Αφηρημένο

Xanthatin, μια λακτόνη σεσκιτερπένιο καθαρίζεται από Xanthium strumarium L., κατέχει εξέχουσα αντικαρκινική δράση. Βρήκαμε ότι η διάσπαση της δραστικότητας της ΟδΚ3β ήταν απαραίτητη για να ασκήσει xanthatin αντικαρκινικές ιδιότητες του σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), παράλληλα με προτιμότερη καταστολή της συστατική ενεργοποίηση της STAT3. Είναι ενδιαφέρον ότι, η απενεργοποίηση των δύο σημάτων είναι δύο αλληλοαποκλειόμενες γεγονότα στην xanthatin-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο. Επιπλέον, με έκπληξη ότι η έκθεση του xanthatin απέτυχε να ενεργοποιήσει τη πιθανός παρενέργεια κανονικών Wnt /β-κατενίνης που ακολουθείται από ΟδΚ3β αδρανοποίηση. Παρατηρήσαμε επίσης ότι η ρύθμιση προς τα κάτω της STAT3 ήταν απαραίτητη για xanthatin να τελειοποιήσουν τον κίνδυνο. Έτσι, η ανακάλυψη των xanthatin, η οποία έχει την ικανότητα να ενορχηστρώσει ταυτόχρονα δύο ανεξάρτητες καταρράκτες σηματοδότησης, μπορεί να έχει σημαντικές συνέπειες για τη διαλογή πολλά υποσχόμενων φαρμάκων σε θεραπείες του καρκίνου

Παράθεση:. Tao L, Fan F, Liu Υ, Λι W, Zhang L, Ruan J, et al. (2013) Συντονισμένες καταστολή της STAT3 και ΟδΚ3β εμπλέκεται στην ανάπτυξη Αναστολή της μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα από Xanthatin. PLoS ONE 8 (11): e81945. doi: 10.1371 /journal.pone.0081945

Επιμέλεια: Kamyar Afarinkia, Πανεπιστήμιο του Μπράντφορντ, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 31 Αυγούστου, 2013? Αποδεκτές: 17 Οκτωβρίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 28 Νοεμβρίου του 2013

Copyright: © 2013 Tao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Αρ 81173174 και 81202655)? Το Εθνικό Key Technology Research & amp? Πρόγραμμα Ανάπτυξης (Αρ 2008BAI51B02)? Ph.D. Προγράμματα Ίδρυμα του Υπουργείου Παιδείας της Κίνας (Αρ 20113237110008). έργα απόφοιτος της έρευνας και της καινοτομίας Jiangsu Ακαδημία (αρ CXZZ13_0627). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

3β συνθάσης γλυκογόνου κινάσης (ΟδΚ3β) έχει αναδειχθεί ως μία από τις πιο ελκυστικές θεραπευτικοί στόχοι για την θεραπευτική αγωγή νευροεκφυλιστικών ασθενειών, και οι αναστολείς της ΟδΚ3β έχουν εφαρμοστεί με επιτυχία στην κλινική πρακτική για δεκαετίες [1,2]. Ακόμα κι αν έχει γίνει ευρέως αποδεκτό ότι οι παρεκκλίνουσα λειτουργίες της ΟδΚ3β μεσολάβηση συχνά σχετίζονται με την καρκινογένεση, η αξιοποίηση των ανταγωνιστών ΟδΚ3β σε θεραπείες του καρκίνου παραμένει αινιγματική και αμφιλεγόμενη [3]. Μια σημαντική ανησυχία σε θεραπεία αντι-ΟδΚ3β αναμένεται να ενεργοποιήσει Wnt /β-κατενίνης σηματοδότησης και σταθεροποίηση ογκογονίδια έτσι πιθανώς να οδηγήσει σε καρκινογένεση. Στο κυτταρόπλασμα, ΟδΚ3β φωσφορυλιώνει β-κατενίνης και στοχεύει αυτό για ουμπικουιτίνωση και την υποβάθμιση του πρωτεασώματος. Ως εκ τούτου, η αναστολή της ΟδΚ3β έχει σαν αποτέλεσμα τη συσσώρευση β-κατενίνης, η επακόλουθη μετατόπιση εντός του πυρήνα και πρόσληψη του παράγοντα /Τ-λεμφοκυτταρικές παράγοντα ενισχυτή (LEF /TCF) δέσμευσης DNA διαμεσολαβούμενη ογκογόνες πρωτεΐνες μεταγραφής [4].

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι γνωστή για την κορυφή κύρια αιτία θνησιμότητας παγκοσμίως [5]. Η τρέχουσα γνώση όσον αφορά την ΟδΚ3β σε εξέλιξης του καρκίνου του πνεύμονα βασίζεται στην κλινική παρατήρηση ότι φωσφορυλιωμένη ΟδΚ3β (Ser 9, κινάση νεκρά) θα μπορούσε να είναι ένας καλός προγνωστικός δείκτης για τον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) που υπερεκφράζουν καρκίνωμα του πνεύμονα [6]. Πρόσφατα στοιχεία έχουν δείξει ότι η αναστολή της ΟδΚ3β ενισχύει την ικανότητα του celecoxib χημειοπροληπτική φάρμακο να ρυθμίζουν προς τα κάτω αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη c-FLIP [7] και ευαισθητοποιεί παράγοντα νέκρωσης όγκων που σχετίζονται με συνδέτη που επάγει απόπτωση (TRAIL) προκληθείσα απόπτωση σε μη μικρών κυττάρων καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) [8], γεγονός που υποδηλώνει ότι η διακοπή της δραστηριότητας της ΟδΚ3β μπορεί να χρησιμεύσει ως προαιρετικό τρόπο να εμποδίσει τον καρκίνο του πνεύμονα.

