Αφηρημένο

Ιστορικό

Αν και τα ανδρογόνα φτωχό σε ανθεκτικά ευνουχισμό καρκίνο του προστάτη (CRPC), μεταστάσεις ακόμα εκφράζουν υποδοχέα πυρηνικής ανδρογόνων (AR) και ανδρογόνων ρυθμίζονται τα γονίδια. Πρόσφατα αναφέρθηκε ότι η C-τερματική κολοβωμένη συστατικώς δραστικές παραλλαγές ματίσματος AR συμβάλλουν στην ανάπτυξη CRPC. Δεδομένου ότι ειδικά αντισώματα ανίχνευση όλων των C-τελικό κουτσουρεμένο παραλλαγές AR δεν είναι διαθέσιμο, ο στόχος μας ήταν να αναπτύξουμε μια προσέγγιση για την αξιολόγηση του επιπολασμού και της λειτουργίας των παραλλαγών AR στον καρκίνο του προστάτη (PCA).

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Χρησιμοποιώντας 2 αντισώματα έναντι διαφορετικών περιοχών της πρωτεΐνης AR (Ν- ή ο-άκρο), δείξαμε με επιτυχία την ύπαρξη παραλλαγής AR στην LuCaP 86,2 ξενομοσχεύματος. Για την αξιολόγηση του επιπολασμού των παραλλαγών AR στον ανθρώπινο ιστό προστάτη, έχουμε χρησιμοποιήσει αυτή τη μέθοδο για μικροσυστοιχίες ιστού συμπεριλαμβανομένων 50 πρωτοβάθμια προστάτη και 162 μεταστατικό CRPC ιστούς. RT-PCR χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιώσει παραλλαγές AR. Παρατηρήσαμε μια σημαντική μείωση στην C-τερματική χρώση πυρηνικό AR σε CRPC αλλά καμία διαφορά μεταξύ Ν- και Ο-τερματικά AR πυρηνική χρώση σε πρωτογενείς PCa. Η έκφραση του AR ρυθμίζονται πρωτεΐνες PSA και PSMA επηρεάστηκαν οριακά από την μείωση στην C-τερματική χρώση σε CRPC δείγματα. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι υπάρχει μία αύξηση του επιπολασμού των παραλλαγών AR σε CRPC με βάση την ικανότητά μας να διαφοροποιούνται έκφραση πυρηνικών AR χρησιμοποιώντας Ν- και C-τερματικών AR αντισώματα. Αυτά τα ευρήματα επικυρώθηκαν με τη χρήση RT-PCR. Είναι σημαντικό ότι, η απώλεια του C-τερματικού ανοσολογική αντίδραση και η ταυτοποίηση των AR παραλλαγές ήταν διαφορετική ανάλογα με τη θέση της μετάστασης στον ίδιο ασθενή.

Συμπεράσματα

Έχουμε αναπτύξει με επιτυχία μια νέα ανοσοϊστοχημική προσέγγιση, η οποία ήταν χρησιμοποιείται για να εξακριβωθεί η επικράτηση των AR παραλλαγές σε ένα μεγάλο αριθμό των πρωτογενών προστάτη και μεταστατικές CRPC. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ένα στιγμιότυπο της γενικής υψηλής συχνότητας του C-τερματικού παραλλαγές περικομμένο AR ματίσματος και site specific απώλεια AR στο CRPC, οι οποίες θα μπορούσαν να έχουν χρησιμότητα στη σταδιοποίηση ασθενών για AR στοχευμένη θεραπευτική

Παράθεση:. Zhang Χ, Morrissey C , Sun S, M Ketchandji, Νέλσον PS, True LD, et al. (2011) ανδρογόνων υποδοχέων Παραλλαγές συμβαίνουν συχνά σε Ευνουχισμός Ανθεκτικό Καρκίνος του προστάτη μεταστάσεις. PLoS ONE 6 (11): e27970. doi: 10.1371 /journal.pone.0027970

Επιμέλεια: Irina Agoulnik, Διεθνές Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17 του Ιουνίου 2011? Αποδεκτές: 29η Οκτωβρίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 17 Νοεμβρίου, 2011

Copyright: © 2011 Zhang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα βασίζεται σε έργο που υποστηρίχθηκε εν μέρει από ένα PO1 Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας επιχορήγησης (PO1CA085859), η επιχορήγηση Pacific Northwest Καρκίνος του προστάτη σπορίων (P50CA097186), το Ίδρυμα Καρκίνος του προστάτη και το Ίδρυμα Richard M. Lucas. CM έλαβε το βραβείο εξέλιξη της σταδιοδρομίας από την επιχορήγηση του καρκίνου του προστάτη Pacific Northwest σπορίων (P50CA097186). Η έρευνα αυτή είναι το αποτέλεσμα της δουλειάς που υποστηρίζεται από πόρους του Συστήματος Υγείας VA Puget Sound, Σιάτλ, Ουάσιγκτον. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο μεταστατικός καρκίνος του προστάτη (PCA) που επανέρχεται μετά τη θεραπεία με ευνουχισμό ή στέρησης ανδρογόνων (ADT), που ονομάζεται ανθεκτικό ευνουχισμό καρκίνο του προστάτη (CRPC), προμηνύει μια φτωχή έκβαση με υψηλή θνησιμότητα. Αν και τα κυκλοφορούντα επίπεδα ανδρογόνων φτωχού σε CRPC, εξέλιξης του όγκου είναι συχνά ταυτόχρονη με αυξημένα επίπεδα του υποδοχέα ανδρογόνων (AR), η ενεργοποίηση του AR, και την έκφραση του AR-ρυθμιζόμενων γονιδίων. Ωστόσο, μια αύξηση στην έκφραση AR από μόνη της δεν είναι γενικά επαρκής για να εμπλέκει το πρόγραμμα AR μεταγραφική [1]. Διάφοροι μηχανισμοί έχουν αποδειχθεί ότι οδηγεί σε AR μετενεργοποίηση και να συμμετάσχουν στο πρόγραμμα AR παρακάτω ευνουχισμό. Αυτές περιλαμβάνουν την επιμονή της εντός του όγκου ανδρογόνων, σύνθεση έκτοπη ανδρογόνων από τον όγκο είτε από επινεφριδίων ανδρογόνων ή εντός του όγκου

de novo

σύνθεση, και την ενίσχυση της μεταφοράς των ανδρογόνων στον όγκο από το φορέα διαλυμένης ουσίας οργανικές πρωτεΐνες μεταφορέα ανιόντων [2] – [6] . Αρκετές κυτοκίνες και μονοπάτια αυξητικός παράγοντας έχει αποδειχθεί ότι είναι σε θέση να ενεργοποιήσετε την AR μέσω άμεσων μηχανισμών δέσμευσης ή cross-talk [7] – [13]. Μεταβολές στο AR συν-ρυθμιστές μπορεί επίσης να ρυθμίζουν τη δράση AR όταν ανδρογόνων επίπεδα μειώθηκαν [14] – [18]. Λειτουργικά, κάθε ένα από αυτούς τους μηχανισμούς ενεργοποίησης προώθηση AR σε CRPC απαιτεί το καρβοξυ-άκρο περιοχή της ώριμης πρωτεΐνης η οποία περιέχει την επικράτεια δέσμευσης συνδέτη (LBD).

