Αφηρημένο

The Hedgehog (HH) μονοπατιού σηματοδότησης είναι ζωτικής σημασίας για την φυσιολογική εμβρυϊκή ανάπτυξη, σχηματομόρφωσης ιστού και διαφοροποίηση των κυττάρων. Η παρεκκλίνουσα σηματοδότηση HH εμπλέκεται σε πολλαπλές ανθρώπινων καρκίνων. HH σηματοδότηση περιλαμβάνει ένα πολυ-πρωτεΐνη καταρράκτη ενεργοποίησης των πρωτεϊνών που ρυθμίζουν GLI μεταγραφικά γονίδια στόχους HH. Έχουμε αναφέρει προηγουμένως ότι HH σηματοδότηση είναι απαραίτητη για την επιβίωση των κυττάρων ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου και η αναστολή αυτού του σήματος προκαλεί βλάβη στο DNA και εκτεταμένο κυτταρικό θάνατο. Εδώ αναφέρουμε ότι ο άξονας HH /GLI ρυθμίζει ανθρώπινης τελομεράσης ανάστροφης μεταγραφάσης (hTERT), η οποία καθορίζει την δυνατότητα αναπαραγωγής των καρκινικών κυττάρων. Καταστολή των λειτουργιών GLI1 /GLI2 από ένα C-τελικό άκρο κολοβωμένη GLI3 καταστολέα μεταλλαγμένου (GLI3R), ή με GANT61, φαρμακολογική αναστολέας GLI1 /GLI2, μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης hTERT στον ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου, ο καρκίνος του προστάτη και πολύμορφο γλοιοβλάστωμα (GBM) κυτταρικές γραμμές . Η έκφραση ενός Ν-τέρμα ουσιαστικά δραστική μετάλλαξη του GLI2 (GLI2ΔN) αυξήθηκε hTERT mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης και προωθητή hTERT οδηγείται δραστικότητα λουσιφεράσης σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου ενώ GANT61 ανέστειλε την έκφραση του mRNA hTERT και προωθητή hTERT οδηγείται δραστικότητα λουσιφεράσης. Χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση με GLI1 ή GLI2 αντισώματα καθιζάνει θραύσματα του υποκινητή hTERT σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου, η οποία μειώθηκε κατά την έκθεση σε GANT61. Σε αντίθεση, η έκφραση του GLI1 ή GLI2ΔN σε μη κακοήθη κύτταρα 293Τ απέτυχαν να μεταβάλλουν τα επίπεδα των hTERT mRNA και της πρωτεΐνης, ή δραστηριότητα οδηγείται λουσιφεράσης hTERT υποκινητή. Περαιτέρω, η έκφραση του GLI2ΔN αύξησε τη δραστικότητα του ενζύμου τελομεράση, η οποία μειώθηκε με χορήγηση GANT61 στον ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου, του καρκίνου του προστάτη, και τα κύτταρα GBM. Τα αποτελέσματα αυτά προσδιορίζουν hTERT ως άμεσο στόχο του μονοπατιού σηματοδότησης HH, και αποκαλύπτουν μια προηγουμένως άγνωστη ρόλο του άξονα HH /GLI στη ρύθμιση του δυναμικού αντιγραφή των καρκινικών κυττάρων. Αυτά τα ευρήματα έχουν σημασία στην κατανόηση των σημαντικών ρυθμιστικών μηχανισμών που καθορίζουν τις λειτουργίες του HH σηματοδότησης /GLI στα καρκινικά κύτταρα

Παράθεση:. Mazumdar Τ, Sandhu R, Qadan Μ, DeVecchio J, Magloire V, Agyeman Α, et al. (2013) σκαντζόχοιρος Σηματοδοσίας Ρυθμίζει τελομεράση αντίστροφης μεταγραφάσης σε ανθρώπινα κύτταρα του καρκίνου. PLoS ONE 8 (9): e75253. doi: 10.1371 /journal.pone.0075253

Επιμέλεια: Ilya Ulasov, University of Chicago, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 29 Μαρτίου του 2013? Αποδεκτές: 13 Αυγούστου 2013? Δημοσιεύθηκε: 25 Σεπτεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Mazumdar et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς θα ήθελα να γνωρίσω οικονομική στήριξη από την ανάθεση NCI RO1 CA 87952 (JAH), και από το Cleveland Clinic. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Κλασική σηματοδότησης HH ξεκινά όταν οι διαλυτές συνδέτες HH, Sonic (ΕΛΕΡΠΕ), Desert (DHH) ή ινδικό (ΙΗΗ) HH δεσμεύονται διαμεμβρανικό υποδοχέα τους ΡαίοΗβά (Ptch), απελευθερώνοντας έτσι την διαμεμβρανική πρωτεΐνη, λειανθούν (ΠΕΑ) από Ptch-διαμεσολαβούμενη αναστολή. ΠΕΑ ενεργοποιεί στη συνέχεια την οικογένεια GLI των μεταγραφικών παραγόντων που ρυθμίζουν τα γονίδια-στόχους HH. Η οικογένεια GLI των μεταγραφικών παραγόντων περιλαμβάνει GLI1, GLI2 και GLI3. Βάσει ενός Ο-τερματικό του ενεργοποιητή και Ν-τερματικά πεδία καταστολέα, GLI2 και GLI3 έχουν μεταβλητής ενεργοποιητή ή δραστικότητα καταστολέα. GLI1 στερείται τομέως καταστολέα και λειτουργεί κατά κύριο λόγο ως ενεργοποιητής [1], [2]. GLI2 έχει ένα C-τερματικό του ενεργοποιητή και Ν-τερματικά πεδία καταστολέα [3]. GLI2 φέρεται να είναι η αρχική μεσολαβητής του HH γεγονότων σηματοδότησης, η οποία στη συνέχεια προκαλεί την έκφραση GLI1, γεγονός που αυξάνει περαιτέρω την έκφραση του γονιδίου-στόχου HH [4]. Όταν το μονοπάτι σηματοδότησης HH είναι ενεργή, η λανθάνουσα κυτταροπλασματικές πρωτεΐνες GLI μετατοπίζονται στον πυρήνα όπου συνδέονται τα GACCACCCA στοιχεία παρόμοια με τους προαγωγούς των γονιδίων ΗΗ-στόχος [5], [6]. HH σηματοδότηση ρυθμίζει την κυτταρική γεγονότα με τη διαμόρφωση συγκεκριμένων γονιδίων στόχων. Κατά την κανονική εμβρυϊκή ανάπτυξη, η δραστικότητα σηματοδότησης HH είναι απαραίτητο, ρυθμίζεται χωρικά και χρονικά με αποτέλεσμα στην κανονική διαμόρφωση και διαφοροποίηση ιστών. Συντονισμένη σηματοδότηση HH συμμετέχει επίσης σε κυτταρικό πολλαπλασιασμό και επιβίωση, συντήρηση βλαστική ικανότητα και τον προσδιορισμό της κυτταρικής μοίρας [6]. Ανωμάλως ενεργοποιούνται σηματοδότηση HH εμπλέκεται σε πολλαπλές ανθρώπινους καρκίνους και ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, την επιβίωση, τις λειτουργίες του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων, επιθηλιακών να μεσεγχυματικά μετάβασης και μετάσταση [6]. Έχουμε αναφέρει ότι HH σηματοδότηση είναι κρίσιμη για την επιβίωση των ανθρωπίνων κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου, ενώ το κλείδωμα αυτά τα σήματα επάγει ταχεία βλάβη του DNA, με αποκορύφωμα το εκτεταμένο κυτταροτοξικότητας [7], [8], [9], [10]. Απεριόριστη δυνατότητα αναπαραγωγής των καρκινικών κυττάρων είναι στενά συνδεδεμένη με την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων, ωστόσο, ο ρόλος του HH σηματοδότησης στην δυνατότητα αναπαραγωγής των καρκινικών κυττάρων δεν είναι γνωστή.