Ο προσδιορισμός των νέων φαρμάκων από φυσικά προϊόντα έχει μια μακρά και επιτυχημένη ιστορία. Στην παρούσα εργασία, παρουσιάζουμε ένα φυσικό λακτόνη σεσκιτερπένιο xanthatin [9], το οποίο απομονώνεται από το

Xanthium strumarium

L. και έχει εξέχουσα αντικαρκινική δράση, μπορεί να φαρμακολογικά παρεμβαίνει με ΟδΚ3β. Έχει αναφερθεί ότι το εκχύλισμα μεθανόλης του

Xanthium strumarium

L. που προσφέρει σημαντικές xanthatin μπορεί να αναστέλλει δραστικότητα της ΟδΚ3β και ρυθμίζουν προς τα κάτω παράγοντα μεταγραφής μικροφθαλμίας σχετιζόμενη (MITF) μεσολάβηση μελανογένεση, ενώ MITF είναι ένας κύριος στόχος της Wnt μονοπάτι σηματοδότησης [10]. Τα ευρήματα αυτά προκαταρκτικά δείχνουν ότι θα μπορούσε να υπάρχει αιτιώδης σύνδεσμος μεταξύ της αναστολής της ΟδΚ3β και ενεργοποίηση Wnt από το εργοστάσιο. Επιπλέον, Αν Wnt ενεργοποίηση σηματοδότησης είναι ένα αναπόφευκτο αποτέλεσμα συνοδεύεται από την αναστολή της GSΚ3β, θα διατυπωθεί η άποψη ότι θα μπορούσε πολύ πιθανόν να υπάρχουν κάποιες προληπτικές θεραπείες για τον κίνδυνο από xanthatin. Στην περίπτωση αυτή, ο πολυτάλαντος κινάσης ως ένας θεραπευτικός στόχος θα πραγματοποιηθούν και η χρησιμότητα του xanthatin Θα εκτιμηθεί επίσης.

Προηγουμένως, δείξαμε ότι xanthatin σημαντικά επαγόμενη διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της κασπάσης-εξαρτώμενη απόπτωση σε ανθρώπινα πνεύμονα και γαστρικό καρκίνο, καθώς επίσης και ποντικού μελανώματος [9,11,12]. Ωστόσο, παραμένει σε μεγάλο βαθμό ασαφές αν η αναστολή της ΟδΚ3β είναι απαραίτητη για την αντικαρκινική δράση του xanthatin. Να αποκαλύψει περαιτέρω πιθανούς μηχανισμούς για τον κατάλληλο συντονισμό των πολλαπλών μονοπατιών ότι η απενεργοποίηση της ΟδΚ3β από xanthatin δόση δεν διατηρούν εύκολα β-κατενίνης /Wnt, απευθυνόμαστε μετατροπέα σήματος και ενεργοποιητής της μεταγραφής 3 (STAT3), επειδή υπάρχει μια επεκτατική απόδειξη της λογοτεχνίας αποκρυπτογράφηση ότι STAT3 ρυθμίζει μια χούφτα προς τα κάτω ογκογονιδίων από κοινού με β-κατενίνης. Για το καλύτερο της γνώσης μας, 1250 επικαλυπτόμενες υποθετικό γονιδίων στόχων έχουν προσδιοριστεί ότι ήταν συν-ρυθμίζονται με β-κατενίνης /TCF4 και STAT3 [13]. Αυτά τα καλά χαρακτηρισμένων κοινούς στόχους περιλαμβάνουν επιταχυντές του κυτταρικού κύκλου (c-Myc, CyclinD1, κ.λ.π.), αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών (Bcl-2, ΧΙΑΡ, κ.λ.π.) και ρυθμιστές μετάσταση όγκου (COX-2, VEGF, κ.λπ.) [ ,,,0],14,15]. Στην πραγματικότητα, η ενεργοποίηση STAT3 συμμετείχε στην πυρηνική συσσώρευση του β-κατενίνης, με αποτέλεσμα την κακή επιβίωση του ασθενούς στο παχύ έντερο και του μαστού [16,17]. Έτσι, συμπεραίνεται ότι η STAT3 θα μπορούσε λειτουργικά συνεργάζονται με β-κατενίνης. Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι η διάσπαση της STAT3 θα μπορούσε να μετριάσει εν μέρει την αυξημένη Wnt /β-κατενίνης παρακάτω ΟδΚ3β αδρανοποίηση από xanthatin.

Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε την επίδραση της xanthatin σχετικά με τις δραστηριότητες STAT3 και ΟδΚ3β στον NSCLC και διερευνάται η υποκείμενη στιχομυθία μεταξύ STAT3 και signalings Wnt /β-κατενίνης. Τα αποτελέσματα θα κατάσχω την αμφιβολία των κλινικών αντικαρκινικών εφαρμογή xanthatin στο μέλλον.

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων και κυτταρικών σειρών

Οι ανθρώπινες γραμμές NSCLC (Α549, H1975 , H1650, HCC827) και μη-ογκογόνο ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα SV40-απαθανάτισε BEAS-2B χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες ελήφθησαν από την κινεζική Ακαδημία Επιστημών κυττάρων Τράπεζας Type Culture Collection (CBTCCCAS, Σαγκάη, Κίνα). Οι κυτταρικές γραμμές καρκίνου του πνεύμονα καλλιεργήθηκαν ως μονοστοιβάδες σε RPMI 1640 μέσο καλλιέργειας συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Wisent, Κεμπέκ, Καναδάς), 100 μg /mL πενικιλλίνη, και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη και BEAS-2Β καλλιεργήθηκε σε ελεύθερο ορού δωρεάν LHC-8 μέσο (Invitrogen, Carlsbad, CA) διατηρήθηκαν σε έναν επωαστήρα με υγροποιημένη ατμόσφαιρα 95% αέρα και 5% CO

2 στους 37 ° C.

