Αφηρημένο

Οι Oncocytic όγκους των κυττάρων που χαρακτηρίζεται από τη συσσώρευση μορφολογικά ανώμαλα μιτοχονδρίων στα κύτταρα τους, προτείνοντας ένα ρόλο για την ανώμαλη μιτοχονδριακού βιογένεση στο μετασχηματισμό oncocytic κυττάρων. Λίγα είναι γνωστά για την αιτία της δυσμορφολογία των συσσωρευμένων μιτοχόνδρια. Οι πρωτεΐνες που ρυθμίζουν την μορφολογία των μιτοχονδρίων, οι «μιτοχόνδρια-διαμόρφωση» πρωτεΐνες, μπορούν να διαμορφώσουν το μέγεθος και τον αριθμό τους? Ωστόσο, τίποτα δεν είναι γνωστό μέχρι σήμερα σχετικά με μια πιθανή εμπλοκή της μιτοχονδριακής δυναμική στο μετασχηματισμό oncocytic κυττάρων σε όγκους. Ο στόχος μας ήταν να εκτιμηθεί η κατάσταση της μορφολογίας μιτοχόνδρια και ο ρόλος του στην μεταμόρφωση oncocytic κύτταρο. Ως εκ τούτου, αξιολόγησε την πρότυπο έκφρασης από τους κύριους μιτοχονδριακών πρωτεϊνών σύντηξης και σχάσης σε μια σειρά δειγμάτων του θυρεοειδούς κυττάρων του όγκου, καθώς και σε κυτταρικές σειρές του θυρεοειδούς του όγκου, με και χωρίς oncocytic χαρακτηριστικά των κυττάρων. Η έκφραση του μιτοχονδριακού σύντηξης (OPA1, Mfn1 και Mfn2) και σχάση (Drp1 και Fis1) πρωτεΐνες εκτιμήθηκαν με ανοσοϊστοχημεία (IHC) σε μια σειρά από 88 ανθρώπινων όγκων του θυρεοειδούς.

In vitro μελέτες

, για συγκριτικούς σκοπούς και να εμβαθύνει τη μελέτη, πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση TPC1 – ένα θηλώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς που προέρχεται από κυτταρική σειρά και XTC.UC1, μια oncocytic θυλακιώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς που προέρχονται από κυτταρική σειρά. Τόσο IHC και

in vitro

πρωτεΐνη αναλύσεις έδειξαν μια συνολική αύξηση στα επίπεδα της «μιτοχονδριακής-διαμόρφωση» πρωτεΐνες σε oncocytic όγκους του θυρεοειδούς. Επιπλέον, η υπερέκφραση της πρωτεΐνης Drp1 προ-σχάση βρέθηκε να σχετίζεται με κακοήθεις όγκους του θυρεοειδούς oncocytic. Είναι ενδιαφέρον ότι, η γενετική και φαρμακολογική παρεμπόδιση της δραστηριότητας Drp1 ήταν σε θέση να επηρεάσει την ικανότητά μετανάστευση /την εισβολή του καρκίνου του θυρεοειδούς κύτταρα », ένα χαρακτηριστικό της κακοήθειας του όγκου. Στην παρούσα μελέτη δείξαμε ότι ανισόρροπη μιτοχονδριακή δυναμική χαρακτηρίζουν τα κακοήθη χαρακτηριστικά του θυρεοειδούς oncocytic κυττάρων, και να συμμετέχουν στην απόκτηση του φαινοτύπου μεταναστευτική

Παράθεση:. Ferreira-da-Silva Α, Valacca C, Ρίος Ε, Pópulo Η Soares P, Sobrinho-Simões M, et al. (2015) Μιτοχονδριακή Dynamics Πρωτεΐνη Drp1 υπερεκφράζεται σε Oncocytic θυρεοειδούς και ρυθμίζει τον καρκίνο κυτταρική μετανάστευση. PLoS ONE 10 (3): e0122308. doi: 10.1371 /journal.pone.0122308

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Marc Liesa, Boston University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 1, Οκτώβρη 2014? Αποδεκτές: 19 Φεβ 2015? Δημοσιεύθηκε: 30, Μαρτίου 2015

Copyright: © 2015 Ferreira-da-Silva et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού και της Υποστήριξη αρχείων Πληροφορίες

Χρηματοδότηση:. η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από το έργο PIC /IC /83037/2007 (σε VM), το έργο MFAG-12120 από AIRC και GR-2011- 02351643 από το Υπουργείο Υγείας της Ιταλίας (σε SC). Περαιτέρω χρηματοδότηση λήφθηκε από το έργο «μικροπεριβάλλον, του μεταβολισμού και του καρκίνου» που βασίζεται σε IPATIMUP και υποστηρίζεται μερικώς από Programa Operacional Περιφερειακής ντο Νόρτε (ON.2-O Novo Norte), υπό την Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN), και μέσω της Fundo Europeu de Desenvolvimento Περιφερειακή (ΕΤΠΑ). IPATIMUP είναι Αναπληρωτής Εργαστήριο του Υπουργείου Επιστημών, Τεχνολογίας και Τριτοβάθμιας Εκπαίδευσης της Πορτογαλίας και υποστηρίζεται εν μέρει από την πορτογαλική Ίδρυμα για την Επιστήμη και την Τεχνολογία (FCT). Η μελέτη ήταν επίσης FCT μέσω επιχορήγησης διδακτορικό στο AFS (Σχετ .: SFRH /BD /39104/2007)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Η συν-συγγραφέας Luca Scorrano δεν είναι πια μια Συντακτική μέλος του Διοικητικού Συμβουλίου PLoS ONE, δεδομένου ο ίδιος παραιτήθηκε πριν από την ημερομηνία υποβολής των συγγραφέων. Έτσι, τίποτα δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE Editorial πολιτικές και κριτήρια.

