Αφηρημένο

Αυτή η μελέτη εξετάζει το ρόλο της s-νιτροσυλίωση στην ανάπτυξη του καρκίνου των ωοθηκών χρησιμοποιώντας βάση κυτταρική καλλιέργεια και

στο vivo

προσεγγίσεις. Χρησιμοποιώντας τον παράγοντα nitrosylating, S-νιτροζογλουταθειόνη (GSNO), μία φυσιολογική μόριο νιτρικού οξειδίου, δείχνουμε ότι η αγωγή GSNO ανέστειλαν τον πολλαπλασιασμό των chemoresponsive και στη χημειοθεραπεία του καρκίνου κυτταρικές γραμμές ωοθηκών (Α2780, C200, SKVO3, ID8, OVCAR3, OVCAR4, OVCAR5, OVCAR7, OVCAR8, OVCAR10, PE01 και ΠΕ04) με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. θεραπεία GSNO κατήργησε αυξητικού παράγοντα (ΗΒ-EGF) που επάγεται μεταγωγής σήματος συμπεριλαμβανομένων φωσφορυλίωση της Akt, ρ42 /44 και STAT3, που είναι γνωστό ότι παίζουν κρίσιμους ρόλους στην ανάπτυξη καρκίνου των ωοθηκών και της εξέλιξης. Για να εξεταστεί η θεραπευτική δυνατότητα του GSNO

in vivo

, γυμνούς ποντικούς που φέρουν ενδο-περιτοναϊκή ξενομοσχεύματα ανθρώπινων κυτταρική γραμμή καρκινώματος ωοθηκών Α2780 (2 × 10

6) χορηγήθηκαν από το στόμα GSNO σε δόση 1 mg /kg σωματικού βάρους. Καθημερινή στοματική χορήγηση του GSNO εξασθενημένων σημαντικά μάζα του όγκου (ρ & lt? 0.001) στην περιτοναϊκή κοιλότητα σε σύγκριση με όχημα (φωσφορικό αλατούχο ρυθμιστικό διάλυμα) ομάδα κατεργασία σε 4 εβδομάδες. GSNO ενισχύεται επίσης με τη μεσολάβηση cisplatin τοξικότητα του όγκου σε ένα Α2780 ωοθήκης καρκίνωμα μοντέλο γυμνού ποντικού. ικανότητα nitrosylating GSNO ήταν αντανακλάται στην επαγόμενη νιτροσυλίωση διαφόρων γνωστών πρωτεϊνών που περιλαμβάνουν ΝΡκΒ ρ65, Akt και EGFR. Ως νέο εύρημα, παρατηρήσαμε ότι GSNO επάγεται επίσης νιτροσυλίωση με αντίστροφη σχέση στο τυροσίνης 705 φωσφορυλίωση STAT3, μια καθιερωμένη παίκτης στην χημειοαντίσταση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου των ωοθηκών και του καρκίνου γενικά. Συνολικά, η μελέτη μας υπογραμμίζει τη σημασία του S-νιτροσυλίωση βασικών καρκίνο προώθηση πρωτεΐνες στη ρύθμιση του καρκίνου των ωοθηκών και προτείνει το θεραπευτικό δυναμικό των παραγόντων nitrosylating (όπως GSNO) για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών μόνη της ή σε συνδυασμό με χημειοθεραπευτικά φάρμακα.

Παράθεση: Giri S, μπαστούνι R, Deshpande Μ, Maguire JL, Johnson Ζ, Graham RP, et al. (2014) Τα προκλινικά θεραπευτικές δυνατότητες του ενός Nitrosylating παράγοντας στη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών. PLoS ONE 9 (6): e97897. doi: 10.1371 /journal.pone.0097897

Επιμέλεια: Chih-Pin Chuu, Εθνική Έρευνα Υγείας Ινστιτούτα, την Ταϊβάν

Ελήφθη: 7 Ιαν του 2014? Αποδεκτές: 24, Απρ 2014? Δημοσιεύθηκε: δεύτερης, Ιουνίου 2014

Copyright: © 2014 Giri et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίζεται από επιχορήγηση Marsha Rivkin Μελετητής και Υπουργείο άμυνας βραβείο OCRP W81XWH-12-1-0270 στην SG. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών (OVCA) είναι η πέμπτη πιο κοινή αιτία θανάτου από όλες τις μορφές καρκίνου μεταξύ των γυναικών στις Ηνωμένες Πολιτείες και την κύρια αιτία θανάτου από γυναικολογικό κακοήθειες [1]. Τα υψηλά ποσοστά θνησιμότητας που σχετίζεται με OVCA οφείλεται στην πλειοψηφία των ασθενών (75%) παρουσιάζουν εκτεταμένη (στάδιο III ή μεγαλύτερο) νόσου κατά τη στιγμή της διάγνωσης [2]. Η κακή επιβίωση 5-χρόνου (30%) οφείλεται στο γεγονός ότι οι περισσότεροι OVCA είναι ακατάλληλο για χρήση κατά τη στιγμή της διάγνωσης. Εάν ανιχνευθεί νωρίς, πάνω από το 90% των ασθενών έχουν καλύτερη πρόγνωση και ανταποκρίνονται σε θεραπεία σε σύγκριση με τους ασθενείς με προχωρημένο στάδιο της νόσου. Ως εκ τούτου, η καλύτερη κατανόηση των βασικών μοριακών γεγονότων που παίζουν σημαντικό ρόλο στην OVCA μπορεί να οδηγήσει σε καλύτερη διάγνωση και τη θεραπεία.

S-νιτροζογλουταθειόνη (GSNO) είναι ένας παράγοντας nitrosylating οποία μεσολαβεί η μετα-μεταφραστική διαδικασία της S-νιτροσυλίωση στις πρωτεΐνες που προκύπτουν σε διαμόρφωση της δράσης τους. S-νιτροσυλίωση είναι ένα σημαντικό βιολογικό αντίδραση του μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ) και αναφέρεται στην μετατροπή των ομάδων θειόλης, συμπεριλαμβανομένων των υπολειμμάτων κυστεΐνης σε πρωτεΐνες, για να σχηματίσει δ-Νιτροδοθειόλες. Είναι ένας μηχανισμός για τη δυναμική μεταμεταφραστική ρύθμιση των περισσότερων ή όλων των σημαντικών κατηγοριών των πρωτεϊνών και είναι ανεξάρτητη από ένζυμο κατάλυσης, ασταθή τροποποίηση, διακόπτη on /off-όπως φωτοφωσφορυλίωση [3]? Ωστόσο, μπορεί να είναι denitrosylation ενζυματική ή μη-ενζυματική. Ένας αυξανόμενος αριθμός πρωτεϊνών έχουν βρεθεί να υποβληθούν σε S-νιτροσυλίωση

in vivo,

ονομάζεται δ-Νιτροδοθειόλες, και παίζουν ένα σημαντικό ρόλο σε διάφορες διεργασίες που κυμαίνονται από τη μεταγωγή σήματος, την επιδιόρθωση του DNA, την άμυνα του ξενιστή, και η αρτηριακή πίεση ελέγχου για την ρύθμιση του καναλιού ιόντων και νευροδιαβίβαση [3]. Ωστόσο, ο ρόλος του S-νιτροσυλίωση στην ανάπτυξη και εξέλιξη OVCA δεν έχει μελετηθεί.

