Αφηρημένο

Ιστορικό

ευνουχισμού ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη (CRPC) είναι μια θανατηφόρος κατάσταση σε ασθενείς που λαμβάνουν θεραπεία στέρησης ανδρογόνων για τον καρκίνο του προστάτη (PC). Παρά τις πολυάριθμες μελέτες που δείχνουν την έκφραση της πρωτεΐνης HIF1α υπό φυσιολογική οξυγόνωση σε κυτταρικές σειρές PC, ο ρόλος αυτής της ορθοξικές έκφρασης HIF1α σε χημειο-αντίσταση και η μετανάστευση δεν έχει διερευνηθεί στο παρελθόν. Καθώς καμία μέθοδος δεν είναι προς το παρόν διαθέσιμη για να καθορίσει ποια όγκους θα προχωρήσει σε CRPC, ο ρόλος των HIF1α στο PC και τις δυνατότητές της για την πρόβλεψη της ανάπτυξης της CRPC διερευνήθηκε επίσης.

Μέθοδοι

Η επίδραση της HIF1α πρωτεΐνη knockdown επί χημειο-αντίσταση και τη μετανάστευση των κυττάρων PC3 αξιολογήθηκε με μέτρηση των κυττάρων και δοκιμασίες Transwell, αντίστοιχα. Μετάφραση απόδοση της HIF1α mRNA προσδιορίστηκε σε κύτταρα PC χρησιμοποιώντας ένα κατασκεύασμα HIF1α 5’ΙΙΤΚ-λουσιφεράσης. Κλινικά αποτελέσματα συσχετίστηκαν μετά τη χρώση των 100 όγκους του προστάτη για την έκφραση HIF1α.

Αποτελέσματα

Οι CRPC-όπως γραμμές κυττάρων (PC3 και DU145) εκφράζονται περισσότερο HIF1α πρωτεΐνη από ένα ευαίσθητο ανδρογόνο κυτταρική γραμμή ( LNCaP). ποσοστό Μετανάστευση και χημειο-αντίσταση ήταν υψηλότερα στα κύτταρα PC3 και οι δύο μειώθηκαν όταν η έκφραση HIF1α ήταν μειωμένη. Αυξημένη μετάφραση HIF1α mRNA μπορεί να είναι υπεύθυνη για HIF1α υπερέκφραση σε κύτταρα PC3. Οι ασθενείς των οποίων οι όγκοι εκφράζονται HIF1α είχε μειωθεί σημαντικά μετάσταση επιβίωση χωρίς και οι ασθενείς που ήταν σε θεραπεία αποστέρησης ανδρογόνων είχαν μειωθεί CRPC επιβίωση χωρίς την ανάλυση Kaplan-Meier. Στην πολυπαραγοντική ανάλυση HIF1α ήταν ένας ανεξάρτητος παράγοντας κινδύνου για την εξέλιξη της μεταστατικής PC (αναλογία κινδύνου (HR) 9,8, p = 0,017) και την ανάπτυξη της CRPC (HR 10.0, p = 0,021) σε ασθενείς σε θεραπεία αποστέρησης ανδρογόνων. Αξίζει να σημειωθεί ότι οι όγκοι που δεν εκφράζουν HIF1α δεν μεταστάσεις ή να αναπτύξουν CRPC.

Συμπεράσματα

HIF1α είναι πιθανό να συμβάλει στην μετάσταση και χημειο-αντίσταση CRPC και στοχευμένη μείωση των HIF1α μπορεί να αυξήσει την ανταπόκριση του CRPCs στη χημειοθεραπεία. Έκφραση των HIF1α μπορεί να είναι ένα χρήσιμο εργαλείο ελέγχου για την ανάπτυξη της CRPC

Παράθεση:. Ranasinghe WKB, Xiao L, Κόβατς S, M Chang, Michiels C, Bolton D, et al. (2013) Ο ρόλος της υποξία Factor 1α Κατά τον προσδιορισμό των ιδιοτήτων του ευνουχισμού-Resistant καρκίνοι του προστάτη. PLoS ONE 8 (1): e54251. doi: 10.1371 /journal.pone.0054251

Επιμέλεια: Irina U. Agoulnik, Διεθνές Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 22 Αυγούστου του 2012? Αποδεκτές: 10, Δεκεμβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 16 Γενάρη του 2013

Copyright: © 2013 Ranasinghe et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις 454322 (GSB), 566.555 (GSB, AS) και 628390 (AS, ΕΠ, GSB) από το Εθνικό Σύστημα Υγείας και Ιατρικής Έρευνας του Συμβουλίου της Αυστραλίας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη (PC) είναι η δεύτερη πιο κοινή μορφή καρκίνου στους άνδρες σε όλο τον κόσμο και συνεχίζει να επιβάλλει μια σημαντική επιβάρυνση της νόσου και ένα αυξανόμενο παγκόσμιο πρόβλημα υγείας. Όμως, η κατανόηση των μηχανισμών που συμβάλλουν στην ανάπτυξη της PC εξακολουθεί να είναι περιορισμένη. [1] Τα ανδρογόνα και τον υποδοχέα ανδρογόνων (AR) είναι σημαντικοί ρυθμιστές της διέγερσης και την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. θεραπεία στέρησης ανδρογόνων (ADT) είναι ο στυλοβάτης της θεραπείας για μεταστατική και τοπικά προχωρημένο καρκίνο του προστάτη. Ωστόσο, ADT αποτυγχάνει τελικά να διατηρήσει την καταστολή του καρκίνου του προστάτη στην πλειονότητα των ανδρών με αυτόν τον όρο.

