Αφηρημένο

Ιστορικό

ΕΤ-743 (trabectedin, Yondelis®) και PM00104 (Zalypsis®) είναι ενώσεις που προέρχονται θαλάσσια που έχουν αντικαρκινική δράση. ΕΤ-743 και PM00104 έκθεση επί παρατεταμένες περιόδους της θεραπείας θα έχει ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη της ανθεκτικότητας στα φάρμακα, αλλά οι μηχανισμοί που οδηγούν σε ανθεκτικότητα δεν είναι ακόμη κατανοητός.

Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση

Ανθρώπινο χονδροσαρκώματος κυτταρικές γραμμές ανθεκτικές σε ΕΤ-743 (CS-1 /ER) ή PM00104 (CS-1 /PR) καθορίστηκαν σε αυτή τη μελέτη. Το CS-1 /ER και CS-1 /PR εμφάνισαν διασταυρούμενη αντοχή στη σισπλατίνη και μεθοτρεξάτη αλλά όχι στη δοξορουβικίνη. Ανθρώπινα συστοιχίες Affymetrix Gene Chip χρησιμοποιήθηκαν για την εξέταση σχετικής γονιδιακής έκφρασης σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές. Βρήκαμε ότι ένας μεγάλος αριθμός γονιδίων έχουν αλλάξει τα επίπεδα έκφρασης σε CS-1 /ER και CS-1 /PR σε σύγκριση με την γονική κυτταρική σειρά. 595 CS-1 /ER και 498 CS-1 /PR γονιδίων ταυτοποιήθηκαν ως υπερεκφράζουν? 856 CS-1 /ER και 874 μεταγραφές CS-1 /PR προσδιορίστηκαν ως υποέκφραση. Τρεις ψευδαργύρου πρωτεΐνη δάκτυλο (ZNF) γονίδια ήταν στον κατάλογο υπερεκφρασμένης γονίδια top 10. Αυτά τα γονίδια δεν έχουν προηγουμένως συνδέονται με αντοχή φαρμάκου σε κύτταρα όγκου. Διαφορική εκφράσεις ZNF93 και ZNF43 γονιδίων επιβεβαιώθηκαν και στα δύο /ER και CS-1 /PR ανθεκτικές κυτταρικές σειρές CS-1 με πραγματικού χρόνου RT-PCR. ZNF93 υπερεκφράστηκε σε δύο ανθεκτικές κυτταρικές σειρές σαρκώματος Ewing ΕΤ-743, καθώς και σε μία σισπλατίνη ανθεκτική κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών, αλλά δεν υπερεκφράζεται σε ανθεκτικές πακλιταξέλη κυτταρικές γραμμές. ZNF93 νοκ ντάουν με siRNA στο CS-1 /ER και CS-1 /PR προκάλεσε αυξημένη ευαισθησία για την ΕΤ-743, PM00104 και σισπλατίνη. Επιπλέον, ZNF93 επιμολυσμένα κύτταρα CS-1 είναι σχετικά ανθεκτικά στην ΕΤ-743, PM00104 και σισπλατίνη.

Συμπεράσματα /Σημασία

Αυτή η μελέτη δείχνει ότι οι πρωτεΐνες δακτύλου ψευδαργύρου, και ZNF93 ειδικότερα, εμπλέκονται στην αντίσταση στην ΕΤ-743 και PM00104

Παράθεση:. Duan Ζ, Choy Ε, Harmon D, Yang C, Ryu Κ, Schwab J, et al. (2009) ZNF93 αυξάνει την αντίσταση στην ΕΤ-743 (Τραβεκτεδίνη? Yondelis®) και PM00104 (Zalypsis®) σε ανθρώπινα καρκινικά Γραμμές κυττάρων. PLoS ONE 4 (9): e6967. doi: 10.1371 /journal.pone.0006967

Επιμέλεια: Nils Cordes, Dresden University of Technology, Γερμανία

Ελήφθη: 2 Απρ, 2009? Αποδεκτές: 10, Αυγ, 2009? Δημοσιεύθηκε: 9 του Σεπτεμβρίου του 2009

Copyright: © 2009 Duan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε, εν μέρει, με επιχορήγηση από PharmaMar. Ο Δρ Duan υποστηρίζεται, εν μέρει, μέσω επιχορήγησης από ωοθηκών Ίδρυμα Έρευνας για τον Καρκίνο (oCRF), και μια επιχορήγηση από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, ΝΙΗ (νανοτεχνολογία πλατφόρμα Εταιρικής Σχέσης), R01-CA119617. Ο Δρ Choy υποστηρίζεται από το Ίδρυμα Jennifer Hunter Yates. Υποστήριξη έχει επίσης παρέχονται από τους χρηματοδότες funds.The Gattegno και Wechsler δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Μπορούμε επίσης να αναγνωρίσουμε ότι οι 2 από διάφορα φάρμακα χημειοθεραπείας που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη, η ΕΤ-743 και PM00104, είχαν κατασκευαστεί και παρέχονται από την εταιρεία, PharmaMar που επίσης χρηματοδοτούνται εν μέρει το έργο

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Βεβαιώνω ότι PharmaMar USA, Inc δεν έχει καμία επίδραση στα αποτελέσματα και τα συμπεράσματα της μελέτης αυτής. Δηλώνω επίσης ότι τα αποτελέσματα και τα συμπεράσματα δεν επηρεάστηκαν από την επιχορήγηση από PharmaMar USA, Inc. Αν και αυτή η μελέτη αυτή υποστηρίχθηκε, εν μέρει, με επιχορήγηση από PharmaMar, αυτό δεν μεταβάλλει προσήλωση μας σε όλα τα PLoS ONE πολιτικές σχετικά με την κοινοχρησία δεδομένων και τα υλικά με άλλους ερευνητές. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Μπορούμε επίσης να αναγνωρίσουμε ότι οι 2 από διάφορα φάρμακα χημειοθεραπείας που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη, η ΕΤ-743 και PM00104, είχαν κατασκευαστεί και παρέχονται από την εταιρεία, PharmaMar που επίσης χρηματοδοτούνται εν μέρει το έργο.