δυνατότητα αναπαραγωγής των ανθρώπινων σωματικών κυττάρων περιορίζεται από ειδικές κατασκευές heterochromatic γνωστή ως τελομερή στα άκρα των γραμμικών χρωμοσωμάτων [11]. θηλαστικών τελομερή αποτελούνται από διαδοχικές επαναλήψεις των αλληλουχιών TTAGGG που υπόκεινται σε σύντμηση με κάθε κύκλο αντιγραφής του DNA [12]. Συμβατικά πολυμεράσες DNA δεν είναι ικανό να αντιγράφεται πλήρως τα άκρα των μορίων γραμμικού DNA? ως εκ τούτου, τελομερές DNA αναμένεται να μειώσει με κάθε κύκλο αντιγραφής του DNA. Κριτικά μειωθεί τελομερή αδυνατούν να προστατεύσουν χρωμοσωμικές άκρα με αποτέλεσμα την μη αναστρέψιμη διακοπή της ανάπτυξης και της περιορισμένης διάρκειας ζωής των κυττάρων. Ως εκ τούτου, ομοιόσταση των τελομερών είναι κρίσιμη για τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την επιβίωση. Η τελομεράση, μια ριβονουκλεοπρωτεΐνη που αποτελείται από ένα συστατικό RNA (TR) και μιας αντίστροφης μεταγραφάσης καταλυτική υπομονάδα (TERT), αναπληρώνει τις επαναλήψεις των τελομερών και επομένως ρυθμίζει την κυτταρική δυναμικό αντιγραφής [13]. Στις περισσότερες ενήλικα κύτταρα, TR είναι μόνιμα παρούσα, αλλά η έκφραση TERT καταστέλλεται, με αποτέλεσμα να περιορίζεται πολλαπλασιασμό δυναμικό και η κυτταρική διάρκεια ζωής [14], [15]. Σε ενεργά πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα όπως βλαστικά κύτταρα και τα καρκινικά κύτταρα, η έκφραση TERT ρυθμίζεται αυξητικά με αποτέλεσμα σε απεριόριστες δυναμικό αντιγραφής και αθανασία των κυττάρων αυτών [16]. Ανθρώπινα TERT (hTERT) έκφραση και δραστικότητα έχει τεκμηριωθεί στην & gt? 75% των ανθρώπινων ορθοκολικών καρκινικών κυττάρων, αλλά μόνο 3-15% του φυσιολογικού βλεννογόνου και γύρω μη καρκινικών κυττάρων [17]. Σε συνεννόηση με τη σημασία της στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων, hTERT ρυθμίζεται αυστηρά με πολλαπλές ενεργοποιητές και καταστολείς, από τα οποία πολλά έχουν εντοπιστεί.

Εδώ δείχνουμε για πρώτη φορά ότι HH σηματοδότησης απορυθμίζει trancriptionally hTERT. Καταστολή της GLI1 /GLI2 μειωμένα επίπεδα της πρωτεΐνης hTERT σε ανθρώπινο κόλον, του προστάτη και του καρκίνου του εγκεφάλου κύτταρα. Η υπερέκφραση του GLI2ΔN αύξησε τα επίπεδα της hTERT mRNA, πρωτεΐνες και hTERT υποκινητή γνώμονα λουσιφεράσης (luc) δραστικότητα σε καρκινικά κύτταρα κόλου. Αποκλεισμός /2 δραστικότητα μειωμένη έκφραση mRNA hTERT GLI1 και την άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ των πρωτεϊνών GLI1 /GLI2 και τον προαγωγό hTERT σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Σε αντίθεση, GLI1 έκφρασης /GLI2ΔN σε μη καρκινικά κύτταρα 293Τ δεν μετέβαλλε τα επίπεδα του hTERT mRNA, δραστικότητα προαγωγού-Ιυο πρωτεΐνης ή hTERT. Κατάργηση HH σηματοδότηση σε καρκινικά κύτταρα μείωσε την δράση της τελομεράσης, η οποία αυξήθηκε κατά έκφραση GLI2ΔN. Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν hTERT να είναι ένας μεταγραφικός στόχος του μονοπατιού σηματοδότησης HH και να προσδιορίσει μια προηγουμένως άγνωστη ρόλο του άξονα HH /GLI στη ρύθμιση του δυναμικού αντιγραφή των καρκινικών κυττάρων. Αυτά τα ευρήματα αποκαλύπτουν μια νέα λειτουργία του HH σηματοδότησης στην αύξηση της ικανότητα αντιγραφής των καρκινικών κυττάρων. Ενδιαφέρον, HH σηματοδότηση ρυθμίζει hTERT σε ένα πλαίσιο με τρόπο που εξαρτάται σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα, σε αντίθεση με μη-κακοήθη κύτταρα, που μπορεί να έχει επιπτώσεις σε θεραπευτικές του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυττάρων Πολιτισμός και αντιδραστήρια