ευνουχισμού ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη (CRPC) είναι μια θανατηφόρα μορφή του PC που μπορεί να εξελιχθεί και μεταστάσεις γρήγορα. Για την ανάπτυξη της CRPC, περισσότερο από το 84% των ασθενών θα έχουν μεταστάσεις [2]. Λίγες βιοδείκτες για την πρόβλεψη των CRPC έχουν περιγραφεί [3], [4], και επί του παρόντος δεν υπάρχει καθολική συναίνεση σχετικά με τον προσδιορισμό ποιοι ασθενείς με PC θα προχωρήσει σε CRPC. Επιπλέον, οι μηχανισμοί με αποτέλεσμα την ανάπτυξη και την εξέλιξη του CRPC παραμένουν ελάχιστα κατανοητή εν μέρει λόγω της περιορισμένης διαθεσιμότητας των κυτταρικών σειρών που υπόδειγμα στενά CRPC. Οι δύο ευρέως χρησιμοποιούμενα κυττάρων PC γραμμές PC3 και DU145 δεν θεωρούνται πλήρως αντιπροσωπευτική της CRPC κυττάρων, δεδομένου ότι δεν είχαν απομονωθεί από τους καρκίνους του προστάτη που είχαν υποτροπιάσει μετά από θεραπεία στέρησης ανδρογόνων, και δεδομένου ότι εκφράζουν λίγο [5] αν υπάρχει AR [6], ενώ AR συχνά υπερεκφράζεται σε CRPC όγκους. Ωστόσο, δεδομένου ότι PC3 και DU145 κύτταρα εμφανίζουν ορισμένες από τις θεμελιώδεις ιδιότητες ενός CRPC όγκου συμπεριλαμβανομένων των υψηλών μετανάστευση (μετάσταση), ανδρογόνο ανεξαρτησία και χημειο-αντίσταση παρόμοια με την CRPC κυτταρική σειρά LNCaP C4-2 [7], καθώς επίσης και μοιράζονται παρόμοιες μοριακές ιδιότητες , συμπεριλαμβανομένων εξάντληση /μετάλλαξη του μιτοχονδριακού DNA, τα οποία έχουν συσχετιστεί με διεισδυτικότητα και αντοχή φαρμάκου [8], αυτές οι δύο κυτταρικές γραμμές αναφέρονται συχνά ως CRPC κυττάρων [9], [10], [11].

η υποξία είναι μείωση στην κανονική συγκέντρωση του οξυγόνου ιστού η οποία συμβαίνει σε πολλές ασθένειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου. Μία υποξική μικροπεριβάλλον εντός του προστάτη έχει υποτεθεί ότι είναι υπεύθυνη για την προώθηση της δευτερογενούς γενετικές μεταβολές και αγγειογόνων διέγερση, οδηγώντας σε μια πιο επιθετική φαινότυπο κυττάρου και κακοήθη εξέλιξη [12]. Η ικανότητα των κυττάρων να προσαρμόζονται σε υποξία εξαρτάται από ένα σύνολο παραγόντων μεταγραφής υποξία (HIFs) τα οποία αποτελούνται από ένα κανονιστικό άλφα (HIF1α) και ένα ιδιοσυστατικό βήτα υπομονάδα (HIF1β). HIFs συνδέονται προς την αλληλουχία πυρήνα 5′-RCGTG-3 ‘σε υποκινητές στόχου και επάγουν περισσότερες από 200 διαφορετικές λειτουργικά γονίδια που εμπλέκονται στην κυτταρική επιβίωση [13]. Η σύνθεση του HIF1α συμβαίνει μέσω μηχανισμών οξυγόνο ανεξάρτητες, αλλά αποικοδόμηση του εξαρτάται από το οξυγόνο και περιλαμβάνει προλυλ υδροξυλάσης, ασπαραγινυλίου υδροξυλάση, την πρωτεΐνη Von Hippel-Lindau και το σύστημα του πρωτεασώματος [13].

Αν και HIF1α υπερεκφράζεται σε έναν αριθμό ανθρώπινων καρκίνων [14], [15], ο ρόλος των HIF1α σε εξέλιξης του καρκίνου είναι ασαφής. Υψηλές συγκεντρώσεις HIF1α στη νεφρική και του καρκίνου του μαστού κυτταρικές γραμμές φαίνεται να αυξάνει την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων, ενώ σε συγκεντρώσεις καρκίνο υψηλού HIF ωοθηκών συνέβαλαν στην αυξημένη απόπτωση [13]. Dai και συνεργάτες ανέφεραν ότι η οξεία υποξία αυξημένη έκφραση HIF1α και την κινητικότητα και επεμβατική ικανότητα των τριών κυτταρικών γραμμών PC [16]. Ωστόσο, παρά τις πολυάριθμες μελέτες που δείχνουν την παρουσία της έκφρασης HIF1α σε νορμοξία, και μια αναφορά ότι HIF1α σηματοδότηση ρυθμίζεται αυξητικά σε νορμοξικά ευνουχισμός-ανθεκτικά κύτταρα LNCaP C4-2 συγκριτικά με τα γονικά κύτταρα LNCaP [17], ο ρόλος του ορθοξικές έκφρασης HIF1α είναι δεν είναι καλά τεκμηριωμένη, και ως εκ τούτου, αποτέλεσε τη βάση της τρέχουσας μελέτης μας.

Ομοίως, παρά την υψηλή έκφραση HIF1α στους ιστούς PC [14], [18], [19], [20], [21], [ ,,,0],22], [23], [24], τη σύνδεσή της με την πρόγνωση είναι ασαφή [25], [24], [26], [27]. Ωστόσο, η συναίνεση είναι ότι HIF1α υπερεκφράζεται σε όγκους του προστάτη [28], [24] και είναι ένας ισχυρός προκαλούμενη από όγκο ασπίδα κατά του οξειδωτικού στρες ή καταστροφή από ανδρογόνα στέρηση, χημειοθεραπεία ή ακτινοβολία κυτταροτοξικότητα [29]. Αυτή τη στιγμή δε μελέτες έχουν αναφέρει τις σχέσεις μεταξύ έκφρασης HIF1α και την ανάπτυξη του CRPC. Ως εκ τούτου, έχουμε ως στόχο να διερευνήσει το ρόλο της HIF1α στη ρύθμιση της CRPC και να αναλύσει το δυναμικό του ως βιοδείκτη για την πρόβλεψη της εξέλιξης της CRPC.

Υλικά και Μέθοδοι

In Vitro μελέτες

καλλιέργειας κυττάρων.