Τα Εισαγωγή

Τα καρκινικά κύτταρα είναι γνωστό ότι υφίστανται μια μετατόπιση στη βασική μεταβολικές οδούς τους, μια διαδικασία που συχνά περιγράφεται ως η «

Warburg αποτέλεσμα

«, σύμφωνα με την οποία, ακόμη και κάτω από υψηλή πίεση του οξυγόνου που παράγουν το μεγαλύτερο μέρος της ATP τους από γλυκόλυση [1]. Αυτή η μετατόπιση στο μεταβολισμό έχει αναφερθεί να συνοδεύεται από μια αλλαγή στη μιτοχονδριακή μορφολογία και το μέγεθος, αν και οι μοριακές λεπτομέρειες που συνοδεύουν τις μορφολογικές αλλαγές που σχετίζονται με την επίδραση Warburg παραμένουν ανεξήγητα, επίσης αφού ελάχιστα είναι γνωστά σχετικά με το πώς μιτοχονδριακή μορφολογία ρυθμίζεται [2,3 ]. Τα τελευταία χρόνια έχουν δει την ταυτοποίηση των στοιχείων πυρήνα του μιτοχονδριακού μηχανημάτων δυναμική, μια αυξανόμενη ομάδα των πρωτεϊνών, οι οποίες, μεταξύ άλλων κυτταρικών λειτουργιών, ρυθμίζουν μιτοχονδριακή σύντηξη και σχάση. Μιτοχονδριακή δυναμική δυσλειτουργία έχει σταδιακά αποκαλυφθεί σε ένα μεγάλο αριθμό παθολογικών καταστάσεων, ιδιαίτερα νευροεκφυλιστικών νόσων και του καρκίνου [4].

Μία συγκεκριμένη ομάδα ασυνήθιστο όγκων έχει αναφερθεί σε σχεδόν σε κάθε όργανο, με μεγαλύτερη συχνότητα σε θυρεοειδή και νεφρό [5,6]. Τέτοιοι όγκοι έχουν κύτταρα με μια ξεχωριστή ιδιαίτερα ηωσινοφιλική, κοκκώδη και πρησμένα κυτταρόπλασμα, με μεγάλους πυρήνες και εξέχοντα πυρήνια [7,8,9,10]. Η ηλεκτρονική μικροσκοπία έδειξε ότι αυτό πρησμένο εμφάνιση οφείλεται σε ανώμαλη συσσώρευση μιτοχονδρίων εμφανίζει ανώμαλη μορφολογία [11,12,13]. Οι όγκοι αυτοί περιγράφονται ως oncocytic-, oxyphilic-, ηωσινοφιλική, «Hürthle-κυττάρων (όταν αναφέρονται στο θυρεοειδή) όγκων» ή ως «oncocytomas». Για λόγους απλότητας, θα τους ορίσει ως «oncocytomas» ή «oncocytic κυττάρων όγκων» [10]. Στην τρέχουσα κλινική πρακτική, τα κριτήρια για τη διάγνωση των oncocytic παραλλαγές των κυττάρων του θηλώδους καρκινώματος του θυρεοειδούς (PTC) και θυλακιώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς (FTC) περιλαμβάνουν τα πυρηνικά χαρακτηριστικά, τα σημάδια της κάψας ή /και αγγειακή εισβολή που μοιράζονται με τους όγκους μη oncocytic κυττάρων του ίδιου είδους, καθώς και το μιτοχονδριακό πολλαπλασιασμό χαρακτηριστική για oncocytic όγκους των κυττάρων [5,6,7]. Πράγματι, αυτή η ιδέα ότι η oncocytic μετασχηματισμός λαμβάνει χώρα στην κορυφή του «συμβατικά» όγκοι υποστηρίζεται από παρόμοιες γενετικές μεταβολές του oncocytic καρκινώματα και μη oncocytic αντίστοιχά τους, τα οποία εμφανίζουν μια συγκρίσιμη συχνότητα εμφάνισης των διαφόρων γενετικών ανωμαλιών, όπως RET /PTC ανακατατάξεις και BRAFV600E μεταλλάξεις [6,14,15,16,17,18]. Αν και οι πρώτες συστάσεις θεωρούνται όλα τα oncocytic όγκους του θυρεοειδούς κακοήθεις, αργότερα μελέτες έχουν δείξει ότι όσο οι υποθέσεις σωστά κατανεμημένες ανάλογα με τον κλινικο-παθολογικών τους χαρακτηριστικά, όπως η ηλικία των ασθενών, σταδιοποίηση των όγκων και των χειρουργικών procedure- την πρόγνωση των ασθενών με oncocytic κυττάρων PTC και FTC παραλλαγές είναι παρόμοια με εκείνη των ασθενών με τις αντίστοιχες συμβατικές, μη-oncocytic καρκινώματα [3,5,17,19].

Οι κύριες διαφορές μεταξύ oncocytic και μη oncocytic όγκων κατοικούν στην συχνότητα των διακυμάνσεων που βρέθηκαν στο μιτοχονδριακό DNA (mtDNA) και γονίδια πυρηνικό DNA που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες των μιτοχονδρίων [2,5,20,21]. Από αυτά, ένα μεγάλο διαγραφή 5kb, που συχνά αναφέρεται ως η «κοινή διαγραφή» που εξαλείφει ένα αριθμό γονιδίων mtDNA και διαταράσσει την αντιγραφή mtDNA και μεταγραφή, συναντάται συχνά σε oncocytic όγκων του θυρεοειδούς και σχετίζεται με την αύξηση της μιτοχονδριακής μάζα [20, 22,23,24].

Τα στοιχεία στο αρχείο δείχνουν ότι μεταλλάξεις σε γονίδια οξειδωτική φωσφορυλίωση (OXPHOS), δηλαδή σε γονίδια συγκρότημα Ι, μπορεί να οδηγήσει σε δυσλειτουργία του συστήματος OXPHOS και μπορεί να οδηγήσει στη συσσώρευση μη φυσιολογικών μιτοχονδρίων [ ,,,0],20,25]. Χρησιμοποιώντας εργαλείων βιοπληροφορικής, έχουμε δείξει πρόσφατα ότι η υψηλή παθογένεια μεταλλάξεις του mtDNA, δηλαδή σε γονίδια για συγκρότημα Ι, οδηγούν στο oncocytic φαινότυπο [21].

Παραλλαγές της μεταθετάσης της εσωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης 44 ομόλογο (TIMM44), ότι είναι μέρος του μιτοχονδριακού συστήματος πρωτεΐνη εισαγωγής έχουν επίσης περιγραφεί σε οικογενείς μορφές oncocytic όγκων του θυρεοειδούς? Αυτό υποδηλώνει ότι η απορρύθμιση του μιτοχονδριακού μηχανήματα εισαγωγής και, κατά συνέπεια, της λειτουργίας των μιτοχονδρίων σχετίζονται με ανώμαλη μιτοχονδριακή βιογένεση [26].