Εκτός από τους μηχανισμούς που οδηγούν στην ενεργοποίηση AR σε CRPC που απαιτούν συνδετήρα, πρόσφατα στοιχεία δείχνουν την ύπαρξη εναλλακτικά ματισμένων μορφών mRNAs AR που κωδικοποιούν τους υποδοχείς στερείται της LBD, αλλά διατηρεί την ικανότητα να εμπλέκεται μεταγραφικό μηχανισμό και να προωθήσει τη ρύθμιση των γνωστών — και των δυνητικών νέων — σύνολα μεταγραφικών στόχων [19] – [26]. Δεν είναι μόνο αυτά τα Ο-τερματικά κολοβωμένη AR παραλλαγές ουσιαστικά δραστική, αλλά η δομή τους προβλέπει μια γενική αντοχή σε θεραπευτικά όπως AR-ανταγωνιστές που απαιτούν σύνδεση με το LBD για δραστηριότητα. Μέχρι σήμερα, εμείς και οι άλλοι έχουν εντοπίσει τρεις παραλλαγές AR ματίσματος σε δείγματα ανθρώπινου ιστού [22], [25] – [27]. AR-V1 κωδικοποιεί μια παραλλαγή ματίσματος που αποτελείται από εξώνια 1-3 και καταλήγει σε μια κρυπτικό εξόνιο (CE1), AR-V7 (που ονομάζεται επίσης AR3) κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη με εξώνια 1-3 και ένα τερματικό κρυπτικό εξώνιο (CE3), και AR

v567es κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη που αποτελείται από εξώνια 1-4, και λόγω της μετατόπισης πλαισίου λόγω της απώλειας εξώνια 5-7, το εξόνιο 8 έχει ένα κωδικόνιο στοπ που δημιουργείται μετά τα πρώτα 10 αμινοξέα με αποτέλεσμα μια συντομευμένη exon8. [22], [25] – [27]. Οι παραλλαγές ματίσματος Πρόσθετες AR έχουν ανιχνευθεί σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές προστάτη [21], [24], [26] – [28]

Αρκετές μελέτες που αξιολογούν την έκφραση των μορφών AR ματίσματος σε ένα μικρό αριθμό των καρκίνων του προστάτη. υποδηλώνουν ότι AR παραλλαγές πιο εύκολα ανιχνεύονται σε CRPC σύγκριση με καρκίνους ορμόνη-αφελή, και μπορεί να προκύψουν λόγω της επιλεκτικής πίεσης του AR στοχευμένη θεραπεία [22], [25], [26]. Μια πρόσφατη μελέτη που χρησιμοποιείται qRT-PCR για τον εντοπισμό παραλλαγή μεταγραφές AR σε 40 μετάσταση στα οστά, εκ των οποίων 30 ήταν από CRPC, και βρήκε μια συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του AR παραλλαγές και επιβίωσης [29]. Ο προσδιορισμός του επιπολασμού των παραλλαγών AR σε διάφορες κλινικές καταστάσεις του καρκίνου του προστάτη έχει αμφισβητηθεί από τις απαιτήσεις για τα καλά διατηρημένα κατεψυγμένα δείγματα ιστού για αναλύσεις μεταγραφή που βασίζεται, και η έλλειψη αντισώματα ικανά να ανιχνεύουν ειδικά τις περισσότερες πρωτεΐνες παραλλαγή AR. Για να ξεπεραστεί αυτός ο περιορισμός, επιδιώξαμε να επωφεληθούν από το γεγονός ότι οι νέες AR καρβοξυ-άκρα που κωδικοποιείται από εναλλακτικά ματισμένες μορφές του mRNA AR δεν μπορεί να αναγνωριστεί από αντισώματα που κατευθύνονται εναντίον της κανονικής C-άκρο της πλήρους μήκους AR (AR

FL). Υποθέσαμε ότι αυτό το χαρακτηριστικό του AR παραλλαγών που έδωσε την ευκαιρία να διαπιστώσετε παραλλαγές πρωτεΐνης AR σε σταθεροποιημένο με φορμαλίνη ιστούς συγκρίνοντας την διαφορική χρώση των αντισωμάτων που αναγνωρίζουν είτε Ν- ή C-άκρο του AR. Ως εκ τούτου, στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε αντισώματα έναντι της Ν- ή C-άκρο της πρωτεΐνης AR να ανακρίνει ένα μεγάλο αριθμό της καλοήθους ιστού του προστάτη, πρωταρχικός ορμόνη αφελείς ΠΑΠ και μια σειρά μεταστατικού CRPC να εξακριβωθεί η επικράτηση του Ο-τερματικού περικομμένο AR παραλλαγές.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη και τις συνθήκες εργασίας που αναφέρονται στον πίνακα 1.