ΗΤ29, SW480, HCT116 και 293Τ κύτταρα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection. C4-2, DU145, και PC3 κύτταρα ήταν ευγενικό δώρα του Δρ Alexandru Almasan (Cleveland Clinic, ΟΗ). U87 κύτταρα ήταν ένα είδος δώρο του Dr. Candece Gladson (Cleveland Clinic, ΟΗ). Τα κύτταρα συνήθως ελέγχεται από μικροσκοπική ανάλυση της μορφολογίας των κυττάρων, τα χαρακτηριστικά της ανάπτυξης, και την αντιμετώπιση των κυτταροτοξικών παραγόντων [αννεξίνη V /ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) χρώση]. προφίλ γονίδιο μικροσυστοιχιών cDNA ήταν επίσης χαρακτηριστικό και τα κύτταρα ελέγχθηκαν δύο φορές το χρόνο για να είναι μυκόπλασμα-free. ΗΤ29, HCT116, SW480, C4-2, DU145 και PC3 κύτταρα διατηρήθηκαν σε 10% FBS συμπληρωμένο μέσο RPMI ενώ U87 και 293Τ κύτταρα διατηρήθηκαν σε 10% FBS-DMEM συμπληρωμένο. Τα κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν και μετρήθηκαν με μια καταμέτρηση σωματιδίων Ζ2 Coulter και αναλυτή μεγέθους (Beckman Coulter). Για την ανάλυση Western, αντίσωμα έναντι HSP90α /β αγοράστηκε από Santa Cruz Biotechnology? αντι-GLI1 και αντι-hTERT αντισώματα ήταν από Novus Biologicals, και αντι-GLI2 αντίσωμα ήταν από τη Cell Signaling Technology. Anti-c-myc αντισώματος (9Ε10) ελήφθη από το υβρίδωμα Πυρήνα, Lerner Research Institute. GANT61 αγοράστηκε από Calbiochem. Ο Δρ Graham W. Neill (Queen Mary University of London, UK) υπό την προϋπόθεση ευγενικά την GLI1 και πλασμίδια GLI2ΔN σε pBabe-Puro (PBP) φορέα έκφρασης θηλαστικών. Πλήρους μήκους hTERT-PBP πλασμίδιο ήταν ένα δώρο του Δρ Robert Weinberg (Addgene πλασμίδιο # 1771).

Western Blot Ανάλυση

Σύνολο κυτταρολύματα παρασκευάσθηκαν με τη χρήση RIPA ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (Cell Signaling Technology ). Πρωτεΐνη (60 μ§) διαχωρίστηκαν σε 10% ή 5% πήγματα SDS-PAGE. Οι διαχωρισμένες πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου και στη συνέχεια αποκλείστηκε σε ρυθμιστικό αποκλεισμού [5% άπαχο ξηρό γάλα σε 1Χ Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα με 0.1% Tween 20 (TBS-T)] για 1 ώρα. Οι μεμβράνες πλύθηκαν σε 1 Χ TBS-Τ, επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα επί μία νύκτα στους 4 ° C, πλύθηκαν και επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα για 1 ώρα, και τελικά αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας το Super Signal Pico υπόστρωμα από Pierce Biotechnology.

Απομόνωση RNA και mRNA Ανάλυση

Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ Qiagen RNeasy μίνι σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ολικό RNA μετατράπηκε σε cDNA χρησιμοποιώντας τυχαίους εκκινητές (κιτ σύνθεσης cDNA iScript Select? ΒΙΟ-RAD), και χρησιμοποιούνται για την ανάλυση της έκφρασης του mRNA σε πραγματικό χρόνο χρησιμοποιώντας 40 κύκλους των οργάνων και του λογισμικού της Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR. Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας NCBI /Primer-BLAST και χρησιμοποιήθηκαν για να δημιουργηθούν τα προϊόντα PCR. Οι GLI1, GLI2 και GAPDH εκκινητές περιγράφηκε προηγουμένως [9]

hTERT πρόσθιο εκκινητή:. 5′-CCTGGGTGGCACGGCTTTTGTTC-3 ‘.

hTERT αντίστροφος εκκινητής: 5′-CAGCCTTGAAGCCGCGGTTGA-3′.

GLI3R και παροδικές επιμολύνσεις

Το myc-tagged C-τέρμα κατασκεύασμα GLI3R (δώρο του Δρ Ariel Ruiz i Altaba, Πανεπιστήμιο της Γενεύης Ιατρική Σχολή, Γενεύη, Ελβετία) έχει περιγραφεί στο παρελθόν (3). κύτταρα ΗΤ29 επιμολύνθηκαν παροδικά χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000.

(Invitrogen) με GLI3R ή τον κενό φορέα pCS2-ΜΤ (προικισμένος από τον Δρ David Turner, σε μοριακό & amp? Behavioral Neuroscience Institute, University of Michigan, Ann Arbor , ΜΙ). Τα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για τα πειράματα 24 ώρες, 48 ώρες, ή 72 ώρες μετά την διαμόλυνση.