Ένα εντυπωσιακό χαρακτηριστικό των συσσωρευμένων μιτοχόνδρια στο oncocytic όγκους των κυττάρων είναι ανώμαλη δομή και τη μορφολογία τους. Αυτό δείχνει μια απορρύθμιση και στις πρωτεΐνες που ελέγχουν μιτοχονδριακή δυναμική, τις «μιτοχόνδρια-διαμόρφωση» πρωτεΐνες, μια διαδικασία που εξαρτάται από μιτοχονδριακή σύντηξη και σχάση και άρρηκτα συνδεδεμένη με μιτοχονδριακή βιογένεση, τη διανομή, τη σηματοδότηση και την απόπτωση [27,28,29]. Είναι ενδιαφέρον ότι, ανισορροπία του φαινοτύπου μιτοχονδρίων προς τον κατακερματισμό ενορχηστρώνει τη μεταναστευτική ικανότητα σε κύτταρα όπου μετανάστευσης αντιπροσωπεύει ένα καίριο φυσιολογική λειτουργία, όπως Τ-κυτταρικών λεμφοκυττάρων και καρκινικών μεταστατικών κυττάρων [30,31]. Πράγματι, προκειμένου να καταστεί δυνατή κίνηση, μιτοχόνδρια πρέπει να κατακερματιστεί να ευνοεί επανατοπικοποίηση και την πρόσληψή τους σε συγκεκριμένες υποκυτταρικές περιοχές. Στην περίπτωση των καρκινικών κυττάρων, ένας άμεσος συσχετισμός έχει αποδειχθεί μεταξύ του μεταστατικού βαθμό και τη Drp1 εξαρτώμενη κατακερματισμό των μιτοχονδρίων στον καρκίνο του μαστού [31]. Μιτοχονδριακή σχάση απαιτεί την κυτοσολική dynamin σχετίζονται πρωτεΐνη 1 (Drp1) και το μιτοχονδριακό τους υποδοχείς της σχάσης 1 (Fis1), μιτοχονδριακό παράγοντα σχάσης (ΠΔΠ) και μιτοχονδριακή Division (Mid) 49 και 51. Αντίθετα, η mitofusin εξωτερικής μεμβράνης (ΜΕΚ) 1 και 2 και η εσωτερική μεμβράνη dynamin-όπως οπτικό πρωτεΐνη ατροφία 1 (OPA1), διαμεσολαβεί μιτοχονδριακή σύντηξη [32,33]. Παρά τις γνωστές μιτοχονδριακό μορφολογικές αλλοιώσεις που παρατηρήθηκαν σε oncocytic όγκους των κυττάρων, η γνώση σχετικά με τα επίπεδα και ο ρόλος αυτών των μιτοχονδρίων-διαμόρφωση πρωτεϊνών είναι λιγοστά. Ως εκ τούτου, έθεσε ως στόχο να διερευνήσει εάν το μιτοχονδριακό δυναμική μεταβάλλεται σε oncocytic όγκους κυττάρων θυρεοειδούς. Τα δεδομένα μας υποδεικνύουν ότι οι πρωτεΐνες των μιτοχονδρίων σχάση Drp1 και Fis1 υπερεκφράζονται σε oncocytic όγκους των κυττάρων, και ότι τα επίπεδα έκφρασης Drp1 συσχετίζεται με κακοήθεια oncocytic κύτταρο όγκου

ex vivo

και με την ικανότητα μετανάστευσης ενός oncocytic θυρεοειδούς κυτταρική γραμμή όγκου

in vitro

. Είναι ενδιαφέρον ότι, η γενετική και φαρμακολογική παρεμπόδιση της Drp1 μειώνει τη μετανάστευση του oncocytic κυτταρική γραμμή όγκου, προσφέροντας μια νέα θεραπευτική προσέγγιση για την αντιμετώπιση των μεταστατικών όγκων oncocytic κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Η παρούσα μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με την εθνική ηθική και κανονιστική νομοθεσία για τη χρήση των βιολογικών δειγμάτων. Το υλικό που χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη αυτή προέρχεται από το «Banco de Tecidos e Tumores» (όγκοι και ιστών Τράπεζας) από το Νοσοκομείο de São João, Πόρτο, η οποία συγκεντρώνει όλα τα δείγματα μετά από γραπτή συγκατάθεση των ασθενών, ή κηδεμόνες τους, σε περίπτωση η ανηλίκων. Να έχουν πρόσβαση σε αυτά τα δείγματα, οι ερευνητές πρέπει να υποβάλει ένα σχέδιο στην Επιτροπή Δεοντολογίας του Νοσοκομείου de São João για έγκριση. Το έργο μας έχει εγκριθεί.

Ασθενής

επιλογή

Μια σειρά από 88 όγκων του θυρεοειδούς ανασύρθηκαν από τα αρχεία του Τμήματος Παθολογίας του Νοσοκομείου S. João (HSJ), Πόρτο. Δείγματα Θυρεοειδής ελήφθησαν από ασθενείς με ηλικίες από 15 έως 83 ετών. Η ιστολογική εξέταση όλων των δειγμάτων όγκου αναθεωρήθηκε ανεξάρτητα από δύο παθολόγους (ER και MSS) και η τελική κατάταξη έγινε σύμφωνα με τα κριτήρια του ΠΟΥ [34]. Η διάγνωση των θυρεοειδικών όγκων ήταν τα ακόλουθα: θυρεοειδή θυλακιώδη αδένωμα (FA, n = 19? 12 oncocytic και 7 μη-oncocytic), θυλακιώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς (FTC, η = 7? 1 oncocytic και 6 μη-oncocytic), θυλακιώδη παραλλαγή της θηλώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς (FVPTC, n = 30? 8 oncocytic και 22 μη-oncocytic), συμβατικά θηλώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς (cPTC, n = 32? 9 oncocytic και 23 μη-oncocytic).

