystems. β-Gal Assay Kit αγοράστηκε από την Invitrogen (αρ. καταλόγου K1455-01). Ανθρώπινα κιτ ZFX-ELISA (CSB-EL026467HU) αγοράστηκε από CUSABIO BIOTECH CO., Ltd, Κίνα. Όλα τα άλλα χημικά αγοράστηκαν από εμπορικές πηγές σε υψηλότερης διαθέσιμης καθαρότητας.

Κυτταροκαλλιέργεια

Α549, CRL-5875 και ΗΤΒ-183 κυτταρικές γραμμές αγοράστηκαν από την ATCC (American Type Culture Collection), μέσω ο οργανισμός από το Πεκίνο Zhongyuan Limited, Πεκίνο, Κίνα. Η 16HBE14o

– κυτταρική σειρά (ανθρώπινη φυσιολογική βρογχικών επιθηλιακών κυττάρων) είναι ένα γενναιόδωρο δώρο από τον Dr Dieter Gruenert (Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια, Σαν Φρανσίσκο) [33]. Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με ορό εμβρύου μόσχου (10%), 1% μη απαραίτητα αμινοξέα και πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη προστέθηκαν. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε υγροποιημένο θάλαμο στους 37 ° C με 5% CO

2.

Ηθική δήλωση

Όλες οι πειραματικές διαδικασίες εγκρίθηκαν από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review της επαρχίας Jiangsu Ιατρικού Συλλόγου. Οι πληροφορίες που δόθηκαν στους ασθενείς, και η γραπτή συναίνεση λήφθηκε για όλα τα δείγματα ασθενών.

πλασμίδιο κατασκευή

Για την κατασκευή προ-mir-144, ένα θραύσμα DNA που περιέχει το 86-bp HSA- miR-144 πρόδρομος (συν 100 bp ανοδικά και 100 bp προς τα κάτω) ενισχύθηκε από γονιδιωματικό DNA των κυττάρων 16HBE14o- και κλωνοποιήθηκε σε pcDNA (+) 3,1 (Invitrogen), το οποίο έχει τροποποιηθεί για την αντίσταση πουρομυκίνης. Για την έκφραση εκτοπικά ZFX, η κωδικοποιητική αλληλουχία DNA θραύσμα του ZFX πολλαπλασιάστηκε με RT-PCR και κλωνοποιήθηκε σε ρΒΑΒΕ-neo φορέα.

Για τη δοκιμασία λουσιφεράσης, χρησιμοποιήθηκε

Σύστημα pMIR-REPORT (Applied Biosystems). Τα πλασμίδια (pMIR-REPORT-Luciferase-ZFX-3′-UTR και μεταλλαγμένες του) κατασκευάστηκαν ακολουθώντας μεθόδους. Το 3′-UTR του ZFX ενισχύθηκε με RT-PCR. Οι εκκινητές για PCR είναι: gcgcaagcttcaatacttctacagaacg και gcgcgagctccctatatgcaccagtgac. Το ενισχυμένο προϊόν υποκλωνοποιήθηκε σε φορέα pMIR-REPORT-λουσιφεράσης μεταξύ των θέσεων HindIII και SacI. QuikChange τοπο-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) χρησιμοποιήθηκε για να δημιουργήσει pMIR-REPORT-Luciferase-ZFX-3′-UTR-μεταλλαγμένο πλασμίδιο χρησιμοποιώντας ακόλουθους εκκινητές: 5′-cgtgtataGCAGgtttgcct-3 ‘και 5′-aggcaaacCTGCtatacacg-3’. Ένα πλασμίδιο που κωδικοποιεί β-γαλακτοσιδάση (pMIR-REPORT ελέγχου β-gal) χρησιμοποιήθηκε για να ομαλοποιήσει μεταβλητότητα λόγω των διαφορών στη βιωσιμότητα των κυττάρων και την αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης.

Για να knockdown έκφραση ZFX, ZFX shRNA πλασμίδιο κατασκευάσθηκε. Τα θραύσματα του DNA συντέθηκαν, ανοπτήθηκαν και εισήχθη εντός φορέα pLKO.1. Η ώριμη αλληλουχία έννοια είναι: 5′-atgtacctgtgtgtattgct-3 ‘

Ρετροϊών και λοιμώξεις φακοϊού

παραγωγή

Ρετροϊών διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34] χρησιμοποιώντας κύτταρα AmphoPhoenix.. Lentivirus συσκευάστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ ViraPower από την Invitrogen σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Virus εφαρμόσθηκε στα κύτταρα-στόχους για 24 ώρες. Μετά τη μόλυνση, τα κύτταρα εκτέθηκαν είτε πουρομυκίνη (1 μg /ml) ή νεομυκίνη επιλογής (500 μg /ml).