Οι τρεις γραμμές ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του προστάτη (PC3, DU145 και LNCaP) που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη ήταν γενναιόδωρα δώρισε από Α /Prof. Ian Davis, Ludwig Institute for Cancer Research, Melbourne, και είχε αγοραστεί από την ATCC το 2009. Οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 (Invitrogen, Mulgrave, Αυστραλία) συμπληρωμένο με 8% FBS και 100 U /mL πενικιλλίνη. Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή με 95% αέρα και

2 5% CO. Τα κύτταρα υποξία-αγωγή καλλιεργήθηκαν με τον ίδιο τρόπο όπως και οι έλεγχοι εκτός από το ότι η αέρια φάση περιείχε 94% άζωτο (Ν

2), 5% CO

2 και 1% O

2, με συγκεντρώσεις οξυγόνου παρακολουθείται και ρυθμίζεται αυτόματα από τον ηλεκτρονικό ελεγκτή οξυγόνου (ProOx Model 110, Biospherix, Redfield, ΝΥ).

ανάλυση κηλίδος Western.

τα κύτταρα πλύθηκαν άπαξ με παγωμένο αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό ( PBS) και λύθηκαν με 0,1-0,2 ml προ-βρασμένο δωδεκυλθειικό νάτριο (SDS) ρυθμιστικού διαλύματος λύσης. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση πηκτής SDS-πολυακρυλαμιδίου, και μεταφέρθηκε σε ένα Hybond-C έξτρα μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (GE Healthcare, Rydalmere, Αυστραλία). HIF1α πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε με ένα αντι-ανθρώπινο αντίσωμα HIF1α μονοκλωνικό ποντικού (1:1000, BD Biosciences, North Ryde, Australia) που ακολουθείται από ένα χράνου αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση αντι-ποντικού δευτερογενούς κατσίκα (1:5000, Bio-Rad). Ως μάρτυρας φόρτωσης, τα στυπώματα επωάστηκαν με υπεροξειδάση (HRP), συζευγμένης κουνελιού αντι-GAPDH αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Συγκροτήματα απεικονίστηκαν σε ένα LAS 3000 Image Reader (Fujifilm, Brookvale, Αυστραλία), με ECL Advance Western Blotting Detection Kit (GE Healthcare). Η πυκνομετρική ανάλυση των ζωνών πρωτεΐνης πραγματοποιήθηκε με λογισμικό MultiGauge (Fujifilm).

Δοκιμασία πολλαπλασιασμού.

Για τη μέτρηση της βασικής επίπεδα πολλαπλασιασμού, 2 × 10

5 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ένα 6 καλά τρυβλίο Petri σε μέσο καλλιέργειας συμπληρωμένο με FBS. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS σε 24 ώρες και καλλιεργήθηκαν για περαιτέρω 48 ώρες σε μέσο χωρίς ορό. Τα κύτταρα που επρόκειτο να λάβουν θεραπεία καλλιεργήθηκαν όπως παραπάνω, και το μέσο απομακρύνθηκε στις 24 ώρες και συμπληρωμένο με FBS-ελεύθερα μέσα ενημέρωσης πριν από την επεξεργασία με υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η

2O

2), χλωριούχο κοβάλτιο, 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) ή υποξία (1% O

2) για 48 ώρες. Τα κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα αυτοματοποιημένο μετρητή κυττάρων (Countess®, Invitrogen).

Δοκιμασίες Μετανάστευση /εισβολή (Transwell Δοκιμασία)

καρκινικά κύτταρα του προστάτη σπάρθηκαν σε πυκνότητα 2 × 10

5 κύτταρα σε 250 μΐ ανά φρεάτιο του μέσου καλλιέργειας χωρίς ορό επί του άνω θαλάμου των μεμβρανών φίλτρου τερεφθαλικό πολυαιθυλένιο επικαλυμμένο με ινονεκτίνη. Οι άνω θάλαμοι εισήχθησαν σε φρεάτια ιστοκαλλιέργειας και 750 μΙ μέσου καλλιέργειας χωρίς ορό προστέθηκε στον κάτω θάλαμο. Μετά από ολονύκτια επώαση στους 37 ° C, μη-μεταναστευτικά κύτταρα στην επιφάνεια του άνω μεμβράνη απομακρύνθηκαν με μια μπατονέτα, και τα κύτταρα που είχαν μεταναστεύσει διαμέσου των πόρων της μεμβράνης και εισέβαλαν την κάτω πλευρά της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν με 90% μεθανόλη και χρωματίσθηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη. Για την ποσοτική εκτίμηση, ο αριθμός των χρωματισμένο, μεταναστεύουν κύτταρα στη συνέχεια απαριθμήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο. Πέντε πεδία χαμηλής ισχύος ανά φίλτρο μετρήθηκαν σε τρεις ξεχωριστές περιπτώσεις για τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Σταθερή HIF1α γκρεμίζω στα κύτταρα PC3.

Τα πλασμίδια που κωδικοποιούν την ανθρώπινη HIF1α shRNA (Mission® αριθμούς κλώνος TRCN0000003810 και TRCN0000010819, τα οποία κωδικοποιούν μία φουρκέτα τύπου siRNA) και ένα πλασμίδιο αρνητικό μάρτυρα (SHC002) αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ). Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν είτε με πλασμίδιο HIF1α shRNA ή το πλασμίδιο ελέγχου αρνητικού χρησιμοποιώντας τη μέθοδο επιμόλυνσης Neon® (Invitrogen). Εν συντομία, 1 × 10

6 κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, πλύθηκαν με PBS, και ιζηματοποιήθηκαν πριν την επαναιώρηση σε 100 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος Νέον επαναιώρηση. HIF1α ή ελέγχου shRNA πλασμίδιο (5 μg) προστέθηκαν και αναμίχθηκαν καλά στο κυτταρικό εναιώρημα πριν από την επιμόλυνση. Τα επιμολυσμένα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλήρες μέσο και επιλέγονται με 1.0 μg /ml πουρομυκίνη (Sigma-Aldrich) για 7 ημέρες πριν από την περαιτέρω δοκιμασίες. Knockdown της πρωτεΐνης HIF1α καταδείχθηκε με κηλίδωση Western, και με μέτρηση της κατάντη προϊόν, αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF), με ανοσορροφητική δοκιμασία συνδεδεμένη με ένζυμο (ELISA).

Μετάφραση αποδοτικότητα.

