Αφηρημένο

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι μια θανατηφόρα ασθένεια που επηρεάζει εκατομμύρια ανθρώπους σε όλο τον κόσμο. Τρέχουσες προκλήσεις θεραπείας περιλαμβάνουν τη διαχείριση της επιβάρυνσης λόγω ασθενειών, καθώς και βελτιώσεις στην ανίχνευση και τη στόχευση των καρκινικών κυττάρων. Για τον εντοπισμό της νόσου state-ειδικό υπογραφές επιφανειακό αντιγόνο, συνδυάσαμε φθορισμού κυττάρου barcoding με υψηλής απόδοσης κυτταρομετρίας ροής των χαρακτηριστικών των πρωτογενών και μεταστατικών σειρές καρκίνου του κόλου (SW480, SW620, HCT116 και). πολυπλεξίας τεχνική μας προσφέρει βελτιώσεις σε σχέση με τις συμβατικές μεθόδους, επιτρέποντας την ταυτόχρονη και ταχεία εξέταση των καρκινικών κυττάρων με μειωμένη προσπάθεια και το κόστος. Η μέθοδος χρησιμοποιεί μια ανάλυση πρωτεϊνών-επίπεδο με εμπορικά διαθέσιμα αντισώματα σε ζωντανά κύτταρα με ανέπαφη επιτόπους για την ανίχνευση πιθανών ογκοειδικό στόχους που μπορούν να διερευνηθούν περαιτέρω για κλινική χρησιμότητα τους. συστοιχίες Πολυπλεκτικά αντίσωμα μπορεί εύκολα να εφαρμοστεί σε άλλους τύπους όγκων ή παθολογικές καταστάσεις για την ανακάλυψη βασίζεται σε προσεγγίσεις με στόχο την αναγνώριση

Παράθεση:. Sukhdeo K, Paramban RI, Vidal JG, Ελιά J, Martin J, Rivera Μ, κ.ά. . (2013) Multiplex κυτταρομετρίας ροής Σήμανση και αντισωμάτων Πίνακες Προσδιορίστε το αντιγόνο επιφανείας προφίλ της Πρωτοβάθμιας και μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου Γραμμές κυττάρων. PLoS ONE 8 (1): e53015. doi: 10.1371 /journal.pone.0053015

Επιμέλεια: Ilya Ulasov, University of Chicago, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 19 Ιουν του 2012? Αποδεκτές: 22 Νοέμ 2012? Δημοσιεύθηκε: 7 Ιανουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Sukhdeo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Ίδρυμα όγκου Παιδιατρικής του εγκεφάλου των Ηνωμένων Πολιτειών, Κοινωνία Brain Tumor, Goldhirsh Ιδρύματος, και James D. Ίδρυμα McDonnell. Το έργο αυτό χρηματοδοτείται επίσης από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας χορηγεί CA112958 (Jnr), CA116659 (Jnr), CA154130 (Jnr), Διαδρομή προς Ανεξαρτησία Βραβείο CA157948 (JDL), Case Western Reserve Ιατρικής Επιστήμονας Πρόγραμμα Κατάρτισης Τ32 GM007250 (KS), και το Εθνικό Υπηρεσία Βραβείο Έρευνας, του National Cancer Institute F30 CA165857 (KS). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και έχουν τα ακόλουθα συγκρούσεις: RIP, JGV, JE, JM, CTC, και RB πληρώνονται οι εργαζόμενοι της BD Biosciences. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου κατατάσσεται μεταξύ των πιο κοινούς καρκίνους τόσο από πλευράς εμφάνισης καρκίνου και καρκινογόνες θανάτων που σχετίζονται με τις δυτικές χώρες [1]. Πρώιμου σταδίου καρκίνου του παχέος εντέρου μπορεί να αντιμετωπιστεί επιτυχώς με χειρουργική εκτομή? Ωστόσο, μεταστατική ασθένεια είναι συχνά ανθεκτική στη θεραπεία και είναι υπεύθυνη για την πλειονότητα της νοσηρότητας και θνησιμότητας. Κλινικών αποφάσεων καθοδηγείται από στάσης της αμερικανικής μεικτής επιτροπής για τον Καρκίνο ΤΝΜ (όγκος-node-μετάσταση) που είναι ατελής για πρόγνωση και δεν προβλέπει την ανταπόκριση στη θεραπεία. Μια κρίσιμη ανάγκη υπάρχει για να προσδιορίσει στόχος δείκτες κακοήθειας που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την έγκαιρη ανίχνευση, πρόγνωση, παρέμβαση, και /ή στόχευση των καρκινικών κυττάρων. Ως παράδειγμα, έχουν αντιγόνα που σχετίζονται με όγκο (ΤΑΑ) έχουν χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση των κυκλοφορούντων κυττάρων όγκου (CTCs) στην κυκλοφορία του αίματος, καθώς και διαδίδονται καρκινικά κύτταρα (DTC) στον μυελό των οστών με τη δυνατότητα να παρακολουθεί το φορτίο του όγκου, την πρόβλεψη του κινδύνου της εξέλιξης, και τη μέτρηση απόκρισης χημειοθεραπεία. Αυτές οι τεχνολογίες περιλαμβάνουν κλινικά εγκεκριμένα προϊόντα όπως CellSearch ™ (Veridex) που χρησιμοποιούν ανοσοανίχνευση CTCs βάσει των Επιθηλιακών μόριο κυτταρικής προσκόλλησης (EpCAM) μεμβρανώδη έκφραση [2]. ΤΑΑ κυτταρικής επιφάνειας ειδικότερα είναι επίσης πολύτιμα επειδή είναι προσιτά σε συστημικά υπολειπόμενων μόρια στόχευσης (π.χ. αντισώματα, απταμερή, κτλ) που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για να παραδώσουν βιοδραστικά ωφέλιμα φορτία, σηματοδότηση μπλοκ, ή να ενεργοποιήσουν την εξαρτώμενη από αντίσωμα διαμεσολαβούμενη από κύτταρα κυτταροτοξικότητα.

