Αφηρημένο

Snail1 είναι ένας παράγοντας μεταγραφής που διεγείρει τον επιθηλιακό να μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ). Κατά τη διάρκεια της EMT, επιθηλιακά κύτταρα χάνουν διασταυρώσεις τους, την αναδιοργάνωση cytoskeletons τους, και να επαναπρογραμματίσει γονιδιακής έκφρασης. Παρά το γεγονός ότι Snail1 είναι ένα προεξέχον καταστολέας της μεταγραφής Ε-καδερίνης, ακριβείς ρόλους της σε καθένα από τα φαινόμενα της ΕΜΤ δεν είναι πλήρως κατανοητοί, ιδιαίτερα στην κυτταροσκελετική αλλαγές. Προηγούμενες μελέτες έχουν χρησιμοποιήσει τα συστήματα του γονιδίου νοκ ντάουν για να καθορίσουν τις λειτουργίες της Snail1. Ωστόσο, ατελής πρωτεΐνη knockdown συνδέεται συχνά με αυτά τα συστήματα, τα οποία μπορεί να προκαλέσουν εσφαλμένη ερμηνεία των δεδομένων. Να αξιολογήσει με μεγαλύτερη ακρίβεια τις λειτουργίες της Snail1, έχουμε δημιουργήσει μια σταθερή κυτταρική γραμμή με μια στοχευμένη κατάλυση της Snail1 (Snail1 KO) με τη χρήση του συστήματος CRISPR /Cas9n. κύτταρα Snail1 KO δείχνουν αυξημένη προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου, μειωμένη προσκόλληση κυττάρου-υποστρώματος και τη μετανάστευση των κυττάρων, αλλαγές στην κυτταροσκελετική οργάνωση τους που περιλαμβάνουν μερικές ίνες στρες και άφθονη φλοιώδη ακτίνης, και προς τα πάνω ρύθμιση των επιθηλιακών γονιδίων δεικτών όπως Ε-καδερίνης, occludin, και κλαουδίνης -1. Ωστόσο, μορφολογικές αλλαγές που προκαλούνται από την κατεργασία των κυττάρων Snail1 KO με ΤΟΡ-βήτα. Άλλοι παράγοντες μεταγραφής που επάγουν ΕΜΤ επίσης επάγεται από την αγωγή με ΤΟΡ-βήτα. Η ακριβής διαγραφή του Snail1 από το σύστημα /Cas9n CRISPR παρέχει σαφείς αποδείξεις ότι η απώλεια του Snail1 προκαλεί αλλαγές στον κυτταρικό σκελετό ακτίνης, μειώνει προσκόλληση κυττάρου-υποστρώματος, και αυξάνει την προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου. Θεραπεία των κυττάρων RMG1 με TGF-β υποδεικνύει πλεονασμού μεταξύ των μεταγραφικών παραγόντων που προκαλούν EMT

Παράθεση:. Haraguchi Μ, Sato M, Ozawa Μ (2015) CRISPR /Cas9n διαμεσολαβείται διαγραφή του σαλιγκαριού 1Gene (

SNAI1

) αποκαλύπτει ο ρόλος του στη ρύθμιση της κυτταρικής μορφολογίας, αλληλεπιδράσεις κυττάρων-κυττάρων και γονιδιακής έκφρασης σε καρκίνο των ωοθηκών (RMG-1) κύτταρα. PLoS ONE 10 (7): e0132260. doi: 10.1371 /journal.pone.0132260

Επιμέλεια: Μιχαήλ Klymkowsky, Πανεπιστήμιο του Κολοράντο, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 20 του Δεκέμβρη του 2014? Αποδεκτές: 11 του Ιουνίου 2015? Δημοσιεύθηκε: 10 Ιουλίου 2015

Copyright: © 2015 Haraguchi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας της Ιαπωνίας. Χορηγεί αριθμό: 22590287 για να MH. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η επιθηλιακή προς μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) είναι μια κοινή διαδικασία που συμβαίνει κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης, την επούλωση των πληγών και της μετάστασης του καρκίνου. Κατά τη διάρκεια της EMT, επιθηλιακά κύτταρα χάνουν διασταυρώσεις τους, αλλάζουν το σχήμα τους, την αναδιοργάνωση cytoskeletons τους, και να επαναπρογραμματίσει γονιδιακής έκφρασης [1]. Αυτή η αλλαγή στην έκφραση γονιδίου επάγεται με πολλές ρυθμιστικές master, συμπεριλαμβανομένου του Snail1, συστροφή, και ψευδαργύρου-δακτύλου σύνδεσης (Zeb) παράγοντες μεταγραφής E-box. συνεισφορές τους στην επαγωγή της EMT εξαρτώνται από τον τύπο του κυττάρου και το σηματοδοτικό μονοπάτι που ξεκινά EMT. Συχνά ελέγχουν την έκφραση του άλλου και λειτουργικά συνεργάζονται σε γονίδια στόχους [1]. EMT ρυθμίζεται από οδούς με τη μεσολάβηση πολλαπλών κυτοκινών, συμπεριλαμβανομένων των Wnt, Notch και αυξητικό παράγοντα μετασχηματισμού (TGF) -β [2] σηματοδότησης. Το μονοπάτι TGF-β σηματοδότηση έχει κυρίαρχο ρόλο μεταξύ τους [1]. Μετά την επαγωγή της ΕΜΤ με ΤΟΡ-β, οι παράγοντες μεταγραφής όπως Snail1 ρυθμίζεται αυξητικά [3]. ρόλος Snail1 στην ΕΜΤ έχει μελετηθεί εκτενώς. Snail1 είναι ένας ισχυρός καταστολέας των επιθηλιακών δεικτών, όπως η E-cadherin, τα claudins και τις occludins. Από την άλλη πλευρά, Snail1 αυξάνει την έκφραση των δεικτών μεσεγχυματικών όπως βιμεντίνη και φιμπρονεκτίνη [4], [5]. Έχουμε επιβεβαιώσει ότι Snail1 ρυθμίζει προσκόλληση κυττάρου-μήτρας μέσω της ρύθμισης της έκφρασης των πρωτεϊνών ιντεγκρίνης και βασικής μεμβράνης, όπως τα λαμινίνες [6]. Snail1 κυρίως πιστεύεται ότι επάγει EMT μέσω της άμεσης καταστολής της Ε-καδερίνης, η οποία οδηγεί σε μετατόπιση της πυρηνικής βήτα-κατενίνης και περαιτέρω μεταβολές στη μεταγραφή [7]. γονιδιακή έκφραση Snail1 έχει αναφερθεί ότι επάγουν αλλαγές στο σχήμα των κυττάρων και των κινήσεων [5]. Οι αλλαγές αυτές απαιτούν αλλαγές στην ακτίνη οργάνωση. Ωστόσο, οι μοριακοί μηχανισμοί που ελέγχουν F-ακτίνης δυναμική κατά τη διάρκεια της ΕΜΤ δεν είναι πλήρως κατανοητοί [1]. Πρόσφατα, McGrail ερεύνησε το ρόλο των Snail1 στην κυτταροσκελετού ανάπλαση και η ακτίνη δυναμική. Μελετήθηκε η επίδραση του Snail1 στην έκφραση των γονιδίων ακτίνη κυτταροσκελετό σχετίζονται [8]. Έχουμε, επίσης, προσπάθησε να αποσαφηνίσει τον αντίκτυπο της Snail1 σχετικά με το σχήμα των κυττάρων και τη διαμόρφωση της ακτίνης με τη διαγραφή Snail1 από κύτταρα RMG1.