Για να καθοριστεί αν η 5’UTR της HIF1α mRNA έχει κανένα ρόλο στην HIF1α υπερέκφραση σε κύτταρα του προστάτη ένα πλασμίδιο αναφοράς δομήθηκε με τον οποίο ολόκληρη η 5’UTR και 238 bp της αλληλουχίας του υποκινητή HIF1α κλωνοποιήθηκε ανοδικά του

Firefly

λουσιφεράση ακολουθίες κωδικοποίησης στο πλασμίδιο ανταποκριτή pGL4.10. Το κατασκεύασμα ανταποκριτής επιμολύνθηκε σε LNCaP και PC3 κύτταρα και η δραστηριότητα της λουσιφεράσης της πυγολαμπίδας που κινείται από τον φορέα ρεπόρτερ HIF1-UTR και

Renilla

λουσιφεράσης (ΡΤΚ-Renilla φορέα αναφοράς ελέγχου) προσδιορίσθηκαν μετά από 24 ώρες επώασης. Σύνολο mRNA εκχυλίστηκε από τα επιμολυσμένα κύτταρα και η ποσότητα του mRNA λουσιφεράσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας Real Time PCR. Λουσιφεράσης mRNA στα κύτταρα επιμολυσμένα με τον άδειο φορέα pGL4 χρησιμοποιήθηκε ως βασικό έλεγχο. Μετάφραση απόδοση υπολογίστηκε διαιρώντας το

Firefly

δραστηριότητα λουσιφεράσης (ανάλογη με την πρωτεΐνη λουσιφεράση) από τη συγκέντρωση του

Firefly

mRNA λουσιφεράσης. Η αναλογία αυτή διορθώθηκε περαιτέρω για την αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης λαμβάνοντας υπόψη το

Renilla

δραστηριότητα λουσιφεράσης.

Κλινικές μελέτες έκβασης

δείγματα ανθρώπινων ιστών.

Για το αξιολόγηση των συσχετίσεων μεταξύ της έκφρασης HIF1α και κλινικές εκβάσεις, 100 ανθρώπινων όγκων του προστάτη από ασθενείς που είχαν υπό την προϋπόθεση ενημέρωσε γραπτή συγκατάθεση συλλέχθηκαν μετά από ριζική προστατεκτομή ή διουρηθρική εκτομή του προστάτη (TURP) στο ίδρυμά μας μεταξύ 2000 και 2011. Όλα τα δείγματα ελήφθησαν από το Victorian Βιοτράπεζας Καρκίνου ή το Τμήμα Ανατομικές Παθολογίας στο Νοσοκομείο Austin, Βικτώρια, Αυστραλία. Έγκριση για τη χρήση των βιολογικών δειγμάτων και δεδομένων των ασθενών αποχαρακτηριστούν για αυτή τη μελέτη λήφθηκε από την Επιτροπή Austin Υγείας Ανθρωπίνων Έρευνας Ηθικής.

ανοσοϊστοχημεία.

παραφίνη-ενσωματωμένες τομές ιστών de-κερωμένο σε histolene και ενυδατωμένο με μειούμενες συγκεντρώσεις αιθανόλης. Τα πλακίδια ξεπλύθηκαν σε Tris-ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα /Tween20 (TBST) και τα αντιγόνα ανακτήθηκαν με θέρμανση σε ρυθμιστικό κιτρικού οξέος (ρΗ 6,0) σε ένα φούρνο μικροκυμάτων για 2 λεπτά σε μέτρια υψηλές και 13 λεπτά σε μέτρια χαμηλή. Τα πλακίδια αφέθηκαν να ψυχθούν και ενδογενών υπεροξειδασών στα δείγματα αποκλείστηκαν με κατεργασία με υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% επί 10 λεπτά στο σκοτάδι. Τα πλακίδια πλύθηκαν σε νερό, εξισορροπημένη σε ρυθμιστικό διάλυμα TBST, αποκλείστηκαν με Ultravision (Thermo Fisher Scientific) για 10 λεπτά και χρωματίστηκαν για HIF1α χρησιμοποιώντας πολυκλωνικό αντίσωμα HIF1α (1:100, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) στους 4 ° C όλη τη νύκτα . Μετά την επώαση του αντισώματος, πλακίδια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ένα συζευγμένο με HRP δευτερογενές αντίσωμα (Dako) στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Τα πλακίδια πλύθηκαν με TBST ακόλουθες 5 λεπτά επώασης με 3,3′-διαμινοβενζιδίνη (DAB) χρωμογόνο (1 σταγόνα /ml ρυθμιστικού διαλύματος υποστρώματος, Dako) για να ολοκληρωθεί η ανάπτυξη του χρώματος. Τέλος, τα πλακίδια με αιματοξυλίνη επί 1 λεπτό, πλύθηκαν με τρεχούμενο νερό και το νερό της βρύσης του Scott για 1 λεπτό κάθε, αφυδατωμένα και κάλυμμα γλίστρησε. Οι ερευνητές δεν γνώριζαν την κατάσταση μεμονωμένων δειγμάτων, καθώς και οι όγκοι χωρίζονται ανάλογα με την παρουσία ή απουσία HIF1α παρά αδύναμη ή ισχυρή χρώση για να μειωθεί η διακύμανση μεταξύ των παρατηρητών.

Αποτελέσματα.

απομακρυσμένες μεταστάσεις ορίστηκαν από ανωμαλίες τεκμηριώνονται στα οστά σάρωσης ή αξονική τομογραφία. CRPC ορίστηκε ως 2 διαδοχικές αυξήσεις του ειδικού προστατικού αντιγόνου (PSA) από το ναδίρ PSA. Ο χρόνος για την ανάπτυξη των μακρινών μετάσταση μετρήθηκε από τη χειρουργική επέμβαση, ενώ ο χρόνος για την ανάπτυξη του CRPC, χημειο-αντίσταση και PC-ειδικών θάνατος μετρήθηκαν από την έναρξη της στέρησης ανδρογόνων. Προ-επεμβατική PSA ορίστηκε ως PSA αμέσως πριν από τη λήψη του δείγματος ιστού, και Τ3 και Τ4 στάσης ορίστηκε ως τοπικά προχωρημένο καρκίνο του προστάτη όπως και στην αμερικανική κοινή Επιτροπής του 2002 σχετικά με το σύστημα Καρκίνος στάσης [30].

Στατιστικές ανάλυσης.