οι προσπάθειες για τον εντοπισμό ΤΑΑ στον καρκίνο του παχέος εντέρου και άλλων μορφών καρκίνου έχουν στηριχθεί σε ένα πλήθος τεχνικών, το καθένα με το δικό του σύνολο των πλεονεκτημάτων και των περιορισμών [3], [4]. Η γονιδιακή έκφραση microarray προφίλ ή βιβλιοθήκες έκφρασης cDNA που προέρχεται από όγκο με ορούς ασθενών (π.χ. Ορολογική Ταυτοποίηση ανασυνδυαστικά εκφρασμένων κλώνοι, SEREX) είναι με βάση την έκφραση του RNA επιπέδου. Αυτές οι προσεγγίσεις μπορεί να είναι προβληματική, γιατί μετα-μεταγραφικής (π.χ. miRNAs) και μετα-μεταφραστικών μηχανισμών ρύθμισης ασκήσει σημαντική επιρροή πάνω στην πραγματική ποσότητα της πρωτεΐνης που κατέχονται από κάθε κύτταρο μαζί με την λειτουργία της σηματοδότησης εντός του κυττάρου [5], [6]. Δηλαδή, κύτταρα με μεταγραφές χαμηλού επιπέδου μπορούν να περιέχουν δυσανάλογα υψηλά επίπεδα μεταφράζεται σε πρωτεΐνες (π.χ. μακράς διάρκειας ζωής) και το αντίστροφο. Μάζα συστοιχίες φασματοσκοπία και πρωτεΐνη μικροσυστοιχίες χρησιμοποιούν ολικού κυττάρου ή κλασματοποιημένα προϊόντα λύσης από κύτταρα καρκίνου κόλου να ανιχνεύσει διαφορικά εκφραζόμενο ΤΑΑ. Αυτές οι μέθοδοι βασίζονται σε πρωτεΐνες για την ανίχνευση ΤΑΑ μπορεί να επηρεαστεί από την εγγενή διάσπαση της φυσικής πρωτεΐνης διαμόρφωση κατά τη διάρκεια της παρασκευής του δείγματος, κυρίαρχη αναπαράσταση των ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών, και η περιορισμένη μοριακή πόρους (δηλ εμπορικώς διαθέσιμα αντισώματα) για να αξιολογηθεί ταχέως το δυναμικό των υποψηφίων βιοδεικτών.

Για την αναγνώριση ΤΑΑ, πραγματοποιήσαμε μια υψηλής απόδοσης διαλογή ανοσοφαινοτυπικές του πρωτογενούς και του μεταστατικού καρκίνου του παχέος εντέρου χρησιμοποιώντας μία συστοιχία αντισωμάτων που περιέχουν σχεδόν πλήρη κάλυψη της συστάδας διαφοροποιήσεως (CD) οικογένεια επιφάνεια μόριο, καθώς και πολλές άλλες κοινές αντιγόνα επιφανείας . Εμείς πολυπλέκονται επίσης την οθόνη συστοιχία αντισωμάτων με τη χρήση του φθορισμού των κυττάρων barcoding. στρατηγικής προσδιορίζονται ολοκληρωμένο προφίλ πρωτεϊνών επιφάνειας μας, συμπεριλαμβανομένων των ΤΑΑ μοιρασμένες σε όλη δείγματα όγκων, καθώς και εκείνες που είχαν τη νόσο state-ειδικά. Το ΤΑΑ παν-όγκου, ιντεγκρίνης α6 (CD49f), ελέγχθηκε για να έχουν ένα προφίλ έκφρασης παρόμοιο με EpCAM, αποδεικνύοντας τις δυνατότητες αυτής της τεχνολογίας για να εντοπίσει βιοδείκτες υποψηφίου όγκου που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για να βελτιώσετε περαιτέρω την ανίχνευση των κακοηθών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των ΚΜΑ /οι κωδικοί DTC.