χρωματίνης Ανοσοκαθίζηση (μάρκας) Ανάλυση

Τα κύτταρα κατεργάζονται με GANT61 (20 μΜ) για 24 ώρες ήταν διασυνδεδεμένη σε 1% φορμαλδεΰδη /PBS, 10 λεπτά, 37 ° C, η οποία περατώθηκε σε γλυκίνη, 5 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν σε PBS και πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάζονται. Οι πυρήνες σε υπερήχους για τη δημιουργία θραυσμάτων χρωματίνης (≈ 500 έως 800 bp). Η χρωματίνη προδιαυγάστηκε με ένα μίγμα από πρωτεΐνη Α-Sepharose και proteinG-sepharose που έχει αποκλειστεί με αλβουμίνη βόειου ορού (1 mg /ml) και DNA σπέρματος σολομού (1 mg /ml). 10% του προκαταρκτική διαύγαση χρωματίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος εισόδου. Ίσες ποσότητες των προδιαυγάστηκε θραύσματα χρωματίνης ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντισώματα ειδικά για GLI1 (Novus Biologicals, CO), GLI2 (Cell Signaling Technology (ΜΑ), IgG (Abcam, ΜΑ? Αρνητικός έλεγχος), ή ιστόνη Η3 (Abcam, ΜΑ? Θετικός έλεγχος ). Οι μέθοδοι διεξήχθησαν όπως περιγράφεται προηγουμένως (3, 4). τα ανοσοκαταβυθίστηκαν προϊόντα πλύθηκαν εκτενώς και εκλούεται. 30 μΐ των εκλουσμένων προϊόντων υπέστησαν κατεργασία με RNase Α και πρωτεϊνάση Κ που ακολουθείται από αντίστροφη εγκάρσια σύνδεση και DNA απομόνωση. Gene ειδικούς εκκινητές ποσοτικοποιούνται τα ποσά των hTERT και προαγωγέα DNA BCL-2 στις ανοσοκαταβυθίστηκε κλάσματα. τα προϊόντα PCR διαχωρίστηκαν σε γέλη αγαρόζης 1%, βάφονται με βρωμιούχο αιθίδιο, και έγινε ορατό κάτω από υπεριώδες φως.

οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση ChIP έχουν ως εξής:

hTERT υποστηρικτής προς τα εμπρός: 5′-TGATGGGGACCGTTCCTTCCATC-3 ‘

προωθητή hTERT αντίστροφη:. 5′-ACACGGCCCACCCAGGGTTTA-3′.

BCL2-υποκινητή προς τα εμπρός : 5′-CCGGACGCGC CCTCCC-3 ‘

BCL-2 υποκινητή αντίστροφη:. 5′-GGTGCCTGTCCTCTTACTTCATTCTC-3′.

λουσιφεράσης Δοκιμασία

Ο υποκινητής hTERT πλήρους μήκους (-3337 /+ 438), και τη διαγραφή ανάντη μεταλλάξεις (-1226 /+ 438 και -233 /+ 438) καθοδηγούμενου λουσιφεράσης κατασκευάσματα ανταποκριτή παρεσχέθησαν ευγενώς από τον Dr. Ralf Janknecht, Πανεπιστήμιο της Οκλαχόμα Κέντρο Επιστημών Υγείας, OK [18] . ΗΤ29 ή 293Τ κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen) με 4 mg της αναφοράς της λουσιφεράσης και 0,4 mg pRLTK (λουσιφεράση της Renilla οδηγείται από προαγωγέα ΤΚ). 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ διπλής λουσιφεράσης (Promega Corporation) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η δραστικότητα λουσιφεράσης ανιχνεύθηκε με τη χρήση μετρητή Victor2 multilabel, και ομαλοποιήθηκε ως προς Renilla δραστικότητα λουσιφεράσης ένας έλεγχος για την αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης.

Η τελομεράση Επαναληπτική Amplification Protocol (TRAP) Δοκιμασία

Τα κύτταρα λύθηκαν σε 1Χ ρυθμιστικό λύσης CHAPS και 0,25 ug των κυτταρολυμάτων χρησιμοποιήθηκαν για την εκτέλεση προσδιορισμού TRAP. 1 μg TS εκκινητή άκρο σημασμένο με 3 μΐ γ

P32ATP (Perkin Elmer) χρησιμοποιώντας 1 μΙ ΡΝΚ (ΝΕΒ) σε μια αντίδραση 20 μΙ στους 37 ° C για 45 λεπτά και καθαρίστηκε μέσω Sephadex G-25 στήλη. Σε κάθε αντίδραση, 2 pmole του γ-32Ρ άκρο επισημασμένο TS εκκινητές, και αντίστροφοι εκκινητές για PCR ενίσχυση αναμίχθηκαν με 0.05 πιΜ dNTP, 20 mM Tris • Cl ρΗ 8.3, 1.5 mM MgCl

2, 63 mM ΚΟΙ, 0,05 % Tween 20, και 1 mM EGTA. 20 ng του RNase Α προστέθηκε με το κυτταρικό λύμα σε αντιδράσεις επεξεργασμένο με RNase. επέκταση εκκινητή τελομεράση μεσολάβηση διεξήχθη στους 30 ° C για 30 λεπτά που ακολουθείται από PCR ενίσχυση χρησιμοποιώντας το TS και αντίστροφους εκκινητές. Προϊόντα από προσδιορισμοί TRAP αναλύθηκαν σε 12,5% PAGE μη-μετουσίωσης. Τα αρχεία TIFF των σαρωμένων εικόνων γέλη ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρία χρησιμοποιώντας το Image J λογισμικό και η δράση της τελομεράσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο που αναφέρεται στο πρωτόκολλο του κατασκευαστή για το κιτ ανίχνευσης τελομεράσης TRAPEZE (Chemicon International Inc., ΜΑ).

στατιστική Ανάλυση

Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA).

Αποτελέσματα

HH Σηματοδοσίας ρυθμίζει προς τα πάνω έκφραση hTERT σε ανθρώπινα κύτταρα του καρκίνου

