Οι

Αφηρημένο

Ιστορικό

Host αποκρίσεις των Τ-κυττάρων που σχετίζεται με θετικά αποτελέσματα σε επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών (EOC), αλλά παραμένει ασαφές το πώς καλύτερα να προωθήσει αυτές τις αντιδράσεις σε ασθενείς. Προς αυτό το στόχο, αξιολογήσαμε μια ομάδα κλινικά σχετικών κυτοκινών για την ικανότητα να ενισχύσει πολλαπλές λειτουργίες των Τ-κυττάρων τελεστή (polyfunctionality) στο φυσικό περιβάλλον του όγκου.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

πειράματα γίνεται με μόνιμα κύτταρα CD8 + και CD4 + T σε παρασκευάσματα χύμα ασκίτη κυττάρων από υψηλής ποιότητας ΕΓΚ ασθενείς ορώδες. Τ κύτταρα διεγέρθηκαν με α-CD3 παρουσία 100% αυτόλογο ασκιτικό υγρό, με ή χωρίς εξωγενή IL-2, IL-12, IL-18 ή IL-21, μόνη ή σε συνδυασμό. τον πολλαπλασιασμό των Τ-κυττάρων (Ki-67) και λειτουργία (IFN-γ, TNF-α, IL-2, CCL4, και έκφραση CD107a) αξιολογήθηκαν από πολλαπλών παραμέτρων κυτταρομετρίας ροής. Παράλληλα, 27 κυτοκίνες μετρήθηκαν σε υπερκείμενα καλλιέργειας. Ενώ ασκιτικό υγρό είχε ποικίλα αποτελέσματα σε CD8 + και τον πολλαπλασιασμό των Τ-κυττάρων CD4 +, ανέστειλε λειτουργία των Τ-κυττάρων στα περισσότερα δείγματα ασθενών, με CD107a, IFN-γ, και CCL4 δείχνει την μεγαλύτερη αναστολή. Αυτό συνοδεύτηκε από μειωμένα επίπεδα της IL-1β, IL-1 ra, IL-9, IL-17, G-CSF, GM-CSF, ΜΙΡ-1α, PDGF-ΒΒ, και bFGF σε υπερκείμενα καλλιέργειας. πολλαπλασιασμός των Τ-κυττάρων ενισχύθηκε με εξωγενή IL-2, αλλά και άλλες λειτουργίες των Τ-κυττάρων ήταν σε μεγάλο βαθμό ανεπηρέαστη από ενιαίο κυτοκίνες. Ο συνδυασμός IL-2 με κυτοκίνες ασκούν συμπληρωματικές οδούς σηματοδότησης, ιδίως IL-12 και IL-18, ενισχυμένη έκφραση του IFN-γ, TNF-α, και CCL4 σε όλα τα δείγματα των ασθενών, με την προώθηση πολυλειτουργική αποκρίσεις Τ-κυττάρων. Παρά το γεγονός αυτό, άλλες λειτουργικές παραμέτρους γενικά παρέμεινε αδρανές.

Συμπεράσματα /Σημασία

Το ΕΓΚ ασκίτη περιβάλλον διαταράσσει πολλαπλές λειτουργίες των Τ-κυττάρων, και εξωγενών κυτοκινών εμπλοκή διαφορετικών οδών σηματοδότησης μόνο αντιστρέψει εν μέρει αυτά τα αποτελέσματα. Τα αποτελέσματά μας μπορεί να εξηγήσει την περιορισμένη αποτελεσματικότητα των θεραπειών κυτοκίνης για ΕΓΚ μέχρι σήμερα. Την πλήρη αποκατάσταση της λειτουργίας των Τ-κυττάρων απαιτεί την ενεργοποίηση των μονοπατιών πέρα ​​από εκείνους που ασχολούνται με την IL-2, IL-12, IL-18 και IL-21 σηματοδότηση

Παράθεση:. Tran E, Nielsen JS, Wick DA , Ng AV, Johnson LDS, Nesslinger NJ, et al. (2010) Οι απαντήσεις Πολυλειτουργικά Τ-κυττάρων διαταράσσεται από τον καρκίνο των ωοθηκών ασκίτη Περιβάλλοντος και μόνο εν μέρει αποκατασταθεί από κλινικά σχετικές κυτοκίνες. PLoS ONE 5 (12): e15625. doi: 10.1371 /journal.pone.0015625

Επιμέλεια: Irina Agoulnik, Διεθνές Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 13 Αύγ, 2010? Αποδεκτές: 19 του Νοέμβρη, 2010? Δημοσιεύθηκε: 22η Δεκεμβρίου 2010