Αποτελέσματα

Multiplex barcoding σε συνδυασμό με τη διαλογή

Δύο πρωτογενή αδενοκαρκίνωμα (SW480, HCT116) και μία μεταστατική επιλέχθηκαν (SW620) κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου για συστοιχία αντισωμάτων μελέτη μας. Και οι τρεις γραμμές έχουν ένα επιθηλιακής προέλευσης και τη βιολογία του όγκου τους έχει μελετηθεί καλά στη βιβλιογραφία. SW480 προήλθε από ένα πρωτεύον αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου από έναν ασθενή που στη συνέχεια υποτροπίασαν με μεγάλη εξάπλωση μεσεντερικοί λεμφαδένες μεταστάσεις που χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό της SW620 κυτταρική γραμμή [7]. Η χρήση ενός συνόλου κυτταρικών γραμμών ασθενούς αντιστοίχιση μειώνει γενετική μεταβλητότητα και επιτρέπει μια πιο ελεγχόμενη σύγκριση των μοριακών αλλαγών μετά τη μεταστατική εξέλιξη [8], [9].

Πολυπλεξία και των τριών δειγμάτων για ταυτόχρονη επισήμανση και η ανάλυση επιτεύχθηκε μέσω φθορισμού των κυττάρων barcoding. Στην τεχνική αυτή, τα κύτταρα επισημαίνονται με διακριτικό ενδοκυτταρική βαφή και μετά συνενώθηκαν μαζί πριν από την επισήμανση του αντισώματος. Η ταυτότητα της κάθε κυτταρικής σειράς αναγνωρίζεται στον κυτταρομετρητή ροής βάσει του φθορισμού είτε από το ιώδες (Horizon Διάδοσης Dye? VPD450) ή μπλε (καρβοξυφλουορεσκίνη ηλεκτριμιδύλ εστέρα? CFSE) τα λέιζερ διέγερσης, ενώ το κόκκινο λέιζερ που προορίζεται για την ανίχνευση της Alexa647 στη δευτερογενή αντισώματα. Η κυτταρική γραμμή SW480 ήταν γραμμικό κώδικα με επισήμανση με VPD450 ενώ SW620 κύτταρα μη επισημασμένου πριν από τη συγκέντρωση των δύο κυτταρικές σειρές σε ένα ενιαίο αναμεμιγμένη πληθυσμού (Σχήμα 1, βλέπε Υλικά και Μέθοδοι). Η τρίτη κυτταρική γραμμή, HCT116, έγινε γραμμικό κώδικα χρησιμοποιώντας CFSE και επίσης αναμιγνύονται για να δημιουργηθεί ένα ενιαίο σύνολο που αποτελείται από τις τρεις διαφορετικές κυτταρικές σειρές. Στη συνέχεια εφαρμόζεται ο συνδυασμός των κυττάρων επάνω σε μία συστοιχία αντισωμάτων που αποτελείται από 242 αντισωμάτων και 9 έλεγχοι ισοτύπου κατανεμήθηκαν σε τρεις πλάκες των 96 φρεατίων (Σχήμα 1). Τα αντισώματα που περιλαμβάνονται στην συστοιχία παρέχει κάλυψη σχεδόν κάθε συστάδας διαφοροποιήσεως (CD) μόριο και πολλά άλλα κοινά αντιγόνα επιφανείας. Ως εκ τούτου, ήμασταν σε θέση να εξετάσουν ένα ευρύ φάσμα επιφανειακών πρωτεϊνών και παράγουν υπογραφές για κάθε κόλον κυτταρική σειρά καρκίνου.