η

ιστός

Ανθρώπινο πρωτογενών και μεταστατικών ιστών προστάτη ελήφθησαν στο πλαίσιο του ερευνητικού προγράμματος του προστάτη και του Πανεπιστημίου της Ουάσιγκτον Ιατρικό Κέντρο Καρκίνου του προστάτη των χορηγών Rapid πρόγραμμα Αυτοψία, το οποίο έχει εγκριθεί από το Πανεπιστήμιο της Ουάσιγκτον Διοικητικού κριτική Θεσμική. Το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review του Πανεπιστημίου της Washington Medical Center ενέκρινε όλες τις διαδικασίες που αφορούν τα ανθρώπινα θέματα, και όλα τα θέματα που υπέγραψε γραπτή συγκατάθεση. μικροσυστοιχίες ανθρώπινου ιστού (TMAs) αποτελείται από 42 ασθενείς από καρκίνο του προστάτη Δωρητών Ταχεία Πρόγραμμα Αυτοψία (συμπεριλαμβανομένων 65 μεταστάσεις μαλακών ιστών και 120 οστικές μεταστάσεις) [30], 55 ασθενείς ριζική προστατεκτομή (συμπεριλαμβανομένων 28 κανονικό προστάτη, 24 υπερπλασίας του προστάτη, και 50 πρωτοβάθμια προστάτη χρησιμοποιήθηκαν καρκινικούς ιστούς). Η LuCaP 86,2 προστάτη ξενομόσχευμα καρκίνου είναι ένα αδενοκαρκίνωμα που δεν ανταποκρίνεται σε ευνουχισμό και προέρχεται από ένα ανθρώπινο μετάσταση της ουροδόχου κύστης του προστάτη. Η LuCaP 35 καρκίνου του προστάτη ξενομοσχεύματος είναι ένα αδενοκαρκίνωμα που ανταποκρίνεται σε ευνουχισμό και προήλθε από ΠΑΠ λεμφαδένα μετάσταση. Αυτά τα ξενομοσχεύματα αποτυγχάνουν να αναπτυχθούν ως κυτταρικές σειρές, έτσι διατηρούνται με διαδοχικό πέρασμα σε ποντίκια SCID. Η LuCaP 86,2 ξενομόσχευμα εκφράζει ένα γνωστό C-τερματικού παραλλαγή περικομμένο AR AR

v567es που είναι ενεργά. Η LuCaP 35 ξενομόσχευμα εκφράζει μόνο μεγάλη τύπου AR [25]. Φρέσκα LuCaP 35 και 86,2 ξενομοσχεύματος ιστοί χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση Western. Είκοσι δύο CRPC μεταστατικούς ιστούς από αυτοψία ασθενείς ταχεία αντιστοιχούν στους ιστούς στον ανθρώπινο TMA είχε καταψύχθηκαν γρήγορα σε υγρό άζωτο μετά την εκτομή και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Κλινικά δεδομένα που αφορούν τα 42 αυτοψία ασθενείς παρουσιάζεται στον Πίνακα 2.

Η

Αντίστροφη Μεταγραφή-PCR (RT-PCR) και ποσοτική RT-PCR (qRT-PCR)

Συνολική ιστός RNA απομονώθηκε από κιμά φρέσκο ​​ιστό χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Δύο μικρογραμμάρια ολικού RNA υποβλήθηκε σε πέψη με DNase Ι, και αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας Superscript First-Strand Synthesis System (Invitrogen). PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας AmpliTaq Gold® PCR Master Mix (Applied Biosystems). Τα προϊόντα PCR αναλύθηκαν σε 2% φωτογραφιών gel και εικόνα αγαρόζης ελήφθησαν με τη χρήση AlphaDigiDoc σύστημα Pro απεικόνισης από την Alpha Innotech (San Leandro, CA). Αντιδράσεις qRT-PCR έγιναν χρησιμοποιώντας ένα Applied Biosystems ανιχνευτή 7900 ακολουθία με 5 ng του cDNA, 200 ηΜ κάθε ζεύγος εκκινητών και Power SYBR Green ΡΟΚ Master Mix ή TaqMan Οικουμενική PCR Master Mix από την Applied Biosystems.

Η γονιδιακή έκφραση επίπεδα μετρήθηκαν με σχετική ποσοτικοποίηση μεταξύ των δειγμάτων RNA, και πολλαπλές μεταβολές έκφρασης προσδιορίστηκαν με τη μέθοδο 2-ΔΔCT [31]. Όλα τα πειράματα qRT-PCR διεξήχθησαν εις τριπλούν, και το γονίδιο οικοκυρικής RPL13A χρησιμοποιήθηκε ως ενδογενής έλεγχος.

Οι αλληλουχίες εκκινητών που καταγράφονται στον Πίνακα 3.

Η

Κυτταροκαλλιέργεια και διέγερση

κύτταρα VCAP που εκφράζουν τόσο την AR

FL και AR

v567es παραλλαγή αναπτύχθηκαν σε 80% συρροή σε πλάκες 30 mm σε μέσο RPMI 1640 με 5% ορό, και στη συνέχεια άλλαξαν σε μέσο RPMI-1640 με 5% απογυμνωμένο από ξυλάνθρακα ορό για 24 ώρες. Διυδροτεστοστερόνη (DHT) 10

-9 Μ, MDV-3100 50 ηΜ, ή MDV-3100 συν DHT προστέθηκαν στις καλλιέργειες. Μετά από 24 ώρες, το ολικό RNA συλλέχθηκε από φρεάτια εις διπλούν για qRT-PCR για την ανίχνευση AR

FL, AR

v567es και μεταγραφές AR-V7. Το πείραμα επαναλήφθηκε 6 φορές με κάθε φορά τριπλούν, και τα αποτελέσματα qRT-PCR ομαλοποιήθηκαν σε ομάδα θεραπείας DHT.

Western Blotting

Φρέσκα ιστός ομογενοποιήθηκε και λύθηκαν με ψυχρό ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl

2, 1 mM EGTA, 1% Triton Χ-100) που περιέχει Halt ™ αναστολείς πρωτεάσης κοκτέιλ και φωσφατάσης Αναστολέας (Thermoscientific). Πλήρεις προϊόντα λύσης διαχωρίστηκαν σε SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, μπλοκαριστεί σε 5% γάλα-PBS-Tween και ανιχνεύθηκαν με τα αντίστοιχα όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Οι μεμβράνες επωάστηκαν με ένα χρένου δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση (Cell Signaling) και αναπτύχθηκε με ECL (Pharmacia Biotech). Οι μεμβράνες απογυμνώθηκαν για 30 λεπτά σε απογύμνωσης Ρυθμιστικό (Thermoscientific) και επανα-διερευνήθηκαν με αντι-β-ακτίνης αντίσωμα ως έλεγχος φόρτωσης (Sigma-Aldrich). Ανεξάρτητα πειράματα επικυρωμένη ότι αυτή η διαδικασία απογύμνωσης δεν οδήγησε σε απώλεια του σήματος.