Copyright: © 2010 Tran et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Ίδρυμα British Columbia Cancer, Υπουργείο άμυνας των Ηνωμένων Πολιτειών, και των Φυσικών Επιστημών και Έρευνας του Συμβουλίου του Καναδά. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Πολυάριθμες μελέτες κατά την τελευταία δεκαετία έχουν δείξει ότι το ανοσοποιητικό σύστημα επηρεάζει τις κλινικές εκβάσεις σε ασθενείς με υψηλής ποιότητας ορώδες επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών (εφεξής EOC). Συγκεκριμένα, η παρουσία των ογκο-διηθητικά CD8 + Τ κυττάρων σχετίζεται με την παρατεταμένη ελεύθερη νόσου και συνολική επιβίωση [1], [2]. Επιπλέον, οι αυξημένες αριθμοί CD56 + Τ κυττάρων στο διαμέρισμα ασκίτη συσχετίζεται με αυξημένη ευαισθησία λευκοχρύσου [3]. Πιο πρόσφατα, υγρό ασκίτη που περιέχει αυξημένα επίπεδα της IL-17 (μία κυτοκίνη κυρίως παράγεται από Th17 και άλλα δραστικά Τ κύτταρα [4]) συσχετίστηκε με αυξημένη συνολική επιβίωση [5]. Μαζί, αυτές οι μελέτες προτείνουν ότι η ενίσχυση της ενδογενούς απόκρισης Τ-κυττάρων προς EOC μπορεί να είναι κλινικά οφέλη για τους ασθενείς. Ωστόσο, το περιβάλλον του όγκου των ωοθηκών περιέχει πολλά ανοσοκατασταλτική τύπους κυττάρων και των παραγόντων που μπορεί να αντιταχθεί κατά του όγκου αποκρίσεις Τ-κυττάρων. Κατά συνέπεια, οι αυξημένες αριθμοί που σχετίζονται με όγκους ρυθμιστικά Τ κύτταρα (Tregs) και μακροφάγα που σχετίζονται με κακή επιβίωση σε EOC [1], [2]. Πολλοί διαλυτές ανοσοκατασταλτικών παραγόντων βρίσκονται επίσης σε ασκίτη, περιλαμβανομένων των IL-10, ΤΟΡ-β, VEGF, Β7-H1 /PD-L1, Β7-Η4, SDF-1, EBAG9 /RCAS1, συνδέτη Fas, και διαλυτός υποδοχέας IL-2 [1], [2].

Η ετερογένεια των ανοσοκατασταλτικών μηχανισμών ΕΓΚ παρουσιάζει μια τεράστια πρόκληση για την ανοσοθεραπεία, καθώς υποδηλώνει ότι οι πολλαπλές ανοσοκατασταλτικών μηχανισμών μπορεί να χρειαστεί να αντιστραφεί για να αποκαταστήσει τη λειτουργία των Τ-κυττάρων. Για παράδειγμα, η εξάντληση Treg αξιολογείται ως μέσο για την ενίσχυση της ανοσίας έναντι διαφόρων ανθρώπινων καρκίνων [6], συμπεριλαμβανομένων ΕΓΚ [7], αλλά στην καλύτερη περίπτωση θα αντιστραφεί μόνο έναν μηχανισμό ανοσοκαταστολής, αφήνοντας ανέπαφη άλλες ανοσολογικές εμπόδια. Αντί να προσπαθούν να απενεργοποιήσετε αυτά τα εμπόδια ένας-ένας, μια πιο πραγματιστική κλινική προσέγγιση θα ήταν να παραδώσει παράγοντες που μπορεί να παρακάμψει ευρέως ανοσοκατασταλτικά εμπόδια στο περιβάλλον του όγκου. Έτσι, εντοπίζοντας τα σήματα ή οι συνθήκες που προάγουν απαντήσεις των Τ-κυττάρων στο περιβάλλον EOC μπορεί να οδηγήσει σε πιο αποτελεσματική ανοσοθεραπευτικών στρατηγικών.