Εισαγωγή

ΕΤ-743 (Yondelis®? τραβεκτεδίνη) είναι παράγωγο της θαλάσσιας αλκαλοειδές που απομονώνεται από την Καραϊβική θάλασσα squirt

Ecteinascidia κογχών

[1], [2]. ΕΤ-743 έχει ένα ευρύ φάσμα δράσης σε κυτταρικές γραμμές όγκου σε ρΜ και χαμηλές συγκεντρώσεις ηΜ, και έχει επίσης κλινική δραστικότητα έναντι του καρκίνου των ωοθηκών, του καρκίνου του μαστού, και σαρκωμάτων [2], [3]. ΕΤ-743 έχει εγκριθεί από την ΕΜΕΑ /ΕΕ για τους ασθενείς με προχωρημένο σάρκωμα που είτε έχουν προχωρήσει μετά τη θεραπεία με ανθρακυκλίνη ή δεν είναι κλινικά κατάλληλο για να λάβετε συμβατικούς παράγοντες [4]. ΕΤ-743 αποτελείται από τρία τετραϋδροϊσοκινολίνης υπομονάδων που περιέχει ένα κεντρικό τμήμα καρβινολαμίνη επιτρέπουν να προσδένονται ομοιοπολικά με DNA. ΕΤ-743 δεσμεύεται στη μικρή αύλακα του DNA έλικα με προτίμηση δεσμευτική αλληλουχία-ειδικά για πλούσιες σε GC τριδύμων και στη συνέχεια σχηματίζει ομοιοπολικό ενώσεις προσθήκης με το Ν2-θέση της γουανίνης. Ως αποτέλεσμα, η μικρή αύλακα εκτίθεται και στράφηκε προς την κύρια αύλακα. Όταν συμβαίνει τέτοια σύνδεση, έλικες του DNA γίνονται διασυνδεδεμένη και δεν μπορούν να αναπαραχθούν, με αποτέλεσμα το θάνατο του κυττάρου [5], [6]. Η κατεύθυνση του DNA καμπής είναι ένα νέο χαρακτηριστικό μεταξύ DNA ελάσσονα αύλακα παράγοντες αλληλεπιδραστική, καθιστώντας έτσι ΕΤ-743 μοναδική.

PM00104 (Zalypsis®), που προέρχεται από τα μαλάκια, είναι μία νέα χημική οντότητα που σχετίζονται με Γιορουμυκίνη, μια θαλάσσιων φυσικών ένωση που ανήκει στην οικογένεια των

ρενιεραμυκινών

, που λαμβάνεται από σφουγγάρια [7], [8]. PM00104 έχει

in vitro

και

in vivo

αντικαρκινική δραστικότητα έναντι μιας ευρείας ποικιλίας στερεών και αιματολογικών όγκων. Όπως και με ΕΤ-743, PM00104 συνδέεται επίσης στο DNA και είναι κυτταροτοξική? Ωστόσο, σε αντίθεση με ΕΤ-743, PM00104 δεν ενεργοποιεί την απόκριση «DNA σημείο ελέγχου ζημία». Έτσι, οι κυτταροτοξικές επιδράσεις της PM00104, αν και εξαρτάται από την DNA δεσμευτική, δεν ενεργοποιούνται από μηχανισμούς ανταπόκρισης βλάβη του DNA [8].

Όπως και με άλλα χημειοθεραπευτικά φάρμακα, ΕΤ-743 και PM00104 έκθεση επί παρατεταμένες περιόδους της θεραπείας θα έχει ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη της ανθεκτικότητας στα φάρμακα, αλλά οι μηχανισμοί δεν είναι καλά κατανοητοί. Διάφορες μελέτες έχουν αναφέρει αντικρουόμενες περιγραφές της σχέσης μεταξύ της έκφρασης ABCB1 και αντίσταση ΕΤ-743 σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές [9], [10]. Στην ανθρώπινη κυτταρική γραμμή ωοθηκών IGROV-1, η οποία επιλέγεται για την αντοχή ΕΤ-743, ABCB1 υπερεκφράζεται [11]. Ευαισθησία θα μπορούσε να αποκατασταθεί με την προσθήκη του αναστολέα pGP1 PSC-833, υποδηλώνοντας ότι η ΕΤ-743 μπορεί να είναι ένα υπόστρωμα pGP1. Μια άλλη μελέτη ωστόσο, παρατηρείται ότι δύο υπερ-εκφράζουν ανθρώπινου επιδερμοειδούς καρκινικές κυτταρικές σειρές Pgp (ΚΒ-8-5 και ΚΒ-C-2) δεν ήταν ανθεκτικά σε ΕΤ-743 [9]. Αξιοσημείωτα, υπο-θανατηφόρες συγκεντρώσεις της ΕΤ-743 θα μπορούσε να αντιστρέψει αντίσταση σε δοξορουβικίνη και βινκριστίνη σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές. Δεν υπάρχουν αναφορές που περιγράφουν το μηχανισμό αντίστασης PM00104 στα καρκινικά κύτταρα.

χονδροσαρκώματα είναι μια ετερογενής ομάδα των όγκων μεσεγχυματικής προέλευσης που αναπτύσσονται στα οστά ή χόνδρο και εμφάνιση χονδροκυττάρων χαρακτηριστικά [12]. Αυτοί οι όγκοι ανταποκρίνονται ανεπαρκώς σε συμβατικές θεραπείες, όπως η χημειοθεραπεία και η ακτινοβολία, και πρόγνωση σχετίζεται με βαθμό του όγκου και την κατάσταση διαφοροποίησης. Η ευαισθησία των κυττάρων σαρκώματος σε ΕΤ-743 και PM00104 εμάς και άλλους οδήγησε να εξετάσει αυτές τις ενώσεις ως ενδιαφέροντες υποψήφιοι για τη μελλοντική θεραπεία χονδροσαρκώματος [13], [14], [15]. Ωστόσο, όπως με άλλους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, η τάση των καρκινικών κυττάρων να αναπτύξουν αντίσταση σε ΕΤ-743 ή PM00104 αποτελεί σημαντική πρόκληση για τη χρήση αυτού του φαρμάκου για παρατεταμένη χρονική περίοδο. Ο στόχος της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση των μηχανισμών της ΕΤ-743 ή PM00104 αντίσταση σε χονδροσάρκωμα

Υλικό και Μέθοδοι

φάρμακα χημειοθεραπείας

ΕΤ-743 (Yondelis®.? τραβεκτεδίνη) και PM00104 (Zalypsis®) παρασχέθηκαν από PharmaMar (Ισπανία). Η πακλιταξέλη (Ταχοί ®), δοξορουβικίνη (Αδριαμυκίνη RDF®, ΕΚ No. 2,468,183), μεθοτρεξάτη (Trexall) και σισπλατίνη (σισπλατίνη? CDDP) ελήφθησαν μέσω αχρησιμοποίητα υπολειμματικά κλινικό υλικό που παρέχεται από το φαρμακείο στο Γενικό Νοσοκομείο της Μασαχουσέτης. Το διάλυμα στοκ των φαρμάκων παρασκευάσθηκαν σύμφωνα με τις προδιαγραφές του φαρμάκου και αποθηκεύεται στους -20 ° C.