Mir-144 υπερ-έκφραση

Το προ-mir-144 ή αντίστοιχο φορέα πλασμιδίου του επιμολύνθηκε σε Α549 κύτταρα με lipofectamine 2000 (Invitrogen). Τα επιμολυσμένα κύτταρα ξεκίνησαν για επιλογή με πουρομυκίνη (1 μg /ml) 24 ώρες μετά την επιμόλυνση για 2 ημέρες.

Δείγματα ιστών

26 ασθενείς που είχαν διαγνωστεί ως NSCLC στο Τμήμα Ιατρικής του αναπνευστικού του νοσοκομείου μας συμπεριλήφθηκαν στην παρούσα μελέτη. Πριν από την χειρουργική επέμβαση, κανένας από αυτούς τους ασθενείς έλαβαν οποιαδήποτε θεραπεία. Οι όγκοι και τα γύρω δείγματα πνευμονικού ιστού μη-όγκου συλλέχθηκαν και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C. Πριν από τη συλλογή του δείγματος, δεοντολογική έγκριση ελήφθη από το νοσοκομείο και ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από όλα τα άτομα πριν την έναρξη της συλλογής των ιστών.

εκχύλιση RNA από ιστούς και τα κύτταρα

Καθαρίστε τον αισθητήρα ομογενοποίησης, λαβίδες, σπάτουλες και οποιαδήποτε άλλα μέσα τα οποία χρησιμοποιούνται για το χειρισμό των δειγμάτων ιστού με πλύσιμο τους με τα ακόλουθα ρυθμιστικά διαλύματα διαδοχικά: RNAseZAP, 75% αιθανόλη και DEPC νερού. Αφήστε τα δείγματα κατεψυγμένου ιστού να αποψυχθεί αρκετά, και στη συνέχεια κόβεται ο ιστός σε μικρά τεμάχια με μία αποστειρωμένη λεπίδα ξυραφιού. Ξύστε όλα τα κομμάτια του ιστού σε 50 ml σωλήνα που περιείχε ρυθμιστικό L3 (Invitrogen), και ομογενοποιείται ιστός 3 φορές (30s κάθε φορά, να θέσει τα δείγματα επί πάγου για την διαστήματα). Spin ομογενοποιημένα δείγματα σε 12000 g για 5 λεπτά στους 4 ° C. Σύνολο miRNA εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας κιτ απομόνωσης PureLink miRNA (Invitrogen) ακολουθώντας το εργοστάσιο εγχειρίδιο.

Για την εξαγωγή RNA από καλλιεργημένα κύτταρα, ξύστε κύτταρα (περίπου 2 × 10

6 για κάθε δείγμα) σε 15 ml σωλήνες, και τους περιστρέφονται με 250 χ g για 5 λεπτά για να σφαιροποιηθούν τα κύτταρα. Προσθέστε 300 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος L3 σε κάθε σφαιρίδιο κυττάρων, και στροβιλισμού. MicroRNA εξήχθη μετά το εργοστάσιο εγχειρίδιο (κιτ απομόνωσης PureLink miRNA, Invitrogen).

Real-Time PCR αναλύσεις των miRNAs

Τα επίπεδα των miRNA προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας TaqMan microRNA Αναλύσεις Kit (Applied Biosystems) . Εκκινητές για miR-451, mir144 και RUN48 αγοράστηκαν από την ΑΒΙ. Η αντίστροφη αντίδραση μεταγραφής και PCR πραγματικού χρόνου διεξήχθησαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του παρόχου. RUN48 χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικό πρότυπο για την κανονικοποίηση. Σχετική έκφραση των miRNA υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας μέσο όρο της ομάδας ελέγχου ως βαθμονομητή.

Real-Time PCR αναλύσεις ZFX mRNA

Το συνολικό RNA εξήχθη από κύτταρα διαφορετικών ομάδων με τη χρήση αντιδραστηρίων ΤπζοΙ. Τα επίπεδα mRNA του ZFX εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας κιτ δοκιμασίας έκφρασης γονιδίου TaqMan. Real-time PCR εκτελέσθηκε ακολουθώντας την εργοστάσιο πρωτόκολλο. Τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν με το γονίδιο καθαριότητας GAPDH.

