Αφηρημένο

Ιστορικό

Up-ρύθμιση του πιο άφθονα οικογένεια Η ανθρώπινη ενδογενή ρετροϊό (HERV-H), ιδιαίτερα env που σχετίζονται με μεταγραφές, συσχετίζεται με τον καρκίνο του παχέος εντέρου. Ωστόσο, πρότυπο έκφρασης συγκολλημένα μη-κωδικοποίησης μεταγραφές του HERV-H δεν είναι σαφής.

Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση

Σε αυτή τη μελέτη, η έκφραση του HERV-H ματισμένα μεταγραφήματα σε καρκίνο του παχέος εντέρου διερευνήθηκε από μια στρατηγική RT-PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές στοχεύουν το tRNA

θέσης πρόσδεσης του εκκινητή His και την περιοχή R στην 3 ‘μακρά τερματική επανάληψη (LTR), που ακολουθείται από κλωνοποίηση και αλληλούχιση των αμπλικονίων. Ακολουθίες στη συνέχεια ανατίθενται σε μεμονωμένους HERV-Η τόπους χρησιμοποιώντας ιδιωτικές διαφορές νουκλεοτιδίων μεταξύ των τόπων. Διαφορετικά πρότυπα έκφρασης του HERV-Η ματισμένα μεταγραφήματα από διακριτά ενεργά στοιχεία βρέθηκαν σε καρκίνο του παχέος εντέρου ΗΤ29 κυτταρικές σειρές, LS 174Τ, RKO, SW480 και SW620. Επιπλέον, τα πρότυπα έκφρασης σε SW480 και RKO μεταβλήθηκαν σημαντικά με επεξεργασία απομεθυλίωση. Είναι ενδιαφέρον, περισσότερα στοιχεία HERV-H βρέθηκαν να είναι μεταγραφικά ενεργό σε ιστούς όγκων του παχέος εντέρου σε σχέση με το παρακείμενο φυσιολογικούς ιστούς (14

vs.

7).

Συμπεράσματα /Σημασία

Αυτή είναι η πρώτη έρευνα για τη μελέτη του χαρακτήρα της έκφρασης του μη-κωδικοποίησης ματισμένα μεταγραφήματα στοιχείων HERV-H στον καρκίνο του παχέος εντέρου. πρότυπα έκφρασης των HERV-Η ματίσματος διέφερε μεταξύ των κυτταρικών σειρών καρκίνου του παχέος εντέρου και θα μπορούσαν να επηρεαστούν από γονιδιωματική επίπεδα μεθυλίωσης του DNA. Το πιο σημαντικό, εκτός από την κοινώς αποδεκτή άποψη του πάνω ρύθμιση της έκφρασης HERV-H σε καρκινικούς ιστούς παχέος εντέρου, βρήκαμε πιο ενεργό loci HERV-Η σε όγκο του κόλου σε σύγκριση με παρακείμενες φυσιολογικούς ιστούς

Παράθεση:. Liang Q , Xu Z, Xu R, Wu L, Zheng S (2012) πρότυπα έκφρασης των μη-κωδικοποίησης ματίσματος από Ανθρωπίνων ενδογενής Ρετροϊών HERV-Η Elements στον Καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 7 (1): e29950. doi: 10.1371 /journal.pone.0029950

Επιμέλεια: Klaus Roemer, του Πανεπιστημίου του Saarland Ιατρική Σχολή, Γερμανία

Ελήφθη: 15, Σεπ, 2011? Αποδεκτές: 7η Δεκεμβρίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 6η Ιανουαρίου 2012

Copyright: © 2012 Liang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τη Διεθνή Συνεργασία του Ιδρύματος Επιστήμης και Τεχνολογίας Βασικά της επαρχίας Zhejiang (2009C14010), Ίδρυμα Zhejiang Provincial Φυσικών Επιστημών (R2090353), Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (30973382 και 81101488). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ανθρώπινο ενδογενείς ρετροϊούς (HERVs) αποτελούν το 8% του ανθρώπινου γονιδιώματος [1]. Έχουν συναχθεί ότι προέρχονται από τη μόλυνση των γεννητικών κυττάρων από εξωγενείς ρετροϊούς κατά τη διάρκεια των πρωτευόντων εξέλιξη [2]. Η προϊική δομή των στοιχείων HERV αποτελείται κυρίως από 5 ‘LTR-