κυτταρική γραμμή Chondrosarcoma CS-1

Ο chonodrosarcoma ανθρώπινη κυτταρική σειρά, που μεταδίδονται από το 1999 και έχει οριστεί CS -1, καθορίστηκαν από μια χειρουργικά ανθρώπινο υψηλής ποιότητας chonodrosarcoma που δεν είχε προηγουμένως εκτεθεί σε χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία, και αναπτύχθηκαν σε μονοστοιβάδα. Εν συντομία, ιστός ασηπτικά ελήφθη αμέσως μετά την εκτομή, τοποθετήθηκε σε RPMI-1640 μέσο καλλιέργειας ιστού συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, και ο ιστός καλλιεργήθηκε στους 37 ° C επωαστήρα που περιέχει 5% CO2 [13], [14]. Η λεπτομερής ανάλυση των CS-1 έχει αναφερθεί προηγουμένως [13], [14], [15], [16], [17]. Ολικό RNA εκχυλίστηκε μετά CS-1 ανακαλλιεργήθηκε τέσσερις φορές.

Καθιέρωση της ΕΤ-743 ή ανθεκτική PM00104 κυτταρική γραμμή

CS-1 /ER και CS-1 /PR κύτταρα ανθεκτικά σε ET -743 ή PM00104 καθιερώθηκαν από την κυτταρική γραμμή γονέα CS-1 από την έκθεση σε ΕΤ-743 ή PM00104 με βήμα-βήμα αύξησης συγκέντρωση της ΕΤ-743 ή PM00104 για ένα χρόνο χρησιμοποιώντας παρόμοια μέθοδο όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [18], [19 ], [20]. Εν συντομία, τα καλλιεργημένα κύτταρα CS-1 εκτέθηκαν σε 0,00001 μΜ είτε η ΕΤ-743 ή PM00104 για 7 ημέρες και στη συνέχεια πλένονται και καλλιεργούνται σε μέσο που περιέχει 0.00003 μΜ για 7 ημέρες. Εάν τα κύτταρα CS-1 απέδειξαν κυτταροτοξικότητες μετά την έκθεση σε μια δεδομένη συγκέντρωση της ΕΤ-743 ή PM00104, πλύθηκαν και καλλιεργήθηκαν σε μέσο ελεύθερο φαρμάκου για 7 ημέρες. Για παράδειγμα, έχουμε παρατηρήσει το 90% των CS-1 κύτταρα θανατώθηκαν όταν τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 0,001 μΜ ΕΤ-743 ή 0.003 μΜ PM00104 για 7 ημέρες. Όταν τα βιώσιμα κύτταρα είχαν ανακτηθεί, αυτά σπάρθηκαν σε μέσο που περιέχει το πιο πρόσφατα εκτεθειμένες συγκέντρωση του φαρμάκου και πάλι για 3 ημέρες. Μετά από επανειλημμένες αρκετούς κύκλους και όταν τα κύτταρα μεγάλωσαν σε 70% συρροή σε μέσο καλλιέργειας που περιέχουν φάρμακα, η συγκέντρωση των φαρμάκων θα αυξηθεί στο επόμενο επίπεδο. Μετά από ένα χρόνο, ο ΕΤ-743 ανθεκτική κυτταρική γραμμή CS-1 /ER και PM00104 ανθεκτική κυτταρική γραμμή CS-1 /PR καθορίστηκαν όπως προσδιορίζεται με δοκιμασία ΜΤΤ. Αυτά τα κύτταρα αντιπροσωπεύουν πληθυσμών ανθεκτικών στα φάρμακα κυττάρων αντί για ένα επιλεγμένο κλωνοποιημένο πληθυσμό. CS-1 /ER μπορεί να αναπτυχθεί σε συγκεντρώσεις 0.005 μΜ ΕΤ-743 και CS-1 /PR μπορούν να μεγαλώσουν σε συγκέντρωση 0,01 μΜ PM00104.

Άλλα φάρμακο ανθεκτική κυτταρική γραμμή που χρησιμοποιείται σε αυτή τη μελέτη

ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών SKOV-3 και Α2780 και ένα ανθρώπινο καρκίνο του μαστού κυτταρική γραμμή MCF-7 αγοράσθηκαν από τη Συλλογή ιστών Αμερικανικού τύπου (Rockville, MD). Η πακλιταξέλη ανθεκτική SKOV-3

TR, MCF-7

TR και σισπλατίνη ανθεκτικές A2780cp κυτταρικές γραμμές καθιερώθηκαν όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [19], [20]. Ο Δρ Κάτια. Scotlandi (Institute Ορθοπεδικά Rizzoli, Ιταλία) υπό την προϋπόθεση σάρκωμα Ewing ΕΤ-743 ανθεκτική κυτταρική γραμμή TC-ΕΤ [21].

καλλιέργειας ιστού

Όλες οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη (Invitrogen). Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C σε

2-95% ατμόσφαιρα αέρα 5% CO και περάστηκαν όταν κοντά συρρέουσες μονοστοιβάδες επετεύχθησαν χρησιμοποιώντας διάλυμα τρυψίνης-ΕϋΤΑ. Drug-ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές περιοδικώς καλλιεργήθηκαν στο αντίστοιχο φάρμακο για να επιβεβαιώσουν τα χαρακτηριστικά ανθεκτικότητας στα φάρμακα τους. Τα κύτταρα ήταν ελεύθερα σχετικά με τη μόλυνση μυκοπλάσματος όπως δοκιμάστηκε με MycoAlert (R) Mycoplasma Detection Kit από Cambrex (Rockland, ΜΕ).

