Αφηρημένο

Η ανασύσταση της ανάπτυξης του όγκου σε ποντικούς με ανοσοανεπάρκεια από τα αναλυτικά πρωτογενή ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα είναι πάντα μια πρόκληση. Ο κύριος στόχος της παρούσας μελέτης είναι να δημιουργηθεί ένα αξιόπιστο σύστημα προσδιορισμού που θα μας επιτρέψει να ανασυστήσει επαναλήψιμα αναγέννηση του όγκου ανθρώπινου προστάτη σε ποντίκια χρησιμοποιώντας ασθενή μόνο τα καρκινικά κύτταρα που προέρχονται. Χρησιμοποιώντας πολλά από τα 114 χωρίς θεραπεία πρωτοπαθούς καρκίνου του ανθρώπινου προστάτη (HPCA) δείγματα που έχουμε δουλέψει, εδώ δείχνουμε ότι: 1) η subcutaneum αντιπροσωπεύει την πιο ευαίσθητη περιοχή που επιτρέπει τη μεταμόσχευση των εμφυτευμένων τεμαχίων HPCA? 2) πρωτογενή κύτταρα HPCA από μόνες τους αδυνατούν να αναγεννηθούν όγκους σε ανοσοκατεσταλμένα φιλοξενεί? 3) όταν εγχύονται ταυτόχρονα σε Matrigel με rUGM (αρουραίος ουρογεννητικού κόλπου μεσέγχυμα), CAF (ινοβλάστες καρκίνωμα που σχετίζονται), ή HS5 (απαθανάτισε μυελό των οστών που προέρχονται στρωματικά) κύτταρα, τα πρωτογενή κύτταρα HPCA αποτύχει να ξεκινήσει σειρά μεταφυτεύσιμων όγκους σε ποντίκια NOD /SCID? και 4) Ωστόσο, τα κύτταρα HPCA εγχύονται ταυτόχρονα με τα κύτταρα HS5 σε πιο ανοσοανεπάρκεια NOD /SCID-IL2Rγ

– /- (NSG) ποντίκια αναγέννηση εύκολα σειριακά μεταφυτεύσιμων όγκους. Η HPCA /HS5 ανασυσταθεί όγκους «προστάτη» παρουσιάζουν μια συνολική επιθηλιακά μορφολογία, είναι της ανθρώπινης προέλευσης και περιέχουν κύτταρα θετικά για AR, Ck8, και ρακεμάσης. Κυτταρογενετική ανάλυση παρέχει περαιτέρω αποδείξεις για την παρουσία ανώμαλων κυττάρων καρυοτυπικά HPCA στους όγκους HPCA /HS5. Σπουδαιότητας, HPCA /HS5 όγκους ξενομοσχεύματος περιέχει EpCAM

+ κύτταρα που είναι τόσο κλωνογονικού και ογκογόνο. Απροσδόκητα, όλες οι HPCA /HS5 ανασυσταθεί όγκοι είναι αδιαφοροποίητα, ακόμη και για τα κύτταρα που προέρχονται από HPCA Gleason 7 όγκους. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι πρωτογενή κύτταρα HPCA εγχύονται ταυτόχρονα με το απαθανάτισε στρωματικά κύτταρα HS5 παράγουν αδιαφοροποίητα όγκων σε ποντίκια NSG και θα παρέχει αποδείξεις ότι αδιαφοροποίητα κύτταρα HPCA μπορεί να είναι

τα

κύτταρα που κατείχε ογκογόνο δυναμικό και αναγεννημένη HPCA /HS5 όγκους ξενομοσχεύματος.

Παράθεση: Chen X, Liu Β, Li Q, Honorio S, Liu X, Liu C, et al. (2013) κύτταρα διαχωρίζονται Πρωτοβάθμια Ανθρωπίνων Καρκίνος του προστάτη εγχύονται ταυτόχρονα με το Cells απαθανάτισε HS5 Μυελού των Οστών στρωματικά Δημιουργήστε Αδιαφοροποίητη όγκοι σε NOD /SCID ποντίκια-γ. PLoS ONE 8 (2): e56903. doi: 10.1371 /journal.pone.0056903