Ανοσοϊστοχημεία

φορμαλίνη σταθερές τομές ιστών εγκλεισμένων σε παραφίνη (5 μm) αποπαραφινοποιήθηκαν και επανυδατώθηκαν. Το αντιγόνο ανάκτηση διεξήχθη με 10 mM κιτρικό ρυθμιστικό (ρΗ 6.0) σε μια χύτρα ταχύτητας (20 psi για 10 λεπτά). Η ενδογενής υπεροξείδιο και βιοτίνη /αβιδίνη αποκλείστηκε για 15 λεπτά με τις αντίστοιχες παράγοντες (Vector Laboratories). Μετά από επώαση με 5% φυσιολογικό ορό κατσίκας-horse-κοτόπουλο σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα, οι τομές επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα (Πίνακας 1) στους 4 ° C όλη τη νύκτα ακολουθούμενο από βιοτινυλιωμένα δευτερογενή αντισώματα και αντιδραστήριο SABC (Vector Laboratories). DAB (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε ως χρωμογόνο και αιματοξυλίνη ως αντιχρώση. Ποντίκι ή IgG κουνελιού, ανάλογα με την περίπτωση, στην ίδια συγκέντρωση όπως το πρωτογενές αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας και δεν δείχνουν μη ειδική χρώση [32].

Ανοσοϊστοχημική

αξιολόγηση

Λίγα άχρηστα πυρήνες βρέθηκαν στο TMAs λόγω πυρήνα ιστό λείπει, νέκρωση του καρκίνου, ή ανεπαρκής καρκινικά κύτταρα. Αυτοί οι πυρήνες είχαν αποκλειστεί από τα αποτελέσματα.

Ανοσοβαφή αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα ημι-συνεχές βαθμολογία πυρηνική AR, που δημιουργήθηκε από τον πολλαπλασιασμό κάθε επίπεδο έντασης (0 για χωρίς λεκέ, 1 για ασθενή λεκέ, και 2 για την έντονη χρώση) από το αντίστοιχο ποσοστό των θετικών κυττάρων, και στη συνέχεια αθροίζοντας τα αποτελέσματα.

Ki-67 χρώση μετρήθηκε με τυχαία επιλογή μέχρι 4 πεδία 250 μm

2 σε κάθε θέση ιστού. Συνολικός αριθμός κυττάρων και Ki67 θετικός αριθμός κυττάρων μετρήθηκαν, και η τελική τιμή του δείκτη Ki-67 υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας θετικός αριθμός κυττάρων δια του συνολικού αριθμού των κυττάρων.

AR αντισώματα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη στοχευμένη τρεις ευδιάκριτες περιοχές του ανθρώπινου AR πρωτεΐνη. Τα ανοσογόνα του AR F39.4.1 (κατά aa301-320) και AR441 (κατά aa299-315) βρίσκονταν στην Ν-τερματική του AR, ενώ AR C-19 (έναντι aa900-919) στο Ο-τερματικό. Ως εκ τούτου, περιγράφουμε AR F39.4.1 και AR441 ως Ν-τερματικό αντισώματα Ar και Ar, C-19 ως C-τερματικό αντίσωμα AR. Ειδικά μοτίβα AR πυρηνικών ανοσοχρώση αξιολογήθηκαν ως: N + C + (παρόμοια θετικά Ν-τερματικά και C-τερματικά χρώση AR στον πυρήνα)? N + C ↓ (C-τερματικό όρος AR μειώθηκε περισσότερο από 50% σε σύγκριση με Ν-τερματικό στον πυρήνα) και Ν-C- (παρόμοια αρνητική Ν- και C-τερματικών χρώση AR στον πυρήνα). Οι ιστοί της ομάδας Ν ↓ C + δεν συμπεριλήφθηκαν επειδή ήταν σπάνια, και όχι σε σχέση με το C-τελικό κουτσουρεμένο AR παραλλαγές.

Η στατιστική ανάλυση

Στατιστικές αναλύσεις των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού Prism (Prism Graphpad), όπου χρησιμοποιείται το τεστ Mann-Whitney, και

σ

τιμές ≤0.05 επελέγησαν ως στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

μορφών εναλλακτικού ματίσματος AR θα μπορούσε να πιστοποιούνται χρησιμοποιώντας Ν- και Ο-τερματικά αντισώματα

Αρκετές παραλλαγές μεταγραφής AR περιγραφεί ότι κωδικοποιούν πολυπεπτίδια AR στερείται του Ο-τερματικού LBD λόγω εναλλακτικό μάτισμα εξωνίου [21], [24] – [28] . Ωστόσο, ειδικά αντισώματα δεν είναι διαθέσιμα για την ανίχνευση όλων αυτών των παραλλαγών σε ιστό. Δεδομένου ότι τα αντισώματα έχουν αναπτυχθεί προς συγκεκριμένες Ν-τερματικά και Ο-τερματικά πεδία του AR πρωτεΐνης, επιδιώξαμε να καθοριστεί εάν αυτά τα αντιδραστήρια θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για τη διάκριση του προστάτη που εκφράζουν διαφορετικές μορφές AR. Για την επικύρωση αυτή την προσέγγιση, αξιολογήσαμε δύο πρώτες γραμμές του προστάτη ξενομοσχεύματος που προέρχονται στο εργαστήριο ενός από τους συγγραφείς (RLV) και είναι γνωστό ότι εκφράζουν διαφορετικά mRNA AR-κωδικοποιούν. Η LuCaP 86,2 ξενομοσχεύματος, που προέρχεται από ανθρώπινο μετάσταση κύστη PCa και διατηρήθηκε με σειριακή διέλευση σε μη ευνουχισμένων ποντίκια SCID, έχει δειχθεί να κατέχει μια κολοβωμένη παραλλαγή AR ματίσματος C-τερματικό που παραλειφθεί εξώνια 5-7 και κωδικοποιεί μια εναλλακτική πλαίσιο ανάγνωσης από εξώνιο 8 , ορίζεται AR

v567es. Το ξενομόσχευμα LuCaP 35 προήλθε από ένα PCa λεμφαδένα μετάσταση και εκφράζει AR πλήρους μήκους (AR

FL) που κωδικοποιεί mRNA αποτελείται από 8 εξώνια και μιας πρωτεΐνης του κατάλληλου μεγέθους για αυτό το μεταγράφημα [25].