γκουάβα νεξίνη Δοκιμασία

Η δοκιμή διεξήχθη μετά από εργοστάσιο πρωτόκολλο (Millipore). Εν συντομία, επισυνάπτονται και τα αιωρούμενα κύτταρα συλλέγονται όλα. Τα κύτταρα αιωρήθηκαν σε 100 μΐ μέσου και επωάζονται με 100 Αντιδραστήριο νεξίνη μι γκουάβα σε κάθε φρεάτιο για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Τα δείγματα στη συνέχεια μετρήθηκαν σε ένα σύστημα γκουάβα (Millipore). Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό που παρέχεται από την εταιρεία.

κηλίδα

Σύνολο λύματα Δυτική κυττάρων συλλέχθηκαν σε 2% SDS συμπληρωμένο με αναστολείς πρωτεϊνάσης. Ίσες ποσότητες πρωτεϊνών (50 μα) υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου (10 ή 15%). Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν πάνω σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης καθαρό. Μετά τη μεταφορά της πρωτεΐνης, οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% άπαχο ξηρό γάλα σε ΤΒδ-Τ για 1 ώρα πριν από την προσθήκη πρωτογενών αντισωμάτων και επωάστηκαν στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Οι μεμβράνες στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές με ΤΒδ-Τ και επωάστηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου σε ΤΒδ-Τ. Μετά από τρεις πλύσεις σε ΤΒδ-Τ, ανοσοαντιδραστικά προϊόντα κατέστησαν ορατά με χρήση του συστήματος SuperSignal υποστρώματος κηλίδωση Western ανίχνευση (Pierce, USA).

Λουσιφεράσης

δοκιμασία

Ο λουσιφεράσης εκτελέστηκε σε κύτταρα Α549 χρησιμοποιώντας pMIR -Έκθεση συστήματος [34] (Applied Biosystems) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του παρόχου. Εν συντομία, pMIR-REPORT-Luciferase-ZFX-3′-UTR ή μεταλλαγμένων της (3 μg) συν-επιμολύνθηκαν με pMIR-REPORT ελέγχου β-gal (1 μg) σε κύτταρα Α549 (10

6) με ή χωρίς mir-144 υπερ-έκφραση χρησιμοποιώντας 15 μΙ Lipofectmin 2000 (Invitrogen).

24 ώρες αργότερα, η δράση της λουσιφεράσης μετρήθηκε με λουσιφεράσης Assay Kit (Applied Biosystems). Ξεπλύνετε τα κύτταρα με PBS. 250 μL Διάλυμα Λύσης προστέθηκε στα κύτταρα. Αποσυνδέστε τα κύτταρα από την πλάκα με ένα ξέστρο κυττάρων. Μεταφέρετε το κυτταρικό λύμα σε ένα σωλήνα μικροφυγοκέντρου και φυγοκέντρηση σε 4 ° C για 5 λεπτά για να σφαιροποιηθούν θραύσματα. Μεταφέρετε το υπερκείμενο σε καινούργιο σωλήνα. Μεταφορά 50 μL του εκχυλίσματος κυττάρου σε ένα σωλήνα φωτόμετρο. Προσθέστε 100 μL του υποστρώματος Α (διάλυμα ΑΤΡ). Προσθέστε 100 μL του υποστρώματος Β (διάλυμα λουσιφερίνης). Προγραμματίσετε το φωτόμετρο να εκτελέσει μια 2-s καθυστέρηση προ-μέτρηση που ακολουθείται από ένα-s 10 περίοδο μέτρησης. Τοποθετήστε το σωλήνα στο φωτόμετρο και να ξεκινήσει την ανάγνωση. Η δραστικότητα β-γαλακτοσιδάσης δοκιμάστηκε χρησιμοποιώντας β-Gal Assay Kit (Invitrogen) ακολουθώντας το εγχειρίδιο του κατασκευαστή. Η σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης αποκτήθηκε με κανονικοποίηση της έκφρασης λουσιφεράσης με έκφραση β-gal.