η κακή ρύθμιση της HH σηματοδότηση είναι γνωστό ότι προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και επιβίωση κυττάρου σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα, ως εκ τούτου, θεωρήθηκε ότι το ενεργοποιημένο μονοπάτι HH μπορεί επίσης να παίζει ένα ρόλο στην δυνατότητα αναπαραγωγής των καρκινικών κυττάρων. Η τελομεράση, ένας ρυθμιστής κλειδί της αντιγραφής δυναμικού και συνδέεται στενά με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την επιβίωση, είναι επομένως ένα ισχυρό υποψήφιο για ρύθμιση από ενεργοποιημένα σηματοδότηση HH σε καρκινικά κύτταρα. Για να δοκιμαστεί αυτή η υπόθεση, η σχέση μεταξύ του HH /GLI σηματοδότησης έκφραση άξονα και τελομεράσης εξετάστηκε σε πολλαπλές κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου. Εμείς κατήργησε τον άξονα σηματοδότησης HH /GLI σε πολλαπλές κυτταρικές γραμμές ανθρώπινου καρκίνου με φαρμακολογική αναστολείς και μετρήθηκε η έκφραση της τελομεράσης. Ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου ΗΤ29 και SW480, εκτίθενται σε GANT61 (20 μΜ), ένα μικρό αναστολέας μόριο GLI1 και GLI2 [9], για 72 ώρες επέδειξε μειωμένη επίπεδα σταθερής κατάστασης της GLI1, GLI2 και πρωτεΐνες hTERT (Εικ. 1Α). Παρομοίως, ο αποκλεισμός HH σηματοδότησης /GLI στα καρκινικά κύτταρα προστάτη C4-2, DU145 και PC3 έδειξαν επίσης μειώθηκε GLI1, GLI2 και η έκφραση πρωτεΐνης hTERT (Εικ. 1Α). Η χορήγηση GANT61 (20 μΜ) προς την GBM κυτταρική γραμμή U87 σε περίοδο 72 ωρών είχε ως αποτέλεσμα μειωμένες GLI1, GLI2 και hTERT πρωτεΐνη εκφράσεις (Εικ. 1Β). Εμείς αξιολογηθούν περαιτέρω τα αποτελέσματα του μονοπατιού σηματοδότησης HH επί της έκφρασης hTERT τροποποιώντας γενετικά το /GLI μονοπάτι σηματοδότησης HH. Χρησιμοποιήσαμε ένα C-τέρμα του μεταλλαγμένου GLI3 (GLI3R, myc-tagged GLI3C’DCla1 [3]), η οποία καταστέλλει GLI1 και GLI2 δραστηριότητα [8]. Μετά από παροδική επιμόλυνση GLI3R σε ΗΤ29 (. Πυκνομετρική ποσοτικοποίηση στο Σχ 2Α) και HCT116 (Εικ. 2Β) κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου, GLI1, GLI2 και τα επίπεδα πρωτεΐνης hTERT μειώθηκαν σε περίοδο 48 ωρών – 72 ώρες. Αντιθέτως, μια σταθερή έκφραση είτε GLI1 ή GLI2ΔN, ένα Ν-τέρμα του μεταλλαγμένου GLI2, με συστατική λειτουργία ενεργοποιητή σε κύτταρα ΗΤ29 για 10 περάσματα έδειξαν αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης hTERT (Σχ. 2C).

A :

ΗΤ29, SW480 (κύτταρα καρκινώματος κόλον), C4-2, DU145 και PC3 (κύτταρα καρκίνου του προστάτη) υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 72 ώρες με είτε DMSO (έλεγχος οχήματος) ή GANT61 (20 μΜ).

Β:

U87 (κύτταρα GBM) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με GANT61 (20 μΜ) για 0-72 ώρες. Επίπεδα σταθερής κατάστασης της GLI1, GLI2 και hTERT πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν με ανάλυση Western. HSP90α /β χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας φόρτωσης

Η

Α:.

ΗΤ29,

Β:

HCT116 κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με GLI3R (myc-tagged) για 48 hr ή 72 ώρες, αντίστοιχα. Επίπεδα σταθερής κατάστασης της GLI1, GLI2 και hTERT προσδιορίστηκαν με ανάλυση Western εκπροσωπήθηκαν ως πυκνότητας των κηλίδων στο

Μια

με έναν εκπρόσωπο κηλίδα hTERT (ένθετο). Η έκφραση του GLI3R προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-myc.

C:

PBP κενό φορέα (V) ή πλήρους μήκους cDNA σε GLI1 PBP (GLI1) ή GLI2ΔN σε PBP (GLI2ΔN) εκφράστηκε σταθερά σε κύτταρα ΗΤ29, και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 10 περάσματα. Επίπεδα σταθερής κατάστασης της GLI1, GLI2 και hTERT μετρήθηκαν με κηλίδωση Western. HSP90α /β χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. * P & lt?. 0.0001

Η

GLI Μεταγραφή παράγοντες αλληλεπιδρούν με την hTERT Διοργανωτή σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του

Στη συνέχεια, μελετήσαμε τον μηχανισμό με τον οποίο τα σήματα HH ρυθμίζουν την έκφραση των hTERT στον ανθρώπινο καρκίνο κύτταρα. Η μεταγραφική ρύθμιση της έκφρασης hTERT είναι ένας κοινός μηχανισμός του hTERT αυξητική ρύθμιση σε καρκινικά κύτταρα [19]. Δεδομένου ότι οι πρωτεΐνες GLI είναι παράγοντες μεταγραφής, υποθέσαμε ότι GLI1 και GLI2 ρυθμίζουν μεταγραφικά έκφραση hTERT σε καρκινικά κύτταρα. έκφραση mRNA hTERT ήταν ανυψωμένη στις δύο GLI1- και GLI2-κύτταρα που υπερεκφράζουν ΗΤ29 (εικ. 3Α). Όταν τα κύτταρα ΗΤ29 εκτέθηκαν σε GANT61 (20 μΜ), τα επίπεδα mRNA hTERT μειώθηκαν σημαντικά μέσα σε 24 ώρες και παρέμεινε σε καταστολή έως 72 ώρες (Σχ. 3Β). κύτταρα DU145 αποδειχθεί μειωμένα επίπεδα GLI2 και hTERT mRNA όταν εκτίθεται σε GANT61 (20 μΜ), ενώ η έκφραση μεταγράφου GLI1 παρέμεινε αμετάβλητη στις 48 ώρες μετά την αγωγή (Σχ. 3C). Κατά την έκθεση σε GANT61 (20 μΜ), τα κύτταρα υ87 καταδεικνύεται μειώσεις GLI1, GLI2 και mRNA hTERT μέσα σε 24 ώρες (Σχ. 3D). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν μεταγραφική ρύθμιση της έκφρασης hTERT από HH οδό σηματοδότησης σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα

Α:.

ΗΤ29 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά κενό φορέα (V), GLI1 (GLI1) ή GLI2ΔN (GLI2ΔN) αναλύθηκαν για hTERT, GLI1 και έκφραση GLI2 mRNA που καθορίζεται από την Real-Time PCR.

Β:

έκθεσης των κυττάρων ΗΤ29 σε GANT61 (20 μΜ? 0-72 ώρες) μειωμένη έκφραση της hTERT mRNA, που καθορίζεται από την Real-Time PCR.