Αναλύσαμε πρωτεϊνών που προέρχονται από LuCaP 86,2 και LuCaP 35 ξενομοσχεύματα με κηλίδα Western χρησιμοποιώντας αντισώματα που αναγνωρίζουν Ν-άκρο (AR 441) ή Ο-άκρο (AR C-19) του AR

FL πρωτεΐνη. Στον όγκο LuCaP 35, και τα δύο αντισώματα AR ανίχνευσε ένα παρόμοιο 110 KDa AR πολυπεπτίδιο που αντιστοιχούσε στο μέγεθος του AR

FL. Στον όγκο LuCaP 86,2, δίπλα σε ένα ασθενές 110 KDa μπάντα, Ν-τερματικό αντίσωμα AR εντόπισαν επίσης μια ισομορφή 80 kDa, AR που αντιστοιχούσε στο προβλεπόμενο μέγεθος των Ο-τελικό κουτσουρεμένο AR ματίσματος παραλλαγή-AR

v567es ενώ η C-τερματική αντίσωμα AR δεν είχε (Σχήμα 1Α).

(Α) ανάλυση κηλίδας Western της έκφρασης AR σε LuCaP 86,2 και LuCaP 35 όγκους ξενομοσχεύματος. (Β) IHC χρώση για το Ν- και C-τερματικών AR επί LuCaP 86.2 (α και β) και LuCaP 35 (γ και δ) ξενομοσχεύματος όγκους. χρώσης (C) IHC για PSA (ε), PSMA (στ), Χρωμογρανίνης-Α (ζ), Synaptophysin (h), Ki67 (i) και αρνητικό μάρτυρα (ι) επί LuCaP 86,2 ξενομοσχεύματος. (D) IHC χρώση για PSA (k), PSMA (L), Χρωμογρανίνης-A (m), Synaptophysin (n), Ki67 (o) και αρνητικού ελέγχου (ρ) επί LuCaP 35 ξενομοσχεύματος. (Αρχική x200 μεγέθυνση, τοποθετήστε Χ400).

Η

Παρόμοια με αποτέλεσμα την Western blot, ανοσοϊστοχημική ανάλυση (IHC) της LuCaP 86,2 έδειξε πολύ ασθενή πυρηνική χρώση χρησιμοποιώντας το C-τερματικό AR (AR c-19) αντίσωμα, αλλά έντονη πυρηνική χρώση σε σειριακή τομή με αντίσωμα έναντι AR Ν-τερματικό (AR F39.4.1). Η LuCaP 35 όγκων, φαίνεται να εκφράσει μόνο AR

FL με ανάλυση Western, δεν έδειξε καμία διαφορά μεταξύ Ν και χρώση AR C-τερματικό με IHC (Εικόνα 1Β). Αυτά τα δεδομένα επιβεβαίωσαν ότι συγκρίνοντας την Ν-τερματική AR με C-τερματικό έκφραση AR θα μπορούσε να προσδιορίσει C-τελικό κουτσουρεμένο παραλλαγές AR /μεταλλάξεις στο PCa ιστό.

AR

v567es έχει δειχθεί ότι είναι συστατικώς δραστική [25 ], αυτό είναι συνεπές με το γεγονός ότι παρατηρήθηκε διαφορετική AR ανοσοαντιδραστικότητα με Ν- και C-τερματικά αντισώματα στον πυρήνα. Για να επιβεβαιώσετε περαιτέρω δραστηριότητα πυρηνική AR, που βάφονται για το AR-ρυθμίζεται PSA και πρωτεΐνες PSMA. LuCaP 86,2 ήταν ανοσοδραστική τόσο PSA και PSMA. Για να επιβεβαιώσετε ότι LuCaP 86.2 δεν ήταν μια γραμμή νευροενδοκρινείς ξενομόσχευμα, θα βάφονται με νευροενδοκρινείς βιοδείκτες Χρωμογρανίνης Α (CHG-Α) και Synaptophysin (ΣΥΝ). LuCaP 86,2 έδειξε αρνητική CHG-A ανοσολογική αντίδραση, και αδύναμη έως μέτρια ΣΥΝ ανοσολογική ως πρόστιμο, κοκκώδες προϊόν της αντίδρασης που κυρίως εντοπίζεται στο περιφερικό κυτταρόπλασμα των κυττάρων. Επιπλέον, περίπου το 20% των καρκινικών κυττάρων ήταν θετικό Κί67 υποδεικνύοντας LuCaP 86,2 είχε ένα μέτριο ρυθμό πολλαπλασιασμού (Σχήμα 1 C). Αντίστοιχα αποτελέσματα IHC για LuCaP 35 επίσης φαίνεται στο Σχήμα 1D.

Παραλλαγές στο Ν-τελικό και C-τερματικό έκφραση AR σπάνια εμφανίστηκε σε καλοήθεις επιθήλιο και πρωτοβάθμια χωρίς θεραπεία του προστάτη

Για τον προσδιορισμό της συχνότητας των C-τερματικό παραλλαγές περικομμένο AR σε καλοήθεις επιθήλιο και μη εντοπισμένο προστάτη, εμείς σκόραρε IHC χρώση ριζική προστατεκτομή δείγματα. Όλα τα 28 δείγματα φυσιολογικού προστάτη είχαν σύμφωνη έκφραση Ν-τερματικού και Ο-τερματικού της πυρηνικής AR (N + C +) (Σχήμα 2Α α και β). Μεταξύ των υπερπλαστικών δείγματα 24 προστάτη, 21 περιπτώσεις (87,5%) έδειξε συνεπείς N + C + έκφρασης (Σχήμα 2Α γ και δ), μόνο 1 (4,2%) είχαν μειωθεί C-τερματικό χρώση AR (Ν + C ↓) και 2 (8,3 %) δεν έχουν καμία ανοσολογική AR (NC-). Σε 50 πρώτων δειγμάτων PCa, 46 περιπτώσεις (92%) εξέφρασε N + C + AR (Σχήμα 2Α e-h), 2 περιπτώσεις (4%) είχαν μειωθεί πυρηνικής C-τερματικό εναντίον χρώση AR Ν-τερματικό (Ν + C ↓) , ενώ 2 περιπτώσεις (4%) ήταν AR αρνητικό (NC-). Συνολικά, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην αναλογία των Ν- vs. C-τερματικό πυρηνικών ένταση χρώσης μεταξύ φυσιολογικό προστάτη και τα δείγματα υπερπλαστικών προστάτη (

σ

= 0,5756), κανονικό προστάτη και τα δείγματα προστάτη (

p

= 0,7428), και υπερπλαστικών προστάτη και δείγματα προστάτη (

σ

= 0.7508) (Σχήμα 2Β).