Η λειτουργία της Snail1 έχει αξιολογηθεί σε διάφορους τύπους καρκινικών κυττάρων μέσω της χρήσης της παρεμβολής RNA (RNAi) [9]. Ωστόσο, knockdown της έκφρασης γονιδίου στόχου με RNAi είναι ελλιπής και προσωρινή [10]. Για να προσδιοριστεί ο ακριβής ρόλος της Snail1 κατά τη διάρκεια της επαγωγής της EMT, έχουμε απασχολούνται ένα νέο σύστημα επεξεργασίας γονιδίωμα ονομάζεται «σύμπλεγμα Τακτικά διάκενα Σύντομη Παλινδρομική Επαναλήψεις (CRISPR) /CRISPR που σχετίζεται με 9 (Cas9)« Το σύστημα CRISPR /Cas9 αποτελείται από δύο συστατικά : η πρωτεΐνη Cas9 και ένας οδηγός RNA (gRNA). Η πρωτεΐνη Cas9 κατέχει δραστικότητα νουκλεάσης και μπορούν να προκαλέσουν θραύσεις δίκλωνου (DSBs) σε οποιοδήποτε γονιδιωματική αλληλουχία DNA καθοδηγείται από ένα gRNA, υπό την προϋπόθεση ότι υπάρχει protospacer παρακείμενα μοτίβο αλληλουχίας (ΡΑΜ) στο στοχευόμενο τόπο [11]. Σε περίπτωση απουσίας ενός προτύπου επισκευή, προσδένονται μέσω μιας μη-ομόλογη ένωση άκρων διαδικασία, η οποία προκαλεί μικρή παρεμβολή ή διαγραφή μεταλλάξεις γνωστή ως indels. Έτσι, CRISPR /Cas9 επιτρέπει ειδικές γονιδιωματικές διάσπαση [12]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι CRISPR /Cas9 μπορεί να είναι ιδιαίτερα ενεργός σε ανθρώπινα κύτταρα, ακόμη και με ατελώς συμφωνημένα διεπαφές RNA-DNA. Ως εκ τούτου, το σύστημα /Cas9 CRISPR μπορεί να επάγει υψηλής συχνότητας εκτός στόχου μεταλλαξογένεση σε ανθρώπινα κύτταρα [13]. Για να αποφευχθεί η εκτός στόχου μεταλλαξογένεση, Ran κ.ά. [14] ανέπτυξε μια στρατηγική που συνδυάζει την aspartae-σε αλανίνη (D10A) μετάλλαξη εκδοχή nickase του Cas9 (Cas9n) με ένα ζεύγος όφσετ gRNAs συμπληρωματικό προς αντίθετους κλώνους της θέσης στόχου. Cas9n nicks DNA για να αποδώσει τα διαλείμματα μονόκλωνο. Αυτά τα διαλείμματα είναι κατά προτίμηση επισκευαστεί μέσω ομολογία-σκηνοθεσία επισκευή, η οποία μειώνει τη συχνότητα των ανεπιθύμητων μεταλλάξεων Indel που προκύπτουν από off-στόχο DSBs [12]. Όταν Cas9n συνδυάζεται με ένα ζεύγος gRNAs, διπλό χάραξης προκαλεί DSBs στο μόνο το γονιδιωματικό loci όπου τα δύο από τα gRNAs προσδένονται σε κατάλληλη απόσταση. Αυτό αυξάνει αποτελεσματικά την ειδικότητα της αναγνώρισης στόχου. Αυτό το διπλό σύστημα χάραξης αναφέρεται στη μείωση της δραστηριότητας εκτός στόχου από 50 έως 1500 φορές σε κυτταρικές σειρές [14].

Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε το CRISPR σύστημα /Cas9n να μπλοκάρει συγκεκριμένα την έκφραση Snail1 σε ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα ωοθηκών (RMG-1) κύτταρα [15] και προσδιορίζεται η επίδραση αυτού του σαλιγκαριού knockout (ΚΟ) στη μορφολογία των κυττάρων και τη λειτουργία, καθώς και ΤΟΡ-β επαγόμενη EMT.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Πειράματα με την τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA διεξήχθησαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές της Επιτροπής Πανεπιστήμιο Καγκοσίμα στη ανασυνδυασμένου DNA. Ο αριθμός έγκρισης ασφαλείας είναι 26005.

γραμμή κυττάρων και του πολιτισμού

Ανθρώπινο ωοθηκών mesonephroid κυτταρική γραμμή αδενοκαρκινώματος RMG1 [15] λήφθηκε από την JCRB (ιαπωνική συλλογή της έρευνας Bioresources, Osaka) Cell Bank και καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco Τροποποιημένο Eagle Medium (DMEM) (Nissui, Tokyo) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS) (Nichirei Biosciences, Inc. Tokyo).