Λόγω της μικρής παρακολούθηση των υποθέσεων που περιλαμβάνονται σε αυτή τη σειρά και στη συνακόλουθη περιορισμένο αριθμό εκδηλώσεων θανάτου, η συνολική επιβίωση δεν αναλύθηκε. Η παρούσα μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με την εθνική ηθική και κανονιστική νομοθεσία για τη χρήση των βιολογικών δειγμάτων.

Ιστός μικροσυστοιχιών (TMA)

αντιπροσωπευτικές περιοχές των διαφόρων βλαβών επιλέχθηκαν προσεκτικά για αιματοξυλίνη και ηωσίνη-βάφονται τμήματα και σημαδεύτηκαν σε μεμονωμένα μπλοκ παραφίνης. Δύο δοκίμια ιστού (διαμέτρου 3 mm το καθένα) λήφθηκαν από όλα τα επιλεγμένα δείγματα και έγιναν ακριβώς αποτίθενται εντός διπλούν TMA μπλοκ αποδέκτη παραφίνης χρησιμοποιώντας ένα όργανο ιστό-array (Beecher Instruments, Silver Spring, MD) όπως περιγράφεται αλλού [35]. Σε κάθε μπλοκ μικροσυστοιχιών ιστού, τομείς της μη νεοπλασματικών θυρεοειδικό ιστό συμπεριλήφθηκαν επίσης ως έλεγχοι. Πολλαπλές 3 μm τομές κόπηκαν από τα τεμάχια TMA και μεταφέρθηκε σε ultrafrost διαφάνειες.

Ανοσοϊστοχημική ανάλυση

Ανοσοϊστοχημική ανάλυση (IHC) πραγματοποιήθηκε σε 3 μm σταθεροποιημένο με φορμαλίνη, ενσωματωμένες σε παραφίνη τομές. Οι τομές επανυδατώθηκαν αποπαραφινοποιήθηκαν και σε μια σειρά μειούμενης συγκέντρωσης διαλυμάτων αιθανόλης. Αποπαραφινωθείσες ενιαίο δείγματα καθώς και τμήματα TMA υπέκειντο σε θερμότητα προκαλούμενη ανάκτηση αντιγόνου είτε σε 10 mM ρΗ 6 ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικού (κιτρικό νάτριο) ή σε 1 mM ρΗ8 αιθυλενοδιαμίνη ρυθμιστικό τετραοξικό οξύ (EDTA) (LabVision Corporation, Fremont, CA, USA), σε ένα μικροκύματα ορίζεται σε 300watts για 10 λεπτά.

Μετά την ανάκτηση διαλυμάτων είχε ψυχθεί, ιστοί ήταν αντικείμενο για 10 λεπτά για να μπλοκάρισμα της ενδογενούς ενεργότητας υπεροξειδάσης και της δέσμευσης με 3% H μη ειδικής

2O

2 και στο μεγάλο αριθμό Ultra V αντιδραστήριο Block (Thermo Scientific /Lab Vision, Fremont, USA) ανάλογα με το σύστημα ανίχνευσης που χρησιμοποιείται.

Οι τομές στη συνέχεια επωάστηκαν σε υγροποιημένο θάλαμο με τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα και κατά συνέπεια με τις προδιαγραφές του κατασκευαστή: κουνέλι πολυκλωνικό αντίσωμα ειδικό για Fis1 (1: 100) ref. ALX-210 – 907 από Alexis Biochemicals, τώρα Enzo Επιστημών Ζωής (Farmingdale, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ), μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού ειδικό για Drp1 (1: 100) ref. 611.112 και το μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού ειδικό για OPA1 (1: 100) ref. 612607, τόσο από την BD Biosciences (Franklin Lakes, New Jersey, USA), πολυκλωνικά κουνελιού ειδικά για Mfn1 (1: 250) ref. SC-50330 (Santa Cruz Biotechnology Santa Cruz, USA), μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού ειδικό για Mfn2 (1: 400) ref. 9927-M03 από Abnova, (Jhongli City, Ταϊβάν). Ως έλεγχος για μιτοχονδριακή πολυκλωνικό αντίσωμα περιεχόμενο ποντικού ειδικό για SDHA (1: 2000) ref. MS203, από Mitosciences, τώρα Abcam (Cambridge, UK) χρησιμοποιήθηκε. Προηγουμένως ήταν θετικοί έλεγχοι από θυρεοειδούς, του μαστού και των μυών συμπεριλήφθηκαν για όλα τα αντισώματα της σειράς. Οι αρνητικοί έλεγχοι διεξήχθησαν με αντικατάσταση του πρωτογενούς αντισώματος με μη άνοσο ορό ποντικού.

Η τεχνική ανοσοϊστοχημεία εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ένα σημασμένο σύστημα ανίχνευσης ανοσοϋπεροξειδάσης στρεπταβιδίνης-βιοτίνης (Thermo Scientific /Lab Vision, Fremont, USA) ή το Envision G /2 System /AP (K5355, Dako, Denmark) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

για MFN1 και SDHA η ανοσοϊστοχημική χρώση αναπτύχθηκε με DAB (3,3′-διαμινοβενζιδίνη) υπόστρωμα. Για τις υπόλοιπες αντισώματα η ανοσοχρώση πραγματοποιήθηκε με ή ο /2 System /AP (K5355, Dako, Δανία), και τα δείγματα Envision G αναπτύχθηκαν με μόνιμο κόκκινο χρωμογόνου.