Δοκιμασία κυτταροτοξικότητας

Drug κυτταροτοξικότητα αξιολογήθηκε in vitro χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ όπως προηγουμένως περιγράφεται [22]. Εν συντομία, 2 χ 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο απλώθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων σε μέσο καλλιέργειας (RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% βόειο εμβρυϊκό ορό και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη) που περιείχε αυξανόμενες συγκεντρώσεις του φαρμάκου. Μετά από 7 ημέρες καλλιέργειας, 10 μΐ ΜΤΤ (5 mg /ml σε PBS, που λαμβάνεται από την Sigma) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και οι πλάκες επωάστηκαν για 4 ώρες. Το προκύπτον προϊόντος φορμαζάνης διαλύθηκε με οξύ-ισοπροπανόλη και η απορρόφηση σε μήκος κύματος 490 nm (Α

490) διαβάστηκε σε ένα φασματοφωτόμετρο μικροπλάκας SPECTRAmax® (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Οι τιμές απορρόφησης κανονικοποιήθηκαν αποδίδοντας την τιμή της γραμμής ελέγχου στο μέσο χωρίς φάρμακο σε 1,0 και την τιμή του ελέγχου δεν κύτταρο στο 0. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

RNA εκχύλιση

Ολικό RNA συλλέχθηκε από CS-1 (γονική κυτταρική σειρά με διόδου 4 φορές), CS-1 /ER και CS-1 /PR (ανθεκτικό κόρη κυτταρικές σειρές με καλλιεργημένα για ένα έτος) χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο TRIzol® (GIBCO, Grand Island , ΝΥ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για να ληφθεί υπόψη και να εξαλειφθούν βιολογική θόρυβο, RNA απομονώθηκε από τρεις ξεχωριστές φιάλες από κάθε κυτταρική σειρά. Αυτές οι βιολογικές επαναλήψεις συνενώθηκαν. ποιότητα RNA καθορίστηκε

μέσω

αιθίδιο μετά από ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης /φορμαλδεΰδης βρωμιούχο χρώση.

Gene μεταγραφικό προφίλ

Το συνολικό RNA επεξεργασία και υβριδοποιήθηκε σε Affymetrix Gene Chip U133 Plus 2.0 συστοιχίες (Santa Clara, CA) από το γονίδιο Array Κέντρο Τεχνολογίας στην Ιατρική Σχολή του Χάρβαρντ (https://genome.med.harvard.edu). Affymetrix Gene Chip U133 Plus 2.0 στην πρώτη και πιο ολοκληρωμένη ολόκληρη σειρά έκφρασης του ανθρώπινου γονιδιώματος. Αυτή η σειρά ολοκληρώνεται η κάλυψη του συνόλου του ανθρώπινου γονιδιώματος με πάνω από 47.000 μεταγραφές. Κάθε ανιχνευτής αποτελείται από 20 ξεχωριστές 23-μερή ολιγονουκλεοτίδια. Το επίπεδο έκφρασης του mRNA κάθε ποσοτικοποιείται με μέτρηση υβριδισμού του σε αυτές τις 23-μερή σε σύγκριση με υβριδισμό του σε ένα ολιγονουκλεοτίδιο αναντιστοιχία ενός βάσης.

Δεδομένα ανάλυσης

GeneSifter χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των δεδομένων των μικροσυστοιχιών (https://www.genesifter.net/web/). GeneSifter παρέχει ισχυρές αναλυτικές αλγορίθμους (RMA, PAM, ANOVA, Κλάρα, Benjamini-Hochberg, κλπ) μέσα από μια διαισθητική web interface. GeneSifter μπορεί να προσδιορίσει διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων και ανάλυση διασποράς για την αναγνώριση προτύπων γονιδιακής έκφρασης και διαχωρισμό των γονιδίων με βάση αυτά τα σχέδια. Φορές αλλαγή στην έκφραση μεταξύ των ευαίσθητων και ανθεκτικών κυτταρικών σειρών αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το τεστ Mann-Whitney. Μία δεκαπλάσια ή μεγαλύτερη μεταβολή στην ένταση σε συνδυασμό με ένα Mann-Whitney σχετίζεται τιμή Ρ μικρότερη από 0,05 χρησιμοποιήθηκε ως κριτήριο για συμπερίληψη στο φιλτραρισμένα σύνολο δεδομένων μας. πληροφορίες Ένταση εξήχθη στο Microsoft Excel, όπως απαιτείται.

αντίστροφη TaqMan μεταγραφή-PCR για την ποσοτικοποίηση των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων

Σε πραγματικό χρόνο RT-PCR πραγματοποιήθηκαν για την επικύρωση διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων. Για την ανίχνευση έκφρασης γονιδίου, cDNA ανάστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε από ολικό RNA δείγματα χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές ολίγο dT από την Taq Man RNA Δοκιμασίες και αντιδραστήρια από το κιτ TaqMan του RNA Αντίστροφη Μεταγραφή (Applied Biosystems). Το προκύπτον cDNA ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας Taq Man δάκτυλο ψευδαργύρου πρωτεΐνη 93 (ZNF93), ZNF43 και Thada εκκινητές προσδιορισμό γονιδίου με την Taq Man καθολική PCR Master Mix και αναλύονται με ένα StepOnePlus πραγματικού χρόνου PCR System σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Applied Biosystems) . GAPDH και ακτίνη χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος. Τα σχετικά επίπεδα γονιδιακής έκφρασης υπολογίστηκαν από τα σχετικά σήματα από κανονικοποίηση με το σήμα για GAPDH ή ακτίνης έκφρασης. μίγματα αντίδρασης PCR περιείχε Taq Man ανθρώπινη ZNF93, ή ZNF43 και Thada και η Universal PCR Master Mix σε ένα συνολικό όγκο 20 AL. μεταβλητές ποδηλασία ήταν ως εξής: 95 ° C για 10 λεπτά που ακολουθείται από 40 κύκλους στους 95 ° C (15 δευτερόλεπτα) και ανασύνδεσης /επέκτασης στους 60 ° C (1 λεπτό). Όλες οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν

ZNF93 siRNA

δοκιμασία

Για ZNF93 (GenBank αριθμός πρόσβασης: NM_031218). Παρεμβολών, αίσθηση ZNF93 ολιγο (5′-CCUCUACCCUUAGUUCACAtt-3 ‘) και αντινόημα ZNF93 ολίγο ( 5’-UGUGAACUAAGGGUAGAGGag-3 ‘) αγοράστηκαν από την Applied Biosystems και χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για την επικύρωση της ειδικότητας ZNF93 RNAi, οι siGenome SMARTpool Ανθρώπινα ZNF93 siRNAs αγοράστηκαν από Dharmacon (Chicago, IL) με τις ακόλουθες τέσσερις αλληλουχίες στόχους του ZNF93 γονιδίου. Αλληλουχία στόχος 1: 5’-GGACUUAACCAGUGUAGUA-3 ‘? αλληλουχία στόχος 2: 5’-AACCAAUCCUCGACACUUA-3 ‘? αλληλουχίας στόχου 3: 5′-GCCCUACGUUUGUGAAGAA-3′ και αλληλουχίας στόχου 4: 5’-CCUUAUAGAUGUAGAGAAU-3 ‘. Για την επιμόλυνση, τα κύτταρα είτε τοποθετούνται σε πλάκες 96 φρεατίων για δοκιμασίες ΜΤΤ ή επιστρώνονται σε τρυβλία για εξαγωγή RNA. Οι επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν με siPORT ™

NeoFX

™ αντιδραστήρια siRNA επιμόλυνσης (Ambion. Inc, Austin, TX) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ο σιγαστήρας ™ EGFP siRNA (Ambion) και αντιδραστηρίου siRNA Control® (Dharmacon) χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί και αρνητικοί έλεγχοι σε όλα τα πειράματα. Για ZNF93 αναστολή, η τελική συγκέντρωση του siRNA ήταν είτε στους 25 ηΜ ή 100 ηΜ. Το μέσο αντικαταστάθηκε με RPMI1640 συμπληρωμένο με 10% FBS 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. Ολικό RNA απομονώθηκε μετά από 72 ώρες ZNF93 siRNA επιμόλυνσης για Real-time RT-PCR επιβεβαίωση.

ρΙΚΕδ

ZNF93 φορέα έκφρασης κατασκευή και επιμόλυνση

Ένα θραύσμα cDNA ζεύγους 1907 βάση που περιέχει τη πλήρους ORF του ανθρώπινου ZNF93 ενισχύθηκε με RT-PCR από το RNA του CS-1 /PR κυτταρική γραμμή η οποία υπερεκφράζει πολύ ZNF93. RT-PCR πραγματοποιήθηκε με χρήση των sense και antisense εκκινητές για την ανθρώπινη ZNF93: νόημα εναρκτήρας 5′-ATAAGAATGCGGCCCGGAAGCCTAGAAATGGGACCATTG-3 ‘για την εισαγωγή μίας θέσεως Not Ι όπως υπογραμμίζεται και αντιπληροφοριακό εκκινητή: 5′-GGTGGATCCTCACACTTCTAGGGTTTCT-3’ (GenBank # NM_031218) προς εισαγάγει μια θέση BamHI όπως υπογράμμισε. Οι εισαχθείσες θέσεις ενζύμου περιορισμού σχεδιάστηκαν για ακόλουθες μελέτες διαμόλυνση. Clonetech του (Palo Atlo, CA) φορέας έκφρασης θηλαστικών pIRESneo χρησιμοποιήθηκε για τη λειτουργική μελέτη έκφρασης. Το προκύπτον ZNF93 RT-PCR προϊόν κλωνοποιήθηκε εντός φορέα pCR®2.1 χρησιμοποιώντας Original ΤΑ Cloning Kit της Invitrogen. Μετά την επιβεβαίωση αλληλουχίας, ZNF93 αποκόπηκε από τον φορέα pCR®2.1, καθαρισμένο, υποκλωνοποιήθηκε στο MCS του φορέα έκφρασης pIRESneo, και στη συνέχεια αλληλουχήθηκε για να επιβεβαιωθεί η σωστή ORF. Η έκφραση του cDNA ZNF93 ήταν υπό τον έλεγχο του pCMV. Οι επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν με χρήση αντιδραστηρίων LipofectAmine Plus (Invitrogen) ως εξής: περίπου 5 × 10

5 κύτταρα CS-1 καλλιεργήθηκαν σε 90 χιλιοστόμετρο πιάτα καλλιέργειας ιστού και καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα. Πριν από την επιμόλυνση, το μέσο ανάπτυξης αντικαταστάθηκε με ελεύθερο ορού RPMI 1640 και καλλιεργήθηκαν για τρεις ώρες. αντιδραστήριο LipofectAmine που περιέχει 5 μg του pIRES

άδειο, pIRES

ZNF93 συνδυάστηκε με Plus αντιδραστήριο και εφαρμόζεται στα κύτταρα. Μετά από καλλιέργεια για τέσσερις ώρες, το μέσο αντικαταστάθηκε με RPMI 1640 που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου. θειικό G418 (Invitrogen) επιλογής (300 μg /ml) άρχισε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. Το μέσο επιλογής αλλαζόταν κάθε 2 ημέρες. Επιδράσεις της υπερέκφρασης ZNF93 επί ΕΤ-743 και PM00104 προσδιορίστηκαν με δοκιμασία κυτταροτοξικότητας ΜΤΤ.

Αποτελέσματα

CS-1 /ER, CS-1 /PR κυτταρικές σειρές είναι ανθεκτικές σε διάφορα χημειοθεραπευτικούς παράγοντες

CS-1 /ER και CS-1 /PR επελέγησαν από την γονική κυτταρική γραμμή, CS-1, με έκθεση σε σταδιακή αύξηση των συγκεντρώσεων PM00104 ΕΤ-743 ή για χρονικό διάστημα ενός έτους. Ο φαινότυπος αντοχής φαρμάκου βρέθηκε να είναι σταθερό μετά από 14 μήνες συνεχούς καλλιέργειας σε ναρκωτικά ή τουλάχιστον 6 μηνών υπό συνθήκες χωρίς φάρμακο. Δεν παρατηρήθηκε καμία σημαντική διαφορά μεταξύ κυττάρων CS-1 /PR CS-1 και CS-1 /ER ή

in vitro

ανάπτυξης κυττάρου (παρόμοιο χρόνο διπλασιασμού) και μικροσκοπική μορφολογία. ανάλυση κυτταροτοξικότητας ΜΤΤ δείχνει ότι CS-1 /ER, CS-1 /PR είναι 10- 20 φορές πιο ανθεκτικό σε ΕΤ-743 και PM00104 σε σύγκριση με την ευαίσθητη γονική κυτταρική σειρά. Το IC

50-αξία της ΕΤ-743 σε κύτταρα CS-1 ήταν 0. 0008 μΜ σε σύγκριση με 0. 01 μΜ σε CS-1 κύτταρα /ER (αντίσταση 12,5 φορές). Το

50-αξίας IC των PM00104 στα κύτταρα CS-1 ήταν 0. 002 μΜ σε σύγκριση με 0. 04 μΜ σε CS-1 κύτταρα /PR (αντίσταση 20 φορές). Επιπλέον, CS-1 /ER και CS-1 /PR παρουσιάζει αντοχή στη σισπλατίνη και μεθοτρεξάτη αλλά όχι στη δοξορουβικίνη (Εικ. 1).