Αντισώματα και αντιδραστήρια

μονοκλωνικό

ποντίκι αντισώματα (mAbs) κατά της ανθρώπινης Ε-καδερίνης (κλώνος 36, BD Biosciences, San Jose, CA), ανθρώπινη Snail1 (κλώνος L7042, κυτταρική σηματοδότηση, Danvers, ΜΑ), η ανθρώπινη βιμεντίνη (κλώνος V9, ΖΥΜΕϋ, Carlsbad, CA), ανθρώπινη βινκουλίνης (κλώνος hVIN-1, Sigma, St. Louis, ΜΟ), ανθρώπινη βιτρονεκτίνη (κλώνος 342603, Κ & amp? συστήματα D, Minneapolis, ΜΝ), την ανθρώπινη φιμπρονεκτίνη (κλώνος 10 /Fibronectin, BD Biosciences, San Jose, CA), όπως καθώς και πολυκλωνικά αντισώματα (pAbs) έναντι του ανθρώπινου κλαουδίνης-1 (κλώνος MH25, Invitrogen, Waltham, ΜΑ), ανθρώπινο occludin (κλώνος Ζ-T22, ΖΥΜΕϋ, Carlsbad, CA), ανθρώπινη ιντεγκρίνη άλφα 5 (Ag0860, αριθμός καταλόγου 0569 – 1 ΑΡ, Proteintech, Chicago, IL), βήτα-ακτίνη (αριθμός καταλόγου GTX109639, Genetex, Irvine, CA), και άλφα τουμπουλίνης 4α (αριθμός καταλόγου GTX112141, Genetex, Irvine, CA) αγοράστηκαν όπως υποδεικνύεται. Αντι-ποντικού και τα συζυγή υπεροξειδάσης κρένου IgG αντι-κουνελιού (Jackson Immunoresearch Laborattories, Inc, West Grove, ΡΑ), ροδαμίνη Χ-συζευγμένο φαλλοϊδίνη (Wako, Osaka) και θειαζολύλιο βρωμιούχο μπλε τετραζολίου (ΜΤΤ, Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) αγοράστηκαν επίσης όπως υποδεικνύεται.

CRISPR /Cas9 πλασμίδιο σχεδιασμό

για να επιλέξετε την αλληλουχία-στόχο για επεξεργασία του γονιδιώματος, υποβλήθηκε η ανθρώπινη γονιδιωματική αλληλουχία Snail1 γύρω από το πρώτο εξόνιο (NC_000020.11) σε ένα online εργαλείο σχεδιασμού CRISPR (https://tools.genome-engineering.org). Επιλέχθηκαν δύο θέσεις-στόχους (Εικ 1Α) με τη χρήση κανόνων που περιγράφηκε προηγουμένως [14]. Τα ολιγονουκλεοτίδια που χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή gRNAs για το ανθρώπινο γονίδιο Snail1 ήταν: g-snail1 1s (5′-caccgAGAGCGCGGCATAGTGGTCG-3 ‘), ζ-snail1 1R (5′- aaacCGACCACTATGCCGCGCTCTc-3′), ζ-snail1 2s (5’-caccgGCCTAACTACAGCGAGCTGC -3 ‘) και ζ snail1 2R (5′- aaacGCAGCTCGCTGTAGTTAGGCc-3’).

(Α) Σχηματική απεικόνιση της δομής του γονιδίου snail1 και αλληλουχίες γύρω από την τόπους στόχους. Κίτρινα κουτιά δείχνουν εξόνια που κωδικοποιούν την πρωτεΐνη Snail1. Μπλε κουτιά δείχνουν μη-κωδικοποίησης εξώνια. Οι αλληλουχίες στόχοι gRNA και τομέων PAM υποδεικνύονται με μαύρο και κόκκινο υπογράμμιση, αντίστοιχα. Τα βέλη δείχνουν τις θέσεις των εκκινητών PCR. (Β) Οι γονιδιωματικές αλληλουχίες γύρω από τις περιοχές-στόχους του άγριου τύπου (WT) και κύτταρα Snail1 KO1. (Γ) κυματομορφής δεδομένα από αλληλουχητή DNA εμφανίζει την αλληλουχία που αποκτήθηκε από θραύσματα PCR του γονιδιωματικού DNA.

Η

Το ανθρώπινο κωδικόνιο βελτιστοποιημένο SpCas9 nickase και χιμαιρικά οδηγό φορέα έκφρασης RNA pX335-U6-Chimeric_BB-CBh- hSpCas9n (D10A), (καμία 42335, Addgene, Cambridge, ΜΑ) [16] χωνεύθηκε με

Bbs

Ι, (FD1014, Fermentas /Thermo Scientific, Waltham, ΜΑ) και, στη συνέχεια, ένα ζεύγος συγκολλημένων ολιγονουκλεοτιδίων για κάθε θέση στόχου κλωνοποιήθηκε στον οδηγό RNA σύμφωνα με ένα πρωτόκολλο που περιγράφηκε προηγουμένως [12]. Αυτά τα κατασκευάσματα ορίστηκαν pX335-Cas9-g snail1 1 και pX335-Cas9-g snail1 2, αντίστοιχα.

CRISPR /Cas9n μεσολάβηση μηχανική του γονιδιώματος RMG1 κύτταρο

RMG1 κύτταρα (2 χ 10

5), συν-επιμολυσμένα με 3 μg pX335-Cas9-g σαλιγκάρι 1, 3 μg pX335-Cas9-g σαλιγκάρι 2, και 1 μg του ρΕΟΡΡ-Ν1 (Clontech, Mountain View, CA) χρησιμοποιώντας λιποφεκταμίνη 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA). Δύο ημέρες μετά την επιμόλυνση, τα επιμολυσμένα κύτταρα πέρασαν και σπάρθηκαν ως μεμονωμένες αποικίες (0,5 κύτταρα /φρεάτιο) σε πλάκες 96 φρεατίων. Την επόμενη ημέρα, G418 (τελική συγκέντρωση 1 mg /mL) εφαρμόστηκε σε κάθε φρεάτιο. Μετά από 3-4 εβδομάδες επιλογής, οι αναδυόμενες αποικίες μεταφέρθηκαν σε τρυβλία 24 φρεατίων για να επεκταθεί. Μετά από 2-3 εβδομάδες της επέκτασης, τα κύτταρα σε κάθε αποικία διαιρέθηκαν στο μισό? ένα ήμισυ υποβλήθηκε σε πολλαπλασιασμό και το άλλο μισό χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η έκφραση του Snail1 χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western. Πέντε κλώνοι έδειξαν μια σημαντική μείωση στην έκφραση Snail1. Ως εκ τούτου, τα γενωμικά DNAs αυτών των κλώνων απομονώθηκαν. θραύσματα DNA (182 bp σε μέγεθος) που κάλυψαν οι στόχοι περιοχές gRNA ενισχύθηκαν χρησιμοποιώντας PCR. Οι εκκινητές -57F (5′-GAGTGGTTCTTCTGCGCTAC-3 ‘) και 125R (5′-CCCACGCAGCCTTCGCCTGT-3’) χρησιμοποιήθηκαν για την PCR. Τα προϊόντα PCR επαληθεύθηκαν με χρήση ηλεκτροφόρησης πηκτής, καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ εκχύλισης πηκτής QIAquick (Quiagen, Hilden Γερμανία), και η αλληλουχία απευθείας για την ανίχνευση της μετάλλαξης διαγραφής. Τα προϊόντα PCR από 5 κλώνοι περιείχαν μεταλλάξεις διαγραφής. Για να επιβεβαιωθεί κατά πόσον αυτές οι αποικίες έχουν μεταλλάξεις σε δύο αλληλόμορφα (τα λεγόμενα bi-αλληλικές KO), τα εν λόγω προϊόντα PCR υποκλωνοποιήθηκαν εντός του ρΟΕΜ-Τ Easy (Promega Fitchburg, WI) και ενισχύθηκε σε ένα βακτηριακό ξενιστή? τότε το πλασμιδιακό DNA από μεμονωμένες αποικίες αναλύθηκε κατά την αλληλουχία.