gag

–

pro

–

pol

–

env

-3′ LTR, σε τα οποία τα τέσσερα γονίδια (

gag

: ομάδα-ειδικό αντιγόνο,

pro

: πρωτεάσης,

pol

: πολυμεράσης, και

env

: φάκελο) κωδικοποιούν δομικές /λειτουργικές πρωτεΐνες απαραίτητες για μια ικανότητα αντιγραφής ρετροϊού, και οι μακρές τερματικές επαναλήψεις (LTR) και στα δύο άκρα διαφέρουν HERVs από άλλα ρετροτρανσποζόνια όπως μακριές διάσπαρτες πυρηνικών στοιχεία (γραμμές). Τα περισσότερα από τα υπολείμματα των HERVs απλά απομονώνονται LTR αντίτυπα, με την εσωτερική αλληλουχία έχει χαθεί κατά τη διάρκεια ολοκλήρωσης ή μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού. Οι οικογένειες HERV ορίζονται με διαφορετικά κριτήρια, όπως ομοιογένεια στην εξωγενή αντίστοιχά τους, ομοιότητα αλληλουχίας των

pol

γονιδίων, και την θέση πρόσδεσης εκκινητή (PBS) αμέσως προς τα κάτω του 5 ‘LTR. H οικογένεια HERV (HERV-H) περιέχει PBS με μια αλληλουχία παρόμοια με την ανθρώπινη tRNA

Του. Υπάρχουν περίπου χίλια HERV-Η στοιχείων σε όλο το ανθρώπινο γονιδίωμα, και οι περισσότεροι από αυτούς (800-900) στερούνται σχεδόν το σύνολο του

env

περιοχή [3], [4]. Έχει αναφερθεί ότι μόνο το 18 HERV-H στοιχεία στο ανθρώπινο γονιδίωμα είναι σχετικά πλήρης [5], και μόνο τρεις ταυτοποιήθηκαν να περιέχουν άθικτο

env

ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης (ORFs) [6].

Αν και τα περισσότερα από τα στοιχεία HERV-H είναι δομικά ατελής λόγω της μετάλλαξης και τη διαγραφή κατά τη διάρκεια της εξέλιξης, υπάρχουν εκατοντάδες από αυτούς διατηρούν πλήρη LTRs 5 ‘και 3’ και PBS-tRNA

του αμέσως μετά το 5 ‘ LTR [7]. Η έκφραση των στοιχείων HERV είναι κυρίως υπό τον έλεγχο των Ι_ΤΡδ τους [8]. Ένα πλήρες στοιχείο LTR έχει μια δομή του U3-R-U5 (5 ‘→ 3’), που περιέχει τόσο έναρξη μεταγραφής και τερματισμό σημάτων. Η μεταγραφή των στοιχείων HERV συνήθως ξεκινά από την περιοχή R στο 5 ‘LTR και τερματίζει στο τέλος της περιοχής R στην 3’ LTR. Προτείνεται επίσης ότι ο τύπος εξαρτώμενη κυτταρική έκφραση των στοιχείων HERV ελέγχεται συνήθως από ειδικές ρυθμιστικές αλληλουχίες που βρίσκονται κυρίως στην περιοχή U3 [9].

Λόγω της ανοσοκατασταλτικής ιδιότητα της πρωτεΐνης περιβλήματος του HERV-H, πολλές μελέτες επικεντρώθηκαν στις

env

-σχετικών μεταγραφές [10], και εν λόγω η

env

-σχετικών μεταγραφές σπάνια δοθεί προσοχή. Up-ρύθμιση του πιο άφθονα οικογένεια H HERV, ειδικά

env

-σχετικών μεταγραφές, έχει αναφερθεί ότι σχετίζεται με καρκίνο του παχέος εντέρου [5], [11], [12]. Σε προηγούμενη μελέτη μας, παρατηρήσαμε ότι υπήρχαν πολλά συγκολλημένα μη κωδικοποιητική RNA που μεταγράφεται από στοιχεία HERV-Η, τόσο υπό κανονικές συνθήκες και καρκινικούς ιστούς παχέος εντέρου, καθώς και του παχέος εντέρου καρκινικές κυτταρικές σειρές. Ωστόσο, το πρότυπο έκφρασης των ματισμένων μη-κωδικοποίησης μεταγραφές από HERV-Hs δεν είναι σαφής. Κατά τη διάρκεια των μελετών για τα τρία πρόσφατα ταυτοποιημένα HERV-Η-συναφή γονίδια [13], [14], [15] στο εργαστήριό μας, παρατηρήσαμε ότι η συνολική έκφραση των στοιχείων HERV-Η σε καρκίνο του παχέος εντέρου ήταν πολύπλοκη και διαφορετική μεταξύ των δειγμάτων όγκων και παρακείμενα φυσιολογικά δείγματα. Παρατηρήσαμε επίσης ότι πολλοί