CS-1 /ER, CS-1 /PR και CS- 1 κύτταρα εκτέθηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις των φαρμάκων για 6 ημέρες. Η αναστολή της ανάπτυξης προσδιορίστηκε με επώαση με ΜΤΤ χρωστικής τετραζολίου και με απορρόφηση μέτρηση στα 490 nm. Δεδομένα απεικονίζουν τρεις επαναλήψεις σε κάθε συγκέντρωση.

Η

Ένας μεγάλος αριθμός γονιδίων συνδέονται με ΕΤ-743 και PM00104 αντίσταση

Ανθρώπινο Affymetrix Gene Chip U133 Plus 2.0 συστοιχίες χρησιμοποιούνται για την εξέταση σχετικής επίπεδα έκφρασης του RNA μεταξύ του CS-1, CS-1 /ER, και CS-1 /PR. Τα προφίλ έκφρασης αυτών των κυτταρικών σειρών τρία χονδροσαρκώματος εκτιμήθηκαν με Genesifter. Επιπλέον, έχουμε υποβάλει δεδομένα μικροσυστοιχιών μας στο Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) και έχουν αυτά τα δεδομένα πίνακα έχουν εκχωρηθεί ένας αριθμός πρόσβασης GEO ως GSE16748. Βρήκαμε ένα μεγάλο αριθμό γονιδίων είχαν σημαντικά διαφορετικά επίπεδα έκφρασης σε CS-1 /ER και CS-1 /PR σε σύγκριση με CS-1. Για να επικεντρωθεί σε γονίδια με μόνο σημαντικές αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης, προσδιορίσαμε γονίδια με δέκα φορές ή μεγαλύτερη αλλαγή στα επίπεδα έκφρασης. Χρησιμοποιώντας αυτά τα κριτήρια, 595 (CS-1 /ER), 498 γονίδια (CS-1 /PR) παρουσίασαν περισσότερο από δέκα φορές υπερέκφραση στις ανθεκτικές γραμμές ΕΤ-743 και PM00104 σε σχέση με την έκφρασή τους σε ευαίσθητες γονικών γραμμών (σχ. 2Α). Επιπλέον, 856 (CS-1 /ER), 874 (CS-1 /PR) μεταγραφές ήταν περισσότερο από δέκα φορές μειώθηκε στις ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές σε σύγκριση με τους ελέγχους (Σχ. 2Β). Οι μεταβολές στα επίπεδα έκφρασης κυμαίνονταν από 10- έως 536- φορές. Τα γονίδια εντοπίστηκαν ήταν σε μεγάλο βαθμό μη-επικαλυπτόμενα μεταξύ των κυτταρικών γραμμών και κωδικοποιούνται για τις πρωτεΐνες με μια ευρεία ποικιλία από βιοχημικές λειτουργίες. Τα γονίδια που ταυτοποιούνται κωδικοποιούν για πρωτεΐνες που δεσμεύονται DNA έχουν καταλυτικές δραστηριότητες, δραστηριότητες μοριακό αισθητήριο, ρυθμίζουν μεταγραφή, πρωτεΐνες και τα μόρια των μεταφορών, ρυθμίζουν τα ένζυμα και υπάρχουν πολλά άλλα γονίδια που έχουν περιορισμένη χαρακτηρισμό. Οι top 20 πιο ιδιαίτερα υπερεκφράζεται και υποεκφράζεται γονίδια σε κάθε μία από τις ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Υπήρχαν επτά γονίδια υπερεκφράζονται τόσο CS-1 /ER και CS-1 /PR και ένα γονίδιο που υποεκφράζεται στις δύο κυτταρικές σειρές. Σε αυτές τις δύο ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές, υπάρχουν περισσότερες υπερβολική λείανση γονιδίου στο top 20 πάνω λίστα εκφρασμένα γονίδια σε σύγκριση με το υπό εκφράζεται λίστα γονιδίων. Παρατηρήσαμε επίσης το βαθμό της αλλαγής στην έκφραση γονιδίου ήταν πιο δραματική στο σύνολο των υπό εκφρασμένων γονιδίων (Πίνακας 1).

Genes υπερεκφράζεται /υπό εκφράζεται σε περισσότερες από μία κυτταρική γραμμή υποδεικνύονται στις επικαλυπτόμενες περιοχές οι κύκλοι.

η

τα γονίδια που εκφράζονται διαφορικά σε αμφότερες τις ανθεκτικές κυτταρικές σειρές

Εικ. 2 διάγραμμα Venn δείχνει ότι 185 γονίδια υπερεκφράζονται, 174 γονίδια υποεκφράζεται στις δύο CS-1 /ER, και CS-1 /PR ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές σε σύγκριση με CS-1 (Σχ. 2Α και σχ. 2Β). Οι top 20 πιο ιδιαίτερα overexpresssed γονίδια σε αμφότερες τις ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές συνοψίζονται στον Πίνακα 2. Οπως 3 στα κορυφαία 20 γονίδια overecpressing τόσο CS-1 /ER, και CS-1 /PR ανθεκτικές κυτταρικές σειρές είναι ψευδάργυρος γονίδια πρωτεϊνών δακτύλου (ZNF93, ZNF43 και ZNF568), αποφασίσαμε να επικυρώσει περαιτέρω αυτά τα γονίδια με πραγματικού χρόνου RT-PCR.

η

TaqMan πραγματικού χρόνου RT-PCR ανάλυση των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων

για να επικυρώσετε το δεδομένα συστοιχία, εκτελέσαμε Real-Time RT-PCR τρία γονίδια που εκφράζονται διαφορικά σε δύο ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές. ZNF93, ZNF43, και η έκφραση RNA Thada μετρήθηκαν με κιτ δοκιμασίας TaqMan του RNA. Διαφορική έκφραση του ZNF93 και ZNF43 επιβεβαιώθηκαν σε αμφότερες /ER και CS-1 /PR ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές CS-1 (Σχ. 3Α, Σχ. 3Β και Σχ. 3C). Thada υπερέκφραση δεν επιβεβαιώθηκε στην ανθεκτική κυτταρική σειρά CS-1 /ER

Μια

(Σχήμα 3D.):. Οικόπεδο Ενίσχυση για το γονίδιο της β-ακτίνης.