η στατιστική ανάλυση έγινε υπό την καθοδήγηση της στατιστικής συμβουλευτικής υπηρεσίας, Πανεπιστήμιο της Μελβούρνης, στην Αυστραλία. Chi-τετράγωνο ανάλυση Pearson και την ακριβή τεστ του Fisher διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας δύο-από-δύο πίνακες (σκορ Gleason, HIF1α θετικότητα, το στάδιο του όγκου και τον αριθμό των ασθενών που ξεκίνησε στις θεραπεία στέρησης ανδρογόνων) στο λογισμικό SigmaStat (Jandel Scientific, San Rafael, CA) για να ελέγξτε τη σύνδεση μεταξύ των χαρακτηριστικών των ασθενών και την έκφραση HIF1α. Μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική ανάλυση πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση μοντέλων παλινδρόμησης κατά Cox για όλες τις μεταβλητές. Προκειμένου να ξεπεραστεί η μη σύγκλισης του μοντέλου παλινδρόμησης Cox κατά την ανάλυση για HIF1α θετικότητα και το σκορ Gleason (καθώς δεν υπήρχαν αποτελέσματα στην αρνητική ομάδα HIF1α και οι χαμηλές βαθμολογίες Gleason), αυτά μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική ανάλυση υπολογίστηκαν από Cox παλινδρόμησης με τιμωρούνται μέγιστη μέθοδο Firth της πιθανότητας χρησιμοποιώντας το λογισμικό R, (R Ίδρυμα για στατιστικούς υπολογισμούς έκδοση 2.14.0). Επιβίωση υπολογίστηκε για κάθε αποτέλεσμα χρησιμοποιώντας καμπύλες Kaplan-Meier με δοκιμασία log rank για το στατιστικό πακέτο SPSS (IBM SPSS έκδοση 17). Διαγνωστική αξιολόγηση δοκιμής με ευαισθησία και ειδικότητα ανάλυσης διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας MedCalc στατιστικού λογισμικού (MedCalc λογισμικό, το Βέλγιο https://www.medcalc.org/).

In vitro

δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± SEM. Η στατιστική σημαντικότητα για ενιαία συγκρίσεις των κανονικά κατανεμημένων δεδομένων προσδιορίστηκε με δοκιμασία t του Student ή για δεδομένα που δεν έγινε κανονικά διανέμονται από Mann-Whitney τεστ rank sum. Για πολλαπλές συγκρίσεις έγιναν μονόδρομη ΑΝΟνΑ ακολουθούμενη από διόρθωση Bonferroni. Όλα τα στατιστικά στοιχεία αναλύθηκαν με το πρόγραμμα SigmaStat (Jandel Scientific).

Αποτελέσματα

HIF1α έκφραση συσχετίζεται με τη μετανάστευση Βαθμολογήστε το PC κύτταρα

HIF1α πρωτεϊνική έκφραση αναλύθηκε σε ανδρογόνα-ευαίσθητο (LNCaP) και ανδρογόνα αναίσθητη (PC3 και DU145) CRPC-σαν κύτταρα. έκφραση Basal HIF1α υπό φυσιολογική οξυγόνωση ήταν υψηλότερη κατά 12 ± 6-πλάσια και 10 ± 4 φορές, αντίστοιχα, στο CRPC-όπως κυτταρικές σειρές PC3 και DU145, σε σύγκριση με τα κύτταρα LNCaP ευαίσθητο σε ανδρογόνο (Σχήμα 1Α). Είναι ενδιαφέρον η παρατήρηση ότι η βασικού ρυθμού ανάπτυξης των κυττάρων LNCaP σε συνθήκες χωρίς ορό ήταν πολύ υψηλότερη από ό, τι τα κύτταρα PC3, που εκφράζουν περισσότερο HIF1α, δείχνει ότι η αυξημένη έκφραση του HIF1α δεν οδηγεί αναγκαστικά σε μεγαλύτερη πολλαπλασιασμό (Σχήμα 1Β). Για τη διερεύνηση της μεταστατικό δυναμικό των κυττάρων PC γραμμές, η μετανάστευση του CRPC κυτταρικές σειρές PC3 και DU145 συγκρίθηκε με κύτταρα LNCaP ανδρογόνο ευαίσθητα χρησιμοποιώντας δοκιμασία Transwell. Η παρατήρηση ότι η μετανάστευση των PC3 και DU145 κυττάρων ήταν 177 ± 6% και 215 ± 17%, αντιστοίχως, της αξίας για κύτταρα LNCaP (100%) (Σχήμα 1 C) έδειξε ότι η υπερέκφραση του HIF1α σχετίζεται με αυξημένη μετανάστευση.

συγκεντρώσεις Α) πρωτεΐνη Basal HIF1α στις κυτταρικές σειρές PC ανθρώπινη LNCaP, DU145 και PC3 υπό νορμοξικές συνθήκες αναλύθηκαν με κηλίδα Western. (Β) πολλαπλασιασμός προσδιορίστηκε με μέτρηση των κυττάρων μετά από 24 και 48 ώρες. (C), τα ποσοστά της μετανάστευσης /εισβολής μετρήθηκαν με δοκιμασίες Transwell στις 24 ώρες. Οι τιμές στο (Α) και (C) εκφράζεται ως η αύξηση φορές σε σύγκριση με κύτταρα LNCaP, ενώ οι τιμές στο (Β) εκφράζεται ως ποσοστό του χρόνου μηδέν τιμή. Όλες οι τιμές είναι η μέση τιμή ± SEM από τουλάχιστον τρεις ξεχωριστές θεραπείες. συντελεστές (Δ) Η επιβίωση των κυττάρων PC εκτεθεί σε κυτταροτοξικούς συνθήκες. Η επιβίωση των κυττάρων PC3 (τα οποία έχουν υψηλότερη βασική πρωτεΐνη HIF1α) όταν εκτίθενται σε οξειδωτικό στρες με υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η

2O

2) ή χημειοτοξικότητα με 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) συγκρίθηκε με την επιβίωση των LNCaP κύτταρα (τα οποία έχουν χαμηλότερη έκφραση HIF1α). Η επιβίωση αξιολογήθηκε με μέτρηση των αριθμών των κυττάρων στις 24 ώρες. Οι τιμές εκφράζονται ως ποσοστό του μη επεξεργασμένου ελέγχου και είναι η μέση τιμή ± SEM από τουλάχιστον τρεις ξεχωριστές θεραπείες. #, Η P & lt?. 0,05 έναντι αντιμετωπίζονται LNCaP κύτταρα