C:

DU145,

D:

κύτταρα U87 εκτέθηκαν σε GANT61 (20 μΜ? 48 ώρες ή 24 ώρες, αντίστοιχα) και GLI1, GLI2 και hTERT mRNA μετρήθηκε από την Real-time PCR. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD 3 προσδιορισμών. * P & lt?. 0.05

Η

Για να τεμαχίσει το μηχανισμό της μεταγραφικής ρύθμισης της έκφρασης hTERT από σηματοδοτικό μονοπάτι HH, θα παρακολουθούνται τα αποτελέσματα των HH σηματοδότησης σχετικά με τη δραστηριότητα υποκινητή hTERT στα κύτταρα ΗΤ29. Το πλήρους μήκους hTERT υποκινητή καθοδηγείται λουσιφεράσης (FL hTERT prom-Ιυο) ανταποκριτή και ρΡΙ_-ΤΚ ήταν συν-επιμολύνθηκαν παροδικώς σε ΗΤ29 προερχόμενο σταθερές κυτταρικές σειρές που υπερεκφράζουν GLI1 ή GLI2 ή hTERT. Αμφότερες GLI1 και GLI2ΔN κύτταρα που εκφράζουν επέδειξαν 4-πλάσια αύξηση στην δραστικότητα προωθητή ΙιΤΕΚΤ εντός 24 ωρών από την επιμόλυνση (Σχ. 4Α). Για τον προσδιορισμό του ελάχιστου μήκους προωθητή που απαιτούνται για τις HH-εξαρτώμενη επιδράσεις στην δραστικότητα hTERT υποκινητή, ο υποκινητής hTERT FL (-3337 /+ 438), και ανάντη μεταλλάξεις διαγραφής (-1226 /+ 438 και -233 /+ 438) καθοδηγούμενου λουσιφεράση ρεπόρτερ συν-επιμολύνθηκαν σε κύτταρα ΗΤ29 που ακολουθείται από έκθεση είτε τον έλεγχο του οχήματος ή GANT61 (20 μΜ) για 24 ώρες. Τα δεδομένα αποδεικνύουν ότι η περιοχή -1226 /+ 438 είναι η ελάχιστη απαίτηση για ενεργοποίηση hTERT υποκινητή HH-εξαρτώμενη αν και, τα αποτελέσματα είναι μικρότερη από εκείνη του hTERT υποκινητή FL (Εικ. 4Β). Η δραστηριότητα hTERT υποκινητή FL ήταν σημαντικά μειωμένη μετά από αποκλεισμό δραστηριότητα GLI με GANT61 (20 μΜ) (Σχ. 4Β). Στη συνέχεια, ερευνήσαμε κατά πόσο οι παράγοντες μεταγραφής GLI αλληλεπίδρασε απευθείας με τον υποκινητή hTERT σε καρκινικά κύτταρα.

Σε silico

ανάλυση του προωθητή hTERT αποκάλυψε 7 υποθετικές θέσεις πρόσδεσης για την οικογένεια GLI παραγόντων μεταγραφής. Αμφότερα τα αντισώματα GLI1 και GLI2 καταβυθίστηκε θραύσματα του υποκινητή hTERT σε αναλύσεις πλινθίου (Εικ. 4C). PCR ενίσχυση των θραυσμάτων χρωματίνης χρησιμοποιώντας εκκινητές ειδικούς για περιοχές υποκινητή hTERT οδήγησε σε αμπλικόνια που περιείχε atleast τον πυρήνα (-226 /+ 360) προωθητή hTERT επιβεβαιώθηκε με ανάλυση αλληλουχίας των PCR αμπλικονίων. Η δέσμευση του GLI1 και GLI2 προς τον υποκινητή hTERT μειώθηκε σε παρουσία GANT61 (20 μΜ) εντός 24 ωρών (Σχ. 4D). BCL-2, έχουν αναφερθεί στο παρελθόν ως στόχος τόσο GLI1 και GLI2, χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος (Εικόνα 4C και 4D).

Α:.

Σταθερά παράγωγα των κυττάρων ΗΤ29 (που περιγράφεται στο Το Σχ. 2C) συν-επιμολύνθηκαν με πλήρους μήκους hTERT υποκινητή οδηγείται λουσιφεράσης (-3337 /+ 438) ανταποκριτή και λουσιφεράσης Renilla (pRL-ΤΚ) κατασκευάσματα για 24 ώρες. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. δραστικότητα λουσιφεράσης προωθητή hTERT ομαλοποιήθηκε έναντι δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla και παρουσιάζεται ως μέση τιμή ± SD, η = 3.

Β:

ΗΤ29 κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με είτε το πλήρους μήκους (-3337 /+ 438) ή ανάντη διαγράφεται μεταλλάγματα (-1226 /+ 438 ή -233 /+ 438) του hTERT prom-Luc ρεπόρτερ και ρΡΙ_-ΤΚ ακολουθούμενη από έκθεση σε GANT61 (20 μΜ, 24 ώρες) και τον προσδιορισμό της δραστηριότητας της λουσιφεράσης. δραστικότητα λουσιφεράσης προωθητή hTERT ομαλοποιήθηκε έναντι δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla και παρουσιάζεται ως μέση τιμή ± SD, η = 3.

C:

ΗΤ29 κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση ChIP χρησιμοποιώντας αντισώματα ειδικά για GLI1, GLI2, ή ιστόνη Η3 (θετικός ελέγχου, που χρησιμοποιούνται για την κανονικοποίηση).

D:

ΗΤ29 κύτταρα κατεργασμένα με GANT61 (20 μΜ, 24 ώρες) παρομοίως αξιολογήθηκαν με ανάλυση chip. Μεταγενέστερες Real-Time PCR που χρησιμοποιήθηκαν εκκινητές που πλαισιώνεται τις περιοχές προαγωγού του hTERT ή του γονιδίου στόχου GLI, BCL-2 (θετικός έλεγχος). * P & lt?. 0.05