Χημικά και το Regents

Xanthatin απομονώθηκε και καθαρίστηκε από την ομάδα μας, όπως περιγράφεται προηγουμένως [10] και η καθαρότητα υπερέβη το 95% όπως προσδιορίζεται με μία μέθοδο HPLC. Το 100 mM απόθεμα xanthatin διάλυμα παρασκευάστηκε σε 100% DMSO και κύτταρα επεξεργασμένα με την ίδια ποσότητα DMSO χρησίμευσαν ως έλεγχος. χλωριούχο λίθιο (LiCl), SB216763 και Ν-ακετυλο κυστεϊνη (NAC) αγοράστηκαν από την Sigma (St. Louis, ΜΟ, USA). Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη IL-6 ελήφθη από R &?. D Systems (Minneapolis, ΜΝ, USA)

Μια λύση δοκιμασία πολλαπλασιασμού κυττάρων

Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με CellTiter 96

® υδατική δοκιμασία πολλαπλασιασμού κυττάρων One Solution (Promega, Madison, WI, USA). Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες κυτταρικής καλλιέργειας 96 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με υποδεικνύεται παράγοντες. Μετά από επώαση για υποδεικνυόμενη χρονική περίοδο, 20 μL του αντιδραστηρίου Ένα διάλυμα προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και η επώαση συνεχίστηκε για επιπλέον 1-4 ώρες. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 490 nm χρησιμοποιώντας Synergy ™ ΗΤ Πολλαπλών-Mode Microplate Reader (Bio-Tek, Winooski, VT, USA). Η επίδραση της υποδεικνύεται παραγόντων στη βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε ως το ποσοστό της βιωσιμότητας των κυττάρων σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου υπό αγωγή με όχημα, οι οποίες αποδίδεται αυθαίρετα 100% βιωσιμότητα. Η συγκέντρωση του xanthatin με αποτέλεσμα 50% αναστολή της ανάπτυξης ελέγχου (IC

50) υπολογίστηκε με SPSS λογισμικό στατιστικής. Εικόνες της κυτταρικής μορφολογίας ελήφθησαν με ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο (CarlZeiss, Hallbergnoos, Γερμανία) τυχαία πεδία.

Η κυτταρομετρία ροής

δοκιμασία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες κυτταρικής καλλιέργειας 6-πηγαδιών και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διάφοροι παράγοντες για υποδεικνυόμενη χρονική περίοδο. Για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου, τα κύτταρα αποκολλήθηκαν με θρυψίνη και πλύθηκαν με ψυχρό PBS. Καταβυθισθέντα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 500 μL ψυχρής αιθανόλης 70% για όλη τη νύχτα στους -20 ° C. Αφού πλύθηκαν σε PBS, σταθεροποιήθηκαν κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με RNase στους 37 ° C για 30 λεπτά και χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου σε σκοτάδι και αναλύθηκαν αμέσως με κυτταρομετρία ροής (FACS Calibur, BD Biosciences, San Jose, CA). Για την ανάλυση των κυττάρων απόπτωσης, τα κύτταρα αποκολλήθηκαν με θρυψίνη και πλύθηκαν με ψυχρό PBS. Τα επαναιωρημένα κύτταρα σε 500 μι ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης διπλό χρωματίστηκαν με ΡΙΤΟ-συζευγμένο Annexin V και ΡΙ. Μετά από 15 λεπτά επώασης σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι, τα δείγματα αναλύθηκαν αμέσως με κυτταρομετρία ροής.

Western ανάλυση κηλίδος

λύματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν με ρυθμιστικό RIPA που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης και φωσφατάσης. εκχυλίσματα Πυρηνική και κυτταροπλασματικά κυττάρου παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ ΝΕ-PER Πυρηνικής και κυτταροπλασματικά Extraction (Thermo, Rockford, USA). Ίσες ποσότητες των προϊόντων λύσης κυττάρου (25 μg) φορτώθηκαν σε 10% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF. Μετά μπλοκαρίστηκαν μεμβράνες, επωάστηκαν με μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της GSK-3 (1:500, Signalway Αντίσωμα) και φωσφόρου ΟδΚ3β Ser-9 (1:10000, Epitomics), β-κατενίνης (1:5000, Epitomics) και φωσφόρου -β-κατενίνης Ser-33/37 /Thr41 (1:1000, Cell Signaling Technology), STAT3 και φώσφορο-STAT3 Tyr705 (1:1000, Cell Signaling Technology), Akt και φώσφορο-Akt Ser473 (1:1000, Cell Signaling Τεχνολογίας), GPADH (1:5000, Bioworld Τεχνολογίας) και Lamin A /C (1:5000, Epitomics) που ακολουθείται από επώαση με συζευγμένη με υπεροξειδάση χρόνου IgGs (1:10000, Bioworld Biotechnology). πρωτεΐνες-στόχους εντοπίστηκαν από το σύστημα ECL (Millipore, Braunschweig, Γερμανία) και οπτικοποιούνται με το σύστημα ChemiDoc XRS (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

πλασμίδια και το γονίδιο επιμόλυνση

τα κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με πλασμίδια (0,1 μg /φρεάτιο για 96 φρεατίων πλάκες καλλιέργειας και πλάκες καλλιέργειας /φρεάτιο για 6 φρεατίων 2 μg) που περιέχει την αιμοσυγκολλητίνη (ΗΑ) ταμπέλα σήμα ιδιοσυστατικά ενεργή (S9A) ΟδΚ3β (πλασμίδια 14754, Addgene, Cambridge, μΑ , που κατατέθηκε από τον Δρ Jim Woodgett) και pcDNA3.0 άδειο φορέα (Invitrogene, Carlsbad CA, USA) ως έλεγχος με τη χρήση του μέσου Opti-ΜΕΜ (Gibco-BRL /Invitrogen, Carlsbad, CA) συν το αντιδραστήριο επιμόλυνσης X-tremeGENE HP DNA ( Roche, Mannheim, Germany) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Μετά από 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υποδεικνυόμενη παράγοντες για αναλύσεις Western blot και δοκιμασία πολλαπλασιασμού.