Η επιμόλυνση των κυττάρων Snail1 KO με Snail1 (πείραμα διάσωσης)

κύτταρα Snail1 ΚΟ (2 × 10

5) επιμολύνθηκαν με 2.5 μg ΗΑ-tagged ανθρώπινη Snail1 πλασμίδιο (pCAGGS-Snail1 ΗΑ) χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 ή πολυαιθυλενοϊμίνη max (Polysciences Inc, Warrington, ΡΑ). Ήμασταν σε θέση να επιμολύνει παροδικά κύτταρα Snail1 KO με Snail1, όμως, ήμασταν σε θέση να επιμολύνει σταθερά κύτταρα Snail1 KO με Snail1.

κηλίδωση Western

κηλίδωση Western διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως, με μικρές τροποποιήσεις [6]. Τα κύτταρα βράζονται επί 5 λεπτά σε δωδεκυλοθειικό νάτριο (SDS) ρυθμιστικού δείγματος πηκτής. Ταυτόσημα ποσότητες πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 10%, και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Whatman Protran ΒΑ83, 0.2 μm, GE Healthcare, Wauwatosa WI). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% άπαχο γάλα σε αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris (TBS), και στη συνέχεια επωάστηκαν με ειδικά πρωτογενή αντισώματα (1: 1000) όλη τη νύκτα. Αυτό ακολουθήθηκε από κατεργασία με δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση. Μετά από πλύση με TBS, ζώνες πρωτεΐνης έγιναν ορατές με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (ECL) (PRN 2106, GE Healthcare, Wauwatosa WI).

ανοσοφθορισμού χρώση

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν επί καλυπτρίδων για 48 ώρες και σταθερής με 3% παραφορμαλδεΰδη σε φωσφορικό ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα (PBS) (-) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ο κυτταροσκελετός οπτικοποιήθηκε με χρώση με ροδαμίνη Χ-συζευγμένο Φαλλοϊδίνη σε PBS (-) που περιέχει 0.1% TritonX-100 για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης με λέιζερ (Carl Zeiss LSM700).

απομόνωση RNA και σε πραγματικό χρόνο PCR ανάλυση

Το συνολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας ISOGEN II (Wako, Osaka) και αντιστροφής μεταγράφηκε χρησιμοποιώντας ReverTra Ace αντίστροφης μεταγραφάσης (Toyobo, Οζάκα). Το προκύπτον cDNA υποβλήθηκε σε ποσοτική RT- PCR (qRT-PCR) χρησιμοποιώντας Syber premix Ex Taq (PR820, Takara Bio, Ohtsu). qRT-PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του συστήματος Plus Real-Time PCR Βήμα πρώτο (Applied Biosystems, Fostercity, CA). Τα επίπεδα έκφρασης ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ΔΔCt με

GAPDH

ως βαθμονομητή. Οι εκκινητές που χρησιμοποιούνται στην παρούσα ανάλυση παρατίθενται στον Πίνακα 1.

Η

Συνημμένο δοκιμασία

Η δοκιμασία προσκόλλησης διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως, με μικρές τροποποιήσεις [6]. Τα κύτταρα πλύθηκαν και επωάστηκαν με 0.125% θρυψίνη-0.01% EDTA για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα αποκολλημένα κύτταρα συλλέχθηκαν και εναιωρήθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FCS. Τα κύτταρα (1.5 × 10

4) σπάρθηκαν σε μη επικαλυμμένες πλάκες 96-φρεατίων ή 96 φρεατίων που είχαν προ-επωάστηκαν με DMEM που περιείχε 10% FCS. Ο ίδιος αριθμός κυττάρων σπάρθηκε σε πλάκες 96-φρεατίων που είχαν προ-επικαλυμμένες με πολυ-λυσίνη για ομαλοποίηση. Μετά από 4 ώρες επώασης, τα μη προσκολλημένα κύτταρα απομακρύνθηκαν με έκπλυση και τα προσκολλημένα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 70% αιθανόλη για 20 λεπτά. Μετά από χρώση με διάλυμα 0.1% κρυσταλλικού ιώδους σε PBS για 30 λεπτά, τα κύτταρα ξεπλύθηκαν και στην συνέχεια διαλύθηκε χρησιμοποιώντας 0,5% TritonX-100 σε PBS. Η οπτική πυκνότητα των διαλυμένων κυττάρων μετρήθηκε στα 595 nm. Ο αριθμός των προσκολλημένων κυττάρων υπολογίστηκε με χρήση μίας πρότυπης καμπύλης (αριθμός κυττάρων έναντι τιμές απορρόφησης). Η αναλογία των συνδεδεμένων κυττάρων εκφράστηκε ως ο αριθμός των προσκολλημένων κυττάρων σε μη επικαλυμμένο ή προ-επωάστηκαν φρεάτια διαιρείται με εκείνες επικαλυμμένα φρεάτια πολυ-λυσίνη.