προσδιορισμού ELISA του ZFX

Αποψύξτε δείγματα από -80 ° C. Κόψτε φυσιολογικών και καρκινικών ιστών σε μικρά κομμάτια, και ζυγίζουν περίπου 100 mg των δειγμάτων για κάθε δοκιμασία. Ξεπλύνετε ιστού με PBS, ομογενοποιείται ιστός σε 1 mL PBS και αποθηκεύσει όλη τη νύχτα στους -20 ° C. Δύο κύκλοι ψύξης-απόψυξης διεξήχθησαν για να σπάσει τα κυτταρικές μεμβράνες, φυγοκεντρήστε τα ομογενοποιήματα για 5 λεπτά σε 10.000 g, 4 ° C. Μετρήστε το επίπεδο της πρωτεΐνης του ZFX στο υπερκείμενο με τη χρήση κιτ ZFX-Elisa (CUSABIO BIOTECH CO., Ltd, Κίνα) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, και να ομαλοποιήσει το βάρος του βάρους του ιστού.

Στατιστικά

Πειραματικά αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με μη ζευγαρωμένα μαθητές

t

δοκιμή ή ANOVA υποθέτοντας άνισες διακύμανση εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά χρησιμοποιώντας SigmaPlot 11.0 (San Jose, CA USA). Σημαντικότητα ορίζεται ως * ρ & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt?. 0.001

Αποτελέσματα

είναι

Επίπεδα mir-144 και mir-451 μειώθηκε σε ιστούς όγκων NSCLC σε σύγκριση με περι-όγκου φυσιολογικούς ιστούς

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α και 1Β, βρήκαμε μια σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω τόσο για mir-144 (& gt? 70% μείωση, p & lt? 0.001) και mir-451 (& gt ? 60% μείωση, ρ & lt? 0.001) σε ιστούς καρκίνου του πνεύμονα μη-μικρού κυττάρου (n = 26) σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς δεν περι-καρκινικές (n = 26), η οποία είναι σύμφωνη με δείχνοντας προηγούμενα δεδομένα ότι mir-144 και mir-451 μοιράζονται το ίδιο τόπο DNA, συντονισμένα μεταγράφεται και παίζει παρόμοιο ρόλο σε διάφορες παθοφυσιολογικές σενάρια [13], [24], [35], [36]. Επιπλέον, μια σημαντική μείωση του επιπέδου mir-144 (Εικόνα 1 C) παρατηρείται επίσης σε καρκίνο υψηλής ποιότητας (IIIA-IV) σε σύγκριση με ότι στον καρκίνο χαμηλού βαθμού (ΙΑ-ΙΙΒ).

Α και B. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του mir-144 και Mir-451 σε φυσιολογικά (n = 26) και ιστούς όγκου (n = 26). Τα επίπεδα έκφρασης του mir-144 ή Mir-451 σε ιστούς όγκων κανονικοποιήθηκαν προς την έκφραση της παραπάνω microRNAs στους αντίστοιχους φυσιολογικούς ιστούς από τον ίδιο ασθενή. C. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του mir-144 σε χαμηλού βαθμού (ΙΑ-ΙΙΒ) (n = 14) και υψηλής ποιότητας (IIIA-IV) αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα (n = 12).

Η

τα επίπεδα έκφρασης του miR-144 είναι χαμηλότερα σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα σε σύγκριση με τα φυσιολογικά ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα

Σταθερά βρήκαμε επίσης ότι Mir-144 είναι σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε NSCLC κυτταρικές γραμμές Α549 (& gt ? 45% μείωση, ρ & lt? 0.001), CRL-5875 (& gt? 60% μείωση, ρ & lt? 0.001), ΗΤΒ-183 (& gt? 50% μείωση, ρ & lt? 0.001) σε σύγκριση με την κανονική βρογχικών επιθηλιακών κυτταρικών σειρών (16HBE14o- κύτταρα) (Σχήμα 2).

η

έκτοπη miR-144 έκφρασης αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων Α549 και προάγει την απόπτωση των κυττάρων

Στη συνέχεια, προσπάθησαν να προσδιορίσουν κατά πόσον mir-144 παίζει άμεσο ρυθμιστικό ρόλο στην ανάπτυξη του όγκου. Για να ελέγξει την υπόθεση αυτή, θα κατασκευαστεί με επιτυχία mir-144 υπερέκφραση σε Α549 καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Τα αποτελέσματα έδειξαν έκφραση Mir-144 σε Mir-144 υπερεκφράζονται κύτταρο Α549 είναι πάνω από 7 φορές υψηλότερη από τον έλεγχο φορέα (Σχήμα 3Α). Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι mir-144 υπερέκφραση οδηγεί σε σημαντική αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων (Σχήμα 3Β) και ενίσχυση της απόπτωσης όπως εκδηλώνεται από τους αυξημένους δείκτες αποπτωτική πρωτεΐνη (κυτόχρωμα-c και κασπάσης 3) και κυτταρομετρία ροής αποτελέσματα (Σχήμα 3C-F) .