Η

Μεγαλύτερη HIF1α έκφραση συσχετίζεται με αυξημένη κυτταρική επιβίωση

Ένα από τα χαρακτηριστικά του CRPC είναι η αντοχή του σε χημειοθεραπεία και η ακτινοθεραπεία. Για να διερευνηθεί αν HIF1α είναι υπεύθυνη για την αυξημένη επιβίωση του CRPC κύτταρα που μοιάζουν με

in vitro

, την επιβίωση των κυττάρων μετά την αγωγή του PC3 ή LNCaP κυττάρων με δύο κυτταροτοξικών παραγόντων, H

2O

2 (α πηγή του οξειδωτικού στρες) και 5-φθοριοουρακίλη (5-FU, ένα χημειοθεραπευτικό φάρμακο) μετρήθηκε. δοκιμασίες πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Σχήμα 1D) αποκάλυψε ότι τα ποσοστά επιβίωσης των 60 ± 14% και 42 ± 8% για PC3 κύτταρα μετά από θεραπεία με 100 μΜ H

2O

2 ή 15 μΜ 5-FU, αντίστοιχα, ήταν σημαντικά μεγαλύτερες από τα αντίστοιχα ποσοστά επιβίωσης των 17 ± 4% και 3 ± 1,6% στα κύτταρα LNCaP ανδρογόνα-ευαίσθητο.

HIF1α Νοκ ντάουν Μειώνει κυττάρων επιβίωση και μετανάστευση των PC3 κύτταρα

Για να επιβεβαιωθεί ότι η αυξημένη επιβίωση και τη μετανάστευση των κυττάρων PC3 οφειλόταν σε μεγαλύτερη έκφραση της πρωτεΐνης HIF1α, η έκφραση των HIF1α στα κύτταρα PC3 χτυπήθηκε κάτω χρησιμοποιώντας φορείς shRNA. Η επιμόλυνση των κυττάρων PC3 με ένα φορέα που εκφράζει HIF1α shRNA μείωσε την έκφραση της πρωτεΐνης HIF1α σε 12 ± 3% στον κλώνο 1 και 16 ± 3% σε κλώνος 2 σε σύγκριση με αγρίου τύπου κύτταρα PC3 (100%) (Σχήμα 2Α). VEGF, ένα κατάντη προϊόν του HIF1α, επίσης μειώθηκε στις HIF1α knockdown κλώνους, επιβεβαιώνοντας την μείωση της δραστηριότητας HIF1α (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η παρατήρηση ότι δεν υπήρχε διαφορά στο βασικό ρυθμό πολλαπλασιασμού μεταξύ HIF1α shRNA κύτταρα που εκφράζουν PC3 και τα κύτταρα PC3 διαμολύνθηκαν με ένα κωδικοποιημένο φορέα ελέγχου είναι συνεπής με το εύρημα ότι δεν υπήρχε συσχέτιση μεταξύ μεγαλύτερη έκφραση HIF1α και ρυθμό πολλαπλασιασμού (Σχήμα 1Β). Μετά H

2O

2 θεραπεία μόνο 22.5 ± 3% των HIF1α knockdown κυττάρων PC3 (shRNA κλώνος 1) επιβίωσαν σε σύγκριση με 58,5 ± 10% επιβίωση σε περιπλεγμένο έλεγχο κύτταρα PC3 φορέα-επιμολυσμένα (Σχήμα 2Β). Παρομοίως, 5-FU μείωσε την επιβίωση των κυττάρων σε 27 ± 2% στα HIF1α knockdown κυττάρων, σε σύγκριση με την επιβίωση των κυττάρων 62 ± 9% σε κύτταρα PC3 επιμολυσμένα με ένα κωδικοποιημένο φορέα ελέγχου. Δεν υπήρχε σημαντική μεταβολή στην έκφραση του HIF1α μετά την επεξεργασία των κυττάρων PC3 διαμολύνθηκαν με έλεγχο shRNA με 100 μΜ H

2O

2 ή 15 μΜ 5-FU σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα PC3 (Εικόνα 2C). Ωστόσο, υπήρχαν 2,3 ± 0,2-φορές και 6,6 ± 1 φορές αυξήσεις στην έκφραση του HIF1α μετά την επεξεργασία των κυττάρων PC3 με 1% O

2 ή 300 μΜ CoCl

2, αντιστοίχως (Σχήμα 2C). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α η βασική έκφραση του HIF1α σε HIF1α shRNA κύτταρα που εκφράζουν PC3 είναι μη ανιχνεύσιμη, και ως εκ τούτου δεν είναι εφικτό να προσδιοριστεί η επίδραση της θεραπείας με 100 μΜ H

2O

2 ή 15 μΜ 5-FU για HIF1α shRNA-κλώνους έκφρασης PC3.

(Α) συγκεντρώσεις HIF1α μειώθηκαν σε 2 ξεχωριστά κλώνους των κυττάρων PC3 ακόλουθα σταθερή έκφραση HIF1α shRNA όπως αξιολογείται με κηλίδα Western. Οι τιμές είναι ο μέσος όρος ± SEM από τουλάχιστον τρία ξεχωριστά πειράματα και εκφράζονται ως ποσοστό των κυττάρων PC3 άγριου τύπου. *, Ρ & lt? 0,05 έναντι κυττάρων PC3 άγριου τύπου. (Β) Η επιβίωση των κυττάρων PC3 μετά από έκθεση σε οξειδωτικό στρες (υπεροξείδιο του υδρογόνου (H

2O

2)) ή χημειοτοξικότητα (5-φθοριοουρακίλη (5-FU) επί 24 ώρες μειώθηκε μετά HIF1α knockdown σε σύγκριση με κωδικοποιημένα έλεγχος φορέα-επιμολυσμένα κύτταρα PC3 οι τιμές είναι ο μέσος όρος ± SEM από τουλάχιστον τρία ξεχωριστά πειράματα και εκφράζονται ως ποσοστό των μη επεξεργασμένων κωδικοποιημένα ελέγχου φορέα-επιμολυσμένα κύτταρα PC3 #, Ρ & lt?.. 0.05 έναντι του ελέγχου (C) έκφραση πρωτεΐνης HIF1α in. PC3 κύτταρα επιμολυσμένα με τον έλεγχο shRNA μετά τη θεραπεία με 1% O