Για το σκοπό αυτό, έχουμε ήδη αναπτύξει ένα μοντέλο ποντικού του ΕΓΚ που επιτρέπει λειτουργική αξιολόγηση των CD8 + T κυτταρικών αποκρίσεων στο περιβάλλον του όγκου των ωοθηκών [8]. Συγκεκριμένα, μηχανικής μια γραμμή όγκου ποντικού ΕΓΚ να εκφράζει ένα επιτόπιο κυττάρου CD8 + Τ από την ωολευκωματίνη μοντέλο αντιγόνου. Ποντικοί που φέρουν προηγμένη, ευρεία διάδοση όγκων με εκτεταμένες ασκίτη υποβλήθηκαν σε θεραπεία με θετή μεταφορά των CD8 + Τ κύτταρα ειδικά για τον επίτοπο ωολευκωματίνης. Αξιοσημείωτα, υιοθεσίας μεταφέρθηκε CD8 + Τ κύτταρα υποβλήθηκαν σε έντονη πολλαπλασιασμός όχι μόνο σε λεμφαδένες και περιφερικό αίμα, αλλά και στις ασκίτης και διαμερίσματα του όγκου. Πράγματι, στην κορυφή της απόκρισης, τα μεταφερόμενα κύτταρα Τ αποτελούσαν το 40% των CD8 + Τ κυττάρων στο περιφερικό αίμα, και έως 96% των CD8 + Τ κυττάρων σε ασκίτη. Αυτή η βαθιά πολλαπλασιαστική απόκριση ακολουθήθηκε από ταχεία και σχεδόν πλήρης υποχώρηση του όγκου στην πλειονότητα των ζώων, αποδεικνύοντας ότι τα κύτταρα Τ ήταν λειτουργικά ενεργά. Σημαντικά, ο πολλαπλασιασμός και αντι-καρκινική δραστικότητα των μεταβιβασθέντων CD8 + Τ κυττάρων ήταν εξαρτάται εξ ολοκλήρου από την IL-2 /IL-15 σηματοδότηση, όπως αποδεικνύεται από γενετική διαταραχή της άλφα υποδοχέα της IL-2 (CD25) ή βήτα (CD122) υπομονάδες [ ,,,0],8]. Έτσι, ακόμη και κατά τον καθορισμό των προχωρημένων όγκων των ωοθηκών, CD8 + Τ κύτταρα τοποθετημένα ισχυρές αποκρίσεις κατά του όγκου υπό την προϋπόθεση ότι η IL-2 /IL-15 μονοπατιών σηματοδότησης ήταν άθικτα.

Τα προηγούμενα αποτελέσματα έθεσε το ζήτημα του κατά πόσον κυτοκινών όπως η IL-2 μπορεί παρομοίως κατισχύει τα ανοσοκατασταλτικά αποτελέσματα της ασκίτη σε ανθρώπινο EOC. Προηγούμενη

in vitro

μελέτες με ανθρώπινα δείγματα EOC έχουν δείξει ότι η IL-2 μπορεί να αποκαταστήσει μερικώς ενεργοποιημένα από λεμφοκίνη φονείς (LAK) κυτταρική κυτταροτοξικότητα σε παρουσία 50% υγρό ασκίτη, ενώ ο συνδυασμός της IL-2 με TCR διέγερση [9] ή IL-12 [10], [11] αποκατασταθεί πλήρως LAK κυτταροτοξικότητα. Ωστόσο, η χρήση του 50% ασκιτικού υγρού από μόνη της δεν ανακεφαλαιώνουν πλήρως το περιβάλλον των ωοθηκών όγκου, η οποία περιέχει επίσης ανοσοκατασταλτικές τύπους κυττάρων όπως Tregs και MDSCs [1], [2]. Επιπλέον, Laks οι κυρίως αποτελούνται από κύτταρα ΝΚ, τα οποία μπορούν να επηρεάζονται διαφορετικά από ασκίτη σε σύγκριση με τα κύτταρα Τ. Επιπλέον, αυτές οι παλαιότερες μελέτες μετρήθηκε κυτταροτοξικότητα με παρασκευάσματα χύδην LAK κυττάρων και ως εκ τούτου δεν διαλεύκανση των επιδράσεων των κυτοκινών επί διαφόρων υποσυνόλων Τ κυττάρων. Τέλος,

in vitro

κυτταροτοξικότητα είναι μία μόνο πτυχή της λειτουργίας των Τ-κυττάρων και δεν συσχετίζονται πάντα με αποτελεσματικές απαντήσεις Τ-κυττάρων

in vivo

[12].