(Α) χρώση IHC για Ν- και C-τερματικών AR σε κανονική προστάτη (ΝΡ) (α και β), υπερπλασίας του προστάτη (ΗΡ) (γ και δ) και του πρωτογενούς PCa (ΕΗ) (μεγέθυνση χ200). (Β) Σύγκριση των προφίλ χρώση AR μεταξύ φυσιολογικό προστάτη, υπερπλασίας του προστάτη και του πρωτογενούς ΣΕΣ. (C) Σύγκριση των προφίλ χρώση AR μεταξύ πρωτοβάθμιας προστάτη και μεταστατικές CRPC.

Η

Παραλλαγές στο Ν-τελικό και C-τερματικό έκφραση AR συνέβη συχνά στο CRPC

Για τον προσδιορισμό της συχνότητας των έκφραση παραλλαγή AR στο μεταστατικό ΣΕΣ, που σκόραρε IHC χρώση των μεταστατικών τόπων από τους 42 ασθενείς που πέθαναν προηγμένων CRPC.

Μεταξύ 162 μεταστατικές θέσεις, 103 (63,6%) sites έδειξαν συνεπή έκφραση της πυρηνικής AR και με τα δύο αντισώματα (Ν + C +). Ωστόσο, 39 (24,1%) θέσεις είχαν μια πυρηνική Ο-τερματικό όρος AR (Ν + C ↓) που ήταν τουλάχιστον 50% μικρότερο από το αντίστοιχο Ν-τερματικό σκορ AR, και 20 (12,3%) θέσεις μετάστασης δεν είχε καμία πυρηνική έκφραση AR (NC-) (Σχήμα 2C). Αυτά τα αποτελέσματα IHC ήταν σε συμφωνία με τη συχνότητα των παραλλαγών ματίσματος AR στο μεταστατικό προστάτη προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας μεθόδους PCR για την ανίχνευση AR-V7 /AR3 και AR

v567es μεταγραφές [25]. Δεν υπήρχε διαφορά στο Ν-τερματικό χρώση AR μεταξύ πρωτογενών και μεταστατικών προστάτη (

σ

= 0,38, τα δεδομένα δεν δείχνουν), αλλά η συχνότητα της μειωμένης C-τερματικό έκφραση της πυρηνικής AR στο μεταστατικό CRPC ήταν σημαντικά υψηλότερη από ό, τι στην πρωτοβάθμια προστάτη (

σ

= 0,0027). Η σύγκριση της έκφρασης πυρηνικών AR μεταξύ πρωτογενών και μεταστατικών PCa CRPC φαίνεται στο Σχήμα 2C.

AR-ρυθμιζόμενη γονιδιακή έκφραση μεταβλήθηκε σε μεταστατικό CRPC με μειωμένη πυρηνική C-τερματικό AR

Για να προσδιοριστεί εάν η μείωση στην C-τερματική έκφραση πυρηνικών AR συσχετίστηκε με μια μεταβολή στην έκφραση των ρυθμιζόμενων πρωτεϊνών AR, που αντιπροσωπεύει μια απώλεια δραστικότητας AR, εξετάσαμε AR ρυθμιζόμενες πρωτεΐνες PSA, η έκφραση PSMA, και TMPRSS2 στα μεταστατικά CRPC δείγματα (Σχήμα 3Α) . Ενώ μόλις λείπει σημασία, η έκφραση του PSA σε θέσεις μεταστατικού N + C ↓ ήταν χαμηλότερη από N + C + μεταστατικές θέσεις (

σ

= 0,0505). έκφραση PSA σε Ν-C- μεταστατικές θέσεις ήταν σημαντικά χαμηλότερη από τις δύο θέσεις μεταστατικής N + C + και N + C ↓ (

ρ

& lt? 0.001) (Σχήμα 3Β). Επιπλέον, η έκφραση του PSMA σε N + C + μεταστατικές θέσεις ήταν υψηλότερη από ό, τι στο N + C sites μεταστατικό ↓ (

σ

= 0,0097), αλλά PSMA σε NC-μεταστατικές θέσεις ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ό, τι τόσο N + C + και sites μεταστατικό N + C ↓ (

σ

& lt? 0.0001) (Σχήμα 3Β). Τέλος, η έκφραση της TMPRSS2 σε N + C + μεταστατικές θέσεις ήταν σημαντικά υψηλότερη από ό, τι sites μεταστατικό N + C ↓ (

σ

= 0.045). TMPRSS2 σε Ν-C- μεταστατικές θέσεις ήταν σημαντικά χαμηλότερη από τις δύο θέσεις μεταστατικής N + C + και N + C ↓ (

ρ

& lt? 0,01) (Σχήμα 3Β). Η απώλεια της έκφρασης TMPRSS2 σε Ν + C ↓ και NC- μεταστατικές θέσεις δεν ήταν τόσο έντονη όσο η απώλεια του PSA και PSMA έκφραση, γεγονός που υποδηλώνει ότι TMPRSS2 δεν μπορεί να ρυθμίζεται από τον AR στο ίδιο επίπεδο όπως PSA και PSMA σε CRPC.

(α) χρώση IHC για Ν-τερματική AR (α), Ο-τερματικό AR (β), PSA (γ), PSMA (d), TMPRSS2 (ε), ΑΚΤ-1 (στ), Κί -67 (ζ), Αρνητικός μάρτυρας (h) σε μεταστατικό CRPC ιστού (μεγέθυνση x200, εισάγετε χ400). (Β) PSA, PSMA, TMPRSS2 και AKT-1 προφίλ χρώση των CRPC.