Β

: οικόπεδο Ενίσχυση για ZNF93 γονίδιο.

C

: Σχετικά επίπεδα έκφρασης του mRNA ZNF93.

D

: Περίληψη των σχετικών επιπέδων έκφρασης των ZNF93, ZNF43 και Thada mRNA

Η

Η έκφραση της ZNF93 σε άλλα ανθεκτικά σε πολλαπλά φάρμακα κυτταρικές σειρές

γονίδιο ZNF93 υπερεκφράζεται σε δύο. CS-1 /ER και κυτταρικές σειρές /PR CS-1 και η λειτουργία του ZNF93 είναι ασαφές αν η πρωτεΐνη έχει εμπλακεί στη ρύθμιση κυτταρικών μεταγραφικής. Όπως γονίδιο ZNF93 δεν έχει προηγουμένως συνδεθεί με αντοχή φαρμάκου και επελέγη για περαιτέρω μελέτη. Αξιολογήσαμε περαιτέρω την έκφραση του ZNF93 σε άλλα πολλαπλά φάρμακα ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές με πραγματικού χρόνου RT-PCR. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ZNF93 υπερεκφράζεται σε δύο ΕΤ-743 ανθεκτική κυτταρική γραμμή σαρκώματος Ewing, TC-ΕΤ, καθώς και σε ένα σισπλατίνη ανθεκτική κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών, A2780cp, σε σύγκριση με σισπλατίνη ευαίσθητο γονικές κυτταρικές σειρές τους ΕΤ-743, ή, αλλά ZNF93 δεν υπερεκφράζεται σε ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές πακλιταξέλη SKOV-3

TR και MCF-7

TR (Εικ. 4).

Όλα πραγματικού χρόνου έχουν δεδομένα RT-PCR έχουν κανονικοποιηθεί σε β ακτίνης.

η

Συνέπειες της αναστολής της έκφρασης ZNF93 με siRNA στις ευαισθησίες των ναρκωτικών

για να προσδιορίσετε αν ZNF93 παίζει ρόλο στην ΕΤ-743 και η ευαισθησία PM00104, θα αναστέλλεται η έκφραση της στο CS κύτταρα -1 /PR χρησιμοποιώντας siRNA νοκ ντάουν. Οι σχετικές ευαισθησίες φάρμακο εκτιμήθηκαν με σύγκριση των IC

50 τιμές προσδιορίζονται με ΜΤΤ σε siRNA επεξεργασμένο, μη-ειδική siRNA επεξεργασμένα και μη επεξεργασμένα πολλαπλά φάρμακα ελέγχου ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές. Πρώτον, η κυτταροτοξικότητα σε ΕΤ-743 και PM00104 μετρήθηκε 4 ημέρες μετά την επιμόλυνση των κυττάρων ανθεκτικών με ZNF93 siRNA ολιγονουκλεοτίδια από την Applied Biosystems. Παρατηρήσαμε ότι ZNF93 κάτω ρύθμιση έκανε μερικώς ανακτήσει την ευαισθησία να PM00104 (Εικ. 5Α) στο CS-1 κυτταρική γραμμή /PR. Πραγματικού χρόνου RT-PCR αποκάλυψε ZNF93 έκφραση ήταν σημαντικά μειωμένη μετά τα κύτταρα σε επεξεργασία με siRNA (Σχ. 5Β). Παρόμοια αποτελέσματα βρέθηκαν σε φάρμακο ανθεκτική κυτταρική γραμμή CS-1 /ER (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, για την επικύρωση της ειδικότητας ZNF93 RNAi, οι siGenome SMARTpool Ανθρώπινα ZNF93 siRNAs αγοράστηκαν από Dharmacon με τις τέσσερις αλληλουχίες στόχους του ZNF93 γονιδίου και εξετάστηκαν σε ανθεκτική cisplantin κυτταρική γραμμή A2780cp. Η ZNF93 έκφραση σε siRNA επιμολυσμένα A2780cp κυττάρων μειώθηκε σημαντικά, όπως αξιολογήθηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR (Σχ. 5D). ΜΤΤ δοκιμασία έδειξε την IC

50 τιμές του siRNA αγωγή A2780cp κύτταρα ήταν χαμηλότερες σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα ανθεκτικές γραμμές (Εικ. 5C), υποδεικνύοντας ότι ZNF93 siRNA αναστέλλει την έκφραση ZNF93 και μερικώς αποκαθιστά την ευαισθησία του ανθεκτική κυτταρική γραμμή προς σισπλατίνη .

A

: CS-1 /PR επιμολύνθηκε με ZNF93 siRNA * (Applied Biosystems), καθώς και μη-ειδικά siRNA.

C

: A2780cp επιμολύνθηκε με ZNF93 siRNA

† (Dharmacon), καθώς και μη-ειδικά siRNA. Η σχετική ευαισθησία του κάθε θεραπεία να PM00104 ή σισπλατίνη προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ 72 ώρες μετά την επιμόλυνση.

Β και D

: Επιβεβαίωση της ZNF93 νοκ ντάουν με πραγματικού χρόνου RT-PCR. Ολικό RNA απομονώθηκε 72 ώρες μετά την επιμόλυνση και έκφραση ZNF93 αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR.