ανοσοχρώση τυφλά ημι-ποσοτικά αξιολογούνται από δύο παρατηρητές (VM και AFS) χωρίς γνώση οποιουδήποτε κλινικών πληροφοριών από τις περιπτώσεις? μια βαθμολογία IHC αποκτήθηκε μέσα από το άθροισμα της έντασης της χρώσης (0- απουσιάζει? 1- λιποθυμίας? 2 μέτρια? 3- ισχυρή) από την επέκταση της χρωματισμένο καρκινικών κυττάρων (1-0 στο 25%? 2-25 στο 50% ? 3-50 σε 75%? 4- & gt? 75%). Αξιολόγηση του ποσοστού των ανοσοδραστικών κυττάρων για όλα τα αντισώματα έγινε με απαρίθμηση 300 κυττάρων όγκου σε τυχαία πεδία. Σε όλες τις περιπτώσεις αντιφατικά επιτεύχθηκε συναίνεση. Ως μιτοχονδριακό δείκτη, και ως ένα μέσο για να αξιολογήσει το ποσό των μιτοχονδρίων, τα επίπεδα έκφρασης SDHA έχουν πρόσβαση και να χρησιμοποιηθούν για την εξομάλυνση των αποτελεσμάτων μας. Σε κάθε δείγμα, συγκρίναμε την έκφραση των πρωτεϊνών που ενδιαφέρουν, τόσο υπό κανονικές συνθήκες και όγκου ιστών, έναντι χρώση SDHA. Έτσι, για κάθε περίπτωση, ήμασταν σε θέση να αξιολογήσει σε ένα άτομο και ακριβή τρόπο τις αλλαγές στην έκφραση της πρωτεΐνης στη μελέτη, ανεξάρτητα από το ύψος των μιτοχονδρίων, που υποδεικνύεται από την έκφραση SDHA.

Κυτταρικές σειρές

καρκίνος του θυρεοειδούς κυτταρικές σειρές: TPC1 (ευγενικά από Dumont JE και Mareel Μ-Εθνικό Κέντρο καρκίνου Research Institute, Τόκιο, Ιαπωνία), ένα PTC-κυτταρική γραμμή που λαμβάνεται, και XTC.UC1 (από Wong MG και Savagner F- Χειρουργική Service, Ιατρικό Κέντρο Βετεράνων Υποθέσεων, San Francisco, California), μία κυτταρική γραμμή που λαμβάνεται από ένα oncocytic παραλλαγή θυλακιώδες καρκίνωμα, χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Αμφότερες οι κυτταρικές σειρές είχαν προηγουμένως χαρακτηριζόμενη στο μοριακό και γονοτυπική επίπεδο [36,37]. κύτταρα TPC1 καλλιεργήθηκαν με μέσο RPMI με Glutamax συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS), 1% (ν /ν) Pen Strep και 0.5% (ν /ν) fungizone (όλα από την GIBCO, Invitrogen, Carlsbad, USA)? XTC.UC1 διατηρήθηκε με DMEM /F12 (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, USA) συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) FBS, ινσουλίνη σε 10 μg /mL, TSH στο κάθε συσκευασία 10 MU /ml (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA ), 1% Pen Strep (ν /ν) και 0,5% (ν /ν) fungizone. Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές επικυρώνονται χρησιμοποιώντας ανάλυση προφίλ DNA, που λαμβάνεται με το σύστημα PowerPlex 16 (Promega, Madison, USA), σύμφωνα με τα προφίλ DNA διαθέσιμο σε American Type Culture Collection και την υγεία Science Research Τράπεζα Resource.

κατασκευάσματα και επιμολύνσεις

κυτταροδιάλυμα GFP (ctGFP), μιτοχονδριακά στοχευμένες DsRed (mtRFP), μιτοχονδριακά στοχευμένες YFP (mtYFP) και ροϋΝΑ3.1-HA-K38A-DRP1 πλασμίδια που περιγράφηκε προηγουμένως και ήταν ένα δώρο από Τ Pozzan (ενετικό Ινστιτούτο Μοριακής Ιατρικής, Πάντοβα, Ιταλία) [33]. Ο κενός pcDNA3.1 ελήφθη από BD-Clontech και pcDNA3.1-HA-K38A-DRP1 γενιάς πλασμίδιο περιγράφηκε προηγουμένως [33]. κυτταρικές γραμμές XTC.UC1 διαμολύνθηκαν παροδικά με ηλεκτροπόρωση χρησιμοποιώντας την επιμόλυνση System Νέον (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Σε συν-επιμολύνσεις πειράματα, 1,5 μg του φορέα δείκτη (ctGFP σε επικοινωνούντα πειράματα) συν 3 μg του pcDNA 3.1 ή pcDNA3.1-HA-K38A-DRP1 χρησιμοποιήθηκαν ανά 2.0×10

6 κύτταρα. Ο συγκεκριμένος συνδυασμός των πλασμιδίων επιμολύνθηκαν σε κάθε πείραμα δεικνύεται στις λεζάντες σχήμα. Μετά από 24 ώρες, τα επιμολυσμένα κύτταρα ταξινομήθηκαν με FACS και χρησιμοποιήθηκαν για πειράματα 24 ώρες αργότερα.

ποσοτική PCR

Για την παρασκευή cDNA, 1 ng του συνολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα με τη χρήση του πρώτου κλώνου cDNA κιτ σύνθεσης RevertAid ( Fermentas, Burlington, ON, Καναδάς). Αντίστροφη μεταγραφή προϊόντα ενισχύθηκαν για όλα τα προαναφερθέντα γονίδια με qPCR χρησιμοποιώντας TaqMan PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Για την ανάλυση των δεδομένων

ακτίνη

και

hCyclophilin

χρησιμοποιήθηκαν ως ενδογενείς ελέγχους (στοιχεία εμφανίζονται μόνο για ακτίνη). Τα δεδομένα εκφράζονται ως σχετική έκφραση για κάθε άτομο γονίδιο κανονικοποιούνται στους αντίστοιχους ελέγχους.

Το ΑΒΙ PRISM 7500 Fast Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας (Applied Biosystems) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση του επιπέδου ενίσχυσης και προγραμματίστηκε σε αρχικό στάδιο 2 min στους 50 ° C, 10 λεπτά στους 95 ° C, που ακολουθείται από 45 κύκλους των 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα και 60 ° C για 1 λεπτό. 50 ng του cDNA για κάθε δείγμα χρησιμοποιήθηκε και όλες οι ενισχύσεις έγιναν εις τριπλούν. Η σχετική ποσοτικοποίηση των γονιδίων στόχων προσδιορίσθηκε με τη μέθοδο της ΔΔCT, η οποία προηγουμένως επικυρωθεί με τη Μέθοδο Livak της Γραμμικής Παλινδρόμησης (slope¼0.0696) (Sequence Detector Bulletin Χρήστης 2? Applied Biosystems).

Υποκυτταρική κλασματοποίηση και ανοσοκηλίδωση

Υποκυτταρική κλασμάτωση πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στο Frezza

κ.ά.