Αυτή η μελέτη σχεδιάστηκε για να εξετάσει το θεραπευτικό αποτέλεσμα ενός nitrosylating παράγοντα (GSNO) σε OVCA χρησιμοποιώντας τα

in vitro

και

in vivo

μοντέλα και να εξετάσει το ρόλο των νιτροσυλίωση σε OVCA.

Μέθοδοι

Αντιδραστήρια και αντισώματα

GSNO αγοράστηκε από το Παγκόσμιο Όργανα ακριβείας (Sarasota, FL) και η καθαρότητα του είναι & lt? 98%. Τα ακόλουθα αντισώματα φωσφο-STAT3 (Y705) (Cat # 9145, που χρησιμοποιείται στο 1:1000), pAkt (Ser473) (Cat # 4060, που χρησιμοποιείται στο 1:1000), ρ-Ρ42 /44 (Thr202 /Tyr204) (Cat # 4370, το οποίο χρησιμοποιείται σε 1:1000), STAT3 (Cat # 9139, που χρησιμοποιούνται σε 1:1000), Akt (Cat # 4685, που χρησιμοποιούνται σε 1:1000), Ρ42 /44 (Cat # 9107, που χρησιμοποιούνται σε 1:1000) ήταν από τη Cell Signaling (Danvers, ΜΑ). Βήτα-ακτίνη (β-ακτίνη) αγοράστηκε από την Sigma (St. Louis, ΜΟ). Ορό εμβρύου βοός αγοράστηκε από BioAbChem (Ladson, SC). Ανασυνδυασμένη STAT3 αγοράστηκε από SignalChem (Richmond, Καναδάς).

Cell Culture

Ανθρώπινο OVCA κυτταρικής σειράς SKOV3 και OVCARs ήταν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). Α2780, C200 και OVCAR4 κυτταρικές γραμμές ήταν ένα είδος δώρο από τον Dr. Tom Hamilton (Αντικαρκινικού Κέντρου Fox Chase) [4]. PE01 και ΠΕ04 ήταν ένα είδος δώρο από τον Δρ Taniguchi (University of Washington, Seattle) [4]. Όλες οι κυτταρικές σειρές OVCA διατηρήθηκαν και καλλιεργήθηκαν σε πλήρες Roswell Park Memorial Institute (RPMI)

μέσο που περιέχει 10% ορό και αντιβιοτικά εμβρύου βοός.

Ζώα

Δήλωση Ηθικής.

Έξι – έως οκτώ εβδομάδων θηλυκών γυμνών ποντικών ηλικίας αγοράστηκαν από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου-Frederick Cancer Research and Development Center (Frederick, MD). Όλα τα ποντίκια στεγάστηκαν και διατηρήθηκαν υπό ειδικές συνθήκες σε εγκαταστάσεις στη Mayo Clinic στο Rochester, MN. Οι εγκαταστάσεις που εγκρίνονται και επιθεωρούνται από την Αμερικανική Ένωση για τη Διαπίστευση του Εργαστηρίου Φροντίδα Ζώων (AAALAC Διαπίστευσης # 000717) και σύμφωνα με τους ισχύοντες κανονισμούς και τα πρότυπα του Τμήματος Γεωργίας, του Υπουργείου Υγείας και Ανθρωπίνων Υπηρεσιών των ΗΠΑ ΗΠΑ, και τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγεία. Όλες οι μελέτες εγκρίθηκαν και εποπτεύεται από το Θεσμικό Animal Care and Use Επιτροπή Mayo Clinic (IACUC) με αριθμό πρωτοκόλλου A13909.

Τα ποντίκια διατηρήθηκαν σύμφωνα με Θεσμικών IACUC εγκεκριμένο πρωτόκολλο. Α2780 κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές και επανεναιωρήθηκαν σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) σε 2 × 10

6/100 μΐ και εγχέεται στο ενδοπεριτοναϊκή κοιλότητα του γυμνών ποντικών (ημέρα 0). Η θεραπεία με GSNO (1 mg /kg σωματικού βάρους) ξεκίνησε 3 ημέρες μετά τον εμβολιασμό των κυττάρων. GSNO χορηγήθηκε από του στόματος καθετηριασμό σε 0.1 mL όγκου χρησιμοποιώντας μια 20 gauge βελόνα τροφοδοσίας με διάμετρο μπάλα από 2,25 mm (Braintree Scientific, ΜΑ). Η ομάδα ελέγχου έλαβε PBS ως όχημα. Οι ποντικοί παρακολουθούνταν καθημερινά για οποιαδήποτε ενόχληση και ζυγίζονται κάθε τρίτη ημέρα για να ελέγξει για την ανάπτυξη του όγκου. Για τις μελέτες συνδυασμού, θεραπεία σισπλατίνης (4 mg /kg σωματικού βάρους) με ενδοπεριτοναϊκές ενέσεις δόθηκε την ημέρα 7, 14 και 21, μαζί με θεραπεία GSNO όπως περιγράφεται ανωτέρω (ημέρα 0 ελήφθη ως την ημέρα του ενοφθαλμισμού των κυττάρων). Μετά την επαγωγή όγκου, τα ποντίκια παρακολουθούνταν καθημερινά για σημάδια οποιασδήποτε δυσφορίας. Τα ποντίκια είναι ανθρωπίνως σκότωσε με υπερβολική δόση CO2 στις 4 εβδομάδες, όταν το βάρος του όγκου έφτασε το βάρος εντολή χωρίς θεραπεία ποντίκια [4], [5] και οι όγκοι αποκόπηκαν και μονιμοποιήθηκαν σε φορμόλη για την κοπή.