παρεμβολή RNA

Ολιγονουκλεοτίδια για ανθρώπινη κιτ STAT3 siRNA αγοράστηκαν από ΟηΟεηε (Rockville, MD , ΗΠΑ). Το κιτ περιέχει τρεις προσχεδιασμένα μεζονέτες με στόχο ένα συγκεκριμένο γονίδιο που μας ενδιαφέρει, και χρησιμοποιήσαμε μια ομάδα τριών siRNAs στόχο να εξασφαλίσει την αποδοτικότητα της εργασίας. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με STAT3 siRNA ή μη-ειδική siRNA (0,15 μg /φρεάτιο για 96 φρεατίων πλάκες καλλιέργειας και 2 μg πλάκες καλλιέργειας /φρεάτιο για 6 φρεατίων) χρησιμοποιώντας το Opti-ΜΕΜ συν αντιδραστήριο επιμόλυνσης X-tremeGENE siRNA (Roche, Mannheim, Germany ) σύμφωνα με το εγχειρίδιο οδηγιών. Μετά από 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα περαιτέρω σε επεξεργασία με xanthatin για αναλύσεις Western blot και δοκιμασία πολλαπλασιασμού.

Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad , CA, USA). Πρώτου κλώνου cDNA συντέθηκε με 1 μg συνολικού RNA χρησιμοποιώντας κιτ αντιδραστηρίου PrimeScript RT (TakaraBio, Tokyo, Japan). QRT-PCR χρησιμοποιώντας IQ

TM SYBR Green Supermix και το σύστημα ανίχνευσης σε πραγματικό χρόνο iQ5 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Η μέθοδος συγκριτικής κατώφλι κύκλου (Ct) εφαρμόστηκε για την ποσοτικοποίηση των επιπέδων έκφρασης μέσα από τον υπολογισμό του 2

– μέθοδος (ΔΔCt). Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για PCR είχαν ως εξής (με νόημα και αντινόημα, αντιστοίχως): GAPDH: cgagatccctccaaaatcaa και ttcacacccatgacgaacat? Κυκλίνη D1: gtgctgcgaagtggaaacc και atccaggtggcgacgatct? c-Myc: taccctctcaacgacagcag και tcttgacattctcctcggtg? Bcl-2: gtggagagcgtcaaccgggaga και gggccgtacagttccacaaaggc? ΧΙΑΡ: cgagcagggtttcttttatactgg και tgtagactgcgcgtggcact. τιμές ενίσχυση cDNAs και σχετική έκφραση ελήφθησαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η ανοσοκυτταροχημεία

Μετά την Α549 κύτταρα σε γυάλινες καλυπτρίδες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υποδεικνύεται παράγοντες, αυτοί έχουν καθορισθεί από τον προ-κρύα ακετόνη, κατόπιν ξεπλύθηκαν τρεις φορές με PBS. Τα κύτταρα κατέστησαν περατά σε 0.1% Triton Χ-100 και επωάστηκαν με 1% BSA /PBS για να εμποδίσει μη ειδική σύνδεση. Ακολούθως, τα κύτταρα ανοσοχρώση με επώαση με μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού έναντι β-κατενίνης (αραιωμένο 1:500, Epitomics) όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Μετά από πλύση με PBS, τα κύτταρα επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα αντι-κουνελιού συζευγμένο με FITC κατσίκας (αραιωμένο 1:60, Boster Biotechnology, Wuhan, Κίνα). Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με Hoechst 33258 (BioTime Biotech, Haimen, Κίνα). Εικόνες ελήφθησαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό απεικόνισης ZEN 2011 σε ένα Zeiss αναστρέψει μικροσκόπιο (CarlZeiss, Hallbergnoos, Γερμανία) με 400-πλάσια μεγέθυνση.

Η διπλή λουσιφεράσης δοκιμασία γονιδιακής

Τα κύτταρα σε 96 και πλάκες καλλιέργειας επιμολύνθηκαν παροδικά με 0.1 μg /φρεάτιο ρ-STAT3-TA-Luc πλασμίδια ανταποκριτές (BioTime Biotech, Haimen, Κίνα) ή TCF /LEF-απόκρισης λουσιφεράσης (Luc2P /TCF-LEF /Hygro, Promega, Madison, WI, USA ). Η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης ομαλοποιήθηκε με πλασμίδια αναφοράς λουσιφεράσης Renilla. Μετά από 18 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υποδεικνυόμενη παράγοντες. Σχετική δραστικότητα προαγωγού μετρήθηκε με σύστημα ανταποκριτή (DLR) δοκιμασία διπλής λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας το Glomax 96 Microplate φωτόμετρο (Promega, Madison, WI, USA). Για πειράματα συν-επιμόλυνση, τα κύτταρα σε πλάκες καλλιέργειας των 96 φρεατίων συν-επιμολύνθηκαν με STAT3 siRNA (0,08 μg /φρεάτιο), στόχος και ο έλεγχος πλασμίδια ανταποκριτές (0,15 μg /φρεάτιο σε συνολικό) για 24 ώρες και στη συνέχεια κατεργάζεται με ενδεικνυόμενη παράγοντες, τότε υποβλήθηκαν σε δοκιμασία DLR.

η στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± SD. Οι διαφορές στα αποτελέσματα των δύο ομάδων αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας είτε δύο ουρών του Student t test ή μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από

δοκιμή post hoc

Dunnett. Οι διαφορές με το

P

& lt?. 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

Xanthatin αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των NSCLC

Για να αποκτήσετε πρόσβαση στις αντικαρκινικές δραστηριότητες xanthatin , χρησιμοποιήθηκαν τέσσερις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές NSCLC Α549, H1975, H1650 και HCC827, καθώς και φυσιολογικά (μη νεοπλασματικά) ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα BEAS-2Β. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, βρήκαμε xanthatin ανέστειλε πολλαπλασιασμό NSCLC σε μία δόση και το χρόνο απόκρισης τρόπο. IC

50 τιμές από κάθε κυτταρική γραμμή καρκίνου και χρόνο επώασης υπολογίστηκαν, δείχνοντας ότι xanthatin ασκείται 50% αναστολή κάτω των 20 μΜ μετά από θεραπεία 48 ώρες. Σημειώσαμε επίσης την ανασταλτική επίδραση στην κανονική βρογχικών επιθηλιακών κυττάρων διατηρούνται σε υψηλές συγκεντρώσεις micromolar από την επίδραση των ισοδύναμων δόσεων και ο χρόνος επώασης του xanthatin σε NSCLC. Αντιπροσωπευτικές εικόνες της μορφολογίας των κυττάρων έδειξαν ότι xanthatin σκότωσε επιλεκτικά τα καρκινικά κύτταρα και όχι τα φυσιολογικά κύτταρα (Εικόνα 1Β). Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν ότι xanthatin έχει καθολική αντικαρκινική δράση σε NSCLC χωρίς εμφανή φυσική τοξικότητα.