Σκέδαση δοκιμασία

Η δοκιμασία σκέδασης ήταν εκτελέστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως, με μικρές τροποποιήσεις [17]. Τα κύτταρα πλύθηκαν και επωάστηκαν με 0.125% θρυψίνη-0.01% EDTA για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα αποκολλημένα κύτταρα συλλέχθηκαν και εναιωρήθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο 10% FCS. Τα κύτταρα (1.5 × 10

4) σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων. Μετά από 72 ώρες επώασης, σκέδαση κύτταρο εξετάστηκε χρησιμοποιώντας μικροσκοπία αντίθεσης φάσης. σκέδαση κυττάρων ποσοτικοποιήθηκε με μέτρηση του αριθμού των απομονωμένων κυττάρων από αποικίες σε τυχαία επιλεγμένες εικόνες αντίθεσης φάσης. Ο σχετικός αριθμός των σκέδασης εκτιμήθηκε διαιρώντας τον αριθμό των σκέδασης κυττάρων που προέρχονται από Snail1 KO1 ή από κύτταρα Snail1 KO1 + Snail1 από τον αριθμό των σκέδασης κυττάρων που προέρχονται από κύτταρα φυσικού τύπου (WT).

δοκιμασίας διάστασης

Η δοκιμασία διαχωρισμού διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως, με μικρές τροποποιήσεις [18]. Κύτταρα (5 × 10

4) σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων και καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ με ή χωρίς ΤΟΡ-βήτα. Μετά την επίτευξη συρροής, τα κύτταρα πλύθηκαν και επωάστηκαν με 0.125% θρυψίνη ή 0.125% θρυψίνη-0.01% EDTA για 10 λεπτά στους 37 ° C. Πωλείται κύτταρα πλύθηκαν προσεκτικά με PBS (-) και υποβάλλεται σε μηχανική καταπόνηση με σιφώνιο με 1 mL πιπέτα πέντε φορές. θραύσματα κυττάρων σταθεροποιήθηκαν με 3% παραφορμαλδεΰδη για 20 λεπτά και χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες (Sigma Aldrich, St Louis ΜΟ). Μετά από προσεκτική πλύση, ο αριθμός των σωματιδίων ανά πεδίο μετρήθηκε (τουλάχιστον πέντε διαφορετικά πεδία). Ο σχετικός αριθμός των σωματιδίων αντιπροσωπεύεται από τον αριθμό των σωματιδίων κατακερματισμένων κυττάρων που προέρχονται από τον καθορισμένο τύπο κυττάρων διαιρείται με τον αριθμό των σωματιδίων κατακερματισμένων κυττάρων που προέρχονται από κύτταρα καλλιεργημένα WT χωρίς ΤΟΡ-βήτα.

δοκιμασία Μετανάστευση

Η δοκιμασία μετανάστευσης διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως, με μικρές τροποποιήσεις [6]. δοκιμασίες μετανάστευσης διεξήχθησαν σε transwell θαλάμους με μέγεθος 8 μm πόρων (Corning, 3422, Tewksbury ΜΑ). Εν συντομία, 0,1 ml κυττάρων (4 χ 10

5 κύτταρα /ml) σε DMEM συμπληρωμένο με λευκωματίνη 0,1% βόειου ορού (BSA) σπάρθηκαν στα ανώτερα φρεάτια. Στα κατώτερα φρεάτια, 0,6 ml ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 0.1% BSA που περιέχει 2,5% προστέθηκε FCS. Μετά από 4 ώρες επώασης, τα μη-μεταναστευτικά κύτταρα επί της άνω επιφάνειας της μεμβράνης ήταν εντελώς καθαρίζεται μακριά και 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ) (τελική συγκέντρωση 0.5 προστέθηκε mg /ml) στα κατώτερα φρεάτια και επωάστηκαν για 3 h. Τα μεταναστευτικά κύτταρα που συνδέονται με την κάτω επιφάνεια της μεμβράνης που σχηματίζεται μπλε κηλίδες που περιέχουν φορμαζάνης. Αυτές οι κηλίδες φωτογραφήθηκαν και μετρήθηκαν. Ο σχετικός αριθμός των κυττάρων μετανάστευσαν αντιπροσωπεύεται από τον αριθμό των κυττάρων που μετανάστευσαν του καθορισμένου τύπου κυττάρου διαιρείται με τον αριθμό των μετανάστευσαν WT κύτταρα καλλιεργήθηκαν χωρίς ΤΟΡ-β

Στατιστικές αναλύσεις

.

στατιστικές αναλύσεις ανεξάρτητα δείγματα εκτελέστηκαν χρησιμοποιώντας t-test του Student. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± s.e.m. Τα δύο επίπεδα στατιστικής σημαντικότητας σημειώνονται με αστερίσκο (**

P

& lt? 0,05 και *

P

& lt? 0,01).

Αποτελέσματα

Δημιουργία κυττάρων Snail1 ΚΟ χρησιμοποιώντας το σύστημα /Cas9n CRISPR

για τον προσδιορισμό των ρόλων του Snail1 κατά τη διάρκεια της επαγωγής της EMT, χρησιμοποιήσαμε το σύστημα CRISPR /Cas9n να δημιουργήσει σταθερές RMG1 κυτταρικές σειρές που παρουσιάζουν εκτομή του γονιδίου που κωδικοποιεί Snail1. κύτταρα RMG1 συν-επιμολύνθηκαν με pX335-Cas9-g snail1 1, η οποία διεξάγεται στόχου 1 αλληλουχία, pX335-Cas9-g snail1 2, η οποία διεξάγεται αλληλουχία στόχο 2, (Σχ 1Α) και pEGF-Ν1, το οποίο έφερε μία G418-αντίσταση σημάδι. Περίπου 50 αποικίες αναλύθηκαν μετά από επιλογή G418. Τα μισά από τα κύτταρα σε κάθε αποικία λύθηκαν, και στη συνέχεια το προϊόν λύσης χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η έκφραση Snail1 με κηλίδωση Western. Πέντε κλώνοι έδειξαν μια σημαντική μείωση στην σαλιγκάρι έκφρασης. Ως εκ τούτου, γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε από κάθε έναν από αυτούς τους κλώνους. DNA θραύσματα που καλύπτουν τόσο gRNA στόχος περιοχές ενισχύθηκαν και τα προκύπτοντα προϊόντα PCR υποβλήθηκαν σε άμεση αλληλούχιση. Κάθε ένα από αυτά τα προϊόντα PCR είχαν μεταλλάξεις διαγραφής. Για να επιβεβαιωθεί αν τα δύο αλληλόμορφα είχαν μεταλλάξεις διαγραφής, τα προϊόντα PCR κλωνοποιήθηκαν σε ένα φορέα ρΟΕΜ-Τ και ενισχύθηκε σε ένα βακτηριακό ξενιστή. Το πλασμίδιο DNA που απομονώθηκε από πολλαπλές αποικίες που προκύπτουν από κάθε προϊόν PCR υπέστη προσδιορισμό αλληλουχίας. Δύο κλώνοι έδειξαν 24 διαγραφές bp σε δύο αλληλόμορφα (Σχήμα 1Β και 1Γ). Έχουμε ορίσει αυτούς τους κλώνους Snail1 KO1 και Snail1 KO2. Κάθε μία από τις υπόλοιπες τρεις κλώνοι περιείχαν ένα αλληλόμορφο WT. Επειδή Snail1 KO 1 και Snail1 ΚΟ2 είχαν την ίδια διαγραφή, χρησιμοποιήσαμε Snail1 KO 1 κύτταρα στα ακόλουθα πειράματα. Η απουσία έκφρασης Snail1 σε Snail1 κύτταρα ΚΟ 1 επιβεβαιώθηκε με ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (Σχήμα 2Β) και κηλίδωση Western (Σχήμα 2C).