Επιμέλεια: Amit Singh, Πανεπιστήμιο του Dayton, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 30 Οκτ, 2012? Αποδεκτές: 15 Γενάρη, 2013? Δημοσιεύθηκε: 22 Φεβρουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Chen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει με επιχορηγήσεις από το ΝΙΗ (R01-CA155693-01A), Υπουργείο άμυνας (W81XWH-11-1-0331), η χρηματοδότηση CPRIT (RP120380), και το MD Anderson Cancer Center του Κέντρου για τον Καρκίνο Επιγενετική και η Laura και ο John RNA Κέντρο Arnold Ίδρυμα πιλοτικά επιχορήγησης (έως ΓΔΜ) και από δύο Επιχορηγήσεις Κέντρο (CCSG-5 P30 CA016672-34 και ES007784). XC υποστηρίχθηκε από Cockrell υποτροφία από το Τμήμα Μοριακής Καρκινογένεσης, M.D. Anderson Κέντρο Καρκίνου. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Η αντίστοιχη συγγραφέας, Δρ Ντιν Τανγκ, είναι σήμερα μια Ακαδημαϊκή Επεξεργαστή για PLoS ONE και ότι ο συν-συγγραφέας Δρ Ντιν Τανγκ είναι μέλος PLoS ONE Συντακτική Επιτροπή. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι η κορυφαία κακοήθεια με εκτιμώμενη ~241,740 νέες περιπτώσεις και ~ 28.170 θανάτους στις ΗΠΑ το 2012 [1]. Η αιτιολογία για την PCA παραμένει αινιγματική και τα κύτταρα προέλευσης για τον ευνουχισμό ανθεκτικά προστάτη (δηλαδή, CRPC), το θανατηφόρο ασθένεια που σκοτώνει περισσότερους ασθενείς παραμένει ακαθόριστα. Ανθρώπινους καρκίνους φιλοξενούν έναν πληθυσμό βλαστικών όπως τα καρκινικά κύτταρα λειτουργικά ονομάζονται καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ), τα οποία πιστεύεται ότι είναι υπεύθυνη για την έναρξη του όγκου, την προώθηση, εξέλιξη, μετάσταση, και την αντίσταση θεραπεία [2]. Εργασία από το εργαστήριο μας και πολλοί άλλοι »υποδηλώνει ότι το ανθρώπινο προστάτη περιλαμβάνει επίσης στέλεχος-όπως τα καρκινικά κύτταρα [3] – [32]. Όπως ΚΕΠ σε άλλους όγκους [33], ΚΕΠ του προστάτη είναι ετερογενείς που περιέχουν πολλά υποσύνολα με ξεχωριστή ικανότητα όγκου-αναγέννησης. Αξίζει να σημειωθεί, ΚΕΠ προστάτη αναφέρθηκαν από μερικές ομάδες είναι λιγότερο διαφοροποιημένα εκφράζουν λίγο /όχι AR (υποδοχέα ανδρογόνων) και PSA (ειδικό προστατικό αντιγόνο). Πρόσφατα, χρησιμοποιώντας ένα PSA υποκινητή με γνώμονα την GFP λεντοϊού δημοσιογράφος, έχουμε καθαριστεί από διαφοροποιημένα (PSA

+) και χύδην (PSA

– /lo) προστάτη κύτταρα για προφίλ γονιδιακής έκφρασης και λειτουργικές μελέτες και διαπίστωσε ότι η PSA

– κυτταρικό πληθυσμό /lo φιλοξενεί μακροπρόθεσμη καρκινικά κύτταρα-πολλαπλασιαστικό που αντιστέκονται σε ευνουχισμό [25]. Η μελέτη μας δείχνει ότι η αδιαφοροποίητο PSA

– κυτταρικό πληθυσμό /lo προστάτη πιθανόν να αντιπροσωπεύει μια προϋπάρχουσα κυττάρων προέλευσης για CRPC [25]

Ένα ΚΛΕΙΔΙ αναπάντητο ερώτημα είναι κατά πόσον παρόμοια βλαστικά-όπως του προστάτη. κύτταρα με ενισχυμένες ιδιότητες όγκου-πολλαπλασιαστικό υπάρχουν και στην πρωτογενή ανθρώπινα προστάτη (HPCA) δείγματα. Ο λόγος που το σημαντικό αυτό θέμα έχει απέφυγε μια οριστική απάντηση έγκειται στο γεγονός ότι έχουμε ακόμη να καθιερώσει ένα αξιόπιστο σύστημα προσδιορισμού που μπορεί αναπαραγώγιμα και πιστά την ανασύσταση αναγέννηση όγκου από διαχωριστούν μεμονωμένα κύτταρα HPCA [14]. χρησιμοποιούνται περισσότεροι σήμερα μοντέλα PCa προέρχεται είτε από γενετικά τροποποιημένα ποντίκια, όπου συγκεκριμένα γονίδια υπερεκφράζονται ή νοκ άουτ ή από ξενομοσχεύματα χρησιμοποιώντας ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές ή τεμαχίων όγκου εμβολιάσθηκαν ορθοτοπικά ή εκτοπικά στα ανοσοανεπαρκή ποντίκια [34]. Για πολλούς λόγους, μοντέλα ποντικών του προστάτη έχουν ιστοπαθολογικών χαρακτηριστικών που δεν είναι απόλυτα αντιπροσωπευτικό του ανθρώπινου προστάτη, οι οποίοι συχνά χαρακτηρίζονται από πολλαπλές γενετικές αλλαγές που είναι πέρα ​​από την ικανότητα των οποιωνδήποτε γενετικά μοντέλα μπορεί να ανακεφαλαιώσω. Επιπλέον, μια ειδική γενετική μετάλλαξη μπορεί να οδηγήσει σε διακριτές βιολογικές και ιστολογικών φαινοτύπων σε ζώα έναντι στην ανθρώπινη [35]. Αντίθετα, μοντέλα ξενομοσχεύματος ευρέως μελετηθεί για την ευκολία χρήσης. Αποτελούν της ανθρώπινης προέλευσης και ως εκ τούτου πιστεύεται ότι ανακεφαλαιώσουμε καλύτερα ανθρώπινων όγκων σε σχέση με τις ιστοπαθολογικές και μοριακά χαρακτηριστικά [34]