2, 300 μΜ CoCl

2, 100 μΜ H

2O

2, και 15 μΜ λύματα 5-FU. κυττάρων ηλεκτροφορήθηκαν σε SDS -πολυακρυλαμιδίου πηκτές και κηλιδώθηκαν με HIF1α αντίσωμα. έκφραση GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Οι κηλίδες Western που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ξεχωριστών πειραμάτων. πυκνότητες Band προσδιορίστηκαν με πυκνομετρική ανάλυση του HIF1α /GAPDH και παρουσιάζονται σε σχέση με την τιμή για το μη επεξεργασμένο . κύτταρα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM? * ρ & lt? 0,05 έναντι μη επεξεργασμένα κύτταρα PC3. (D) Οι τιμές της μετανάστευσης /εισβολής στα κύτταρα PC3 knockdown HIF1α μειώθηκαν σε σύγκριση με τα κωδικοποιημένα φορέα ελέγχου επιμολυσμένα κύτταρα PC3 όπως αξιολογείται με δοκιμασία Transwell. Οι τιμές είναι ο μέσος όρος ± SEM από τουλάχιστον τρία ξεχωριστά πειράματα και εκφράζονται ως ποσοστό των μη επεξεργασμένων κωδικοποιημένα ελέγχου φορέα επιμολυσμένα κύτταρα PC3. *, P & lt? 0,05 έναντι του ελέγχου. (Ε) Επαγωγή HIF1α σε κύτταρα LNCaP από υποξία (σκούρο γκρι ράβδοι) ή με χλωριούχο κοβάλτιο (ανοιχτό γκρι ράβδοι) αυξημένη επιβίωση μετά από έκθεση σε οξειδωτικό στρες με H

2O

2 ή χημειοτοξικότητα με 5-FU για 24 ώρα σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου LNCaP (μαύρες ράβδοι). Οι τιμές είναι ο μέσος όρος ± SEM από τουλάχιστον τρεις διαφορετικές θεραπείες και εκφράζονται ως ποσοστό του μη επεξεργασμένου ελέγχου LNCaP. #, Η P & lt? 0,05 έναντι αντιμετωπίζονται LNCaP κύτταρα. *, P & lt? 0,05 έναντι LNCaP κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 1% O

2 και 5-FU. έκφραση της πρωτεΐνης (F) HIF1α σε κύτταρα LNCaP σε επεξεργασία με 1% O

2 και 300 μΜ CoCl

2 σε συνδυασμό με είτε 100 μΜ H

2O

2 ή 15 μΜ 5-FU. Κυτταρολύματα ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτές SDS-πολυακρυλαμιδίου και στυπώθηκαν με HIF1α αντίσωμα. έκφραση GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Οι κηλίδες Western που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ξεχωριστών πειραμάτων. πυκνότητες Band προσδιορίστηκαν με πυκνομετρική ανάλυση του HIF1α /GAPDH και παρουσιάζονται σε σχέση με την τιμή για νορμοξικά κύτταρα που υφίστανται την ίδια μεταχείριση. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM? * P & lt?. 0.05 vs. χωρίς θεραπεία ελέγχου, 100 μΜ H

2O

2 ή 15 μΜ 5-FU επεξεργασμένα κύτταρα LNCaP

Η

Προηγουμένως 1,8 φορές μεγαλύτερο ρυθμό μετανάστευσης παρατηρήθηκε σε PC3 κυττάρων σε σύγκριση με κύτταρα LNCaP ανδρογόνο-κεφαλαίων. Για να καθοριστεί εάν ή όχι η διαφορά αυτή επιτεύχθηκε με τη μεσολάβηση HIF1α, η μετανάστευση των HIF1α νοκ ντάουν και τον έλεγχο των φορέων κύτταρα επιμολυσμένα-PC3 συγκρίθηκε. Knockdown έκφρασης HIF1α με παρεμβολή RNA μειώθηκε μετανάστευση PC3 σε 37 ± 10% (κλώνος 1) και 14 ± 7% (κλώνος 2), σε σύγκριση με τον φορέα ελέγχου κύτταρα επιμολυσμένα-PC3 (100%) (Σχήμα 2D).

επαγωγή HIF1α σε LNCaP κυττάρων αυξάνεται κυττάρων επιβίωση

Για να καθοριστεί εάν η επαγωγή της έκφρασης HIF1α σε LNCaP κύτταρα ευαίσθητο σε ανδρογόνο μπορεί να αυξήσει την επιβίωσή τους μετά τη θεραπεία με κυτταροτοξικούς παράγοντες, η έκφραση HIF1α προκλήθηκε χρησιμοποιώντας είτε υποξία (1 % O

2), ή το χλωριούχο κοβάλτιο υποξία μιμητική (Σχήμα 2Ε). Η επώαση των LNCaP κυττάρων με είτε 100 μΜ H

2O

2 ή 15 μΜ 5-FU μείωσε την επιβίωση σε 17 ± 4% και 26 ± 2% αντίστοιχα σε σύγκριση με μη επεξεργασμένο έλεγχο (100%). Ωστόσο, τα ποσοστά επιβίωσης σε παρουσία 100 μΜ H

2O

2 μετά την επεξεργασία των κυττάρων LNCaP με είτε 1% O

2 ή χλωριούχο κοβάλτιο αυξήθηκε σε 40 ± 8% και 49 ± 11%, αντίστοιχα. Η επιβίωση (113 ± 23%) των κυττάρων LNCaP σε επεξεργασία με 300 μΜ CoCl

2 σε συνδυασμό με 15 μΜ 5-FU ήταν σημαντικά υψηλότερη σε σύγκριση με την επιβίωση (54 ± 10%) παρατηρήθηκε σε κύτταρα LNCaP σε επεξεργασία με 1% O

2 σε συνδυασμό με 15 μΜ 5-FU. Είναι ενδιαφέρον, 300 μΜ CoCl

2 σε συνδυασμό με 15 μΜ 5-FU προκάλεσε μια ελαφρώς υψηλότερη 3,3 ± 0,5-φορές αύξηση στην έκφραση HIF1α σε κύτταρα LNCaP, σε σύγκριση με το 2,1 ± 0,4-φορές αύξηση που επάγεται από 1% O

2 σε συνδυασμό με 15 μΜ 5-FU, αν και η διαφορά δεν ήταν στατιστικά σημαντική (Σχήμα 2F).