(Α) NSCLCs (Α549, H1975, HCC827, κύτταρα H1650) και ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα (BEAS-2Β) εκτέθηκαν να δεικνυόμενες συγκεντρώσεις xanthatin (1, 5, 10, 20, 40 μΜ) για 24 ώρες και 48 ώρες, αντίστοιχα. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με δοκιμασία πολλαπλασιασμού κυττάρων Μια λύση. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD. Οι τιμές εκφράζονται ως εκατοστιαία αναλογία των βιώσιμων κυττάρων κανονικοποιήθηκε με το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων σε 0.5% των κυττάρων DMSO-θεραπεία. Η συγκέντρωση των xanthatin με αποτέλεσμα 50% αναστολή της ανάπτυξης ελέγχου (IC

50) ήταν υπολογίζονται SPSS λογισμικού στατιστικά χρησιμοποιώντας το μοντέλο probit. (Β) Εκπρόσωπος εικόνες της μορφολογίας των κυττάρων σε κύτταρα BEAS-2B και H1975 ελήφθησαν μετά από 48 ώρες θεραπείας με ή χωρίς 20 μΜ xanthatin (100 ×, γραμμή κλίμακας αντιπροσωπεύει 200 ​​μm).

Η

Xanthatin αναστέλλει επιλεκτικά η ενεργοποίηση της STAT3 παρά ΟδΚ3β σε NSCLC

επόμενο αξιολογηθεί κατά πόσο αρνητική ρύθμιση της ΟδΚ3β και STAT3 δραστηριότητας ήταν παράλληλη με τις αντικαρκινικές επιδράσεις του xanthatin. Εμείς αγωγή NSCLC με διάφορες συγκεντρώσεις xanthatin (1, 5, 10, 20 και 40 μΜ) για 6 ώρες, ή 20 μΜ xanthatin εντός 12 ωρών. Η ανάλυση στυπώματος Western έδειξε ότι xanthatin δοσοεξαρτώμενο αυξάνουν την φωσφόρου-ΟδΚ3β (Ser9) και μειώνουν την φωσφόρου-STAT3 (Tyr705) χωρίς το συνολικό επίπεδο πρωτεΐνης άλλαξε το Α549, H1975, H1650 και HCC827 κύτταρα (Σχήμα 2Α). Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι xanthatin ισχυρά καταργηθεί δραστηριότητα STAT3 σε 30 λεπτά, αλλά φωσφορυλιωμένη ΟδΚ3β άρχισε να αυξάνει μετά από 2 ώρες σε θεραπεία Α549 και H1975 κυττάρων (Σχήμα 2Β), γεγονός που υποδηλώνει ότι xanthatin πρωτίστως κατέστειλε STAT3 αντί ΟδΚ3β. Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι η απενεργοποίηση των δύο ΟδΚ3β και STAT3 εμπλέκεται στα κυτταρικά γεγονότα που προκαλούνται από xanthatin.

(Α) NSCLCs (Α549, H1975, HCC827, κύτταρα H1650) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις xanthatin ( 1, 5, 10, 20, 40 μΜ) για 6 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε στύπωμα Western για τη μέτρηση των επιπέδων της πρωτεΐνης του φωσφόρου ΟδΚ3β (Ser9), t-GSK3, φωσφόρου STAT3 (Tyr705) και STAT3 αντίστοιχα. (Β) Α549 και H1975 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 20 μΜ xanthatin για διάφορα χρονικά (0-12 h) και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε στύπωμα Western για τη μέτρηση των επιπέδων της πρωτεΐνης του φωσφόρου ΟδΚ3β (Ser9), GSK-3, φωσφόρου-STAT3 (Tyr705 ) και STAT3 αντίστοιχα.

η

Απενεργοποίηση της ΟδΚ3β και STAT3 είναι δύο αλληλοαποκλειόμενες γεγονότα στην xanthatin-κυτταρικό θάνατο που επάγεται

Για να επιβεβαιώσετε τη σχέση μεταξύ των δύο μοριακά γεγονότα που προκαλούνται από xanthatin και το δυναμικό μηχανισμοί που διέπουν την ευαισθησία του xanthatin-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο, εξετάσαμε αν τα γνωστά ΟδΚ3β-ειδική κινάση αναστολείς, LiCI (μη-ανταγωνιστικός της ΑΤΡ αναστολέας) και SB216763 (ΑΤΡ-ανταγωνιστικός αναστολέας) [18] θα μπορούσε να δημιουργήσει παρόμοια αντικαρκινική δράση και ενισχύουν την αντικαρκινική απόκριση xanthatin. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, βρήκαμε δύο από 20 mM LiCl και 20 μΜ SB 216763 αυξήθηκε ΟδΚ3β αδρανοποίηση και η επίδραση ενισχύεται σημαντικά με xanthatin. Είναι ενδιαφέρον ότι, σε αντίθεση με LiCl, SB216763 θα μπορούσε όχι μόνο να αυξήσει την φωσφορυλίωση της βασικής ΟδΚ3β αλλά και την υποβάθμιση των συνολικών GSK-3 σε Α549 και H1975 NSCLC, η οποία ήταν από τις προσδοκίες μας. Ωστόσο, φαρμακολογικές αναστολείς ΟδΚ3β απέτυχε να επηρεάσει το επίπεδο φωσφόρου-STAT3. Για να διερευνηθεί περαιτέρω αν η ΟδΚ3β αδρανοποίησης θα μπορούσαν να έχουν επιπτώσεις στην επιβίωση των κυττάρων, βρήκαμε ότι ο πολλαπλασιασμός των Α549 και H1975 κυττάρων ανεστάλη έντονα από τους αναστολείς της ΟδΚ3β μόνο του ή σε συνδυασμό με xanthatin για 24 θεραπεία h, και φυσιολογικά ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα επηρεάστηκαν ασθενώς από αναστολείς ΟδΚ3β με ή χωρίς xanthatin (Σχήμα 3Β).