Η ανάλυση ανοσοστυπώματος

Μετά την προβλεπόμενη ώρα επώαση παρουσία ή απουσία δεικνυόμενες ποσότητες του GSNO, ανάλυση ανοσοστυπώματος με ειδικά αντισώματα διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [6] – [9]. Εν συντομία, θεραπεία και χωρίς θεραπεία Α2780 ή SKOV3 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με HB-EGF (50 ng /ml) και /ή GSNO (2 ώρες προεπεξεργασία πριν από την προσθήκη του HB-EGF επί κυττάρων) σε διάφορες χρονικές περιόδους (5-20 λεπτά ) λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης [50 mM Tris-HCl (ρΗ 7.5), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 1 mM DTT, 50 mM Na3VO4 και 0,5% Nonidet Ρ-40] που περιέχει ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης ( Sigma, St. Louis, ΜΟ). Σαράντα μα πρωτεΐνες αναλύθηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Η μεμβράνη στη συνέχεια μπλοκαρίστηκε για 1 ώρα σε 5% TTBS άπαχο ξηρό γάλα (20 mM Tris, 500 mM NaCl και 0,1% Tween 20, ρΗ 7,5) και επωάστηκαν όλη τη νύκτα σε πρωτογενείς αντιοροί έναντι φωσφόρου STAT3 (Y705), STAT3, σ -p42 /44 (Thr202 /Y204), Ρ42 /44, pAkt (Ser473), Akt ή β-ακτίνης που περιέχει 5% άπαχο ξηρό γάλα ή 5% BSA σε περίπτωση φωσφο-αντισωμάτων. Μετά την επώαση με συζευγμένο με HRP δευτερογενούς Ab, στυπώματα αναπτύχθηκαν με ένα σύστημα ανίχνευσης ECL (GE Healthcare, Piscataway, NJ).

δοκιμασίες πολλαπλασιασμού

Τα κύτταρα (2,5-5,0 × 10

4) επιστρώθηκαν σε πλάκα 24-φρεατίων εις τριπλούν και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με δεικνυόμενες συγκεντρώσεις GSNO για 48 ώρες. Ανενεργό οξειδωμένο GSNO χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Ανενεργό οξειδωμένο GSNO παρασκευάστηκε με έκθεση διάλυμα GSNO (0,2 mM σε DMSO) σε φως για 7 ημέρες. Το οξειδωμένο GSNO είναι άχρωμο και δεν παράγει ΝΟ όταν προστίθεται σε μέσα κυτταρικής μόνος του ή με κύτταρα που δεν έχουν εκτεθεί σε αντίθεση GSNO (Σχήμα S1A & amp? C). ΜΤΤ δοκιμασία διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [8] για να εξακριβωθεί ο αριθμός των ζώντων κυττάρων.

Αποικίας Δοκιμασία Σχηματισμού

Τα κύτταρα (2 χ 10

3) απλώθηκαν εις τριπλούν σε 6- φρεατίων και μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με δεικνυόμενες συγκεντρώσεις του GSNO μία φορά. Τα κύτταρα αφέθηκαν να σχηματίσουν αποικίες για έως 2 εβδομάδες και πλήρη μέσα αντικαταστάθηκαν κάθε τέταρτη ημέρα. Οι αποικίες βάφτηκαν με ΜΤΤ και μετρήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [8].

δόσης-αποτελέσματος αναλύονται

Η συγκέντρωση για 50% αναστολή (IC 50) προσδιορίστηκε με βάση τις καμπύλες δόσης-απόκρισης από δοκιμασία ΜΤΤ και υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό CalcuSyn (Biosoft, Cambridge, UK).

μετανάστευση και εισβολή δοκιμασία

κύτταρα SKOV3 αναπτύχθηκαν σε μέσα χωρίς ορό για όλη τη νύχτα. δοκιμασίες μετανάστευσης ξυστό και εισβολή μετρήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [5]. Για τη δοκιμασία κλείσιμο των πληγών, τα κύτταρα SKOV3 αναπτύχθηκαν προς συρροή σε πλάκες 24 φρεατίων και διατηρήθηκαν σε συνθήκες χαμηλού ορού (0,2%) όλη τη νύχτα. Μια γρατσουνιά δημιουργήθηκε στα μέσα του φρεατίου με ένα αποστειρωμένο άκρο 200 μΐ, και τα μέσα αντικαθίστανται με τις αντίστοιχες θεραπείες. Μικρογραφίες συλλέχθηκαν σε 0 και 24 ωρών. Η απόσταση μεταξύ εικονοστοιχείων των κενών μετρήθηκε σε ένα προκαθορισμένο σημείο σε κάθε χρονικό σημείο. Η απόσταση που καλύπτεται αφαιρέθηκε από το σημείο ώρα έναρξης για να εκτιμηθεί η απόσταση που καλύπτεται από τα κύτταρα που μεταναστεύουν [10]. Για την ανίχνευση εισβολής, κύτταρα SKOV3 σε εναιωρήματα (500 μΙ, 2,5 χ 10

4) σπάρθηκαν στην κορυφή του Matrigel-επικαλυμμένες πλάκες transwell (8- μΜ διάμετρος πόρων? BD Biosciences). Τα χαμηλότερα θάλαμοι περιείχαν μέσα ελεύθερα ορού που περιέχουν διάφορα αυξητικού παράγοντα συμπεριλαμβανομένων ΗΒ-EGF και SDF1 σε συγκέντρωση 25 ng /ml. Τα κύτταρα εισβάλλουν στην κατώτερη επιφάνεια του φίλτρου επικαλυμμένα με ένα λεπτό στρώμα Matrigel βάφτηκαν με 0.5% κρυσταλλικό ιώδες (60% PBS, 40% EtOH) και μετρήθηκαν με ένα αντεστραμμένο μικροσκόπιο. Τα αποτελέσματα από τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα εις τριπλούν που παρουσιάζονται.