Η

Στη συνέχεια εξετάσαμε τα γονίδια που έχουν προσδιοριστεί ότι έχουν αυξημένη έκφραση τους σε απάντηση AR-άκρο περικομμένο παραλλαγές [ ,,,0],26], [29], συμπεριλαμβανομένων των ΑΚΤ1, CDC20, CDK1, c-myc, CyclinA2, UGT2B17 και UBE2C. Ποσοτικά αποτελέσματα RT-PCR έδειξε ότι ΑΚΤ1, CDC20, CDK1 και έκφραση UGT2B17 ήταν σημαντικά υψηλότερα στα ↓ N + C (n = 11) σε σύγκριση με + C + δείγματα N (n = 7), (ρ & lt? 0,05) (Σχήμα 4Α) . UBE2C κινήθηκαν επίσης υψηλότερα, αλλά δεν έφθασε σημαντικότητα (p & lt? 0.10). Διαπιστώσαμε περαιτέρω έκφραση της πρωτεΐνης ΑΚΤ-1 από την IHC. Ωστόσο, ο αριθμός σχετικά χαμηλό κύκλο υποδεικνύεται σχετικά υψηλά επίπεδα γονιδιακής έκφρασης σε όλες τις περιπτώσεις. Ως εκ τούτου, όταν βάφονται επίσης την TMA για ΑΚΤ1, σχετικά ισχυρό σήμα ήταν παρούσα στα περισσότερα από τα δείγματα όγκων για την ΤΜΑ και δεδομένων των ημι-ποσοτικές μετρήσεις, δεν ανιχνεύθηκαν διαφορές μεταξύ των ομάδων με IHC (Σχήμα 3Β). Έτσι, καρκίνοι με Ν + C ↓ AR εκφραζόμενη υψηλότερα επίπεδα ΑΚΤ1, αλλά αυτή η διαφορά δεν μπορούσε να ανιχνευθεί στην IHC λόγω άφθονη πρωτεΐνη σε όλες τις ομάδες.

(Α) Προφίλ του επτά AR γονιδίων που σχετίζονται παραλλαγή έκφραση σε ανθρώπινα μεταστατικό ιστούς. (Β) Το ίδιο γονίδια μετρήθηκαν σε LuCaP 86,2 και LuCaP 35 ξενομοσχεύματα. Το γονίδιο καθαριότητας RPL13A χρησιμοποιήθηκε ως ενδογενή έλεγχο.

Η

Η απώλεια του C-τερματικού AR ανοσολογική αντίδραση πυρηνικής συσχετίστηκε με την έκφραση των παραλλαγών AR στο μεταστατικό CRPC

διαπιστώσαμε ότι η απώλεια του Ο-τερματικού AR ανοσοαντιδραστικότητας εμφανίστηκε συχνά σε μεταστατικό CRPC. Αυτή η απώλεια των Ο-τερματικών ανοσοαντιδραστικότητας θα μπορούσε να οφείλεται στην έκφραση ενός αριθμού γνωστές (π.χ. AR-V7 /AR3, ή AR

v567es) και άγνωστες παραλλαγές ματίσματος AR. Για να προσδιοριστεί εάν η Ν- και Ο-τερματικό ανοσοαντιδραστικότητα συνδέθηκε με παραλλαγές AR μεταγραφής, εκτελέσαμε RT-PCR σε ένα υποσύνολο των μεταστατικών CRPC ιστών και συνέκριναν τα αποτελέσματα RT-PCR με τα αποτελέσματα IHC (Πίνακας 4). 4 Ν + Γ + μεταστατικό δείγματα εξετάστηκαν με RT-PCR, όλοι εξέφρασαν AR

FL (ένας είχε επίσης περιορισμένη έκφραση του AR-V7). 8 μεταστατικό δείγματα ταξινομούνται ως N + C ↓ με ανάλυση IHC, όλοι εξέφρασαν την AR

FL και 6 (75%) εξέφρασε επίσης τουλάχιστον μία γνωστή παραλλαγή AR (AR-V7 /AR3 ή /και AR

v567es ) με RT-PCR. Αυτά N + C ↓ μεταστατικό δείγματα παρουσίασαν επίσης τα μικρότερα επίπεδα PSA και PSMA ανοσολογική αντίδραση. Καμία από τις τέσσερις NC-μεταστατικό δείγματα εξέφρασε το AR

FL εξετάζονται με RT-PCR, αν και ένας έδειξε πολύ χαμηλό επίπεδο του AR

v567es έκφρασης.

Η

Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι η ανάλυση IHC χρησιμοποιώντας διαφορετικά αντισώματα AR αναγνωρίζουν περιοχές της πρωτεΐνης ξεχωριστή AR ήταν ιδιαίτερα σύμφωνη με μεταγραφές κωδικοποιούν AR

FL και παραλλαγές ματίσματος AR που στερούνται C-τερματικό εξώνια.

AR mRNA παραλλαγή ήταν ευαίσθητα στην ανδρογόνα συγκέντρωση in vitro

κύτταρα VCAP καλλιεργήθηκαν σε ξυλάνθρακα ριγέ ορό (CSS), και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διυδροτεστοστερόνη (DHT), MDV-3100 ή MDV-3100 με DHT, χωριστά. qRT-PCR έδειξε ότι AR

mRNA FL κατεστάλη με την προσθήκη DHT, MDV-3100 και DHT + MDV (Σχήμα 5Α). Η παραλλαγή AR

v567es mRNA επίσης καταστέλλεται από DHT? Ωστόσο, θα μπορούσε να αυξηθεί με την προσθήκη ανδρογόνων ανταγωνιστή υποδοχέα MDV-3100 μόνο, και καταστέλλεται με το επίπεδο του CSS όταν DHT προστέθηκε με MDV-3100 (Σχήμα 5Β). AR-V7 mRNA ανταποκρίθηκαν με παρόμοιο τρόπο όπως AR

FL (Σχήμα 5C).

(Α) AR

FL mRNA κατεστάλη από DHT, MDV-3100 και MDV-3100 + DHT αλλά όχι στο επίπεδο θεωρείται από DHT μόνο. (Β) AR

v567es mRNA κατεστάλη με την παρουσία του DHT, αυξάνεται περαιτέρω με την προσθήκη του MDV-3100 και καταστέλλεται με το επίπεδο του CSS όταν DHT προστέθηκε μαζί με MDV-3100. (C) AR-V7 mRNA ανταποκρίθηκαν με παρόμοιο τρόπο όπως AR

FL.

Η

Η ετερογενής έκφραση του AR παρατηρήθηκε σε μεμονωμένους ασθενείς

Εντοπίσαμε C-τελικό κουτσουρεμένο AR πρωτεϊνών σε πολλαπλές μεταστατικές θέσεις από κάθε μία από 42 CRPC ασθενείς (Σχήμα 6). Από τους 42 ασθενείς, 16 (38%) δεν είχαν απώλεια των Ο-τερματικών έκφραση AR, 23 (55%) είχαν τουλάχιστον ένα μεταστατικό site με μειωμένη πυρηνική C-τερματικό AR ανοσοαντιδραστικότητα, και 6 (14,3%) είχαν τουλάχιστον ένα ιστοσελίδα χωρίς την έκφραση AR. Τα στοιχεία αυτά υπογραμμίζουν την ετερογένεια της έκφρασης AR μεταξύ διαφορετικών μεταστατικές θέσεις μέσα στον ίδιο ασθενή.