. [38]. Μιτοχονδριακή και κυτοσολικά κλάσματα λήφθηκαν και κηλιδώθηκαν με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-TOM20 (1: 5000) ref. FL-145 (Santa Cruz Biotechnology Santa Cruz, USA) και μια αίγα πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-ακτίνης (1: 2000) ref sc1616 (Santa Cruz Biotechnology Santa Cruz, USA). Τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA, παρουσία αναστολέων φωσφατάσης και πρωτεάσης. Παρόμοιες ποσότητες ολικής πρωτεΐνης αναλύθηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (GE Healthcare, Little Chalfont, Αγγλία). Έχουμε χρησιμοποιούνται ως πρωτογενή αντισώματα, αυτά που αναφέρονται ήδη στο τμήμα ανοσοϊστοχημεία (όλα σε αραίωση 1: 1000). Για την ανίχνευση πρωτεΐνης, χρησιμοποιήθηκαν ένα δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA) και ένα σύστημα φωταύγειας (Perkin-Elmer, Foster City, USA). Οι μεμβράνες εκ νέου ανιχνεύθηκαν με μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-TOM20 (1: 5000) ref. FL-145 (Santa Cruz Biotechnology Santa Cruz, USA) για τον έλεγχο της φόρτωσης πρωτεΐνης. Η έκφραση πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη Bio-Rad Ποσότητα One 1-D Analysis Software.

Ηλεκτρονική μικροσκοπία

Τα κύτταρα παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας μία συμβατική διαδικασία στερέωσης μικροσκοπία ηλεκτρονίων και ελήφθησαν εικόνες χρησιμοποιώντας ένα Τέχναι 20 ( FEI, Eindhoven, Ολλανδία). Οι διαφορές ως προς το μέγεθος μιτοχόνδριο μεταξύ των κυτταρικών σειρών υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το σύνολο της επιφάνειας μιτοχόνδρια. Ένα ελάχιστο 15 μιτοχόνδρια μετρήθηκαν ανά κύτταρο και τουλάχιστον 5 διαφορετικά κύτταρα ανά δείγμα χρησιμοποιήθηκαν τυχαία για την μέτρηση του μεγέθους. Όλα τα πειράματα έγιναν εις τριπλούν.

μιτοχονδριακού απεικόνιση του δικτύου

Για την ποσοτικοποίηση των διαρθρωτικών μιτοχονδριακό κατακερματισμού του δικτύου, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε γυάλινο πυθμένα πιάτα, επιμολυσμένα με μιτοχονδριακή στοχευμένες κίτρινο και κόκκινο φθορίζουσα πρωτεΐνη, mtYFP και mtRFP αντίστοιχα, και μετά από 24 ώρες μονιμοποιήθηκαν με παγωμένη 3.7% φορμαλδεΰδη για 30 λεπτά. Κύτταρα που εκφράζουν mtRFP απεικονίστηκαν με την Zeiss 510 META συνεστιακό laser μικροσκόπιο σάρωσης χρησιμοποιώντας ένα σχέδιο-Αχρωματικός στόχου 100 /1.46NA με ψηφιακό ζουμ 2x (διέγερση στα 561 nm, εκπομπή καταγράφηκαν πάνω από 575nm. Για κάθε κυτταρική σειρά ή κατάσταση τουλάχιστον 25 τυχαία επιλεγμένα κύτταρα απεικονίστηκαν και ποσοτικά σύμφωνα με μιτοχονδριακή δίκτυό της. Ένα σχέδιο-Αχρωματικός 100x (1.46NA) αντικειμενική και ζουμ 2x χρησιμοποιήθηκαν για την εικόνα μεμονωμένων κυττάρων. Ψηφιακές εικόνες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας ImageJ 1,47 (US National Institutes of Health-ΝΙΗ, Bethesda, MD, USA).

Scratch-πληγή δοκιμασία

τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε σχεδόν 90% συρροή σε πλάκες 6 καλά. Υπό τις συνθήκες άσηπτες συνθήκες ένα λεπτό «πληγή» εισήχθη από το ξύσιμο με πιπέτα 10 μl άκρο και αποκολλημένα κύτταρα ξεπλύθηκαν με PBS. χρησιμοποιώντας μια αντίθεσης φάσης που έχει συσταθεί και ένα 40x σύνολο εικόνες μεγέθυνση ελήφθησαν κάθε 5 λεπτά για ένα σύνολο 15 ωρών. Πέντε διαφορετικές μετρήσεις ανά πεδίο έγιναν χρησιμοποιώντας τις φωτογραφίες που τραβήχτηκαν σε 0, 3, 6 , 9, 12 και 15 ώρες χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ. Αναλυτικότερες πληροφορίες σχετικά με τη μεθοδολογία αυτή έχει δημοσιευθεί προηγουμένως [39]. Οι εικόνες επεξεργάστηκαν με το λογισμικό ImageJ.

Δοκιμασίες

Μετανάστευση /εισβολή

Παροδικά διαμολυσμένα TPC-1 και XTC.UC1 κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε RPMI χωρίς ορό και με DMEM /F12, αντίστοιχα, με 0,1 % FBS και σπάρθηκαν στον άνω θάλαμο ενός transwell πλάκας 12-φρεατίων (Corning Costar). Οι πλάκες transwell προ-επικαλύφθηκαν με 5 μg /ml ινωδονεκτίνης (F2006-1MG, Sigma Aldrich) και επωάστηκαν στους 37 ° C 5% CO

2 για 4 ώρες. Οι πλάκες στη συνέχεια ξεπλένονται με PBS1x σε ρΗ7.4 πριν από την προσθήκη των κυττάρων 100.000 ανά φρεάτιο. Τα χαμηλότερα θάλαμοι πληρώθηκαν με το αντίστοιχο μέσο συμπληρωμένο με 10% FBS. Μετά από 12 ώρες της δοκιμασίας, οι μεμβράνες Transwell αποκόπηκαν, ανεστραμμένη και χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ σε μια γυάλινη πλάκα. Οι πυρήνες ορατή στην πλευρά που βλέπει προς τα κάτω της μεμβράνης μετρήθηκαν. Ένα ελάχιστο 5 διαφορετικά πεδία μετρήθηκαν για κάθε διαφάνεια και ένα τριπλούν έγινε για κάθε πειραματική ρύθμιση. Mdivi1 αναστολέας χρησιμοποιήθηκε σε 50 μΜ με βάση τα προηγούμενα δημοσιευμένα δεδομένα και ελλείψει παρατηρήσιμες τοξικές ή στρες κυτταρικές αλλαγές [40]. Δεν βρέθηκαν διαφορές μεταξύ των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με Mdivi1 από το χρόνο μηδέν ή προ-επεξεργασμένο 1 ώρα πριν από την έναρξη της δοκιμασίας.

Στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων IHC πραγματοποιήθηκε με STAT VIEW -J 5.0 (SAS Institute, Inc., Cary, NC). Η σχέση μεταξύ της μέσης επίπεδο έκφρασης (βαθμολογία) των ανοσοϊστοχημικών δεικτών και την ιστοπαθολογία των διαφορετικών περιπτώσεων αξιολογήθηκαν με ANOVA? αποτελέσματα θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές όποτε τιμή p & lt? 0.05. Όταν χρειάζεται, πολλαπλές διορθώσεις σύγκριση διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το post hoc Bonferroni /Dunn δοκιμής και, κατά την ένδειξη του προγράμματος, οι συγκρίσεις μόνο θεωρείται σημαντική όταν ρ τιμή & lt? 0,0018.

Κάθε

in vitro

ανάλυση πραγματοποιήθηκε τουλάχιστον εις τριπλούν και η μέση λήφθηκε έτσι χρησιμοποιήθηκε για t-test ανεξάρτητων Student. Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SE, όπως αναφέρεται στους μύθους των στοιχείων.

Αποτελέσματα

Mfn2, OPA1, Drp1 και Fis1, οι υπερεκφράζεται σε oncocytic όγκους των κυττάρων και Drp1 υπερέκφραση είναι που συνδέονται με κακοήθεις όγκους oncocytic κυττάρων

Τα λεγόμενα «μιτοχόνδρια-διαμόρφωση» πρωτεΐνες είναι ρυθμιστές κλειδιά του σχήματος μιτοχόνδρια και της δυναμικής τους. Το μιτοχονδριακό δίκτυο, πράγματι, ορίζεται από την άκρως οργανωμένη ισορροπία μεταξύ των διαδικασιών σύντηξης και σχάσης, ανάλογα με τις φυσιολογικές ανάγκες του κυττάρου. Μεταξύ των πολλών κυτταρικές διεργασίες και παθοφυσιολογικές συνθήκες, τα μιτοχόνδρια-διαμόρφωση πρωτεΐνες δρουν επίσης από την ομοιοστασία του μεγέθους και του αριθμού των οργανιδίων [4,28,29,32]. Μόλις οι oncocytic όγκους των κυττάρων διαφέρουν από τα μη-ococytic αυτά από μια ανώμαλη συσσώρευση μιτοχονδρίων με μια αλλοιωμένη μορφολογία στο κυτταρόπλασμα του κυττάρου, υποθέσαμε ότι μιτοχονδριακή δυναμική θα μπορούσε να έχει ένα ρόλο στην φαινοτυπική και φυσιολογικές oncocytic ορισμός [11,12,13] . Έτσι, έχουμε εκτέλεσε μια ιστολογική ανάλυση των κύριων «μιτοχόνδρια διαμόρφωσης» επίπεδα πρωτεΐνης σε διάφορα ιστολογικά δείγματα ανθρώπινου θυρεοειδούς όγκου. Σχήμα 1 δείχνει αντιπροσωπευτικό μικρογραφίες ανοσοχρώση των πρωτεϊνών «μιτοχόνδρια διαμόρφωσης» που παρατηρείται σε διάφορα ιστολογικών τύπων των όγκων του θυρεοειδούς, των οποίων 1 oncocytic καρκίνωμα των ωοθυλακίων θυρεοειδούς (FTC), 6 μη oncocytic FTC, 8 oncocytic ωοθυλακίων παραλλαγή του θηλώδους καρκινώματος του θυρεοειδούς (FVPTC) , 22 μη-oncocytic FVPTC, 9 oncocytic συμβατικά θηλώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς (cPTC), 23 μη-oncocytic cPTC, 12 oncocytic θυλακιώδες αδένωμα του θυρεοειδούς (FA) και 7 μη-oncocytic FA. IHC μικρογραφίες αντιπροσώπου ενός καλοήθους oncocytic βλάβη (ΟΦΑ), ένας κακοήθης oncocytic βλάβη (oPTC) και ένα μη oncocytic βλάβης (η noFVPTC), οι histotypes από το κύριο ενδιαφέρον σε αυτό το έργο, παρουσιάζονται στο Σχήμα 1Α, 1Β και 1C. Δεδομένου ότι η έκφραση των πρωτεϊνών «μιτοχόνδρια διαμόρφωσης» στο φυσιολογικό γειτονικό παρέγχυμα ήταν μηδέν, ή ανιχνεύσιμη μόνο κάτω από το σκορ 2, εμείς παραλείπεται στα ιστογράμματα των επιπέδων έκφρασης αυτών των πρωτεϊνών σε φυσιολογικό ιστό. Με την εξαίρεση των Mfn1, εντοπίσαμε μια αύξηση στα επίπεδα έκφρασης των άλλων πρωτεϊνών που μελετήθηκαν, στους όγκους των κυττάρων oncocytic

vs

. οι μη oncocytic αυτά και σε όλες τις τέσσερις ιστο-τύπους που αναλύθηκαν (FVPTC, FTC, cPTC και FA) (Σχήματα 1 και 2Α).

Εκπρόσωπος μικρογραφίες δείχνει ανοσοχρώση της Mfn1, Mfn2, OPA1, Drp1 και Fis1 αντισώματα σε φυσιολογικό ιστό του θυρεοειδούς (ΝΤ) και όγκων ιστό ενός oncocytic θυλακιώδες αδένωμα-OFA) (α), ένα oncocytic θηλώδες θυρεοειδή καρκίνωμα-oPTC (Β) και ένα μη oncocytic θυλακιώδη παραλλαγή του θηλώδους θυρεοειδούς καρκίνωμα-noFVPTV (C) σε ένα συνολική μεγέθυνση 300x. Επεξηγηματικά μαύρα βέλη υποδηλώνουν κεχρωσμένη μετριέται όγκων περιοχές με αυξημένο διαβάθμιση από noFVPTV, να ΟΦΑ και τελικά OFTC. «# Mfn1-Mitofusin 1, Mfn2-Mitofusin 2, OPA1-Optic ατροφία 1, Drp1-Dynamin πρωτεΐνη που σχετίζεται με 1, Fis1-μιτοχονδριακού σχάσης 1 πρωτεΐνη.