ανοσοϊστοχημεία (IHC)

Οι όγκοι αποκόπηκαν από ποντικούς σταθεροποιήθηκαν σε 10% παραφορμαλδεΰδη για 48 ώρες και ενσωματωμένα σε παραφίνη. Τέσσερις-μm πάχους διαδοχικές τομές κόπηκαν και επεξεργασία για ανοσοϊστοχημεία για CD31 (Cat # sc31045, που χρησιμοποιούνται σε 1:100) και Ki-67 (Cat # M7240, που χρησιμοποιούνται σε 1:100). Λύσεις που ελήφθη από την Dako Cytomation (Glostrup, Denmark) χρησιμοποιήθηκαν για την εκτέλεση ανοσοχρώση. Εν συντομία, τομές ιστών αποπαραφινοποιήθηκαν, ακάλυπτη, δεσμεύτηκαν με αβιδίνη-βιοτίνη και επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα επί μία νύκτα. Την επόμενη ημέρα η αντίδραση ανιχνεύεται χρησιμοποιώντας χρωμογόνο σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Dako, Glostrup, Δανία). Τα θετικά κύτταρα χρωματίζονται καφέ. Οι πλάκες εξετάστηκαν υπό μικροσκόπιο φωτός και αντιπροσωπευτικές εικονογράμματα ελήφθησαν από τουλάχιστον 5 ή 6 διαφορετικές διαφάνειες από κάθε ομάδα. Για χρώση CD31, FITC-επισημασμένο δευτερογενές αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε και ορατή χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού σε 6 ενότητες ανά ομάδα.

Μιτωτικά μετράνε και ζωντανή μετρήσεις του όγκου

Η μιτωτική μέτρηση καταγράφηκε στις αιματοξυλίνη και εοσίνη χρωματισμένο τμήματα χρησιμοποιώντας το οπτικό μικροσκόπιο της Olympus ΒΧ-41 στο πεδίο υψηλής ισχύος (HPF? × 400). Τα κύτταρα που υφίστανται μίτωση μετρήθηκαν στους όγκους, στην πιο ενεργή περιοχή ( «hot spots») σε ένα ελάχιστο 5 συνεχόμενων HPFS. Ο μέσος αριθμός των κυττάρων που υφίστανται μίτωση ανά HPF ήταν απαριθμούνται. Μέγιστη διάμετρος των βιώσιμων όγκου ήταν υπολογίζονται αθροίζοντας τη μεγαλύτερη μονοδιάστατη διάμετρος της κάθε κομμάτι του όγκου χρησιμοποιώντας το Olympus ΒΧ-41 μικροσκόπιο και ένα μικρόμετρο. Ομοίως, νεκρωτικές περιοχές μετρήθηκαν και το σύνθετο ζώντων μέγεθος του όγκου υπολογίστηκε από κάθε slide όπως δημοσιεύθηκε πριν από την [4], [5].

Στατιστική Ανάλυση

Δεδομένα εκφράζονται ως το μέσο + SD και αναλύθηκαν στατιστικά χρησιμοποιώντας έλεγχος τ (Prism). P & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

GSNO αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυτταρικών σειρών OVCA

Για να αξιολογηθεί η επίδραση της θεραπείας GSNO στην ανάπτυξη OVCA, διάφορα OVCA κυττάρων. γραμμές (Α2780, C200, PE01, ΠΕ04, OV202 και SKOV3) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις του GSNO (0,1-1 mM). Ο πολλαπλασιασμός προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ μετά από 24 ώρες. Η θεραπεία με GSNO ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό αυτών των OVCA κυτταρικές σειρές σημαντικά σε μια δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 1) που περιλαμβάνει σισπλατίνη ανθεκτικών C200 (Εικ. 1Β), ανθεκτικό ταξόλη ΠΕ04 (Εικ. 1 D) και επιθετικές κυτταρικές γραμμές SKOV3 (Σχ. 1Ε ). Προσθήκη GSNO στα μέσα μαζικής ενημέρωσης ΟΧΙ στην εξαρτώμενη από τη δόση τρόπο? Ωστόσο, οξειδωμένα GSNO δεν παράγουν κανένα (Εικ. S1B-C). Μετρήσαμε επίσης IC50 του GSNO σε κυτταρικές πολλαπλασιασμό διαφόρων κυτταρικών σειρών OVCA χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα CalcuSyn. IC50 για GSNO ήταν 0.162, 0.385, 0.337, 0.427, 0.196 και 0.235 mmol /L σε Α2780, C200, PE01, ΠΕ04, OV2O2 και SKOV3, αντίστοιχα (Πίνακας S1). θεραπεία GSNO εξασθενημένο επίσης τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων των άλλων κυτταρικών σειρών OVCA συμπεριλαμβανομένων OVCAR-3, -4, 5, -7, -8 και -10 κατά εξαρτώμενο από τη δόση τρόπο (Σχ. S2). Η IC50 για GSNO σε αυτές τις κυτταρικές σειρές βρέθηκαν διαφορικά και αναφέρονται στον πίνακα S1. Η ανενεργή οξειδωμένη μορφή του GSNO δεν είχε καμία επίδραση στον πολλαπλασιασμό των κυτταρικών σειρών OVCA

ποσοστό βιωσιμότητας του Α2780, C200, PE01, ΠΕ04, SKOV3 και OV202 κατεργάζεται με υποδεικνυόμενες δόσεις του S-νιτροζογλουταθειόνη (GSNO?. 0.1- 1 mM) προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ. Ανενεργό GSNO (οξειδωμένα, τελευταία γραμμή) χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν 3 ανεξάρτητα πειράματα γίνονται εις τριπλούν. *** P & lt? 0.001? ** P & lt? 0,01? * P & lt? 0.05 και NS? δεν είναι σημαντική σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα χρησιμοποιώντας έλεγχος τ (Prism).

Η

Για να καθοριστεί εάν η αναστολή αυτή αντικατοπτρίστηκε στην κλωνογονική επιβίωση, η ικανότητα σχηματισμού Α2780 αποικία, C200, PE01 και ΠΕ04 κύτταρα έγιναν . Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, μία μόνο θεραπεία του GSNO εξασθενημένων σημαντικά κλωνογόνο επιβίωση αυτών OVCA κυτταρικών γραμμών σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (Εικ. 2). IC50 για GSNO βρέθηκε να είναι 0.122, 0.161, 0.356 και 0.352 mmol /L στο Α2780, C200, PE01 και ΠΕ04, αντίστοιχα (Πίνακας S2). Ανενεργό οξειδωμένη μορφή του GSNO δεν είχε καμία επίδραση επί του σχηματισμού αποικίας των κυτταρικών γραμμών OVCA. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η θεραπεία GSNO μπορεί να οδηγήσει σε παρατεταμένη αναστολή του πολλαπλασιασμού των διαφόρων OVCA κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένων χημειοθεραπεία κυτταρικές γραμμές (C200 και ΠΕ04) (Σχ 2Β, C & amp?. F).