Η

HH /GLI Σηματοδοσίας δεν ρυθμίζει hTERT Έκφραση σε μη-κακοήθη κύτταρα 293Τ

Εμείς διερευνηθεί περαιτέρω κατά πόσον HH σηματοδότησης μεταγραφικά ρυθμίζει hTERT σε μη-κακοήθη κύτταρα. Τα κύτταρα 293Τ πειραματικά μετασχηματίζονται αλλά δεν έχουν την ικανότητα να σχηματίζουν εύκολα όγκους σε γυμνούς ποντικούς [20] και καταδεικνύουν μία επαγώγιμη άξονας σηματοδότηση /GLI HH [21]. Είμαστε παροδικά επιμολυσμένα κύτταρα 293Τ με είτε πλασμίδια GLI1 ή έκφραση GLI2ΔN, και να μετρηθεί η έκφραση hTERT με ανάλυση Western. Αν και GLI1 και GLI2 εκφράσεις πρωτεΐνης ήταν σημαντικά αυξημένα στα επιμολυσμένα κύτταρα 293Τ, η έκφραση της πρωτεΐνης hTERT παρέμεινε αμετάβλητη στις 48 ώρες και 72 ώρες (Εικ. 5Α). hTERT υπερ-εκφράζοντα κύτταρα ΗΤ29 χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος για την ανάλυση πρωτεϊνών hTERT (Εικ. 5Α). Μετρήσαμε hTERT μεταγραφής μετά από παροδική επιμόλυνση σε κύτταρα GLI2ΔN 293Τ. Μέσα σε 48 ώρες από την επιμόλυνση, τα κύτταρα 293Τ κατέδειξε ισχυρή αύξηση GLI2 mRNA και & gt? 5 φορές αύξηση στα επίπεδα mRNA GLI1, αλλά καμία σημαντική αύξηση στο επίπεδο του mRNA hTERT (Σχήμα 5Β).. Περαιτέρω, παροδική συν-επιμόλυνση του FL hTERT prom-Ιυο ανταποκριτή και είτε GLI1 ή πλασμίδια έκφρασης GLI2ΔN δεν αύξησε την δραστικότητα λουσιφεράσης σε κύτταρα 293Τ (Σχ. 5C). Τα ευρήματα αυτά υπογραμμίζουν τα πλαίσια που εξαρτώνται από τις λειτουργίες του μονοπατιού σηματοδότησης HH που απορυθμίζει επιλεκτικά την έκφραση hTERT σε κακοήθη κύτταρα σε αντίθεση με μη κακοήθη κύτταρα

Α:.

293Τ κύτταρα χωρίς θεραπεία (UT), παροδικά επιμολυσμένα με άδειο φορέα (V) ή GFP-tagged GLI1 (GLI1) ή GFP-tagged GLI2ΔN (GLI2ΔN). Έκφραση των GLI1, GLI2 και hTERT προσδιορίστηκε για 48 και 72 ώρες με ανάλυση Western. HSP90α /β χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης και GFP χρησιμοποιήθηκε για να σηματοδοτήσει εξωγενώς εκφράζεται GFP-tagged GLI πρωτεΐνες. Σύνολο κυτταρολύματος από κύτταρα ΗΤ29 εκφράζουν σταθερά hTERT (ΗΤ29 + hTERT) χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος.

Β:

κύτταρα 293Τ παροδικά επιμολυσμένα με φορέα ή GLI2 (όπως περιγράφεται στο Σχήμα 5Α) αναλύθηκαν για GLI1, GLI2 και η έκφραση του mRNA hTERT μέσω qPCR. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD 3 προσδιορισμών.

C:

κύτταρα 293Τ συν-επιμολύνθηκαν παροδικώς με FL-hTERT prom-luc, ρεπόρτερ renilla luceferase και φορέα, GLI1 ή GLI2 (όπως περιγράφεται στο Σχήμα 5Α). 24 ώρες μετά την επιμόλυνση τα κύτταρα αναλύθηκαν για δραστικότητα λουσιφεράσης. δραστηριότητα λουσιφεράσης υποκινητή με γνώμονα hTERT ομαλοποιήθηκε κατά δραστηριότητα λουσιφεράσης Renilla και παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD, n = 3. * ρ & lt?. 0.05

Η

HH /GLI Σηματοδοσίας Ρυθμίζει hTERT ενζυματική δραστηριότητα σε ανθρώπινα κύτταρα του καρκίνου

η ανώμαλη ρύθμιση προς τα πάνω της έκφρασης hTERT σχετίζεται με αυξημένη τελομεράσης ανάστροφης μεταγραφάσης ενζυμική δραστηριότητα σε καρκινικά κύτταρα. Ως εκ τούτου, ελέγξαμε την λειτουργική σημασία του άξονα /GLI /hTERT ΗΗ με μέτρηση της δραστικότητας του ενζύμου τελομεράση στα καρκινικά κύτταρα. ποσοτικό προσδιορισμό TRAP χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η δραστικότητα του hTERT κατόπιν τροποποιήσεως του καταρράκτη σηματοδότησης HH /GLI. GANT61 (20 μΜ) χορήγηση οδήγησε σε μειωμένη δραστικότητα τελομεράσης από 48 ώρες, η οποία διατηρήθηκε για μέχρι 72 ώρες σε κύτταρα ΗΤ29 (Εικ. 6Α, ποσοτικοποιείται στο Σχ. S1). Αντίθετα, σταθερά παράγωγα των κυττάρων ΗΤ29 που εκφράζουν GLI2ΔN καταδειχθεί αυξημένη δραστηριότητα τελομεράσης σε σύγκριση με τον φορέα ελέγχου, ενώ GLI1 υπερ-εκφράζοντα κύτταρα είχαν μέτρια αύξηση στη δράση της τελομεράσης (Σχ. 6Β, ποσοτικοποιούνται στην Εικ. S1). hTERT υπερ-εκφράζοντα κύτταρα με αυξημένη δραστικότητα τελομεράσης χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος (Σχ. 6Β). δραστικότητα τελομεράσης ελαττώθηκε στα κύτταρα DU145 εκτίθενται σε GANT61 (0-30 μΜ) για 48 ώρες (Εικ. 6C). κύτταρα U87 έδειξαν επίσης μειώσεις στη δράση της τελομεράσης εντός 48 ωρών από την έκθεση σε GANT61 (20 μΜ), η οποία διατηρήθηκε μέχρι 72 ώρες (Εικ. 6D). Αυτές οι παρατηρήσεις αποδεικνύουν ότι HH σηματοδότηση ρυθμίζει προς τα πάνω και οι δύο την έκφραση hTERT και δραστικότητα τελομεράσης σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα

Α:.