env

-deleted HERV-Hs ήταν μεταγραφικά ενεργή, και πολλά συγκολλημένα μη κωδικοποιητικού RNA μεταγράφηκαν σε τόσο όγκο και φυσιολογικούς ιστούς, καθώς επίσης και κυτταρικές γραμμές καρκίνου. Σε αυτή τη μελέτη, θα ξεκινήσει την πρώτη μελέτη για να μάθετε την ακριβή τόπους από τα πιο ενεργά στοιχεία HERV-H στον καρκίνο του παχέος εντέρου.

Αποτελέσματα

Η στρατηγική της RT-PCR-αλληλουχίας για να συνδέετε HERV -Η μη-κωδικοποίησης μεταγραφές

Δεδομένου ότι υπάρχουν πάνω από χίλια μέλη της οικογένειας HERV-H σε όλο το ανθρώπινο γονιδίωμα, με αλληλουχίες χαμηλής πολυπλοκότητας και ομόλογες προς ένα με το άλλο, είναι δύσκολο να μελετηθεί το προφίλ τους μεταγραφή από λαμβάνοντας κάθε μέλος υπόψη. Για να το προφίλ της έκφρασης του HERV-H στον καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές, όγκων του παχέος εντέρου και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών, και να προσδιορίσει την ακριβή τόπους από τα πιο ενεργά στοιχεία HERV-H, έχουμε αναπτύξει μια στρατηγική RT-PCR-κλωνοποίησης για να συνδέσετε ένα επιλεγμένη ομάδα HERV-Η-που σχετίζονται με μεταγραφές. Η μεταγραφή των στοιχείων HERV τυπικά ξεκίνησε από την περιοχή 5 ‘R και τερματίζεται στο τέλος της περιοχής 3’ R [16]. Σχεδιάσαμε τους εκκινητές με αναφορά στην αλληλουχία της συναίνεσης HERV-H κατασκευάζονται με Jern

et al.

[5], με την προς τα εμπρός εκκινητή στόχευση του PBS-tRNA

κατάντη του από το 5 ‘LTR και ο αντίστροφος εκκινητής που στοχεύουν στην περιοχή R του 3 ‘LTR (Εικ. 1Α). Αυτό το ζεύγος των εκκινητών έπρεπε να παράγουν προϊόντα PCR από HERV-H μεταγραφές διαφόρων μεγεθών. Κατά συνέπεια, το σύνολο των προϊόντων RT-PCR κλωνοποιήθηκαν εντός των ρΟΕΜ-Τ Easy φορείς και επιμολύνονται σε

E. coli

. Περισσότερα από τριάντα αποικίες από κάθε δείγμα επιλέχθηκαν τυχαία και τα πλασμίδια στη συνέχεια αλληλουχήθηκαν. αποτελέσματα Sequencing αποδόθηκαν σε συγκεκριμένα HERV-Η loci βασίζεται στην ιδιωτική νουκλεοτιδικές διαφορές μεταξύ των μεμονωμένων τόπων (ένα ή περισσότερα νουκλεοτίδια που είναι χαρακτηριστικές για ένα τόπο HERV-Η). Αποτελέσματα αλληλούχισης όλων των τυχαία επιλεγμένων αποικιών έδειξε ότι δεν ένθετα ήταν από μη HERV-H μεταγραφές, αποδεικνύοντας τη στρατηγική μας λειτούργησε καλά.

Α. Σχηματική επίδειξη των τοποθεσιών αστάρι. TSS, θέση έναρξης της μεταγραφής? TTS, μεταγραφή θέση τερματισμού. Β RT-PCR πραγματοποιήθηκε για την ανίχνευση HERV-Η ματισμένα μεταγραφήματα σε κόλον καρκινικές κυτταρικές γραμμές με /χωρίς θεραπεία ακετυλίωση απομεθυλίωση /ιστόνης με χρήση του παράγοντα απομεθυλίωσης DNA DAC και τον αναστολέα TSA αποακετυλάσης ιστόνης. Η2Ο και μείγμα γονιδιωματικού DNA (gDNA μείγμα) χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Γονιδιωματικό μίγμα DNA που παράγεται ζώνες διαφορετικές από τα δείγματα cDNA, τα οποία μεταγράφεται αντίστροφα από ϋΝάση RNA.