Αρκετές ευρέως χρησιμοποιούμενη PCa ξενομοσχευμάτων, όπως η LAPC και LuCaP σειρά [36] -. [ ,,,0],38], έχουν καθιερωθεί από την εμφύτευση ανθρώπινου κομμάτια του όγκου του προστάτη σε ποντίκια. PCa ξενομοσχεύματα μπορούν επίσης να δημιουργηθούν με την έγχυση καθιερωμένες κυτταρικές γραμμές προστάτη όπως PC3, Du145, και LNCaP [39]. Λόγω του πολύ γνωστό γεγονός ότι εντοπισμένη προστάτη ή του προστάτη κύτταρα σπάνια σχηματίζουν όγκους σε ανοσοανεπαρκείς ποντικούς [39], τα παραπάνω αναφερθέντα παραδείγματα των ξενομοσχευμάτων ή κυτταρικές γραμμές όλες συγκροτούνται από μεταστάσεις, και αντιπροσωπεύουν μόνο μια μειοψηφία αφαιρεθεί χειρουργικά ανθρώπινης PCa και δεν αντανακλούν πλήρως την ετερογένεια της νόσου [40]. Πρόσφατα, έχουν γίνει προσπάθειες για την παραγωγή του προστάτη ξενομοσχεύματα με εμβολιασμό εντοπισμένη κομμάτια προστάτη [41], [42] ή πρωτογενή κύτταρα προστάτη ανασυνδυαστεί με νεογνική μεσέγχυμα ποντίκι [43] στη νεφρική κάψα. Τα αναγεννημένα ξενομοσχεύματα φαίνεται να μοιάζουν, ιστοπαθολογικά, τους όγκους των ασθενών δότη, αλλά αν θα μπορούσαν να σειριακά είναι άγνωστη.

Ο κύριος στόχος του παρόντος έργου μας είναι να δημιουργηθεί ένα αξιόπιστο σύστημα προσδιορισμού που θα μας επιτρέψει να επαναλήψιμα και πιστά ανασύσταση αναγέννηση όγκου ανθρώπινου προστάτη σε ποντίκια χρησιμοποιώντας ασθενή που προέρχεται από όγκο μονά κύτταρα HPCA. Έχουμε κάνει στο παρελθόν κάποιες προσπάθειες προς αυτή την κατεύθυνση, αλλά τα περισσότερα από τα πρωτόκολλα ανασύσταση μας απέτυχε εντελώς να αναγεννηθεί όγκους [14]. Εδώ, έχουμε χρησιμοποιηθούν πολλά από τα δείγματα 114 μη επεξεργασμένα προστατεκτομή, που κυμαίνονται από την βαθμολογία Gleason (GS) 6 έως 10, για την παρασκευή ενιαία επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα, τα οποία στη συνέχεια ανασυνδυάζονται με διαφορετικές στρωματικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων rUGM, ινοβλάστες καρκίνωμα που συνδέεται (CAFS), ή αθανατοποιημένα μυελό οστών στρωματικά κύτταρα (HS5), και εμφυτεύεται σε διαφορετικές ανατομικές θέσεις και στις δύο NOD /SCID-IL2Rγ

NOD /SCID ή – /- (NSG) ποντικούς. Παρακάτω σας παρουσιάζουμε τα αποτελέσματα της ολοκληρωμένες μελέτες μας.

Υλικά και Μέθοδοι

Όλες οι μελέτες που αφορούν τα ζώα σε αυτό το έργο έχει εγκριθεί από το MD Anderson Cancer Center IACUC (Θεσμικές φροντίδα των ζώων και την Επιτροπή Χρήση ? ACUF # 08-05-08132). Η τρέχουσα έρευνα δεν περιλαμβάνει ανθρώπινα υποκείμενα (δηλαδή, ζουν άτομα ή αναγνωρίσιμες προσωπικές πληροφορίες), αν και δεν συνεπάγεται πρωτογενή δείγματα HPCA που προέρχονται από τη συνεργασία τους κλινικούς γιατρούς μας με την κάλυψη της IRB (Institutional Review Board) τον αριθμό πρωτοκόλλου LAB04-0498. Όλες οι άλλες μελέτες που παρουσιάζονται εδώ ήταν ο ερευνητής-ξεκίνησε και δεν απαιτούν έγκριση από άλλους ρυθμιστικούς φορείς.