Α. Υπερ-έκφραση του mir-144 σε κύτταρα Α549, σημαίνουν ± SD, η = 3. Οι καμπύλες Β Ανάπτυξη του Α549 κύτταρα με ή χωρίς Mir-144 υπερ-έκφραση, μέση ± SD, η = 3. Γ Western blots-του Α549 κύτταρα με ή χωρίς Mir-144 υπερ-έκφραση. D και Ε Οι αντιπροσωπευτικές εικόνες των αποτελεσμάτων γκουάβα νεξίνη Δοκιμασία των κυττάρων Α549 χωρίς και με Mir-144 υπερ-έκφραση, αντίστοιχα. F: Ποσοτικοποίηση της Δοκιμασίας γκουάβα νεξίνη αποτελέσματα, μέση ± SD, η = 3.

Η

Τα αποτελέσματα έδειξαν στην Εικόνα 1-3 έντονα πρότεινε ότι mir-144 μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ανασταλτικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα . Συγκεκριμένα, φαίνεται ότι Mir-144 συνδέεται αρνητικά με κακοήθη φαινότυπο των καρκίνων του πνεύμονα (Σχήμα 1, 2). Σύμφωνα με αυτή την αντίληψη, έκτοπη έκφραση της mir-144 έχει σαν αποτέλεσμα μια δραματική αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων και την επαγωγή της απόπτωσης όγκου.

ZFX πρωτεΐνη, ένας στόχος κατάντη του mir-144, εκφράζεται υψηλότερη σε ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικές γραμμές από ότι στο βρογχικά επιθηλιακά κυτταρική γραμμή

Ως επόμενο βήμα, φαίνεται να είναι ενδιαφέρουσα για να ανακαλύψει τον υποκείμενο μηχανισμό για Mir-144 με τη μεσολάβηση της αναστολής του όγκου. Με περιεκτικά την αναζήτηση που σχετίζονται με τα δεδομένα, βρήκαμε ZFX (δάκτυλο ψευδαργύρου πρωτεΐνη, X-linked) μπορεί να είναι μια πιθανή δραστικό μόριο για mir-144 δράση στο πλαίσιο της ανάπτυξης και της ανάπτυξης NSCLC. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, ελέγξαμε έκφρασης πρωτεΐνης και του mRNA σε κύτταρα NSCLC και σε φυσιολογικά αντίστοιχά. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, βρήκαμε ότι ZFX πρωτεΐνη είναι σημαντικά υψηλότερη σε κυτταρικές γραμμές NSCLC σύγκριση με τα φυσιολογικά αντίστοιχά τους. Δεν παρατηρήσαμε μια διαφορά μεταξύ NSCLC και τα φυσιολογικά κύτταρα στα επίπεδα mRNA του ZFX (Σχήμα 4Β). Βρήκαμε επίσης επίπεδο ZFX πρωτεΐνη ήταν χαμηλότερη σε Mir-144 υπερ-εκφράζονται κύτταρα Α549 όταν συγκρίνονται με φορέα ελέγχου μεταχθέντα κύτταρα (Σχήμα 4C). Στο Σχήμα 4D δείξαμε το σύστημα του προσδιορισμού λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας σύστημα pMIR-ΕΚΘΕΣΗ για την αξιολόγηση της άμεσης αναστολής της mir-144 για την έκφραση της πρωτεΐνης ZFX. Βρήκαμε Mir-144 μπορεί να αναστέλλει αποτελεσματικά την έκφραση λουσιφεράσης με σύνδεση προς ZFX 3′-UTR, αλλά δεν έχει καμία επίδραση επί της έκφρασης λουσιφεράσης, όταν οι θέσεις σύνδεσης μεταλλάχθηκαν σε ZFX 3′-UTR (Σχήμα 4Ε).