η

η ανοσοχρώση των Mfn1, Mfn2, OPA1, Drp1 και Fis1 αξιολογήθηκε, λαμβάνοντας υπόψη όλους τους όγκους του θυρεοειδούς (Α και Β), και μόνο τους όγκους oncocytic θυρεοειδή (C) ή η μη -oncocytic όγκων του θυρεοειδούς μόνη της (D). Η μέση έκφραση του αντιγόνου υπολογίστηκε όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM σκορ. * Ρ & lt? 0,05 (unpaired t-test). # Mfn1-Mitofusin 1, Mfn2-Mitofusin 2, OPA1-Optic ατροφία 1, Drp1-Dynamin πρωτεΐνη που σχετίζεται με 1, Fis1-μιτοχονδριακού σχάση 1 πρωτεΐνη.

Η

Mfn2 και η Drp1 pro-σχάσης υπερεκφράζονται σημαντικά σε κακοήθη oncocytomas

σε μια βαθύτερη ανάλυση των ιστολογικών δειγμάτων από ανθρώπινους όγκους του θυρεοειδούς, Mfn1 ήταν το μόνο μιτοχόνδρια διαμόρφωσης της πρωτεΐνης για να δείξει καμία σημαντική διαφορά στα επίπεδα έκφρασης, ανεξάρτητα από το φαινότυπο ή καρκινικών τύπων σε σύγκριση (Εικ 2A-2D). Μια συνολική αύξηση των επιπέδων των άλλων πρωτεϊνών που αναλύθηκαν, ανεξάρτητα από προ-σύντηξης τους ή ρόλο προ-σχάση, ήταν όλα σημαντικά υψηλότερα στις oncocytic όγκους σε σύγκριση με τα μη-oncocytic όνες (4.2 ± 0.2

vs

2.9 ± 0.2, p & lt? 0,0001 για Mfn2? 3.3 ± 0.3

vs

2.3 ± 0.2, p = 0.01 για OPA1?. 4.7 ± 0.2

vs

3.0 ± 0.2, p & lt.? 0,0001 για Drp1? 4.9 ± 0.1

vs

3.5 ± 0.2, ρ & lt?. 0.0001 για Fis1), όπως φαίνεται στην ποσοτικοποίηση IHC του Σχ 2Α (Σχήμα 2Α). Σε αντίθεση, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά για οποιαδήποτε από αυτές τις πρωτεΐνες, όταν συγκρίναμε κακοήθη

vs

. καλοήθεις όγκοι, χωρίς διάκριση και την ομαδοποίηση των δειγμάτων σε oncocytic ή μη oncocytic (3.5 ± 0.2

vs

3.0 ± 0.3, p = 0,31 για Mfn2?.. 2.8 ± 0.2

vs

2.3 ± 0,4, p = 0,28 για OPA1? 3.8 ± 0.2

vs

3.5 ± 0.4, p = 0,48 για Drp1?.. 4.1 ± 0.1

vs

3,9 ± 0,34, p = 0,71 για Fis1) (Σχήμα 2Β). Ως εκ τούτου, φαίνεται ότι η μεταβολή του μηχανήματος υπεύθυνος για μιτοχονδριακή μορφολογία σχετίζεται αυστηρά με την oncocytic φαινότυπο, παρά με τη συνολική επιθετικότητα του όγκου. Επιπλέον, στο πλαίσιο των μη oncocytic όγκοι δεν βρέθηκαν διαφορές στα επίπεδα έκφρασης του μιτοχονδριακού δυναμική πρωτεϊνών μεταξύ καλοήθων και κακοήθων όγκων (Σχήμα 2D). Ωστόσο, αν λάβουμε υπόψη το βαθμό σοβαρότητας του όγκου, μόνο εντός του oncocytic φαινότυπο, έχει ενδιαφέρον παρατηρούμε ότι Mfn2 και Drp1 είναι σημαντικά πιο πλούσια σε καρκινώματα σε σύγκριση με αδενώματα των καλοήθων ομολόγους »(4.5 ± 0.2

vs

. 3.4 ± 0.4, p = 0,012 για Mfn2 και 5.1 ± 0.2

vs

. 4.0 ± 0.5, p = 0,038 για Drp1 (Σχήμα 2C). Αξίζει να σημειωθεί ότι οι διαφορές αυτές δεν σχετίζονται με διαφορές στο μιτοχονδριακό αριθμό ( S1 Σχήμα). Αυτό υποδηλώνει ότι εντός oncocytic όγκοι κυττάρων, οι μιτοχονδριακές δυναμική αναλαμβάνει ρόλο στον καθορισμό της κακοήθειας του όγκου και επιθετικότητα.

Drp1 συσσωρεύεται ενεργά στα μιτοχόνδρια και ανισορροπία μιτοχονδριακή δικτύου προς σχάση

για να διευκρινιστεί και να ερευνήσει σε βάθος το ρόλο των μιτοχονδριακών δυναμική μεταβολή στις oncocytic όγκους των κυττάρων, αλλάξαμε σε

in vitro

πειράματα σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του θυρεοειδούς δύο: XTC.UC1, η οποία είναι η μόνη oncocytic κυτταρική σειρά διαθέσιμο, με παραγωγή καρκίνωμα, και TPC1, ένα μη oncocytic θυρεοειδούς κυτταρική γραμμή, χρησιμοποιείται για συγκριτικούς σκοπούς. Πρώτον, αξιολογήθηκαν σε δύο κυτταρικές σειρές το επίπεδο έκφρασης των ίδιων πρωτεϊνών σύντηξης /σχάσης μελετήθηκαν στα δείγματα όγκου ανθρώπου.

με ανάλυση κηλίδος Western, ανιχνεύσαμε, στο oncocytic κυτταρική γραμμή, η ίδια τάση του * P & lt?