Υπάρχει αυξάνεται εκτίμηση της σημασίας των πολυλειτουργική Τ-κυττάρων (δηλαδή, Τ κύτταρα που μπορεί να εκτελέσει ταυτόχρονα πολλαπλές λειτουργίες) σε αποτελεσματικές ανοσολογικές αποκρίσεις [13]. Συγκεκριμένα, οι πολυλειτουργικά αποκρίσεις Τ-κυττάρων που σχετίζεται με προστατευτική ανοσία μετά τον εμβολιασμό κατά της ευλογιάς (ιός δαμαλίτιδας) [14], κίτρινο πυρετό [15], η φυματίωση [16], [17], και η λεϊσμανίαση [18]. Αυξημένα αριθμοί πολυλειτουργική Τ κυττάρων συσχετίζονται επίσης με ευνοϊκές εκβάσεις σε μια ποικιλία ρυθμίσεων ασθένεια, συμπεριλαμβανομένου του HIV /AIDS [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25] , [26], [27], [28], [29], ηπατίτιδα C [30], και λεμφοκυτταρική χοριομηνιγγίτιδας [31]. Στον καθορισμό του καρκίνου, αρκετές μελέτες έχουν βρει αυξημένη αριθμούς όγκου-ειδικά πολυλειτουργικά Τ κύτταρα σε ασθενείς που ανταποκρίνονται ευνοϊκά σε διάφορες μορφές ανοσοθεραπείας, περιλαμβανομένων θετή θεραπεία των Τ-κυττάρων, θεραπεία αντισώματος α-CTLA-4, και εμβόλια όγκου [32] , [33], [34], [35], [36].

στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε για πρώτη φορά οι επιπτώσεις της ανθρώπινης ΕΓΚ ασκίτη περιβάλλον σε Τ-κυττάρων polyfunctionality. Αξιολογήσαμε επίσης την ικανότητα των IL-2 και τρία άλλα κλινικά σχετική κυτοκίνες (IL-12, IL-18 και IL-21) για να αποκαταστήσει ένα ευρύ φάσμα λειτουργιών των Τ-κυττάρων. Βρήκαμε ότι ασκίτη ανέστειλε πολυλειτουργική αποκρίσεις από κύτταρα τόσο CD4 + και CD8 + Τ, με μερικές λειτουργίες που δείχνει μεγαλύτερη αναστολή από ό, τι άλλες. Επιπλέον, μόνο ένα υποσύνολο των λειτουργιών Τ-κυττάρων αποκαταστάθηκε από εξωγενείς κυτοκίνες που παραδίδονται μόνοι τους ή σε συνδυασμό. Έτσι, η πλήρης αποκατάσταση της λειτουργίας των Τ-κυττάρων σε EOC θα απαιτήσει την ενεργοποίηση των οδών πέραν όσων ασχολούνται με IL-2, IL-12, IL-18 και IL-21 σηματοδότηση.

Αποτελέσματα

EOC ασκίτη διαταράσσει πολλαπλές λειτουργίες των Τ-κυττάρων

Πρωτοβάθμια δείγματα ασκίτη συλλέχθηκαν από ασθενείς με υψηλής ποιότητας ορώδες EOC (Πίνακας 1). Για να μοντελοποιηθεί η μητρική ασκιτών περιβάλλοντος του όγκου όσο το δυνατόν εγγύτερα

in vitro

, αναλύσαμε χύμα σφαιρίδια ασκίτη κύτταρο, το οποίο εκτός από CD8 + και CD4 + Τ κύτταρα, περιέχονται κάτοικος καρκινικά κύτταρα, Tregs, Β λεμφοκύτταρα, κύτταρα ΝΚ, και CD14 + κυττάρων (Πίνακας 2). Επιπλέον, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 100% υγρό ασκίτη αυτόλογο να περιλαμβάνουν οποιεσδήποτε διαλυτών παραγόντων, όπως ΤΟΡ-β, IL-10, και VEGF (Πίνακας 2), που μπορούν να επηρεάσουν τη λειτουργία των Τ-κυττάρων. Λόγω της σπανιότητας των σαφώς καθορισμένων Τ-κυττάρου αντιγόνα στον καρκίνο των ωοθηκών, έχουμε διεγερμένες καλλιέργειες με α-CD3 αντίσωμα, το οποίο θα πρέπει να διεγείρουν τόσο τελεστή και ρυθμιστικές υποσύνολα. Έτσι, τα Τ κύτταρα του κάθε ασθενούς αναλύθηκαν με την παρουσία του πλήρες συμπλήρωμα των φυσικώς απαντώμενα κύτταρα όγκου, ανοσοκατασταλτικές κύτταρα και διαλυτούς παράγοντες.