Κύτταρα, Αντιδραστήρια και Ζώα

PC3, DU145, LNCaP, και τα κύτταρα Swiss 3Τ3 ελήφθησαν

από την ATCC. Η κυτταρική γραμμή HS5, το οποίο παρήχθη από ανθρώπινο μυελό των οστών και αθανατοποιημένα με μεταγωγή με τον ιό των ανθρώπινων θηλωμάτων Ε6 /7 γονίδια [44], χορηγήθηκε ευγενώς από τον Dr. Μ Andreeff (ΜΌ Anderson Κέντρο Καρκίνου). ινοβλάστες που σχετίζεται με καρκίνωμα (CAFS) παρασκευάστηκαν όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [45]. Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσα που περιέχουν συνιστάται 7% θερμο-απενεργοποιημένο FBS, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, και 200 ​​U /ml πενικιλίνη (Gibco). Η τεστοστερόνη αγοράστηκε από τη Sigma. Η γραμμή ξενομόσχευμα trpC παρεσχέθη από τον Dr. Palapattu [46]. ποντίκια με ανοσοανεπάρκεια (NOD /SCID, NSG, rag2? βλ. διαιτητή 14 σχετικά με τις ιδιότητες των στελεχών αυτών των ζώων) αρχικά αγοράστηκε από την Jackson Laboratories (Bar Harbor, ΜΕ) και τις αναπαραγωγικές αποικίες ιδρύθηκαν στην εγκατάσταση των ζώων μας και να διατηρούνται σε πρότυπο προϋποθέσεις σύμφωνα με τις οδηγίες του ιδρύματος. Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται στην παρούσα μελέτη παρουσιάζονται στον Πίνακα S1.

Ιστολογική και ανοσοϊστοχημική (IHC) Αναλύσεις

ιστούς όγκων που συλλέγονται από όγκους των ασθενών και ανασυσταθεί ξενομοσχεύματα σταθεροποιήθηκαν σε 10% ουδέτερη ρυθμισμένη φορμαλίνη για 24 ώρες που ακολουθείται από 70% αιθανόλη και ενσωμάτωση σε παραφίνη. Τμήματα (4 μm) κόπηκαν και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (ΗΕ). Για IHC, τα τμήματα αποπαραφινοποιήθηκαν και ενυδατωμένο και ενδογενής δράση υπεροξειδάσης αποκλείστηκε με 3% Η

2O

2 σε νερό για 10 λεπτά. Το αντιγόνο ανάκτηση διεξήχθη με 10 mM κιτρικό ρυθμιστικό (ρΗ 6.0) για 10 λεπτά σε ένα φούρνο μικροκυμάτων που ακολουθείται από μια 20-λεπτών κρυώσει και διεξοδική πλύση. Τα πλακίδια επωάστηκαν με Biocare Blocking Reagent (# BS966M με καζεΐνη στο ρυθμιστικό) για 10 λεπτά για να εμποδίσει μη ειδικής δέσμευσης. Τα πλακίδια επωάστηκαν με διάφορες πρωτεύοντα αντισώματα γιά 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και πλύθηκαν σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα δύο φορές και στη συνέχεια επωάζονται σε βιοτινυλιωμένο κατσίκα-αντι-κουνελιού ή ποντικού IgG (Vector Laboratories, Burlingame, CA) σε αραίωση 1:500 για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από διεξοδική πλύση, αυτά επωάστηκαν με SA-HRP (BioGenex, San Ramon, CA) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου ακολουθούμενη από πλύση. Τέλος, οι πλάκες επωάστηκαν με BioGenex DAB υπόστρωμα (ανάπτυξη χρώματος παρακολουθείται στενά κάτω από ένα μικροσκόπιο) και ελαφρά με αιματοξυλίνη. Εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα MagnaFire φωτογραφική μηχανή, και η όλη τοποθέτηση διαφάνειες σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα Aperio ImageScope.

Aperio υποβοηθούμενη μορφομετρική ανάλυση

HE ή IHC βάφονται γυάλινα πλακίδια που περιέχουν ασθενή ή ξενομοσχεύματος όγκοι ήταν σαρώνονται με τη χρήση της πλατφόρμας απεικόνισης ScanScope Aperio (Aperio Technologies, Vista, CA, USA) με στόχο 20 × σε μια περίοδο χωρική δειγματοληψία 0,47

μ

m ανά pixel. Ολόκληρο διαφάνειες εικόνες είδαν και αναλύθηκαν με τη χρήση επιτραπέζιων προσωπικών υπολογιστών είναι εξοπλισμένα με το ελεύθερο λογισμικό ScanScope.

Καθαρισμός των καρκινικών κυττάρων από πρωτογενείς δείγματα ασθενών και όγκους ξενομοσχεύματος

Βασικές διαδικασίες έχουν πρόσφατα περιγραφεί [14 ]. Στοιχειώδη δείγματα προστάτη ελήφθησαν σε ριζική προστατεκτομή με τη συγκατάθεση των ασθενών, σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές MDACC Institutional Review Board (IRB LAB04-0498). Κανένας από τους ασθενείς έλαβαν καμία επεξεργασία πριν από το χειρουργείο.

Για τα δείγματα των ασθενών

, ιστούς όγκων πρόσφατα ληφθέντα από προστατεκτομή τεμαχίστηκαν σε ~ 1 mm

3 κομμάτια και οι ιστοί υποβάλλονται σε ενζυματική πέψη (κολλαγενάσηε τύπου Ι συν DNase στα 50 U /ml) για 8-10 h στους 37 ° C. Μετά την πέψη, τα επιθηλιακά organoids εμπλουτίζονται με σύντομη φυγοκέντρηση ακολουθούμενη από πέψη με θρυψίνη (0,05%, Gibco) σε ένα ταλαντωτή στους 37 ° C για 15-30 λεπτά για να απελευθερώσει τα επιθηλιακά κύτταρα.