(Α) και Α549 H1975 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,5% DMSO ή 20 μΜ xanthatin συν-επωάστηκαν με ή χωρίς 20 mM LiCl ή 20 μΜ SB216763 για 6 ώρες . Τα δείγματα πρωτεΐνης υποβλήθηκαν σε κηλίδα Western για τη μέτρηση φωσφόρου-ΟδΚ3β (Ser9), η GSK-3, φώσφορο-STAT3 (Tyr705) και STAT3. (Β) NSCLC (Α549, H1975 κύτταρα) και BEAS-2Β εκτέθηκαν σε 0,5% DMSO ή 20 μΜ xanthatin συν-επωάστηκαν με ή χωρίς 20 mM LiCl ή 20 μΜ SB216763 για 24 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD (Για ενδεικνυόμενη συγκρίσεις, *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01). (Γ) έλεγχος siRNA ή siRNA κατά STAT3 επιμολύνθηκαν σε κύτταρα Α549 (2 μg siRNA ανά φρεάτιο). Μετά από 24 ώρες μετά επιμολύνσεις, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με με ή χωρίς 20 μΜ xanthatin για 6 h μετά με κηλίδα Western για τη μέτρηση φωσφόρου ΟδΚ3β (Ser9), GSK-3, φωσφόρου-STAT3 (Tyr705) και STAT3. (D) Έλεγχος siRNA ή siRNA κατά STAT3 επιμολύνθηκαν σε κύτταρα Α549 (0.15 μg siRNA ανά φρεάτιο). Μετά από 24 ώρες μετά επιμολύνσεις, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με με 10 ή 20 μΜ xanthatin για περαιτέρω 24 ώρες και υποβλήθηκαν σε δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD. Για υποδεικνύεται συγκρίσεις, *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt?. 0.01

Η

Θα χρησιμοποιηθεί επίσης siRNA να περιορίσει τη λειτουργία STAT3 σε κύτταρα Α549 ως μια εκτεταμένη επικύρωση. Η ανάλυση στυπώματος Western επιβεβαίωσε σημαντική καταστολή του φωσφόρου STAT3 και συνολική έκφραση STAT3 με στόχο siRNA, τα οποία παράγονται προσθετική αναστολή της δραστηριότητας STAT3 με την παρουσία xanthatin. Ωστόσο, STAT3 siRNA επίσης απέτυχε να μεταβάλλει τη δραστικότητα της ΟδΚ3β σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με έλεγχο siRNA (Σχήμα 3C). Επιπλέον, σίγηση της STAT3 ενισχύσει την ικανότητα των xanthatin να μειώσει την ανάπτυξη των κυττάρων Α549 μετά από 24 ώρες θεραπείας (Σχήμα 3D). Συνολικά, είναι εύλογο να συναχθεί το συμπέρασμα ότι η απόφραξη της ΟδΚ3β και STAT3 δραστηριότητες εμπλέκεται στα αντιπολλαπλασιαστικά αποτελέσματα της xanthatin, αλλά τα δύο γεγονότα δεν είναι αιτιολογικά συνδεδεμένα.

Η φαρμακολογική αναστολή της ΟδΚ3β ενισχύει εν μέρει xanthatin που προκαλείται από κύτταρο σύλληψης και απόπτωση

για την επιβεβαίωση των ενισχυμένων αντικαρκινικές δράσεις από αντι-GSK-3 σε κύτταρα xanthatin εκτεθειμένες οφειλόταν σε μη ισορροπημένη πολλαπλασιασμό των κυττάρων ή απόπτωση, μπορούμε στη συνέχεια παρακολουθείται διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης αποκρίσεις με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής σε κύτταρα Α549. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α και 4C, 20 μΜ xanthatin και 20 mM LiCl θα μπορούσε να επάγει ισχυρά κύτταρα να υποβληθούν σε G2 /M σύλληψης μετά τη θεραπεία 24 ώρες (από 10.56-31.42% και 10,56 έως 30,27%, αντίστοιχα), η οποία συνοδεύεται από μείωση σε G1 φάση (από 69.26-41.21% και 69,26 έως 50,33%, αντίστοιχα). Σε αντίθεση με LiCl, 20 μΜ SB216763 επηρεάζονται λιγότερο ευδιάκριτα G2 /διανομής Μ σε Α549 κύτταρα (από 10.56-15.07%), που ήταν παράλληλη με την προηγούμενη έκθεση [8]. Όταν συν-επωάζονται xanthatin με αναστολείς οι δύο ΟδΚ3β, σημαντική αύξηση των κυττάρων σε G2 /M φάση εμφανίστηκε από LiCl, αλλά δεν SB216763. Τα κύτταρα επίσης χρωματίστηκαν με αννεξίνη V /PI για ανάλυση απόπτωσης. Κύτταρα Α549 επέδειξε μία σαφή απόπτωση μετά από παρατεταμένη έκθεση (48 ώρες) με xanthatin (58,8%), LiCI (54,6%), και SB216763 (48,1%), αντίστοιχα. Επιπλέον, σε συνδυασμό με xanthatin SB216763 επαυξημένης περισσότερο αποπτωτικά κύτταρα από LiCI (96,2% έναντι 71,9%) (Σχήμα 4Β και 4D). Στο σύνολό τους, η αναστολή της ΟδΚ3β είναι πιθανώς υπεύθυνη για xanthatin επαγόμενη διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης.