Η

απέδειξαν πρόσφατα σε ένα μοντέλο ποντικού της EOC ότι το περιβάλλον ασκίτης μπορεί να είναι ιδιαίτερα ανεκτικό για τον πολλαπλασιασμό των Τ-κυττάρων [8]. Για να δούμε αν αυτό ίσχυε επίσης σε ανθρώπινα δείγματα EOC, ελέγξαμε την επίδραση του υγρού ασκιτών επί του πολλαπλασιασμού των Τ-κυττάρων. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α, ασκιτικό υγρό είχε πολύ μεταβλητά αποτελέσματα επί του πολλαπλασιασμού CD8 + Τ-κυττάρων (όπως μετράται με Κί-67 έκφρασης), που κυμαίνονται από ισχυρή αναστολή (1/5 ασθενείς) για ενίσχυση πολλαπλασιασμού (2/5 ασθενείς). Σε γενικές γραμμές, παρόμοιες τάσεις παρατηρήθηκαν για CD4 + Τ κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Έτσι, όπως προτείνεται από τις μελέτες μας ποντικού [8], η ανθρώπινη EOC ασκίτης περιβάλλον δεν είναι καθολικά κατασταλτική και σε ορισμένες περιπτώσεις μπορεί να ενισχύσει τον πολλαπλασιασμό των Τ-κυττάρων.

Μαζική κύτταρα ασκίτη διεγέρθηκαν με συνδεδεμένο πλάκα α-Οϋ3 σε υλικό ή 100% αυτόλογο υγρό ασκίτη για 48 ώρες. (Α) Ο πολλαπλασιασμός και η λειτουργία των CD8 + Τ κυττάρων με την παρουσία μέσων ή αυτόλογων υγρό ασκίτη (άνω πάνελ) αξιολογήθηκε με μέτρηση της έκφρασης του Ki-67, CD107a, CCL4, IFN-γ, TNF-α, και IL-2 από κυτταρομετρία ροής. (Β) Επίδραση της IL-2 (δεύτερη πλευρά), IL-12 (τρίτο τμήμα), και IL-21 (τέταρτος πίνακας) επί του πολλαπλασιασμού + Τ-κυττάρων CD8 και διάφορες λειτουργίες με την παρουσία αυτόλογων ασκιτικού υγρού. Δεδομένων έχει ομαλοποιηθεί σε α-CD3 διεγερμένα κύτταρα σε μέσα μαζικής ενημέρωσης (δηλαδή, τις αξίες των μέσων αφαιρέθηκαν από κάθε κατάσταση διέγερσης). * Υπήρχε σημαντική επίδραση της κυτοκίνης για την ενίσχυση της υποδεικνύεται λειτουργία σε σύγκριση με κύτταρα διεγερμένα σε μέσα (Wilcoxon ζεύγη δοκιμή t, ρ Πρώτον, αυτές οι κυτοκίνες ρυθμίζουν προς τα πάνω έκφραση αμοιβαίως των αντίστοιχων υποδοχέων τους, με αποτέλεσμα την αυξημένη ευαισθησία των κυττάρων Τ σε όλες τις τρεις κυτοκίνες [45], [46], [47], [48]. Δεύτερον, αυτές οι κυτοκίνες μπορεί να μεσολαβήσει συνεργιστική και συμπληρωματικά γεγονότα σηματοδότησης [37], [49], [50]. Για παράδειγμα, η IL-2 και IL-12 ενεργοποιούν συνεργιστικά την οδό ρ38 ΜΑΡΚ να ενισχυθεί η έκφραση ΙΡΝ-γ [51]. Παρομοίως, IL-12 και IL-18 ενεργοποιούν τους παράγοντες μεταγραφής Stat4 και ΑΡ-1, αντίστοιχα, τα οποία μπορούν να ενισχύσουν συνεργιστικώς δραστικότητα υποκινητή ΙΡΝ-γ [52]. Έτσι, η συντονισμένη ενεργοποίηση και των δύο οδών STAT και σηματοδότησης μη-STAT φαίνεται σημαντική για την μέγιστη έκφραση του IFN-γ. Είναι αξιοσημείωτο, όμως, ότι αυτά τα σήματα δεν ήταν επαρκείς για την αποκατάσταση της έκφρασης των πολλών άλλων κυτοκινών. Αυτό υποδηλώνει ότι, στο μέλλον, κυτοκίνες εκτός από IFN-γ θα πρέπει να χρησιμοποιείται ως read-outs, αν κάποιος επιθυμεί να βελτιστοποιήσει το πλήρες φάσμα των λειτουργιών των κυττάρων Τ για την ανοσοθεραπεία του καρκίνου.

Ο συνδυασμός της IL-2 + IL -12+ IL-18 προκάλεσε επίσης σημαντικές αλλαγές στα πολυλειτουργικά μεταθέσεις των Τ-κυττάρων.