Πολλαπλές μεταστατικές θέσεις των 42 CRPC ασθενείς είχαν αναλυθεί από την IHC χρησιμοποιώντας 2 AR αντισώματα. Τα αποτελέσματα χρώσης συνοψίστηκαν ως N + C + (μπλε), N + C ↓ (πορτοκαλί) και Ν-C- (κόκκινο). LN = λεμφαδένων? L = οσφυϊκό σπόνδυλο? R. = δεξιά? Λ = αριστερή? T = θωρακικού σπονδύλου

Η

Επιπλέον, για να καθοριστεί εάν η κατάσταση AR προώθησε το ρυθμό ανάπτυξης του όγκου, χωρίσαμε τις CRPC δείγματα μετάσταση στα οστά σε τρεις ομάδες:. N + C + (n = 93), N + C ↓ (n = 39), και NC- (n = 18). Ο δείκτης Ki67 για τις περιοχές N + C + ήταν 18%. Αυτό δεν ήταν σημαντικά διαφορετική από τις τοποθεσίες Ν + C ↓ (20,8%) (p = 0,4225) ή οι τοποθεσίες NC- (17,8%) (p = 0,95).

Συζήτηση

Παραδοσιακά έννοιες της AR μετατόπιση προς τον πυρήνα που περιλαμβάνουν συνδετήρας σύνδεσης, αποσύνδεσης από συνοδούς και πυρηνική μετατόπιση σημαίνει ότι χωρίς ανδρογόνων συνδέτη, AR θα βρεθεί κυρίως στο κυτταρόπλασμα και CRPC την εξέλιξη του όγκου θα πρέπει να καθοδηγείται από τους μηχανισμούς πλην εκείνων που αφορούν AR. Ωστόσο, αυτό δεν συμβαίνει με εξαίρεση πλέον νευροενδοκρινών όγκων. CRPC συνήθως διαθέτουν ένα μεταγραφικά ενεργή AR που ρυθμίζει την έκφραση των AR ρυθμιζόμενης αγγελιοφόρων RNA [1], [33]. Επιπλέον, στις περισσότερες μελέτες για CRPC ιστούς, το AR έχει βρεθεί στον πυρήνα.

Πολλαπλές μηχανισμοί έχουν προταθεί για να εξηγήσουν AR πυρηνικού εντοπισμού και μερικά ή όλα μπορεί να είναι υπεύθυνη για αυτό που παρατηρήθηκε σε CRPC [34], [35]. Οι περισσότεροι από τους προτεινόμενους μηχανισμούς θα ήταν σε θέση να μετατοπίζονται το AR στον πυρήνα καθώς απαιτούν την δέσμευση συνδέτη με την LBD. Αν αυτή ήταν η περίπτωση, με την προϋπόθεση ότι δεν υπάρχουν διαφορές στο AR δομές, θα περιμέναμε να δούμε καμία διαφορά στο AR ανοσοχρώση με Ν- ή C-τερματικό κατευθύνεται αντισωμάτων σε μεταστατικό CRPC. Ωστόσο, όπως θα δείξουμε στη μελέτη αυτή, υπάρχει μια σημαντική διαφορά μεταξύ των πυρηνικών Ν- και αντισώματα τερματικό AR C- στους μεταστατικούς ιστούς. Αυτό υποδηλώνει ότι ο μηχανισμός (ες), εκτός από αυτά που αναφέρονται παραπάνω θα μπορούσαν επίσης να συμμετέχουν κατά τη διάρκεια AR μετατόπιση στον πυρήνα χωρίς συνδετήρα σε CRPC.

Παρά το γεγονός ότι έχουν αντισώματα έχουν αναπτυχθεί για το AR-V7 /AR3 και AR

παραλλαγές v567es ματίσματος, τουλάχιστον 20 παραλλαγές AR ματίσματος έχουν αναφερθεί μέχρι σήμερα. Με ειδικά αντισώματα διαθέσιμα για μόνο 2 από τις παραλλαγές, η χρήση ειδικής χρώσης αντισώματος επί του ιστού για την ανίχνευση C-τερματικού παραλλαγές κολοβωμένη AR ευνουχισμός επαγόμενη δεν είναι εφικτή [20] – [25]. Εδώ, έχουμε αναπτύξει μια νέα και ταχεία ανοσοϊστοχημική προσέγγιση που συγκρίνει Ν- και C-τερματικών AR ανοσοαντιδραστικότητα, η οποία μπορεί να δείξει με επιτυχία τη συνολική συχνότητα του C-τερματικού παραλλαγές κολοβωμένη AR ματίσματος σε ασθενείς.

Τα δεδομένα που αναφέρονται εδώ συσχέτιση η έκφραση της πρωτεΐνης με AR IHC με 2 αντισώματα και την επικύρωση της έκφρασης των παραλλαγών ματίσματος AR με RT-PCR, υποδεικνύουν έντονα ότι η διακύμανση μεταξύ AR Ν- και αποτελέσματα ο-άκρο ανοσοαντιδραστικότητα από την έκφραση των εναλλακτικών AR mRNA. Ωστόσο, εναλλακτικές εξηγήσεις θα πρέπει να ψυχαγωγηθούν. Οι πρωτογενείς όγκους και μεταστάσεις μαλακών ιστών μονιμοποιήθηκαν με φορμαλίνη και εμβαπτισμένο σε παραφίνη ενώ οι μεταστατικές βλάβες του οστού σταθεροποιήθηκαν με φορμαλίνη και απασβεστωμένες με 10% μυρμηκικό οξύ πριν την ενσωμάτωση σε παραφίνη. Δεν παρατηρήσαμε καμία σημαντική διαφορά στην κηλίδωση AR σε μαλακό ιστό έναντι μετάσταση στα οστά (ρ & gt? 0,05, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, δεν έχουμε δει διαφορές με άλλα αντισώματα μεταξύ του οστού και μέθοδοι μαλακών παρασκευάσματος ιστού χρησιμοποιώντας τις ίδιες μεθόδους και τους ιστούς [36], [37]. Ως εκ τούτου, δεν ήταν σε θέση να προσδιορίσει μια τεχνική λόγος για τις διαφορές στην χρώση.