Για ξενομοσχεύματα

, ιστοί όγκου επωάστηκαν με 1 × Accumax (1200-2000 U /ml που περιέχει πρωτεολυτική δράση κολλαγενάσης και DNase? Innovative Technologies Cell, Inc) σε 10 ml ανά γραμμάριο ιστού επί 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου υπό περιστρεφόμενο συνθήκες. Single-κυτταρικό εναιώρημα ελήφθη με διήθηση του υπερκείμενου μέσω ενός προ-διαβραχεί 40 μm κύτταρο σουρωτήρι και κυτταρικό εναιώρημα στη συνέχεια φορτώθηκε απαλά πάνω σε ένα στρώμα από Histopaque-1077 (Sigma) κλίση στάδιο καθαρισμού για απομάκρυνση της πλειονότητας των ερυθρών αιμοσφαιρίων, τα νεκρά κύτταρα και υπολείμματα. Τέλος, το προκύπτον μίγμα κυττάρων υποβλήθηκε σε κιτ εξάντληση κύτταρο MACS γράμμωσης (Miltenyi Biotec) και το κοκτέιλ (αντι-CD3, 14, 16, 19, 20, 45, 56, και 140b για όγκους ασθενών? Η2Κ

d για ξενομοσχεύματα) για την απομάκρυνση του Lin

+ κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των αιμοποιητικών, ενδοθηλιακών, και άλλα στρωματικά κύτταρα (λείου μυός, μυοεπιθηλιακά, ινοβλαστών, κλπ) για δείγματα ασθενών, ή στρωματικά κύτταρα ποντικού για όγκους ξενομοσχεύματος, αντίστοιχα.

Πειράματα όγκου Transplantation

κύτταρα καθαρισμένα PCa (παραπάνω), είτε μόνο του ή σε συνδυασμό με βοηθητικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων rUGM, CAFS, ή κύτταρα HS5, εμφυτεύεται είτε υποδορίως (sc) ή κάτω από την κάψα του νεφρού (KC) του ανοσο-ανεπαρκή ποντίκια. Εναλλακτικά, τα κομμάτια ή θραύσματα HPCA μεταμοσχεύθηκαν υποδόρια, κάτω από την KC, ή στο πρόσθιο ποντικού προστάτη (AP). Οι Βασικές διαδικασίες για αυτές τις μεταμοσχεύσεις έχουν περιγραφεί προηγουμένως [14]. Εν συντομία,

για εμφυτεύσεις s.c

, καρκινικά κύτταρα εγχύθηκαν, σε 40 μΐ μέσου που περιέχει 50% Matrigel, υποδόρια σε ηλικίας 6-8 εβδομάδων αρσενικών ποντικών συμπληρωμένο με εξωγενή τεστοστερόνη.

Για KC μεταμοσχεύσεις

, τα κύτταρα του προστάτη αναμίχθηκαν με 250.000 κύτταρα rUGM και προϊόντα ανασυνδυασμού του ιστού έγιναν στο κολλαγόνο αρουραίος-ουρά και επωάζονται όλη τη νύκτα. Οι ανασυνδυασμοί ιστός μεταμοσχεύθηκαν επόμενο πρωί κάτω από τη νεφρική κάψα του δέκτη αρσενικών ποντικών συμπληρωμένο με σφαιρίδια τεστοστερόνη.

Για AP μεταμόσχευση

, μικρά κομμάτια των ιστών HPCA άμεσα εμφυτεύονται. Σε μερικές περιπτώσεις, τα κύτταρα HPCA σε διαφορετικούς αριθμούς αναμίχθηκαν πρώτα με κολλαγόνο αρουραίου και επωάζονται σε μία πλάκα καλλιέργειας ιστών στους 37 ° C για 10-15 λεπτά. Στη συνέχεια, τα στερεοποιημένα κυτταρικά σφαιρίδια καλύπτονται απαλά σε μέσο και καλλιεργήθηκαν για 4 ώρες έως όλη τη νύχτα πριν από την εμφύτευση. Μία εγκάρσια τομή στην κατώτερη κοιλία για να εκθέσει το ΑΡ με μερική τραβώντας την ουροδόχο κύστη, των σπερματοδόχων κύστεων και του προστάτη έξω από την κοιλιακή κοιλότητα. Μια τομή 2-3 mm έγινε στο AP μέσω του σωληναρίου μεταξύ των δύο κύριων αγωγών με τη βοήθεια μιας βελόνας 22-gauge. Χρησιμοποιώντας ένα ρύγχος πιπέτας ποτήρι φωτιά στρογγυλεμένες, οι κουκίδες κολλαγόνου εισάγεται μέσα σε ένα θύλακα που σχηματίζεται κάτω από το σωληνάριο του προστάτη. Στη συνέχεια, τα όργανα αντικαταστάθηκαν και το τοίχωμα του σώματος και το δέρμα κλείνεται.