Αυξημένη Μετάφραση αποδοτικότητα των HIF1α mRNA είναι υπεύθυνη για HIF1α υπερέκφραση σε PC3 κύτταρα

Παρά το γεγονός ότι η ρύθμιση της μετάφρασης από το 5 ‘UTR είναι ένας κύριος μηχανισμός για την μετα-μεταγραφική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης, η αποτελεσματικότητα της μετάφρασης του HIF1α mRNA σε κύτταρα του προστάτη δεν έχει αναφερθεί προηγουμένως. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α η αναλογία του

Firefly

να

Renilla

δραστικότητα λουσιφεράσης μετά την επιμόλυνση HIF1α 5’UTR-LUC ανταποκριτή και φορείς ελέγχου ΡΤΚ Renilla ήταν 20 ± 3-φορές και 26 ± 3 φορές σε LNCaP και PC3 κύτταρα, αντίστοιχα, σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με τον άδειο φορέα pGL4. Ωστόσο έκφραση λουσιφεράσης mRNA ήταν 33 ± 1,4 φορές σε LNCaP και 9 ± 2.1 φορές σε κύτταρα PC3 σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με φορέα άδειο pGL4 (Σχήμα 3Β). Περαιτέρω η απόδοση της μετάφρασης του HIF1α mRNA σε κύτταρα PC3 ήταν 2,9 ± 0,4 φορές υψηλότερη σε σύγκριση με τα κύτταρα LNCaP όταν αξιολογήθηκε με τη χρήση του δείκτη της λουσιφεράσης δραστηριότητας /σχετικό περιεχόμενο mRNA (Σχήμα 3C).

(Α)

Firefly

και

Renilla

λουσιφεράσης δραστηριότητες σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη μετά από διαμόλυνση ενός μορφώματος 5’UTR-λουσιφεράσης HIF1α και τον φορέα ρεπόρτερ ελέγχου ρΤΚ Renilla προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία διπλής λουσιφεράσης. (Β) σε πραγματικό χρόνο PCR (RT-PCR) ανάλυση της λουσιφεράσης mRNA σε κύτταρα PC επιμολυσμένα με το κατασκεύασμα 5’UTR-λουσιφεράσης HIF1α. Μετά την επιμόλυνση, RNA απομονώθηκε, και η έκφραση του mRNA λουσιφεράσης ανιχνεύεται με πραγματικού χρόνου RT-PCR και κανονικοποιήθηκαν με έκφραση 18S mRNA. (C) Μεταγραφική απόδοση αντιπροσωπεύει την αναλογία του

Firefly

/

Renilla

δραστικότητα λουσιφεράσης, διαιρούμενη με την σχετική συγκέντρωση mRNA λουσιφεράσης σε κύτταρα PC. Η μεταφραστική αποτελεσματικότητα της λουσιφεράσης mRNA κατευθύνεται από την περιοχή του 5’UTR HIF1α σε κύτταρα PC3 είναι υψηλότερη από ό, τι στα κύτταρα LNCaP. Οι τιμές είναι ο μέσος όρος ± SEM από τουλάχιστον τρία ξεχωριστά πειράματα. *, P & lt?. 0,05 έναντι αντιμετωπίζονται LNCaP κύτταρα

Η

HIF1α Πρωτεΐνη σε Ανθρώπινα Καρκίνος του προστάτη όγκοι

Εκατό ανθρώπινα δείγματα PC χωρίστηκαν σε δύο ομάδες ανάλογα με τη βαθμολογία τους Gleason (≤ 7 (38) και & gt? 7 (62), Πίνακας 1) και την κατάσταση HIF1α. Η έκφραση του HIF1α εκτιμήθηκε με ανοσοϊστοχημεία (Σχήμα 4Α). Εικόνα 4Α (α) δείχνει ένα θετικό, και η Εικόνα 4Α (β) παρουσιάζει αρνητική, HIF1α χρώση σε δύο τυπικό όγκους με Gleason σκοράρει 9 (Ένθετο κουτί, θέα X20). Η Εικόνα 4Α (c) επιδεικνύει ένα θετικό, και το Σχήμα 4Α (d) δείχνει ένα αρνητικό (ά), χρώση HIF1α σε δύο τυπικά όγκους με Gleason στείλει 6. Η θετική χρώση σε κύτταρα PC3 (Εικόνα 4Α (ε)) και σε αρνητική χρώση LNCaP κύτταρα (Σχήμα 4Α (στ)) και σε κύτταρα HIF1α knockdown PC3 (Εικόνα 4Α (ζ)) κατέδειξε την ειδικότητα του αντισώματος HIF1α. Επιπλέον, HIF1α εκφράστηκε σε όλο τον όγκο με αυξημένη έκφραση της κύριας προστάτη αδένα (υποδεικνύεται από το βέλος στο Σχήμα 4Α (α)) και σε μεταστάσεις λεμφαδένα (που υποδεικνύεται από το βέλος στο Σχήμα 4Α (η)). Στην έκφραση θετικά δείγματα HIF1α ήταν ομοιογενής σε όλη την περιοχή του όγκου.

(Α) Εκπρόσωπος αποτελέσματα ανοσοϊστοχημείας δείχνει έκφραση HIF1α στον προστάτη δείγματα καρκίνου και κυτταρικές σειρές. Θετική (Αα) και αρνητικό (Ab) χρώση για HIF1α παρατηρήθηκε σε δύο τυπικό όγκους με Gleason σκοράρει 9 (Ένθετο κουτί, θέα X20). Θετικές (Ac) και αρνητικό (Ad) χρώση παρατηρήθηκε επίσης σε δύο τυπικά όγκους με Gleason στείλει 6. Η θετική χρώση σε κύτταρα PC3 (Ae) και αρνητική χρώση σε κύτταρα LNCaP (AF) και σε HIF1α κύτταρα knockdown PC3 (Ag) αποδειχθεί η