Η

Επιδράσεις της υπερέκφρασης ZNF93 επί ΕΤ-743, PM00104 και σισπλατίνη ευαισθησίες

Οι αναλύσεις μας ενδογενούς έκφρασης ZNF93 έδειξαν ότι ZNF93 συχνά ρυθμίζεται αυξητικά στην σισπλατίνη πολλαπλές ανθεκτικές καρκινικές κυτταρικές σειρές ναρκωτικών ΕΤ-743, PM00104 και, ZNF93 ρύθμιση προς τα κάτω από siRNA θα μπορούσε εν μέρει να ανακτήσει την ευαισθησία στην ΕΤ-743, PM00104 και κισπλατίνης. Αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι η πρωτεΐνη μπορεί να είναι ZNF93 κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη της αντοχής σε αυτά τα φάρμακα. Να καθορίσει περαιτέρω εάν ZNF93 συμμετέχει άμεσα στην ίδρυση του ανθεκτικού φαινοτύπου, επιμολύναμε την ευαίσθητη κυτταρική σειρά ΕΤ-743 και PM00104 CS-1 με ένα φορέα έκφρασης ZNF93 και δημιουργείται σταθερή γραμμή κυττάρων που υπερεκφράζουν ZNF93 (Σχήμα 6D). Στη συνέχεια ρώτησε αν εξωγενείς υπερέκφραση της ZNF93 ήταν αρκετή για να προσδώσει αυξημένη αντίσταση ΕΤ-743 και PM00104. Τα αποτελέσματα από την δοκιμασία ΜΤΤ στα διαμολυσμένους κυτταρικές γραμμές φαίνεται στο Σχ. 6. ZNF93 επιμολυσμένα κύτταρα CS-1 είναι σχετικά ανθεκτικά στην ΕΤ-743, PM00104 και σισπλατίνη, ενώ καμία σημαντική αλλαγή στην αντίσταση παρατηρήθηκε στα CS-1 κύτταρα επιμολυσμένα με τον κενό φορέα (Σχήμα 6Α έως C). Αυξημένα έκφραση ZNF93 στα επιμολυσμένα κύτταρα επιβεβαιώθηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR (Εικ. 6D).

Μια

,

Β

και

C

: Σχετική κυτταροτοξικότητα της ΕΤ-743, PM00104 και σισπλατίνη σε CS-1 που προέρχεται κυτταρικές γραμμές (CS-1 /pIRES

ZNF93) σταθερά επιμολυσμένα με ένα

φορέα έκφρασης ZNF93 pIRES και στο γονικό (CS-1) και κενό φορέα (CS-1 /pIRES) μάρτυρες αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ. Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν εις τριπλούν.

D

:. Επιβεβαίωση της ZNF93 υπερέκφραση σε ρΙΚΕδ

ZNF93 επιμολυσμένα CS-1 κύτταρα με πραγματικού χρόνου RT-PCR, όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι

Η

Συζήτηση

Τα αποτελέσματα από αρκετές κλινικές μελέτες προτείνουν ότι η ΕΤ-743 έχει αντικαρκινική δράση έναντι διαφόρων τύπων καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου σαρκώματα μαλακών ιστών, καρκίνο του μαστού, και των ωοθηκών [2], [3]. Οι ασθενείς με προχωρημένο των ωοθηκών και του καρκίνου του μαστού, καθώς και των οστών ή σαρκώματα μαλακών ιστών συνήθως υποβάλλονται σε αρκετές γραμμές αγωγές κατά του καρκίνου πριν τελικά υποκύψει στην ασθένεια τους. Η πολυφαρμακευτική αντίσταση πιστεύεται ότι παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην αναπόφευκτη αποτυχία των όγκων να ανταποκρίνεται σε κάθε διαδοχική γραμμή της χημειοθεραπείας. Ως εκ τούτου, η κατανόηση των προτύπων και των μηχανισμών της διασταυρούμενης αντοχής και να βρουν τρόπους για να ξεπεραστεί είναι ένας σημαντικός στόχος. Αρκετές μελέτες έχουν μελετήσει τους μηχανισμούς ανθεκτικότητας ΕΤ-743 φαρμάκου με διαφορετικές προσεγγίσεις. Ωστόσο, έχουν αντιφατικά αποτελέσματα έχουν δημοσιευθεί από διάφορες ομάδες που προσπαθούν να συσχετίζονται αντίσταση σε διαφορετικά επίπεδα έκφρασης του RNA και πρωτεϊνών σε ανθεκτικά κύτταρα [9], [10], [13], [14], [21]. Περαιτέρω ανάλυση των διαφορών μεταξύ αυτών των αποτελεσμάτων θα μπορούσε να διευκολυνθεί καλύτερα από την ανάλυση της σειράς γονιδιώματος σε επίπεδο μεταγραφικής.

Στην παρούσα μελέτη, αναφέρουμε την επιτυχή δημιουργία δύο χονδροσαρκώματος κυτταρικές σειρές ανθεκτικές στην ΕΤ-743 ή PM00104. Στη συνέχεια ρωτήθηκε πώς τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης που συνδέονται με διαφορές στην αντίσταση στο φάρμακο σε αυτές τις δύο κυτταρικές σειρές. Χρησιμοποιήσαμε Affymetrix Gene Chip U133 Plus 2 για να εξετάσει το γονιδίωμα-ευρεία έκφραση του RNA μεταγραφές. Σε σύγκριση με αρκετές μελέτες που χρησιμοποιούν μικρότερα σειρά γονιδίων κλίμακα, αυτή η σειρά καλύπτει πλήρως το σύνολο του ανθρώπινου γονιδιώματος με πάνω από 47.000 μεταγραφές. Εμείς επικύρωσε τα αποτελέσματα συστοιχίας γονιδίων για τα γονίδια με τις πιο σημαντικές αλλαγές σε πραγματικό χρόνο RT-PCR. Όπως ήταν αναμενόμενο, υπάρχει ένας μεγάλος αριθμός μεταγραφικών αλλαγές που συνδέονται με

in vitro

επίκτητη αντοχή στην ΕΤ-743 και PM00104. Πράγματι, περίπου το 5% έως 10% (με αποκοπή τιμή 2 φορές) των μεταγραφών είναι υπερεκφράζεται ή υπο-εκφράζεται στις ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές CS-1 /ER και CS-1 /PR σε σύγκριση με την ευαίσθητη γονικό κύτταρο γραμμή.

Στη λίστα των top 20 πάνω από την έκφραση των γονιδίων τόσο για CS-1 /ER και CS-1 /PR, οι ίδιες τρεις ψευδαργύρου γονίδια πρωτεΐνης δακτύλου, ZNF93, ZNF43 και ZNF568 (Πίνακας 2) ήταν όλα αναγνωρισθείς. Αυτά τα γονίδια δεν έχουν προηγουμένως συνδέονται με αντοχή φαρμάκου. Real-time PCR επιβεβαίωσε ZNF93 και ZNF43 είναι σταθερά πάνω από εκφράζονται σε αυτές τις ανθεκτικές κυτταρικές σειρές (Εικ. 3). Προκαταρκτική αξιολόγηση του ZNF93 επιβεβαιώνει ότι η έκφρασή του σχετίζεται με την πολυανθεκτικά φαινοτύπου σε πρόσθετες κυτταρικές σειρές.