Σε όλα τα παραπάνω πειράματα, η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε ξεκινώντας από τη δεύτερη εβδομάδα. Ογκογονικότητα μετρήθηκε κυρίως με εμφάνιση όγκου (δηλαδή, ο αριθμός των όγκων /αριθμός ενέσεων), λανθάνουσα κατάσταση (δηλαδή, ο χρόνος από την ένεση για ανίχνευση ψηλαφητούς όγκους), τον όγκο του όγκου, και το βάρος του τελικού σημείου του όγκου.

Western Blotting

λύματα πλήρων κυττάρων παρασκευάστηκαν σε πλήρες ρυθμιστικό RIPA (50 mM Tris-HCl, ρΗ 7.5, 150 mM NaCl, 1% Nonidet Ρ-40, 0.5% δεοξυχολικό νάτριο, 0,5% Triton Χ-100, 10 mM EDTA) που περιέχει μίγμα αναστολέα πρωτεάσης. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίσθηκαν με κιτ ΜϊογοΒΟΑ (Pierce). Διάφορες ποσότητες πρωτεϊνών φορτώθηκαν σε ένα 15% SDS-PAGE. Κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε όπως πρότυπο χρησιμοποιώντας ECL Plus (PerkinElmer).

Αντίστροφη Μεταγραφή (RT) -PCR Ανάλυση

Ολικό RNA εκχυλίστηκε από τα κομμάτια του όγκου ή καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ (Invitrogen), και χρησιμοποιήθηκαν σε ανάλυση RT-PCR. Οι εκκινητές PCR που περιλαμβάνονται ανθρώπινη AR (νόημα: 5′-GCTAAAGACTCGGAGGAAGCAAG-3 ‘? Αντινόημα: 5′-TGGGGGAAAACAGAGGGTTC-3′)? PSA (νόημα: 5’-TGGGAGTGCGAGAAGCATTC-3 ‘? Αντινόημα: 5′-GCTGTGGCTGACCTGAAATACC-3′)? β-ακτίνης (με νόημα: 5’-CTGGCACCACACCTTCTACAATG-3 ‘? αντινόημα: 5′- AATGTCACGCACGATTTCCCGC-3’)

Καρυοτυπική και της γονιδιωματικής αστάθειας

Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε κολσεμίδη (0,04

μ

g /ml) για 25 λεπτά στους 37 ° C και στη συνέχεια σε ένα υποτονικό διάλυμα (0,075 Μ KCl) για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε ένα μείγμα μεθανόλης και οξικού οξέος (3:01 κατ ‘όγκο) για 15 λεπτά, και πλένονται τρεις φορές στο στερεωτικό. Οι πλάκες ξηραίνονται στον αέρα, βέλτιστα ηλικίας, και G-κλιμακωτά με χρήση διαλύματος τρυψίνης και χρωματίστηκαν σε Giemsa ακολουθώντας την διαδικασία ρουτίνας. Οι εικόνες ελήφθησαν με τη χρήση μικροσκοπίου Nikon 80i είναι εξοπλισμένα με το λογισμικό καρυότυπου από την Applied Spectral Imaging (ASI) Inc (Vista, CA). και τουλάχιστον 15 G-κλιμακωτά μεταφάσεις καρυοτυπήθηκαν.

ενεργοποιημένων με φθορισμό κυττάρων (FACS) και Καθαρισμός του EpCAM

+ Cells

HPCA /HS5 ξενομοσχεύματος όγκοι κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με FcR παράγοντα αποκλεισμού (Miltenyi Biotec) για 10-15 λεπτά στους 4 ° C και χρωματίστηκαν με PerCP-eFluor 710 συζευγμένο αντι-ΕρΟΑΜ αντίσωμα και βιοτινυλιωμένο ποντικού H-2K

d αντισώματος για 30 λεπτά στους 4 ° C. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS και σημάνθηκαν με Alexa Fluor 405 συζευγμένης στρεπταβιδίνης (Invitrogen, S-32351) για 10 λεπτά στους 4 ° C. EpCAM