Η επίδραση της έκτοπη έκφραση του miR-144 στο επίπεδο της πρωτεΐνης ZFX σε κύτταρα Α549. A. Σχετικά επίπεδα έκφρασης του mRNA της ZFX στο Α549, CRL-5875, ΗΤΒ-183 και 16HBE14o- κύτταρα, μέσος όρος ± SD, n = 3. Β Δυτική-κηλίδες του ZFX και GAPDH στα παραπάνω κύτταρα. Γ Western blots-του ZFX και GAPDH σε Α549 κύτταρα με ή χωρίς Mir-144 υπερ-έκφραση. D. Το καθεστώς της δοκιμασίας λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας σύστημα pMIR-ΕΚΘΕΣΗ για την αξιολόγηση της άμεσης αναστολής της mir-144 για την έκφραση της πρωτεΐνης ZFX. E. Οι διάφορες επιδράσεις της mir-144 επί ZFX 3′-UTR και των μεταλλαγμένων του, σημαίνει ± SD, η = 5.Mir-144 μπορεί αποτελεσματικά να αναστέλλουν την έκφραση λουσιφεράσης με σύνδεση προς ZFX 3′-UTR, αλλά δεν έχει καμία επίδραση η έκφραση της λουσιφεράσης, όταν οι θέσεις δέσμευσης μεταλλάχθηκαν σε ZFX 3′-UTR.

η

ZFX νοκ ντάουν αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων Α549 και προάγει την απόπτωση των κυττάρων

για να ελέγξετε αν ZFX ασκεί επίσης άμεση ρυθμιστική λειτουργία στην ανάπτυξη του όγκου NSCLC, εμείς γκρέμισε ZFX πρωτεΐνη στα κύτταρα Α549. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α, knockdown μας κατασκεύασμα αποτελέσματα & gt? 80% πρωτεΐνη έκφρασης κάτω ρύθμιση σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 5Α). Όπως ήταν αναμενόμενο, βρήκαμε ότι ZFX knockdown επάγει ισχυρά απόπτωση NSCLC (όπως εκδηλώνεται από ενισχυμένη αποπτωτική πρωτεΐνη σημειωτές και κυτταρομετρία ροής) και καταστέλλει την ανάπτυξη του όγκου των κυττάρων (Σχήμα 5Β-F), η οποία είναι παρόμοια με τα βιολογικά αποτελέσματα που παρατηρούνται για Mir-144 υπερ- έκφραση που φαίνεται στα προηγούμενα σχήματα.

Α. Σχετικά επίπεδα έκφρασης του mRNA του ZFX σε Α549 με ή χωρίς ZFX knockdown, σημαίνουν ± SD, η = 3. Β Western blots-του ZFX, κυτόχρωμα-c, κασπάσης-3 και GAPDH ανωτέρω κύτταρα. C. Οι καμπύλες ανάπτυξης των Α549 κυττάρων με ή χωρίς ZFX knockdown, σημαίνουν ± SD, η = 3. Δ και Ε Οι αντιπροσωπευτικές εικόνες των αποτελεσμάτων γκουάβα νεξίνη Δοκιμασία των κυττάρων Α549 χωρίς και με ZFX knockdown, αντίστοιχα. F: Ποσοτικοποίηση των Δοκιμασία γκουάβα νεξίνη αποτελέσματα, μέσος όρος ± SD, n = 3.

Η

ZFX απαιτείται για τη λειτουργία κατασταλτική του mir-144 για NSCLC ανάπτυξη

Για να προσδιοριστεί περαιτέρω κατά πόσον ZFX απαιτείται για mir-144 δράση στο σενάριο NSCLC, είμαστε ταυτόχρονα υπερ-εκφράζεται mir-144 και ZFX πρωτεΐνη στο Α549 κυτταρική γραμμή. Εμείς υπερεκφράζεται mir-144 με επιμόλυνση των κυττάρων με προ-mir-144 πλασμίδιο χρησιμοποιώντας λιποφεκταμίνη 2000. 24 ώρες αργότερα, μολύναμε των κυττάρων με ρετροϊό που κωδικοποίησης ZFX πρωτεΐνη. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι ZFX υπερέκφραση μερικώς αλλά σημαντικά μειώνει Mir-144 δράση, όπως αποδεικνύεται από μειωμένη απόπτωση των κυττάρων (Σχήμα 6Α, 6C-6F) και αυξημένη ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων (Σχήμα 6Β) σε σύγκριση με τα κύτταρα του όγκου με μόνο Mir-144 υπερ- έκφρασης, γεγονός που υποδηλώνει σαφώς ότι ZFX-κατάθλιψη απαιτείται για mir-144 διαμεσολαβείται Α549 απόπτωση NSCLC κυττάρων και αναστολής της ανάπτυξης. Σε συνδυασμό με τα δεδομένα που δείχνονται στο Σχήμα 4 και Σχήμα 5, φαίνεται ότι ZFX ως κατάντη γονιδίου-δράστη, μπορεί να εμπλέκονται σε Mir-144 με τη μεσολάβηση NSCLC ρύθμιση ανάπτυξης όγκου, η οποία ρίχνει φως σε περαιτέρω έρευνα αυτής της νέας πορείας στα διαχείριση NSCLC.