(Α) κύτταρα Α549 εκτέθηκαν σε 0,1% DMSO ή 20 μΜ xanthatin συν-επωάστηκαν με ή χωρίς 20 mM LiCl ή 20 μΜ SB216763 για 24 ώρες και στη συνέχεια χρωματίζονται με προπίδιο iodidle για την ανίχνευση του κυτταρικού κύκλου με κυτταρομετρία ροής. (Β) κύτταρα Α549 εκτέθηκαν σε 0,1% DMSO ή 20 μΜ xanthatin συν-επωάστηκαν με ή χωρίς 20 mM LiCl ή 20 μΜ SB216763 για 48 ώρες και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με προπίδιο iodidle και Αηηβχίην-FITC για την ανίχνευση της απόπτωσης με κυτταρομετρία ροής. (Γ) Τα ποσοτικά δεδομένα (/M φάσεις Ο0-G1, S και G2) του κυτταρικού κύκλου που προέρχονται από μέσο όρο τριπλών προσδιορισμών και παρουσιάζεται ως μέση τιμή ± SD. Για υποδεικνύεται συγκρίσεις, *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01. (Δ) Συνολική ποσοστά των αποπτωτικών κυττάρων συνοψίστηκαν από το κάτω δεξιά τεταρτημόριο του κυττάρου ενεργοποιημένων με φθορισμό διαλογή ιστογράμματα (ποσοστό πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων) και πάνω δεξιά τεταρτημόριο (ποσοστό αργά αποπτωτικών κυττάρων). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD. Για ενδεικνυόμενη συγκρίσεις, *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt?. 0.01

Η

αναστολή της ΟδΚ3β είναι απαραίτητη για την αντικαρκινική δράση των xanthatin

Για να μελετηθεί άμεσα είτε απενεργοποίηση του ΟδΚ3β συσχετίζεται με xanthatin-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο, εμείς παροδικά επιμολυσμένα κύτταρα Α549 με ένα ιδιοσυστατικά ενεργό (S9A) κατασκεύασμα της ΟδΚ3β. Όπως βρήκαμε, έκτοπη έκφραση μόνιμα ενεργών ΟδΚ3β εξασθένησε την φωσφορυλίωση της ΟδΚ3β με xanthatin, αλλά ακόμα απέτυχε να μεταβάλλει τα επίπεδα της STAT3 σηματοδότηση σε κύτταρα Α549 (Εικόνα 5Α), η οποία έδειξε περαιτέρω ότι η αναστολή της ΟδΚ3β με xanthatin δεν έγινε επίκληση αναστολής του STAT3. Όπως ήταν αναμενόμενο, η υπερέκφραση μόνιμα ενεργών ΟδΚ3β παρείχε αντίσταση στα αντικαρκινικά δραστηριότητες του xanthatin στο χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 5Β). Εκτός αυτού, είναι βαθύτατα ΟδΚ3β εμπλέκονται στη διαφυγή απόπτωση και την αδρανοποίηση του είναι ένα ανάντη εκδήλωση της γενιάς αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) [19,20]. Για το σκοπό αυτό, παρατηρήσαμε ότι xanthatin-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο εμποδίστηκε εντελώς παρουσία ενός ισχυρού αντιοξειδωτικού και ROS καθαριστή Ν-ακετυλο κυστεϊνη (NAC) (Σχήμα 5C). Επιπλέον, NAC εξασθενημένο πλήρως φωσφορυλίωση της ΟδΚ3β με xanthatin (Σχήμα 5D), η οποία κατέδειξε το ρόλο της αναστολής της ΟδΚ3β με xanthatin σε ROS μεσολάβηση κυτταρικό θάνατο. Συνολικά, τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι η αναστολή της ΟδΚ3β είναι απαραίτητη για την αντικαρκινική δράση του xanthatin μέσω ROS.

(Α) κύτταρα Α549 σπάρθηκαν σε 6 πλάκα καλά επιμολύνθηκαν με HA-tagged ιδιοσυστατικά ενεργή (S9A) -GSK3β ή άδειο διάνυσμα (2 μg πλασμιδικού DNA ανά φρεάτιο). Μετά από 48 ώρες μετά επιμολύνσεις, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς 20 μΜ xanthatin για 6 ώρες, στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε στύπωμα Western για τη μέτρηση των επιπέδων της πρωτεΐνης του ΗΑ ετικέτα, φωσφόρου STAT3 (Tyr705) και STAT3 αντίστοιχα. κύτταρα (Β) Α549 σπάρθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων επιμολύνθηκαν με HA-tagged ιδιοσυστατικά ενεργή (S9A) -GSK3β ή κενού φορέα (0,1 μg πλασμιδικού DNA ανά φρεάτιο). Μετά από 48 ώρες μετά επιμολύνσεις, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 ή 20 μΜ xanthatin για 24 ώρες και 48 ώρες αντίστοιχα, τότε υποβλήθηκαν σε δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Για υποδεικνύεται συγκρίσεις, *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01. (Γ) Κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 ή 20 μΜ xanthatin σε παρουσία ή απουσία 1 mM NAC για 48 ώρες, στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων. (D) Κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 ή 20 μΜ xanthatin σε παρουσία ή απουσία 1 mM NAC για 6 ώρες, στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε στύπωμα Western για τη μέτρηση των επιπέδων της πρωτεΐνης του φωσφόρου ΟδΚ3β (Ser9) και GSK-3, αντίστοιχα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται αντιπροσωπεύονται ως μέση τιμή ± SD. Για υποδεικνύεται συγκρίσεις, *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt?. 0.01

Η

Xanthatin αποτυγχάνει να προκαλέσει γενική μετα-μεταγραφική δραστηριότητα της β- κατενίνης σε απάντηση της ΟδΚ3β αδρανοποίηση