+ και EpCAM

– κύτταρα καθαρίστηκαν περαιτέρω χρησιμοποιώντας FACS [21], [25]. Μετα-ανάλυση έδειξε καθαρότητες των δύο πληθυσμών είναι Πρέπει πρώτα εγχέεται πρόσφατα καθαριστεί πρωτογενή κύτταρα HPCA από 5 όγκους των ασθενών (2 GS7, 1 GS8, 2 GS9) υποδορίως σε ποντίκια NSG. Σε σύνολο 37 ενέσεις, δεν παρατηρήσαμε καμία ανάπτυξη του όγκου μετά από 8 μήνες (Πίνακας 2). Δεδομένου ότι τα κύτταρα HS5 ελαφρώς αυξημένη αναγέννηση του όγκου των κυττάρων HPCA σε NOD /SCID ποντίκια (Πίνακας S5), μπορούμε υποδορίως εγχύονται ταυτόχρονα μη ταξινομημένα κύτταρα HPCA από 9 δείγματα ασθενών με κύτταρα HS5 σε ποντικούς NSG και, παραδόξως, αυτή η τροποποιημένη «πρωτόκολλο ανασυνδυασμού» προκαλούμενη σχηματισμό όγκων σε 41/59 (δηλαδή, περίπου 70%) ενέσεις (Πίνακας 3). κύτταρα που προέρχονται από HPCA 3 GS9, 1 GS8, και 4 όγκους GS7 όλα αναγεννημένη όγκους όταν εγχύονται ταυτόχρονα με κύτταρα HS5 (Πίνακας 3). Ιδρύσαμε και 1 ° ξενομοσχευμάτων σε ποντίκια rag2 από κομμάτια των 3 άλλα δείγματα HPCA (δηλαδή, HPCa57, 58, και 70). Όταν οι 1 ° ξενομοσχεύματος κύτταρα καθαρίστηκαν έξω και εγχύονται ταυτόχρονα με κύτταρα HS5 σε αρσενικούς rag2 ή NSG ποντίκια, εμείς ληφθούν εύκολα τα 2 ° ξενομοσχεύματα [21, 25? δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα]. Συνολικά, έχουμε καθιερώσει 11 HPCA /HS5 ξενομοσχεύματα από 7 GS7 (HPCa57, 58, 70, 83, 84, 85, και 92), 1 GS8 (HPCa91), και 3 GS9 (HPCa80, 87, και 96) όγκων. Τα αποτελέσματα αυτά φαίνεται να δείχνουν ότι τα κύτταρα HS5 προωθήσει ιδιαίτερα αποτελεσματικά την αναγέννηση του όγκου σε NSG ποντίκια από φρέσκα κύτταρα HPCA.

Η

Το

ανασυσταθεί

όγκοι ήταν πολύ ογκογόνο και θα μπορούσαν να περνιούνται επ ‘αόριστον (Πίνακας S6? δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επίσης, τα αναγεννημένα όγκοι ήταν σε θέση να προκαλέσουν μεταμοσχεύσιμων όγκων ανεξάρτητα των κυττάρων HS5 (Πίνακας S6). Επιπλέον, αδιαχώριστα ή CD44-ταξινομημένο (τόσο CD44

+ και CD44

-) κύτταρα HPCA ήταν σε θέση να εκκινήσει εκ νέου όγκους τόσο υποδορίως και στη ραχιαία προστάτη (DP) και, σημαντικά, τα κύτταρα HPCA καθαρίζεται από τα ξενομοσχεύματα είχε καθοριστεί αρχικά σε ποντίκια NSG θα μπορούσε να αναγεννήσει όγκους σε ποντίκια NOD /SCID (Πίνακας S6? δεδομένα δεν παρουσιάζονται)

το ανασυσταθέν «προστάτη» οι όγκοι είναι της ανθρώπινης προέλευσης και να παρουσιάσει ένα μη διαφοροποιημένες και επιθηλιακά Μορφολογία:. IHC, Βιοχημικές, και Μοριακής χαρακτηρισμοί

Πρέπει πρώτα διενεργείται ιστολογική και IHC χαρακτηρισμούς του ανασυσταθέντος όγκων. Όπως ήταν αναμενόμενο, ο όγκος ασθενής εμφάνισε HPCa57 τυπικό ιστολογία GS7 με συνωστισμό αδένες του όγκου, στην οποία τα περισσότερα κύτταρα χρωματίστηκαν θετικά για αυλού των επιθηλιακών κυττάρων του προστάτη δεικτών PSA, πυρηνική AR, και κυτοκερατίνη 8 (Ck8) (Σχ. 2Α). Επίσης, οι αδένες του όγκου έδειξε θετική χρώση για ρακεμάση (άλφα-μεθυλακυλοσυνένζυμο-CoA ρακεμάσης, επίσης γνωστή ως AMACR ή P504S? Κωδικοποιείται από το

AMACR

γονίδιο), αρνητικά (ή ασθενώς θετικό) χρώση για CK5 (ένα βασικό προστάτη επιθηλιακά δείκτη), και αρνητική χρώση για ρ63 (ένας άλλος δείκτης βασικών κυττάρων) (Σχ. 2Α). Οι HPCa57 /HS5 ανασυσταθεί όγκων σε ποντίκια NSG εμφανίστηκε εντελώς αδιαφοροποίητο και στερούνταν αδενικές δομές και την έκφραση του PSA (εικ. 2Β). Τα κύτταρα εξέτασαν συνολικά επιθηλιακά, όπως υποστηρίζεται από την παρουσία κάποιου Ck8