Cells (2 × 10

3) /φρεάτιο (Α2780, C200, PEO1 και PEO4) επιστρώθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με δεικνυόμενες συγκεντρώσεις του S-νιτροζογλουταθειόνη (GSNO) μία φορά. Οξειδωμένο GSNO χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος (τελευταία στήλη). Μετά από 2 εβδομάδες, οι αποικίες κηλιδώνονται με ΜΤΤ και μετρήθηκαν. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD του τριπλούν. * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001 και NS? δεν είναι σημαντική σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα χρησιμοποιώντας έλεγχος τ (Prism).

Η

GSNO εξασθενεί παράγοντες ανάπτυξης που προκαλείται από τη μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή

vitro

Η

επόμενο εξετάζονται η επίδραση της GSNO επί του παράγοντα ανάπτυξης που προκαλείται κυτταρική μετανάστευση και εισβολή. κύτταρα SKOV3 αναπτύχθηκαν επί μία νύκτα σε χαμηλό ορό (0,2%) που περιέχει μέσο είχαν χαραχθεί χρησιμοποιώντας μια αποστειρωμένη πιπέτα 200 μΙ, από τη στιγμή που είχε φθάσει το 90% συρροή. Διάφοροι παράγοντες ανάπτυξης συμπεριλαμβανομένων HB-EGF και SDF1 (50 ng και 25 ng /ml, αντίστοιχα) προστέθηκαν χωριστά στο μέσο με την παρουσία ή απουσία του GSNO (200 μΜ). Εικοσιτέσσερις ώρες αργότερα, ο ρυθμός κλεισίματος του τραύματος υπολογίστηκε. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, GSNO ανέστειλε όλα μετανάστευση μεσολάβηση κυττάρων ΗΒ-EGF και SDF1 στην κυτταρική σειρά SKOV3. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν για Α2780 και C200 κυτταρικές σειρές (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στη συνέχεια εκτιμήσαμε την επίδραση της GSNO στη ρύθμιση του αυξητικού παράγοντα που προκαλείται εισβολή των κυττάρων με χρήση του προσδιορισμού SKOV3 Boyden μετανάστευση θάλαμο (BD Bioscience, San Jose, CA) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11]. Το Σχήμα 3Β δείχνει σαφώς ότι η θεραπεία GSNO ανέστειλε σημαντικά αυξητικό παράγοντα που επάγεται εισβολή των κυττάρων SKOV3 σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι GSNO έχει την ικανότητα να αναστέλλει τη μετανάστευση και εισβολή των κυττάρων OVCA.

A. Κύτταρα που αναπτύχθηκαν με ΗΒ-EGF και SDF1 σε απουσία ή παρουσία του S-νιτροζογλουταθειόνη (GSNO) και η μετανάστευση των κυττάρων μετρήθηκαν με δοκιμασία κλεισίματος τραύματος όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD από n = 7. B. Για να εξεταστεί το αποτέλεσμα GSNO επί εισβολή, 1 × 10

5 SKOV3 κύτταρα σπάρθηκαν στα ανώτερα φρεάτια με 0,2 mM GSNO στον ανώτερο θάλαμο του transwell σε 500 μl μέσου καλλιέργειας. Διάφοροι παράγοντες ανάπτυξης (HB-EGF και SDF1) (25 ng /ml) προστέθηκε στα υποκείμενα μέσα ενημέρωσης. Εικοσιτέσσερις ώρες αργότερα, εισβολή προσδιορίσθηκε οδηγίες ακόλουθη κατασκευαστή. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD του τριπλούν. $$$ P & lt? 0.001 αυξητικού παράγοντα σε σύγκριση με τον έλεγχο. * P & lt? 0,05? *** P & lt?. 0.001 GSNO σε σύγκριση με αυξητικό παράγοντα με τη χρήση t-test του Student (Prism)

Η

GSNO καταργεί προκαλείται από σηματοδότηση αυξητικού παράγοντα σε OVCA κύτταρα

Για να εξεταστεί η επίδραση της GSNO επί αυξητικό παράγοντα που επάγεται σηματοδότηση, στερήθηκαν Α2780 ορού και κύτταρα SKOV3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με GSNO ακολουθούμενη από επεξεργασία HB-EGF για διάφορες χρονικές περιόδους. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και ανοσοστυπώθηκαν για διάφορα μόρια σηματοδότησης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, η αγωγή με GSNO ανέστειλε HB-EGF προκάλεσε ενεργοποίηση της STAT3, Akt και ρ42 /44 όπως φαίνεται από τις μειωμένη ή έλλειψη φωσφορυλίωσης καταγράφηκαν σε σύγκριση με HB-EGF επεξεργασμένα δείγματα. θεραπεία GSNO μείωσε επίσης τα βασικά επίπεδα της φωσφορυλιωμένης μορφής του Akt, STAT3 και ρ42 /44 σε Α2780 και SKOV3 κύτταρα γραμμών (Εικ. 4). Ανενεργό ελέγχου (οξειδωμένη GSNO) δεν είχε καμία επίδραση επί της επαγόμενης σηματοδότηση παράγοντα ανάπτυξης, γεγονός που υποδηλώνει την ειδικότητα του GSNO στην εξασθένηση ΗΒ-EGF προκάλεσε σηματοδότησης και ένα πιθανό μηχανισμό με τον οποίο GSNO μεσολαβεί η εξασθένηση της κυτταρικής ανάπτυξης, τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων OVCA

in vitro

Η

Α2780 (Α) και τα κύτταρα SKOV3 (Β) καλλιεργήθηκαν, στερήθηκαν ορού όλη νύκτα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με S-νιτροζογλουταθειόνη (GSNO? 0,5 ​​mM). ή ανενεργό ελέγχου (οξειδωμένη GSNO? 0,5 ​​mM) με την παρουσία ή απουσία του ΗΒ-EGF (50 ng /ml) για διάφορες χρονικές περιόδους (5-20 λεπτά). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία και σε επεξεργασία για την ανίχνευση των διαφόρων μορίων σηματοδότησης περιλαμβανομένων pSTAT3 (Tyr705), pAkt (Ser473) και ρ-Ρ42 /44 (Thr202 /Tyr204) χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα τους από τη Cell Signaling (Danvers, ΜΑ). Σύνολο STAT3, Akt, ρ42 /44 και β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε για ίση φόρτωση. Οι κηλίδες είναι αντιπροσωπευτικές των δύο ανεξάρτητα πειράματα τρέχουν.