Α. Western blots-του ZFX, κυτόχρωμα-c, κασπάσης-3 και GAPDH σε κύτταρα Α549 με μόνο Mir-144 υπερ-έκφραση, ή Mir-144 υπερ-έκφραση σε συνδυασμό με ZFX υπερ-έκφραση. Η ομάδα ελέγχου transducted με δύο κενά ιούς κωδικοποίησης φορέα. B. Οι καμπύλες ανάπτυξης των ανωτέρω κυττάρων. Γ, Δ και Ε Οι αντιπροσωπευτικές εικόνες των αποτελεσμάτων γκουάβα νεξίνη Δοκιμασία των παραπάνω κυττάρων. ΣΤ Ποσοτικοποίηση της ανάλυσης γκουάβα νεξίνη αποτελέσματα, μέσος όρος ± SD, n = 3.

Η

επίπεδα έκφρασης ZFX είναι σημαντικά υψηλότερη σε όγκους σε σύγκριση με γειτονικά φυσιολογικούς ιστούς τους

Σύμφωνα με το προηγούμενα δεδομένα, ELISA έδειξαν τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του ZFX σε φυσιολογικά (n = 26) ήταν σημαντικά χαμηλότερες από ότι σε ιστούς όγκων (n = 26, ρ & lt? 0.001) (Σχήμα 7Α). Τα σχετικά επίπεδα του ZFX σε όγκους ελήφθησαν με ομαλοποίηση κατά την έκφραση του ZFX στα αντίστοιχα φυσιολογικούς ιστούς από τον ίδιο ασθενή. Επίσης, τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του ZFX σε χαμηλού βαθμού (ΙΑ-ΙΙΒ) και αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα υψηλής ποιότητας (IIIA-IV) συγκρίθηκαν επίσης. Παρά το γεγονός ότι τα επίπεδα ZFX πρωτεΐνης σε υψηλής ποιότητας πνεύμονα agenocarcinoma ήταν ελαφρώς υψηλότερες από εκείνες χαμηλής ποιότητας, τα δεδομένα δεν ήταν σημαντική, possiblely λόγω του μικρού μεγέθους του δείγματος (Σχήμα 7Β).

Α. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του ZFX σε φυσιολογικά (n = 26) και ιστούς όγκου (n = 26). Τα σχετικά επίπεδα του ZFX σε όγκους ελήφθησαν με ομαλοποίηση κατά την έκφραση του ZFX στα αντίστοιχα φυσιολογικούς ιστούς από τον ίδιο ασθενή. B. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του ZFX σε χαμηλού βαθμού (ΙΑ-ΙΙΒ) (n = 14) και υψηλής ποιότητας (IIIA-IV) αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα (n = 12).

Η

Συζήτηση

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η πιο διαδεδομένη κακοήθεια σε όλο τον κόσμο και κατατάσσεται νούμερο 1 για όλα τα θανάτου από καρκίνο. Το τρέχον μοντέλο για την παθογένεση του καρκίνου του πνεύμονα πιστεύεται ότι οφείλεται στο συνδυασμό των γενετικών παραγόντων κινδύνου και δυσάρεστες περιβαλλοντικές διεγέρσεις [37]. Όπως συζητήθηκε πριν, μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) αντιπροσωπεύει περίπου το 80% μεταξύ όλων των υποτύπων καρκίνου του πνεύμονα [2]. Ως εκ τούτου διαλεύκανση του υποκείμενου μηχανισμού για την ανάπτυξη NSCLC στέκεται ως μια μεγάλη πρόκληση για την επιτυχή διαχείριση του καρκίνου του πνεύμονα.