+ και σποραδικές CK5

+ κύτταρα (Εικ. 2Β). Είναι ενδιαφέρον, διάσπαρτα AR

+ και p63

+ κύτταρα θα μπορούσαν να παρατηρηθούν (Εικ. 2Β). Χρώση με ανθρώπινα-ειδικά αντισώματα έναντι μιτοχονδρίων και Ki-67, δύο από τα οποία δεν λεκιάζει ιστούς ποντικού (Σχ. S1), επιβεβαίωσε την ανθρώπινη προέλευση του αναγεννημένου HPCa57 όγκου (Σχ. 2Β). Παρόμοιες μορφές εκφράσεως μορφολογίας και δείκτη παρατηρήθηκαν σε HS5 ανασυσταμένο HPCa58 (Εικ. 3) και 9 άλλα δείγματα HPCA, δηλαδή, HPCa70, 80, 83, 84, 85, 87, 91, 92, 96 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α) Χρώση HE, AR, PSA, Ck8, CK5, p63 και Racamase σε HPCa57 δείγμα του ασθενούς. (Β) του όγκου HPCa57P1 ξενομόσχευμα, που προέρχονται από συν-ένεση με 100.000 κύτταρα HS5, χρησιμοποιήθηκε για να κάνει σειριακά τμήματα, τα οποία χρωματίστηκαν για HE, Hu-Mito, Hu-Ki67, AR, PSA, Ck8, CK5 και ρ63. Τόσο χαμηλή (δηλαδή, 100Χ) και υψηλής ισχύος (δηλαδή, 400χ) μεγεθύνσεις έδειξαν. Βέλος δείχνει CK5

+ κύτταρα.

Η

(Α) Χρώση HE, AR, PSA, Ck8, CK5, p63 και Racamase σε HPCa58 δείγμα του ασθενούς. (Β) του όγκου HPCa58P1 ξενομόσχευμα, που προέρχονται από συν-ένεση με 100.000 κύτταρα HS5, χρησιμοποιήθηκε για να κάνει σειριακές τομές χρωματίστηκαν για HE, Hu-Mito, Hu-Ki67, AR, PSA, Ck8, CK5 και ρ63. Τόσο χαμηλή (δηλαδή, 100Χ) και υψηλής ισχύος (δηλαδή, 400χ) μεγεθύνσεις έδειξαν. Βέλος δείχνει CK5

+ κύτταρα.

Η

Σύμφωνα με τα αποτελέσματα IHC, ανάλυση RT-PCR χρησιμοποιώντας ανθρώπινη-ειδικούς εκκινητές αποκάλυψε ότι κανένα από τα ξενομοσχευμάτων HPCA /HS5 εξέφρασε

PSA

αλλά οι περισσότεροι εκφράζονται διαφορετικά επίπεδα της ανθρώπινης

AR

mRNA (Εικ. 4Α). Αξίζει να σημειωθεί ότι, καλλιεργημένα ποντικού ινοβλάστες (Swiss 3Τ3) και κύτταρα HS5 ήταν αρνητικά τόσο για

AR

και

PSA

mRNAs (Σχ. 4Α). Western blotting πειράματα για δείκτες κυτταρικής 4 αυλού, ρακεμάσης, PSA, AR, και CK18 επιβεβαίωσε έλλειψη έκφρασης PSA και αποκάλυψε διάφορα επίπεδα από τα άλλα 3 δείκτες σε διαφορετικούς ξενομοσχεύματα (Σχ. 4Β-D). Σημειώστε ότι καλλιεργημένα κύτταρα HS5 και όγκους HS5 (βλέπε κατωτέρω) δεν εκφράζουν CK18 (Σχ. 4D, βέλος), παρόλο που εκφράζονται χαμηλά επίπεδα ρακεμάση (Εικ. 4Β). Περιστασιακά, HS5 όγκοι βρέθηκαν να εκφράζουν χαμηλά επίπεδα του AR πρωτεΐνης (Εικ. 4C), παρόλο που εκφράζεται μόλις ανιχνεύσιμη

AR

mRNA (Σχ. 4Α). Οι περισσότεροι ξενομοσχεύματα HPCA /HS5 εξέφρασαν υψηλότερα επίπεδα από ό, τι ρακεμάσης PC3 κύτταρα (Σχ. 4Β). Είναι ενδιαφέρον, κηλίδωση Western για ρ63 αποκάλυψαν πολύ υψηλά επίπεδα σε PC3 και LNCaP κύτταρα, εύκολα ανιχνεύσιμη έκφραση σε HPCa57 και HPCa96 ξενομοσχεύματα, και πολύ χαμηλά επίπεδα σε διάφορες άλλες ξενομοσχεύματα HPCA (HPCa58, 70, και 91) (Σχ. 4Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι συνολικά η

HPCA /HS5 ξενομοσχεύματα περιέχουν ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη

. Ως περαιτέρω υποστήριξη, κηλίδωση Western των AR και CK18 σε μια σειρά όγκων ξενομοσχεύματος HPCa57 /HS5, από το 1 ° γενιάς (Ρ1) με την παραγωγή 4 ° (Ρ4), που προέρχεται από sc ή εμφυτεύσεις DP, έδειξε ότι όλοι αυτοί οι όγκοι ήταν θετικό για AR και CK18 (Σχήμα 4Ε).

(Α) RT-PCR αποτελέσματα του AR, PSA, και β-ακτίνη χρησιμοποιώντας ανθρώπινα-ειδικούς εκκινητές. LNCaP, trpC (θεραπεία-ανθεκτικό καρκίνο προστάτη? 46) και Du145 κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. (Β-D) κηλίδωση Western της ρακεμάσης, PSA, ρ63, CK18 και AR σε όγκους ξενομοσχεύματος HPCA-HS5 και των σφαιρών του όγκου που προέρχεται από κύτταρα. GAPDH και β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι φόρτωσης.