Η

από του στόματος χορήγηση GSNO εξασθενεί την ανάπτυξη του όγκου και ενισχύει την επαγόμενη από σισπλατίνη κυτταροτοξικότητα

in vivo

Η

Για να προσδιοριστεί εάν GSNO θα μπορούσε να εξασθενήσει την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

, κύτταρα Α2780 (2 × 10

6) σε PBS ενοφθαλμίστηκαν ενδοπεριτοναϊκά σε ηλικίας 6 εβδομάδων θηλυκών γυμνών ποντικών για τη δημιουργία όγκων. Οι ποντικοί αποδόθηκαν σε δύο ομάδες αγωγής. Η πρώτη ομάδα (χωρίς θεραπεία) δόθηκε 100 μΙ PBS ως όχημα με διασωλήνωση. Η δεύτερη ομάδα δόθηκε GSNO στοματικά σε PBS (100 μΐ) σε δόση 1 mg /kg σωματικού βάρους κάθε μέρα όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι (Εικ. 5Α). Στο τέλος των 4 εβδομάδων, τα ποντίκια θυσιάστηκαν, και το βάρος του όγκου χονδροειδώς εξετάστηκε, αποκόπηκαν και ζυγίστηκαν. Η καθημερινή χορήγηση του GSNO μείωσε σημαντικά την κοιλιακή περιφέρεια (ρ & lt? 0,01) (Σχήμα 5Β)., Μια ένδειξη του βάρους του όγκου που μεταφέρεται στο περιτόναιο. GSNO επίσης μειωμένη ανάπτυξη του όγκου (ρ & lt? 0.001) στην περιτοναϊκή κοιλότητα του Α2780 γυμνούς ποντικούς που φέρουν σε σύγκριση με το όχημα (PBS) ομάδα αγωγής. Τα μέσα βάρη των όγκων ήταν αποκόπηκε περίπου 68% λιγότερο σε GSNO (3,35 ± 0,52 gm) αγωγή ποντικούς σε σύγκριση με ποντικούς χωρίς αγωγή (7,91 ± 0,412 gm) (Εικ. 5C). Όπως έχει ήδη αναφερθεί από Shaw et al [12] και μας [4], ενδοπεριτοναϊκώς εγχυθέντα κύτταρα Α2780 σχηματίζονται κυρίως συμπαγών όγκων και παρουσιάζονται με μεταστάσεις ωοθήκη-ειδική (Σχήμα 5D, κάτω πλαίσιο). Οι ωοθήκες που σχετίζεται μάζες όγκων στα ποντίκια που έλαβαν GSNO ήταν πολύ μικρότερες από ό, τι στο μη επεξεργασμένο ποντίκια (Σχ. 5D). Για να αξιολογηθεί περαιτέρω η βιωσιμότητα του όγκου, νεκρωτικές και βιώσιμο μέγεθος του όγκου προσδιορίστηκε από αιματοξυλίνη και ηωσίνη χρωματισμένο τμήματα. Η αναλογία των ζωντανών μεγέθους του όγκου με το συνολικό μέγεθος του όγκου υπολογίστηκε με βάση το μεγαλύτερο μονοδιάστατη διάμετρο όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Ε, ξενομοσχεύματα που προέρχονται από ποντικούς που υπέστησαν αγωγή GSNO είχαν σημαντικά λιγότερα βιώσιμα μεγέθη του όγκου (ρ & lt? 0.001) και αυξημένη νεκρωτικές περιοχές σε σχέση με ξενομοσχεύματα που προέρχονται από ποντικούς άνευ αγωγής. Παρά το γεγονός ότι υπήρξε μια πτωτική τάση που παρατηρείται στην μιτωτική και σκαφών μετρήσεις των GSNO ποντίκια με αγωγή όγκων, δεν θα μπορούσαμε να ανιχνεύσει μια σημαντική αλλαγή (Εικ. 5F-G). Συνολικά, η μελέτη μας υποδηλώνει σαφώς το δυναμικό του παράγοντα nitrosylating στον μετριασμό της ανάπτυξης των OVCA

in vivo

(Εικ. 5).

Α. Σχηματικό διάγραμμα του πειραματικού σχεδιασμού. Εν συντομία, Α2780 κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών εγχύθηκε ενδοπεριτοναϊκώς σε γυμνά ποντίκια και S-νιτροζογλουταθειόνη (GSNO) δόθηκε από το στόμα καθημερινά από την ημέρα 3 σε δόση 1 mg /kg βάρους σώματος μέχρι το τέλος της μελέτης. Φωσφορικό ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα (PBS) δόθηκε ως όχημα. Β Μειωμένη κοιλιακή περιφέρεια των ποντικών που έλαβαν GSNO σε σύγκριση με τις ομάδες που έλαβαν φορέα που μετράται κατά την εβδομάδα 4 (** p & lt? 0,01 σε σύγκριση με το όχημα). Γ Μειωμένη αποκομμένο βάρη όγκου των ποντικών που έλαβαν GSNO σε σύγκριση με το όχημα αντιμετωπίζεται κατά την εβδομάδα 4 (*** p & lt? 0.001 σε σύγκριση με το όχημα). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD από 10-14 μεμονωμένων ζώων. Δ Εκπρόσωπος ακαθάριστο μορφολογική εικόνα της μάζας του όγκου και του όγκου που συνδέονται με την ωοθήκη του οχήματος και GSNO ποντίκια με αγωγή. Ε Μετρήσεις βιώσιμων μεγέθους του όγκου του GSNO vs ποντίκια με PBS αγωγή, όπως περιγράφεται στις μεθόδους (*** ρ & lt? 0.001 σε σύγκριση με το όχημα). F. Καταμέτρηση των μιτωτικών κυττάρων και G. καταμέτρηση των CD31 θετικών αγγείων ανά HPF (χ400) σε GSNO vs ποντίκια με PBS αγωγή, όπως περιγράφεται στις μεθόδους), μετρήσεις διεξήχθησαν από 5 πεδία 3 διαφορετικούς όγκους από κάθε ομάδα. NS? μη σημαντική σε σύγκριση με το όχημα.