για να αξιολογηθεί ενδελεχώς την πιθανότητα ότι xanthatin μπορεί να προκαλέσει επιβλαβείς συνέπειες που οφείλεται στην αναστολή της ΟδΚ3β μέσω προς τα πάνω ρύθμιση της β-κατενίνης μεσολαβεί δραστηριότητα μεταγραφής και έκφρασης ογκογονιδίων, στόχος μας ήταν να εξετάσει το ενδοκυτταρικό καταρράκτη σηματοδότησης σε απάντηση στην τόνωση της xanthatin και αναστολέα ΟδΚ3β. Όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 6Α, θεραπεία με 20 μΜ xanthatin για 12 ώρες μετά βίας επαγόμενη ευρεία πυρηνική μετατόπιση του β-κατενίνης, ενώ LiCl μόνος καθίστανται σταθερότητα β-κατενίνης και τη γενική πυρηνική διανομή. Συν-επώαση των δύο παραγόντων που προκαλούνται πιο σοβαρό περιστατικό, αλλά ο αριθμός των κυττάρων ήταν σημαντικά μειωμένη. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η μεταβολή της δραστικότητας προαγωγού από ενεργοποιημένα β-κατενίνης χρησιμοποιώντας λουσιφεράσης κατασκεύασμα με στοιχείο απόκρισης LEF /TCF, το οποίο εμπλέκεται σε μεταγραφή DNA πρόσδεση του β-κατενίνης για τη μελέτη Wnt ενεργοποίηση. Βρήκαμε ότι xanthatin δοσοεξαρτώμενο αυξημένη (0-10 μΜ), αλλά μειώθηκε (20-40 μΜ) την προ-μεταγραφική δραστικότητα του Wnt /β-κατενίνης με ή χωρίς 20 mM ϋΟΙ μετά από 6 ώρες επώασης (Σχήμα 6Β). Ερευνήσαμε περαιτέρω το χρόνο κινητική πορεία χαρακτηρισμό των 20 μΜ xanthatin σχετικά με τη δραστηριότητα της λουσιφεράσης β-κατενίνης-LEF /TCF. Xanthatin προκάλεσε μια εξαρτώμενη από το χρόνο ενεργοποίησης του γονιδίου αναφοράς μέσα σε 2 ώρες αλλά μετά από αυτό, το μέγιστο αποτέλεσμα άρχισε να μειώνεται μέσα σε 6 ώρες. Τα στοιχεία αυτά επιβεβαιώνουν ότι xanthatin έχει τη δυνατότητα να ενεργοποιήσει β-κατενίνης /Wnt, αλλά αυτό το περιστατικό δεν είναι σταθερή.

(Α) κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με όχημα, 20 μΜ xanthatin, 20 mM LiCl ή 20 mM LiCl συν 20 μΜ xanthatin για 12 ώρες, στη συνέχεια τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα εναντίον β-κατενίνης. Α549 κύτταρα ανοσοχρώση με δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με FITC αντι-κουνελιού και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με Hoechst 33258. Τα δείγματα οπτικοποιήθηκαν και φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού (400 ×, γραμμή κλίμακας αντιπροσωπεύει 50 μm). Μπλε απεικονίζει τον πυρήνα και το πράσινο απεικονίζει εντοπισμός της β-κατενίνης. (Β) Α549 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 70-90% συρροή συν-επιμολύνθηκαν με Luc2P /TCF-LEF /Hygro και λουσιφεράσης Renilla (0.1 μg πλασμιδίου DNA ανά φρεάτιο συνολικά) επί 18 ώρες, ακολούθως sitimulated με όχημα, 20 mM LiCl ή 20 mM LiCl συν 1, 5, 10, 20 και 40 μΜ xanthatin για 6 ώρες. Τα κυτταρολύματα έγιναν με δοκιμασία DLR, και ο λόγος της λουσιφεράσης της πυγολαμπίδας να Renilla (σχετική λουσιφεράσης) δραστηριότητα προσδιορίστηκε. Για υποδεικνύεται συγκρίσεις, *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01. N.s, μη σημαντική. (Γ) Κύτταρα Α549 αναπτύχθηκαν σε 70-90% συρροή συν-επιμολύνθηκαν με Luc2P /TCF-LEF /Hygro και λουσιφεράσης Renilla (0.1 μg πλασμιδίου DNA ανά φρεάτιο συνολικά) για 18 ώρες, στη συνέχεια διεγέρθηκαν με 20 μΜ xanthatin για 0 -6 h. Τα κυτταρολύματα έγιναν με τη δοκιμασία DLR, **

P

& lt? 0,01 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. (D) Κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς 20 μΜ xanthatin για 12 ώρες και στη συνέχεια εκχυλίστηκαν συνολικό RNA. CyclinD1, c-myc, Bcl-2, τα επίπεδα ΧΙΑΡ mRNA προσδιορίστηκαν με τη βοήθεια ποσοτικής PCR πραγματικού χρόνου και κανονικοποιήθηκε ως προς το επίπεδο του GAPDH mRNA. Οι φορές αλλαγές της έκφρασης mRNA του υποδεικνύεται γονιδίων συγκρίθηκαν ως αναλογία με τον έλεγχο του οχήματος. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD του τριπλούν πειραμάτων. **

P

& lt? 0,01 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. (Ε) Κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς 20 μΜ xanthatin για 6 ώρες. Κυτταροπλασματικά (Cyto.) Και πυρηνική (Αρ.) Εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε στύπωμα Western για τη μέτρηση των επιπέδων της πρωτεΐνης του β-κατενίνης, φωσφόρου ΟδΚ3β (Ser9), GSK-3, φωσφόρου-STAT3 (Tyr705) και STAT3 αντίστοιχα.

η

Στη συνέχεια, θα καθορίσει τα επίπεδα mRNA των τεσσάρων αντιπροσωπευτικών γονιδίων στόχων Wnt από PCR δοκιμασία ποσοτικά σε πραγματικό χρόνο.