(Α) Αντιπροσωπευτικές εικόνες εμφανίζει την μορφολογία κυττάρων του άγριου τύπου ( WT) RMG κύτταρα (Ι), κύτταρα Snail1 KO1 (II). Τα κύτταρα εμφανίζονται δια μικροσκοπίας αντίθεσης φάσεων. μπαρ κλίμακας δείχνει 50 μm. WT κύτταρα παρουσίασαν πλακόστρωτα-όπως μορφολογίες, ενώ τα περισσότερα από τα κύτταρα Snail1 KO1 εμφανίζουν μια πιο στρογγυλεμένη μορφολογία. Αντιπροσωπευτικά εικόνες των cytoskeletons ακτίνης των κυττάρων WT κύτταρα (III) Snail1 KO1 (IV) βάφονται με ροδαμίνη Χ-συζευγμένη Φαλλοϊδίνη και οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης με λέιζερ (Zeiss LSM700). Ελήφθησαν φωτογραφίες των 5 έως 10 εικόνες ανά δείγμα. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν 5 φορές. WT κύτταρα είναι πλούσια σε ίνες στρες, ενώ τα κύτταρα Snail1 KO1 έχουν σπανίζουν ίνες στρες, αλλά φλοιώδες ακτίνη στις κυτταρικές τους επιφάνειες. μπαρ κλίμακας δείχνει 20 μm. (Β) Ποσοτική RT-PCR των υποδεικνυόμενων γονιδίων σε άγριου τύπου κύτταρα (WT) RMG, κύτταρα Snail1 ΚΟ1 και κύτταρα Snail1 KO1 παροδικά επιμολυσμένα με φορέα έκφρασης Snail1 (κύτταρα Snail1 KO1 + Snail1). Οι τιμές εκφράζονται ως μέσος όρος ± s.e.m τριπλών δειγμάτων. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές. Η στατιστική σημασία, σημειώνονται με αστερίσκο (*

P

& lt? 0,05 και **

P

& lt? 0.01 χρησιμοποιώντας Φοιτητών

t

-τεστ). κύτταρα Snail1 KO1 έδειξε πλήρη απώλεια της έκφρασης σαλιγκάρι και αυξημένη έκφραση του

E-cadherin

,

κλαουδίνης-1

,

occludin

,

β-ακτίνης

και

αλφα-τουμπουλίνης

, καθώς και μειωμένη έκφραση του

ιντεγκρίνης άλφα 5

. Παροδική έκφραση σε κύτταρα Snail1 Snail1 ΚΟ αντιστραφεί αυτά τα αποτελέσματα, εκτός από την αύξηση του

occludin

έκφρασης. (C) Ανάλυση Western blot των υποδεικνύεται πρωτεϊνών σε άγριου τύπου κύτταρα (WT) RMG, κύτταρα Snail1 ΚΟ1 και κύτταρα Snail1 KO1 παροδικά επιμολυσμένα με φορέα έκφρασης Snail1 (κύτταρα Snail1 KO1 + Snail1). κύτταρα Snail1 KO1 έδειξε πλήρη απώλεια της έκφρασης Snail1 και την αύξηση της Ε-καδερίνης, occludin και κλαουδίνης-1, βήτα-ακτίνη, αλφα- τουμπουλίνης, καθώς και μειωμένη σε ιντεγκρίνης άλφα 5 έκφρασης. Παροδική έκφραση σε κύτταρα Snail1 Snail1 ΚΟ αντιστραφεί αυτά τα αποτελέσματα, εκτός από την μείωση σε ιντεγκρίνης άλφα 5 έκφρασης. Βινκουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

Η

Κατάλυση του γονιδίου Snail1 αλλάζει τη μορφολογία και την έκφραση γονιδίων σε κύτταρα RMG1

κύτταρα RMG1 φυσικού τύπου παρουσίασαν πλακόστρωτα-όπως μορφολογίες (Εικόνα 2Α-2Θ, S1 Σχήμα-Ι), ενώ τα περισσότερα κύτταρα Snail1 KO παρουσίασαν πιο στρογγυλεμένη μορφολογία (Σχήμα 2Α-ΙΙ, S1 Σχήμα-ΙΙ). Επειδή κυτταροσκελετική οργάνωση είναι γνωστό ότι συνδέονται άμεσα με μορφολογία των κυττάρων, εξετάσαμε την εντόπιση του κυτταροσκελετού ακτίνης χρησιμοποιώντας ροδαμίνη Χ-συζευγμένο φαλλοειδίνη. WT κύτταρα έδειξαν ακτίνης ίνες στρες σε κυτταροπλάσματα τους (Σχήμα 2Α-ΙΙΙ, S1 Σχήμα-ΙΙΙ). Σε αντίθεση, η φλοιώδη ακτίνης των κυττάρων Snail1 KO έδειξε ένα παχύ, στρογγυλεμένο σχήμα (Σχήμα 2Α-IV, S1 Σχήμα-IV). Snail1 καταστέλλει την έκφραση των επιθηλιακών δεικτών όπως Ε-καδερίνης, κλαουδίνης-1 και occludin [19]. Ανάλυση χρησιμοποιώντας qRT-PCR αποκάλυψε ότι τα κύτταρα Snail1 KO1 παρουσίασαν αυξημένη έκφραση του