Η

Η έκφραση του HERV-H ματισμένα μεταγραφήματα σε καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές, και τροποποιημένη έκφραση σε απόκριση DNA απομεθυλίωση θεραπεία

δοκιμασίες RT-PCR διεξήχθησαν επί πέντε κόλον καρκινικές κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένων ΗΤ29, LS 174Τ, RKO, SW480 και SW620. Διαφορετικά πρότυπα μπάντα ελήφθησαν από αυτές τις κυτταρικές σειρές (Σχ. 1Β αριστερά). Παρατηρήθηκε μία σχετικώς χαμηλότερο επίπεδο έκφρασης HERV-Η σε RKO. Έχει αναφερθεί ότι υπάρχει DNA μεθυλίωση σε παγκόσμιο επίπεδο γονιδιώματος με τη στόχευση επαναληπτικές αλληλουχίες [17], έτσι ώστε να διερευνηθεί περαιτέρω αν η θεραπεία απομεθυλίωση θα αλλάξει το μοτίβο μεταγραφής του στοιχεία HERV-H. Τα καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αναστολείς της μεθυλίωσης του DNA και της ιστόνης δεακετυλάσης (DAC και TSA αντίστοιχα). RT-PCR αποτελέσματα έδειξαν ότι τα πρότυπα έκφρασης του HERV-Η μεταβλήθηκαν σημαντικά σε SW480 και RKO κύτταρα (Εικ. 1Β δεξιά). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η επιγενετική πλαίσιο ενός γονιδιώματος επηρέασε την έκφραση ορισμένων από τα στοιχεία HERV-H.

προϊόν RT-PCR της κάθε κυτταρικής σειράς καρκίνου του παχέος εντέρου αναλύθηκε περαιτέρω με αλληλούχηση μετά την κλωνοποίηση. αποτελέσματα Sequencing αποδόθηκαν σε γονιδιωματικό τόπους δια BLAT αναζητήσεις κατά τη συναρμολόγηση ανθρώπινο γονιδίωμα (hg19). Γονιδιωματικό DNA αλληλουχίες στη συνέχεια ανακτήθηκαν και αναλύθηκαν με RepeatMasker για τον προσδιορισμό των αλληλουχιών HERV-H. Μόνο ένας περιορισμένος αριθμός στοιχείων HERV-H βρέθηκαν να είναι μεταγραφικά ενεργή σε κάθε μία από αυτές τις κυτταρικές σειρές, με έξι θέσεις (επτά στοιχεία) σε ΗΤ29 και δύο ή τρεις σε κάθε μία από τις άλλες κυτταρικές γραμμές (Πίνακας 1).

Χαρακτηρισμός των ενεργών στοιχείων HERV-η και συγκολλημένα μεταγραφές τους σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου

Pair-σοφός ευθυγραμμίσεις πραγματοποιήθηκαν με την 9,0-kb συναίνεση HERV-η κατασκευάστηκε από Jern

et al.

να καθορίσει τα πρότυπα κομμάτι-διαγραφή του κάθε στοιχείου HERV-H. Αποτελέσματα Ευθυγράμμιση έδειξαν όλα τα στοιχεία HERV-Η δραστική σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου ήταν διαρθρωτικά ατελής, με το μακρύτερο μία είναι 6488 bp μακρύς (Πίνακας 1 και Εικ. S1). Έξι θραύσματα βρέθηκαν να διαγραφεί συνήθως σε αυτά τα στοιχεία, μεταξύ των οποίων ένα σύντομο ένα στο

gag

περιοχή, τέσσερις στο

pol

περιοχή, και σχεδόν ολόκληρο το

env

περιοχή (Εικ. 2Α). Υπήρξαν κάποιες εξαιρέσεις. Το στοιχείο που βρίσκεται στο 16q24.1 (που δραστηριοποιούνται στην ΗΤ29) και το ένα βρίσκεται στο 22q11.1 (που δραστηριοποιούνται στην LS 174Τ) ήταν εξαιρετικά μικρή (Εικ. 2Β). Το ένα στο 16q24.1 ήταν μόνο 3.185 bp σε μήκος, με το σύνολο του