Η

εξεταστεί περαιτέρω αν ένας συνδυασμός GSNO με σισπλατίνη θα μπορούσε να ενισχύσει την κυτταροτοξική δράση σε όγκους. Ως εκ τούτου, μετά την έγχυση του Α2780 κυττάρων, 2 σετ των ποντικών υπέστησαν αγωγή ημερησίως με από του στόματος χορήγηση του GSNO (1 mg /kg σωματικού βάρους) και σισπλατίνη (εβδομαδιαία ενδοπεριτοναϊκή ένεση της σισπλατίνης τις ημέρες 7, 14 και 21) ως μονοθεραπεία. Για συνδυαστική θεραπεία, μία ομάδα ποντικών υποβλήθηκε σε επεξεργασία με GSNO και σισπλατίνη όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 6Α. Τόσο GSNO και σισπλατίνη ήταν σημαντικά αποτελεσματική στη μείωση της ανάπτυξης του όγκου και της μάζας ως μονοθεραπεία σε Α2780 ποντίκια που φέρουν (Εικ. 6Β). Ωστόσο, η συνδυαστική θεραπεία ήταν πιο αποτελεσματική στην αναστολή της ανάπτυξης του όγκου σε σύγκριση με τη μονοθεραπεία είτε της φάρμακο. Συνδυασμός σισπλατίνης (4 mg /kg σωματικού βάρους) με GSNO (1 mg /kg σωματικού βάρους) (2,08 ± 0,18 gm) (Εικ. 6Β) μείωσε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου σε σύγκριση με είτε GSNO (3,54 ± 0,35 gm) ή σισπλατίνη επεξεργασία μόνο (3,15 ± 0,34 gm) ή η μη θεραπευμένα ποντίκια (6,9 ± 0,66 gm). Ο όγκος του όγκου μειώθηκε κατά -90% στα περισσότερα από τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με το συνδυασμό. Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι ο συνδυασμός GSNO με θεραπεία σισπλατίνη είναι σημαντικά αποτελεσματική στη μείωση της ανάπτυξης του όγκου σε ένα μοντέλο ποντικού OVCA.

A. Σχηματικό διάγραμμα του πειραματικού σχεδιασμού. B. Αθροιστική βάρος αποκόπηκε όγκου από μεμονωμένους ποντικούς στις 4 εβδομάδες με S-νιτροζογλουταθειόνη (GSNO? 1 mg /kg σωματικού βάρους) (πίνακας 2), σισπλατίνη (4 mg /kg σωματικού βάρους) (πίνακας 3) και GSNO (1 mg /kg σωματικού βάρους) και σισπλατίνη (4 mg /kg σωματικού βάρους) συνδυασμού (πίνακας 4). Cisplatin δόθηκε 3 φορές με ενδοπεριτοναϊκή διαδρομή την ημέρα 7, 14 και 21 ενέσεων του όγκου. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD από 7 μεμονωμένων ζώων. *** P & lt? 0.001 συνδυασμός GSNO + ομάδα που έλαβε αγωγή με σισπλατίνη σε σύγκριση με το μη επεξεργασμένο ή σισπλατίνη ομάδα μόνη θεραπεία? ** P & lt? Ομάδας αντιμετωπίζονται 0,01 GSNO σε σύγκριση με τη μη επεξεργασμένη ομάδα? * P & lt? Ομάδας αντιμετωπίζονται 0,05 σισπλατίνη σε σύγκριση με τη μη επεξεργασμένη ομάδα? # P & lt?. 0.05 συνδυασμό GSNO + σισπλατίνη ομάδα σε σύγκριση με μόνη ομάδα GSNO

Η

θεραπεία GSNO που προκαλείται νιτροσυλίωση της STAT3

Δεδομένου ότι, GSNO είναι μια nitrosylating παράγοντα και είναι γνωστό ότι προκαλεί την μετα-μεταφραστική διαδικασία του S-νιτροσυλίωση επί πρωτεϊνών, γεγονός που οδηγεί σε διαμόρφωση της ενεργότητας τους [13]. Εξετάσαμε την επίδραση της GSNO για νιτροσυλίωση σε διάφορες ενδογενείς πρωτεΐνες που είναι γνωστό ότι νιτροσυλιωμένο και τους βασικούς παίκτες στην OVCA συμπεριλαμβανομένων Akt, p65 και EGFR [14] – [17].

Για να εξετάσει την νιτροσυλίωση των διαφόρων πρωτεϊνών , χρησιμοποιήσαμε ένα εξελιγμένο δοκιμασία βιοτίνη-διακόπτη. Βασικό επίπεδο νιτροσυλιωμένο πρωτεΐνες μπορούσαν να ανιχνευθούν διακύμανση μεταξύ 250 και 35 kd μοριακού βάρους σε κύτταρα OVCA (Εικ. 7Α, λωρίδα 1). θεραπεία GSNO ενίσχυσε την νιτροσυλίωση ενδογενών πρωτεϊνών σε κατεργασμένα κύτταρα με GSNO (0,5 mM) για 2 ώρες (Σχ. 7Α, λωρίδα 2). Η εξειδίκευση της νιτροσυλίωση θα μπορούσε να επιτευχθεί με την παράλειψη της προσθήκης HPDP-βιοτίνης κατά τη διάρκεια της δοκιμασίας βιοτίνης-διακόπτη. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7Α, λωρίδα 3, η παράλειψη της HPDP-βιοτίνης βήμα μπλοκάρει τελείως την ανίχνευση νιτροσυλίωση ενδογενών πρωτεϊνών, υπογραμμίζοντας την εξειδίκευση της μεθόδου νιτροσυλίωση στο εργαστήριο μας. Εμείς επικυρωθεί περαιτέρω την επαγωγή νιτροσυλίωση από GSNO παρατηρώντας για νιτροσυλίωση πρωτεϊνών ανέφεραν ήδη σηματοδότησης που συνδέονται με την εξέλιξη του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων των ωοθηκών. θεραπεία GSNO προκάλεσε την νιτροσυλίωση του p65, Akt και EGFR όπως αναμένεται (Σχ. 7Β). Διαπιστώσαμε περαιτέρω τη μοναδική παρατήρηση του STAT3 υποβάλλονται νιτροσυλίωση κατά την κατεργασία GSNO (Σχ. 7Β, C). Για να επιβεβαιώσετε ότι STAT3 είναι νιτροσυλιωμένο, STAT3 ανοσοκαταβυθίστηκε μετά από δοκιμασία βιοτίνη-διακόπτη με χρήση ειδικών αντισωμάτων και ανοσοαποτύπωση με αντι-βιοτίνη-HRP. Μια παρόμοια παρατήρηση STAT3 υποβάλλονται νιτροσυλίωση κατά την αγωγή GSNO είχε δει. Αυτά τα σύνολα των πειραμάτων δείχνουν σαφώς μια νέα ρύθμιση των STAT3 από το s-νιτροσυλίωση. Για να εξεταστεί περαιτέρω αν αυτό το φαινόμενο δεν περιορίζεται μόνο σε ένα τύπο κυττάρου, μπορούμε αντιμετωπίζονται διάφορα OVCA κυτταρικές σειρές που περιλαμβάνουν Α2780, C200 και SKOV3 με GSNO και οξειδωμένη GSNO ως έλεγχος. Μετά από 2 ώρες επώασης, συνολικό κυτταρικό λύμα υποβλήθηκε σε επεξεργασία για την ανίχνευση κατάσταση φωσφορυλίωσης της STAT3. Όπως φαίνεται στο σχήμα 7D, θεραπεία GSNO καταργηθεί ή μείωσε την φωσφορυλίωση τυροσίνης σε όλες τις κυτταρικές σειρές OVCA χωρίς να επηρεάζει τα επίπεδα STAT3. Οξειδωμένο GSNO δεν επηρέασε τα επίπεδα pSTAT3 σε οποιεσδήποτε κυτταρικές σειρές. Κάτω από παρόμοιες πειραματικές συνθήκες, εξετάσαμε την νιτροσυλίωση της STAT3 με τη μέθοδο διακόπτη βιοτίνη. θεραπεία GSNO αύξησε το συνολικό νιτροσυλίωση πολλαπλών πρωτεϊνών με χαμηλό ή υψηλό μοριακό βάρος σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα και επεξεργασμένα δείγματα οξειδώνεται GSNO όπως είναι προφανές από το Σχήμα 7Ε. Ένα παρόμοιο μοτίβο παρατηρήθηκε σε νιτροσυλίωση της STAT3 γεγονός που υποδηλώνει ότι η προκαλούμενη αύξηση GSNO σε νιτροσυλίωση της STAT3 είναι ένα γενικό φαινόμενο σε όλες τις OVCA κυτταρικές σειρές.