ΗΤ29 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με GANT61 (20 μΜ) για 0-72 ώρες, και λύματα εκχυλίζονται κατά διαστήματα για ανάλυση TRAP. 100 bp DNA σκάλα χρησιμοποιήθηκε ως μοριακού δείκτη (Μ).

Β:

ΗΤ29 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά τον φορέα (V), GLI1 ή GLI2 (GLI2ΔN) (που περιγράφεται στο Σχήμα 3Α) αξιολογήθηκαν για τη δράση της τελομεράσης με ποσοτικό προσδιορισμό TRAP. hTERT υπερεκφράζουν κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος.

C:

U87 και

D:.

Κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με GANT61 (0-30 μΜ? 0-72 ώρες) και δράση της τελομεράσης αναλύθηκε με τον ποσοτικό προσδιορισμό TRAP

Συζήτηση

HH είναι απαραίτητη για τη φυσιολογική εμβρυϊκή ανάπτυξη, όπου ρυθμίζει την διαφοροποίηση των κυττάρων και το σχηματισμό οργάνων με τρόπο βαθμίδωσης εξαρτώμενη [22]. HH σηματοδότηση ρυθμίζει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό με διαμόρφωση μεταγραφικά γονίδια που ελέγχουν την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, όπως κυκλίνη Α, κυκλίνη Ε και, επίσης με Ptch μεσολάβηση παγίδευση της κυκλίνης Β στον cyctoplasm [23], [24], [25]. Στο στάδιο των ενηλίκων, ενεργός σηματοδότηση HH επιμένει σε ένα μικρό υποσύνολο των κυττάρων τα οποία προσδίδουν αναγεννητική δυναμικό για τις ώριμες όργανα [26]. Δυσλειτουργία του HH σηματοδότησης έχει αναφερθεί σε πολλαπλούς ανθρώπινους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου του καρκινώματος βασικών κυττάρων [27], [28], μυελοβλάστωμα [1], [29], ραβδομυοσάρκωμα [30], γλοίωμα [1], παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα [31], [ ,,,0],32], [33], του καρκίνου του προστάτη [34] και καρκινώματος του κόλου [7], [8], [9], [10]. Στα καρκινικά κύτταρα, αυτοκρινούς εξαρτώμενη από συνδετήρα και ογκογονιδίου γνώμονα μηχανισμοί ανεξάρτητη από συνδεσμικό διατηρήσουν ενεργό καταρράκτη σηματοδότησης HH. Η ανώμαλη δραστηριότητα HH οδηγεί σχηματισμό όγκου και τη συντήρηση του όγκου μέσω επαγωγής σημάτων προ-επιβίωσης και αποκλεισμού αποπτωτικά σήματα σε καρκινικά κύτταρα [9], [35]. Ένα άλλο χαρακτηριστικό γνώρισμα του καρκίνου είναι απεριόριστες δυνατότητες πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων με αποτέλεσμα την αθανασία, ωστόσο μια σύνδεση με απορρυθμισμένη HH σηματοδότηση δεν ήταν γνωστή.

Τα τελομερή είναι εξειδικευμένες δομές νουκλεοπρωτεΐνης στα χρωμοσωμικές άκρα που είναι σημαντικές για χρωμοσωμικές σταθερότητα και την αθανασία του κύτταρα. Κανονική σωματικά κύτταρα αντιμετωπίζουν μια βαθμιαία φθορά του μήκους των τελομερών με κάθε κύκλο αντιγραφής του DNA περιορίζοντας έτσι την κυτταρική διάρκεια ζωής. Κανονική βλαστικά κύτταρα και τα καρκινικά κύτταρα να ξεφύγουν τον έλεγχο αυτό και να ανεφοδιάσει τα μήκη των τελομερών τους με την αυξημένη δραστηριότητα της τελομεράσης. Η τελομεράση είναι ένα ριβονουκλεοπρωτεΐνης που αποτελείται από ανθρώπινης τελομεράσης ανάστροφης μεταγραφάσης ένζυμο, hTERT και RNA τελομεράσης hTR [36], [37]. Στα καρκινικά κύτταρα, η έκφραση hTERT είναι παρεκκλίνοντα αποκατασταθεί οδηγεί σε αυξημένη δραστηριότητα τελομεράσης που διατηρεί το μήκος των τελομερών και παρέχει απεριόριστες δυνατότητες αντιγραφής. έκφρασης hTERT και της δραστηριότητας της τελομεράσης έχει μια στενή σχέση [33] με καρκίνους του ανθρώπου [17], [38]. Μετασχηματισμός τελομεράση αρνητικά τα φυσιολογικά κύτταρα in vitro απαιτεί την έκφραση hTERT [39], οριοθετούν έκφραση hTERT ως ένα βήμα περιορισμού του ρυθμού στην ομοιόσταση του μήκους των τελομερών και κυτταρικό μετασχηματισμό. Η ρύθμιση της έκφρασης hTERT έχει μελετηθεί εκτενώς και έχει πολλές θετικές και αρνητικές ρυθμιστικές αρχές έχουν εντοπιστεί [40], [41].

Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε για πρώτη φορά ότι το σηματοδοτικό μονοπάτι HH εξασφαλίζει απεριόριστες δυναμικό αναπαραγωγής των καρκινικών κυττάρων με τη ρύθμιση της έκφρασης hTERT και δραστηριότητας. Σε πολλαπλά ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένων κόλου, του προστάτη και του εγκεφάλου, η καταστολή της έκφρασης GLI1 και GLI2 χρησιμοποιώντας GANT61, ένα μικρό μόριο αναστολέα οδήγησε σε μειωμένη έκφραση του mRNA hTERT, πρωτεΐνης και δραστικότητα του ενζύμου. Το εύρημα αυτό έδειξε ένα ρυθμιστικό άξονα μεταξύ HH σηματοδότησης και hTERT σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα. Χρησιμοποιώντας μια γενετική προσέγγιση για την καταστολή GLI1 και GLI2 χρησιμοποιώντας GLI3R, έκφραση hTERT θα μπορούσε επίσης να ανασταλεί σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. Εξαναγκασμένη έκφραση GLI1 ή μία ουσιαστικά δραστική μεταλλαγμένη έκφρασης GLI2 αυξημένη hTERT mRNA και πρωτεΐνης σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου που αποδεικνύουν HH /GLI μεσολάβηση ρύθμιση της έκφρασης hTERT.