gag

περιοχή και ένα μεγάλο κομμάτι που περιλαμβάνει το

pol

και

env

διαγράφονται. Το ένα στο 22q11.1 άργησε 3842 bp, με σχεδόν το σύνολο του

pol

και

env

περιοχές διαγράφονται. Τα περισσότερα από τα αμπλικόνια ( εντολή = εκκίνηση). αποτελέσματα Sequencing εξαιρέθηκαν εάν οι αλληλουχίες-μεταξύ των εκκινητών είχαν περισσότερα από πέντε ανομοιότητες προς το γενωμικό DNA. Γονιδιωματικό DNA αλληλουχίες ανακτήθηκαν από το συγκρότημα ανθρώπινο γονιδίωμα (hg19) σε https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway. Ακολουθίες αναλύθηκαν με το RepeatMasker εργαλείο στη https://www.repeatmasker.org/cgi-bin/WEBRepeatMasker για τον εντοπισμό επαναλαμβανόμενων στοιχείων. Κατά ζεύγη ευθυγραμμίσεις διεξήχθησαν με GeneDoc. πρόβλεψη ORF πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το online πρόγραμμα ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html). Στη συνέχεια, ακολουθίες υποθετικές αμινοξέων καταραμένος κατά της μη πλεονασματική βάση δεδομένων πρωτεϊνική ακολουθία χρησιμοποιώντας το online πρόγραμμα BLASTP (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

υποβολή Ακολουθία

Ένα σύνολο από 92 νουκλεοτιδικές αλληλουχίες των πρόσφατα εντοπίστηκαν HERV-Η ματίσματος έχουν κατατεθεί σε dbEST με αριθμούς προσχώρησης της JK017330-JK017415 και JK475044-JK475049 (με 7 EST αριθμούς ένταξη βιβλιοθήκη LIBEST_027280 – 027286).

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

ανά ζεύγη ευθυγραμμίσεις για κάθε στοιχείο HERV-H έγιναν με τη συναίνεση HERV-Η κατασκευάστηκε από Jern P,

et al

. Τα αποτελέσματα συντομευθεί ευθυγράμμιση φαίνεται να υποδεικνύουν τα ελλείποντα περιοχές με ακρίβεια. πυκνότητα χρώμα αντιπροσωπεύει την έκταση της ομολογίας με την συναινετική HERV-H. Γραμμές αντιπροσωπεύουν διαγραμμένες περιοχές στα στοιχεία HERV-H σε σχέση με την συναινετική HERV-H. Κόκκινο ορθογώνια υποδεικνύουν τις περιοχές όπου έτρεφε υποθετικό ΑΠΑ, ενώ το κόκκινο ορθογώνια με παχιές γραμμές υποδεικνύουν τα ORF με συντηρημένες περιοχές. Περιφέρειες της LTRs, προ-gag,

gag

,

pro

,

pol

και

env

επισημαίνονται παρακάτω. Γενωμική θέση του κάθε στοιχείου HERV-H υποδεικνύεται αντίστοιχα στη δεξιά πλευρά

doi:. 10.1371 /journal.pone.0029950.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

ανά ζεύγη ευθυγραμμίσεις για κάθε στοιχείο HERV-H έγιναν με τη συναίνεση HERV-Η κατασκευάστηκε από Jern P,

et al

. Τα αποτελέσματα συντομευθεί ευθυγράμμιση φαίνεται να υποδεικνύουν τα ελλείποντα περιοχές με ακρίβεια. πυκνότητα χρώμα αντιπροσωπεύει την έκταση της ομολογίας με την συναινετική HERV-H. Γραμμές αντιπροσωπεύουν διαγραμμένες περιοχές στα στοιχεία HERV-H σε σχέση με την συναινετική HERV-H. Κόκκινο ορθογώνια υποδεικνύουν τις περιοχές όπου έτρεφε υποθετικό ΑΠΑ, ενώ το κόκκινο ορθογώνια με παχιές γραμμές υποδεικνύουν τα ORF με συντηρημένες περιοχές. Περιφέρειες της LTRs, προ-gag,

gag

,

pro

,

pol

και

env

επισημαίνονται παρακάτω. Γενωμικού τόπου του κάθε στοιχείου HERV-H υποδεικνύεται αντίστοιχα στη δεξιά πλευρά. Ο αριθμός του κάθε στοιχείου εμφανίζεται στα αριστερά όπως φαίνεται στον Πίνακα 2.

doi: 10.1371 /journal.pone.0029950.s002

(ΔΕΘ)

Ευχαριστίες

Η συγγραφείς είναι ευγνώμονες στην κα Heather Σίμκιν για την επιμέλεια του χειρογράφου.