Α. Ανίχνευση βιοτινυλιωμένες πρωτεΐνες μετά μέθοδος βιοτίνης-διακόπτης με την παρουσία ή απουσία του S-νιτροζογλουταθειόνη (GSNO? 0,5 ​​mM). Η παράλειψη της βιοτίνης-HPRT καταδεικνύει την ιδιαιτερότητα του S-νιτροσυλίωση με τη μέθοδο βιοτίνης-διακόπτη. B. Ανίχνευση νιτροσυλίωση διαφόρων πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων του EGFR, p65, Akt και STAT3 σε ωοθηκών καρκινικά κύτταρα κατά την κατεργασία GSNO. Γ STAT3 ανοσοκατακρημνίστηκε από νιτροσυλιωμένο λύμα πρωτεΐνης μετά δοκιμασία διακόπτη βιοτίνη και η βιοτινυλίωση του ανιχνεύθηκε με αντι-βιοτίνης-HRP χρησιμοποιώντας ανάλυση κηλίδος Western. D. Α2780, C200 και SKOV3 κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε θεραπεία με GSNO (0.5 mM) ή οξειδωμένο GSNO (0,5 mM) ως έλεγχος για 2 ώρες που ακολουθείται από ανάλυση ανοσοστυπώματος για την ανίχνευση της φωσφορυλίωσης της τυροσίνης του STAT3 στο 705 υπόλειμμα και το συνολικό STAT3. Ε Κάτω από παρόμοιες πειραματικές συνθήκες ως «D», Α2780, C200 και SKOV3 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για τη βιοτίνη μέθοδος διακόπτης για την ανίχνευση της STAT3. Δείγμα στη λωρίδα 4 υποβλήθηκε σε επεξεργασία με GSNO ως λωρίδα 2, με εξαίρεση κατά την επεξεργασία για προσδιορισμό διακόπτη βιοτίνη? η προσθήκη HPDP παραλείφθηκε. Άνω του πίνακα δείχνει τις βιοτινυλιωμένες πρωτεΐνες μετά την δοκιμασία βιοτίνη-διακόπτη. Νιτροσυλιωμένο STAT3 ανιχνεύθηκε με τράβηγμα προς τα κάτω βιοτινυλιωμένες πρωτεΐνες από στρεπταβιδίνη ακολουθούμενη αγαρόζης με ανάλυση ανοσοκηλίδος χρησιμοποιώντας αντι-STAT3 αντίσωμα. Χαμηλότερες ζώνες δείχνουν τα συνολικά επίπεδα της STAT3 εισόδου σε επεξεργασία για προσδιορισμό διακόπτη βιοτίνη.

Η

GSNO nitrosylates STAT3 και επηρεάζει την ικανότητά του να δεσμεύει DNA

Από τη στιγμή που διαπιστώθηκε ότι STAT3 υποβάλλεται νιτροσυλίωση σε καλλιεργημένα κύτταρα , θα εξεταστεί περαιτέρω αν STAT3 θα μπορούσε να νιτροσυλιωμένο

in vitro

και αν μπορεί να επηρεάσει την ικανότητα δέσμευσης του DNA. Για το σκοπό αυτό, πήραμε δύο προσεγγίσεις, πρώτα απομονώνεται πυρηνικό εκχύλισμα από SKOV3, η οποία εμφανίζει υψηλότερο βασικά επίπεδα της φωσφορυλιωμένης μορφής STAT3 και έχει την ικανότητα να δεσμεύει μοτίβο δέσμευσης χωρίς διέγερση STAT3 DNA. Επωάσαμε 20 μg του πυρηνικού εκχυλίσματος (ΝΕ) με GSNO ή οξειδωμένο GSNO παρουσία ή απουσία DTT για 4 ώρες. Μετά την επώαση, η ικανότητα δέσμευσης του DNA του STAT3 εξετάστηκε με επώαση νιτροσυλιωμένο ΝΕ με ολιγονουκλεοτίδια μετατόπισης STAT3 γέλη συζευγμένο με αγαρόζη. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 8Α, ο GSNO κατεργασμένο δείγμα εμφάνισε νιτροσυλίωση του STAT3 όπως είναι εμφανές με δοκιμασία διακόπτη βιοτίνη και δεν θα μπορούσε να τραβηχτεί προς τα κάτω από ολιγονουκλεοτίδια μετατόπιση STAT3 γέλη συζευγμένο με αγαρόζη. Συμπερίληψη DTT σε δείγματα καταργηθεί GSNO μεσολάβηση νιτροσυλίωση του STAT3, με αποτέλεσμα την πρόσδεση του STAT3 επί μοτίβο δέσμευσης του DNA. STAT3 έχει επίσης δειχθεί να προσλάβει συνενεργοποιητή συμπεριλαμβανομένων p300. 0,01?