Δυστυχώς, αν και η καρκινογένεση και παθοφυσιολογία του NSCLC έχουν εντατικά διερευνηθεί κατά τη διάρκεια των τελευταίων δεκαετιών, ο υποκείμενος μηχανισμός της ανάπτυξη NSCLC παραμένει ελάχιστα κατανοητή και εξακολουθεί να υπάρχει έλλειψη της βέλτιστης θεραπευτικές στρατηγικές, ακόμη και μετά από δεκαετίες εντατικής έρευνας.

Η τελευταία δεκαετία είδε microRNA σαν ένα ζεστό χώρο για τη βιολογία του καρκίνου. Αν και microRNAs είναι επίσης απαραίτητο για τη φυσιολογική ανθρώπινη φυσιολογία, πολλά είδη microRNA δειχθεί ότι παίζει σημαντικό ρυθμιστικό ρόλο στην ογκογένεση και την ανάπτυξη του καρκίνου, καθώς και. Τα παραδείγματα περιλαμβάνουν, αλλά δεν περιορίζονται σε, Mir-574-3p και του καρκίνου του προστάτη [38], Mir-23α και γαστρικό καρκίνο [39], mir-21 και του παχέος εντέρου [40]. Με βάση τα άφθονα στοιχεία που συσσωρεύτηκαν κατά τις τελευταίες δύο δεκαετίες, οι επιστήμονες άρχισαν να υποστηρίζουν τη χρήση των microRNAs ως νέων θεραπευτικών στόχων για διάφορες κακοήθειες [41]. καρκίνο του πνεύμονα εντοπίστηκαν microRNAs που σχετίζονται περιλαμβάνουν mir-210 [42], mir-365 [43], mir-449c [44], κλπ

Στην παρούσα μελέτη, εμείς προσπαθήσαμε να παρέχει μια νέα εικόνα για NSCLC ανάπτυξη από τη σκοπιά της μεταφραστικής επιστήμης. Πρώτον, συλλέξαμε τα δεδομένα από την πλευρά κρεβάτι, το οποίο δείχνει μια έντονα συσχέτιση μεταξύ κακοήθους φαινοτύπου των NSCLC και της έκφρασης mir-144. Υπό το φως των δεδομένων από πραγματικά δείγματα NSCLC, θα διερευνηθεί περαιτέρω το ρόλο του mir-144 στην ανάπτυξη NSCLC. Αποτελέσματα αποδείχθηκε ότι ήταν πολύ θετική. Τα δεδομένα έδειξαν ότι mir-144 επάγει σθεναρά την απόπτωση και αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων του NSCLC. Επιπλέον, τα αποτελέσματα πρότειναν επίσης ότι το δάκτυλο ψευδαργύρου Χ-χρωμοσωμική πρωτεΐνη, ή ZFX, φαίνεται να είναι ένας μεταγενέστερος μόριο τελεστή για Mir-144 δράση. Από την άποψη της NSCLC, φαίνεται ότι η αντικαρκινική δραστικότητα του mir-144 είναι τουλάχιστον εν μέρει διαμέσου κλείνουν την έκφραση της πρωτεΐνης ZFX σε επίπεδο μετα-μεταγραφής. Η υπόθεση αυτή επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με άλλα δύο βασικές παρατηρήσεις 1) Mir-144 ασκεί άμεσο ρυθμιστικό ρόλο στην έκφραση ZFX και 2) την έκφραση της πρωτεΐνης ZFX (ELISA) φαίνεται να σχετίζεται με την ογκογένεση.

Μέχρι σήμερα, στην καλύτερη των γνώσεών μας, δεν έχει υπάρξει καμία έκθεση που δείχνει μια άμεση συμμετοχή του άξονα mir-144-ZFX στην ανάπτυξη NSCLC, η οποία δικαιολογεί περαιτέρω διερεύνηση αυτής της οδού στη συμπεριφορά NSCLC. Παρά το γεγονός ότι δεν θα πρέπει να αποκλείει τη συμμετοχή άλλων γονιδίων στόχων για mir-144 δράση στο τρέχον σενάριο, τα αποτελέσματά μας, σε μικρότερο βαθμό, τουλάχιστον παρέχει μια απόδειξη της αρχής που δείχνουν ότι μεταφραστικές προσεγγίσεις μπορεί να είναι χρήσιμη για τη μελλοντική ανάπτυξη νέων θεραπευτικών στρατηγικές για NSCLC.