E-cadherin

,

κλαουδίνης-1

,

και occludin

. Για την εκτέλεση ενός πειράματος διάσωσης, ένας φορέας έκφρασης Snail1 εισήχθη στα κύτταρα Snail1 KO1. Επειδή δεν μπορούσε να πάρει μια επιμόλυνσης που παρουσίασαν σταθερή έκφραση της Snail1, χρησιμοποιήσαμε παροδικές επιμολύνσεις των Snail1 (Sanil1 KO1 + Snail1) ως την πηγή των διασωθέντων κυττάρων σαλιγκάρι KO1. Snail1 KO 1 + κυττάρων Snail1 έδειξε μειωμένη έκφραση του

E-cadherin και κλαουδίνης-1

(Σχήμα 2Β) Δυτική πειράματα κηλίδωσης υποστήριξε επίσης αυτά τα ευρήματα. Η έκφραση της Ε-καδερίνης, κλαουδίνης-1 και occludin ενισχύθηκε με την απουσία της έκφρασης Snail1. Παροδικά διαμολυσμένα Snail1 σε κύτταρα Snail1 KO1 υποστηρίζεται μειωμένη έκφραση Ε-καδερίνης και κλαουδίνης-1 και occludin (Σχήμα 2C). Αντιστρόφως, η έκφραση της ιντεγκρίνης άλφα 5 μειώθηκε σε κύτταρα Snail1 ΚΟ (Σχήμα 2Β και 2C). Είναι αξιοσημείωτο ότι η έκφραση της β-ακτίνης επηρεάστηκε από την παρουσία ή την απουσία της πρωτεΐνης Snail1 (Σχ 2Β και 2C).

Κατάλυση του γονιδίου σαλιγκάρι προκαλεί μεταβολή στη προσκόλληση κυττάρου-υποστρώματος, σκέδαση κύτταρο, κύτταρο διαστάσεως, και η κυτταρική μετανάστευση

Λόγω μειωμένη έκφραση της ιντεγρίνης άλφα 5 παρατηρήθηκε σε κύτταρα Snail1 ΚΟ1, υποθέσαμε ότι προσκόλλησης κυττάρου-υποστρώματος μπορεί να παρεμποδιστεί σε αυτά τα κύτταρα. Πράγματι, τα κύτταρα Snail1 KO1 έδειξαν σημαντικά μειωμένη προσκόλληση κυττάρου-υπόστρωμα σε σύγκριση με κύτταρα WT (σχήμα 3Α και 3Β μαύρη στήλη). Έτσι, η διαγραφή της Snail1 σε κύτταρα RMG1 μειωμένη προσκόλληση κυττάρου-υποστρώματος. Υπάρχει και μια άλλη δυνατότητα? ότι η μείωση της κυτταρικής συγκόλλησης-υποστρώματος σε κύτταρα KO1 snail1 θα μπορούσε να προκύψει από μείωση της εναπόθεσης ECM. Ως εκ τούτου, προεπωάστηκαν τα φρεάτια με μέσο που περιέχει ορό για να επιτρέψει vitonectin /ινονεκτίνη να προσροφηθεί στα φρεάτια, και επανεξετάζονται προσκόλληση κυττάρου-υποστρώματος. Αυτή η θεραπεία σχεδόν διασωθεί η μείωση της κυτταρικής συγκόλλησης-υπόστρωμα που παρατηρείται με τα κύτταρα Snail1 KO1. Περίπου 30,6% των κυττάρων WT και 28,9% των κυττάρων Snail1 KO1 έγινε συνδεμένο με φρεάτια προεπωάστηκε με μέσο που περιέχει ορό (Σχήμα 3Β γκρι στήλη). Ως εκ τούτου, ερευνήσαμε την έκφραση της υαλονηκτίνης και ινονεκτίνη. Αντίθετα με τις προσδοκίες, τα κύτταρα Snail1 KO1 δεν έδειξαν μειωμένη έκφραση αυτών των πρωτεϊνών (Σχήμα 2Β και 2C).

(Α) Αντιπροσωπευτικές εικόνες της πρόσφυσης υποστρώματος με άγριου τύπου (WT) κύτταρα RMG1 (Ι), Snail1 KO1 κύτταρα (II) και τα κύτταρα Snail1 KO παροδικά επιμολυσμένα με φορέα έκφρασης Snail1 (κύτταρα Snail1 KO1 + Snail1) (III) 4 ώρες μετά την σπορά σε μη επικαλυμμένα φρεάτια. (Β) Προσδιορισμός των αναλογιών των προσκολλημένων κυττάρων αντιπροσωπεύεται από τον αριθμό των προσάρτησης κυττάρων σε μη επικαλυμμένα φρεάτια (μαύρη στήλη) ή σε φρεάτια προεπικαλυμμένα με DMEM που περιέχει FCS (γκρι στήλη) διαιρείται με τον αριθμό που συνδέονται με φρεάτια προεπικαλυμμένα με πολυ-λυσίνη . Οι τιμές εκφράζονται ως μέσος όρος ± s.e.m τριπλών δειγμάτων. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές. (Γ) Αντιπροσωπευτικές εικόνες σκέδασης κυττάρων από WT (Ι), Snail1 KO1 (II) και Snail1 KO1 + Snail1 (III) κύτταρα 72 ώρες μετά την σπορά. (D) Προσδιορισμός του σχετικού αριθμού των κυττάρων σκέδασης που αντιπροσωπεύεται από τον αριθμό των απομονωμένων κυττάρων από τις αποικίες του κάθε τύπου κυττάρων διαιρείται με τον αριθμό των απομονωμένων κυττάρων από τις αποικίες των κυττάρων WT. Οι τιμές εκφράζονται ως μέσος όρος ± s.e.m των πέντε εικόνες ανά δείγμα. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τέσσερις φορές. (Ε) Αντιπροσωπευτικές εικόνες του διαχωρισμού κυττάρων μεταξύ WT κύτταρα (Ι), τα κύτταρα Snail1 KO1 (II) και Snail1 KO1 + Snail1 (III) κύτταρα. (F) Προσδιορισμός του σχετικού αριθμού των κατακερματισμένων σωματιδίων, παρουσιάζονται ως ο αριθμός των κατακερματισμένων σωματιδίων κάθε τύπου κυττάρων διαιρείται με τον αριθμό των κατακερματισμένων σωματιδίων WT κύτταρα. Οι τιμές εκφράζονται ως μέσος όρος ± s.e.m 5-10 εικόνων ανά δείγμα. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν δύο φορές. (G) Αντιπροσωπευτικές εικόνες των κυττάρων WT (Ι), κύτταρα Snail1 KO1 (II) και Snail1 ΚΟ + Snail1 (III) κυττάρων που μετανάστευσαν προς τα κάτω επιφάνειες του επικοινωνούντα μεμβρανών. (H) Προσδιορισμός του σχετικού αριθμού των κυττάρων μετανάστευσαν, παρουσιάζονται ως ο αριθμός των κυττάρων που μετανάστευσαν από κάθε τύπο κυττάρων διαιρείται με τον αριθμό των μετανάστευσαν WT κύτταρα. Οι τιμές εκφράζονται ως μέσος όρος ± s.e.m. πέντε εικόνες ανά δείγμα. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές. Η στατιστική σημαντικότητα υποδεικνύεται με αστερίσκο (*

P

& lt? 0,05 και **

P

& lt? 0.01 χρησιμοποιώντας Φοιτητών

t

-τεστ).

Snail1 έχει αναφερθεί ότι παίζει ένα ρόλο στην κυψελίδα σκέδασης [20], έτσι εξετάσαμε την δραστικότητα σκέδασης των κυττάρων Snail1 KO1. Πράγματι, 72 ώρες μετά την σπορά, τα κύτταρα WT εμφανίζονται πολυάριθμες αποικίες σκέδασης (Σχήμα 3C-Ι και 3D). Σε αντίθεση, τα κύτταρα Snail1 KO1 παρουσίασαν σημαντικά χαμηλότερο αριθμό σκέδασης αποικίες (Σχ 3C-ΙΙ και 3D). κύτταρα Snail1 KO1 επιμολυσμένα με Snail1 ανακτηθεί η δραστηριότητα σκέδασης (Σχήμα 3C-III και 3D). Έτσι, η διαγραφή της Snail1 στα κύτταρα RMG1 μειωμένη δραστικότητα σκέδασης κυττάρων.

Snail1 ρυθμίζει την κυτταρική προσκόλληση [5], οπότε υποθέσαμε ότι προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου μπορεί να ενισχυθεί στα κύτταρα Snail1 KO1. Για να ελεγχθεί αυτή η πιθανότητα, εκτελέσαμε μία δοκιμασία διαχωρισμού για να εξετάσει την ακεραιότητα των επιθηλιακών κυττάρων φύλλο Snail1 KO1. Η θεραπεία με θρυψίνη-ΕϋΤΑ επέτρεψε στους WT κύτταρα να αποσπώνται από τα πιάτα ως μικρά σωματίδια των κυττάρων. Αυτά τα σωματίδια διασπώνται πλήρως μετά την πιπέτα (Σχήμα 3Ε-Ι και 3F). Σε αντίθεση, τα κύτταρα Snail1 KO1 αποκολλήθηκε σε μεγάλα φύλλα τα οποία ήταν ανθεκτικά σε σιφωνισμού που βασίζεται μηχανική διάσπαση (Σχήμα 3Ε-ΙΙ και 3F) Επιμόλυνση των κυττάρων Snail1 KO1 με Snail1 οδήγησε σε μερική ανάκτηση της δραστηριότητας διαστάσεως (Σχήμα 3Ε-ΙΙΙ και 3F ). Έτσι, η διαγραφή της Snail1 σε κύτταρα RMG1 αυξημένη προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου.

Snail1 ενισχύει την κυτταρική μετανάστευση [6], έτσι χρησιμοποιήσαμε έναν προσδιορισμό transwell να αξιολογηθεί η μετανάστευση των κυττάρων Snail1 KO1. Σε σύγκριση με WT κύτταρα, η μετανάστευση των κυττάρων Snail1 KO1 προς FCS σημαντικά κατασταλεί. Επιμόλυνση των κυττάρων Snail1 KO1 με Snail1 οδήγησαν σε μερική ανάκαμψη της δραστηριότητας της μετανάστευσης (Σχήμα 3G και 3Η). Έτσι, η διαγραφή της Snail1 σε κύτταρα RMG1 μειωμένη δραστικότητα μετανάστευσης των κυττάρων.

Απώλεια Snail1 δεν εμποδίζουν TGF-beta-επαγόμενη μεταβολή της έκφρασης του γονιδίου μορφολογία και

ΤΟΡ-β επάγει την έκφραση του Snail1 [3] και σαλιγκάρι ελέγχει TGF-β ανταπόκρισης [21]. Ως εκ τούτου, θεωρείται ότι η ΤΟΡ-β επαγόμενη EMT μπορεί να εμποδιστεί με την απουσία της έκφρασης Snail1. Στην πραγματικότητα, όπως φαίνεται στο ΤΟΡ-β κατεργασμένων κυττάρων WT (σχήμα 4Α-I, II), η θεραπεία των κυττάρων Snail1 KO1 με ΤΟΡ-β επαγόμενη μορφολογικές αλλαγές (Εικ 4Α-III, IV). θεραπεία ΤΟΡ-β είχε επίσης ως αποτέλεσμα μειωμένη έκφραση Ε-καδερίνης σε κύτταρα Snail1 KO1 (Εικόνα 4Β και 4C). Έκφραση των άλλων παραγόντων μεταγραφής EMT σχετίζονται, όπως

ZEB1 και TWIST

, αυξημένη σε κύτταρα Snail1 ΚΟ1, σε σύγκριση με τα κύτταρα WT και ενισχύθηκε περαιτέρω με ΤΟΡ-β επεξεργασία (Εικόνα 4Β). Αυτοί οι παράγοντες θα μπορούσαν να συμβάλλουν στις παρατηρούμενες μορφολογικές αλλαγές και μεταβολές της γονιδιακής έκφρασης.

bar Κλίμακα δείχνει 100 μm. Φωτογραφίες τραβήχτηκαν από 5-10 εικόνες ανά δείγμα. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές. (Β) την αξιολόγηση Ποσοτική RT-PCR των κυττάρων φαίνεται στο (Α) για τα υποδεικνυόμενα γονίδια. Οι τιμές εκφράζονται ως μέσος όρος ± s.e.m. τριπλών δειγμάτων. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν δύο φορές. Η στατιστική σημασία, σημειώνονται με αστερίσκο (*

P

& lt? 0,05 και **

P

& lt? 0.01 χρησιμοποιώντας Φοιτητών

t

-τεστ). (Γ) ανάλυση κηλίδας Western των κυττάρων φαίνεται στο (Α) για τα υποδεικνυόμενα πρωτεΐνες. Βινκουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.