Οι τρεις κυτταρικές γραμμές σημάνθηκαν με ή χωρίς ενδοκυτταρική βαφή πριν από την ανάμιξη των κυττάρων σε ένα ενιαίο πισίνα . Τα κύτταρα μετά μεταφέρονται σε κάθε φρεάτιο για την επισήμανση αντισωμάτων. Το περιεχόμενο κάθε φρεάτιο στη συνέχεια σε επεξεργασία σε έναν κυτταρομετρητή ροής. Η ταυτότητα του κάθε κυτταρική γραμμή προσδιορίστηκε με βάση την ένταση φθορισμού. Τα κατάλληλα πύλες καταρτίστηκαν επιτρέποντας την ταυτόχρονη ανάλυση για κάθε αντίσωμα. Τα ιστογράμματα για τον έλεγχο IgM ισοτύπου ποντικού δείχνεται.

Η

Η πλειονότητα των αντισωμάτων (158/242) ήταν είτε πλήρως αδρανής ή δεσμευμένο λιγότερο από 5% των κυττάρων σε σύγκριση με το αντίστοιχο ισότυπο αναφοράς και στις τρεις κυτταρικές γραμμές και, επομένως, δεν ερευνήθηκε περαιτέρω για τους σκοπούς αυτής της μελέτης (πλήρης αποτελέσματα παρουσιάζονται στο Σχήμα S1 και πίνακες S1, S2, S3 και). Βρήκαμε 25 αντισώματα που αντέδρασαν με την πλειονότητα (& gt? 50%) των κυττάρων σε SW480, SW620, HCT116 και κυτταρικές σειρές (Πίνακας 1 και Σχήμα S2). Πολλά από αυτά τα αντισώματα που επιτεύχθηκε σχεδόν πλήρης (& gt? 95%) τη σήμανση των κυττάρων του όγκου. Όπως ήταν αναμενόμενο, οι πρωτεΐνες που σχετίζονται με μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας τάξης Ι (β2-μικροσφαιρίνη, HLA-A /A2 /B /C και MIC-Α /Β) τα οποία συνήθως εκφράζεται σε εμπύρηνα ανθρώπινα κύτταρα ταυτοποιήθηκαν. Άλλα ΤΑΑ κατηγοριοποιήθηκαν σύμφωνα με γνωστές λειτουργία, η οποία προσδιόρισε πολλαπλές πρωτεΐνες που εμπλέκονται σε εξωκυτταρική αλληλεπίδραση μήτρας και κυτταρική προσκόλληση, όπως αρκετές ιντεγκρίνης μέλη της οικογένειας, σε συμφωνία με τα επιθηλιακά βιολογία τους. Επειδή α και β ιντεγκρίνες σχηματίζουν πολυμερικά συμπλέγματα διαμεμβρανική μεταξύ τους, είναι πιθανό ότι η συν-έκφραση της ιντεγκρίνης α2 (CD49b) και ιντεγκρίνης α6 (CD49f) μαζί με ιντεγκρίνη β4 (CD104) μπορεί να υποδεικνύει λειτουργική αλληλεπίδραση αυτών των μελών της οικογένειας ή κοινόχρηστο κανονισμού του καρκίνου του παχέος εντέρου. Ταυτοποιήσαμε επίσης αρκετές πρωτεΐνες με γνωστή λειτουργία στον κυτταρικό μεταβολισμό και τη σηματοδότηση καθώς και άλλοι μεσολαβεί αλληλεπίδραση με τις προσαρμοστικές και έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος. Αυτά τα κοινά αναγνωριστικά θα μπορούσαν να ενημερώσει σχετικά με τη βιολογία του όγκου ή αντιπροσωπεύουν druggable μονοπάτια να στοχεύουν τα καρκινικά κύτταρα. Επιπλέον, λόγω της ευρείας έκφραση τους στην επιφάνεια των κακοήθων κυττάρων, τα αντιγόνα παν-όγκου που προσδιορίζονται στην οθόνη αυτή μπορεί να είναι χρήσιμοι δείκτες για να διευκολύνει τον εντοπισμό των CTCs /κωδικοί DTC.

Η

ανάλυση Βιοπληροφορική

για να δοθεί προτεραιότητα λίστα των ΤΑΑ ως υποψήφιος βιοδείκτες, πραγματοποιήσαμε cross-συγκρίσεις με την Oncomine συλλογή του γονιδίου σύνολα δεδομένων μικροσυστοιχιών έκφραση από τον καρκίνο του παχέος εντέρου, καθώς και αντίστοιχο φυσιολογικό ιστό [10]. Ως εκ τούτου, ήμασταν σε θέση να εκτιμήσει την έκφραση των πρωτεϊνών που προσδιορίζονται στην οθόνη μας, σε σύγκριση με τα προφίλ RNA σε πολλούς ερευνητές, πληθυσμούς ασθενών, και πειραματική πλατφόρμες. Εμείς επικεντρώθηκε εξέτασή μας της έκφρασης ΤΑΑ σε φυσιολογικό κολονικό ιστό, φυσιολογικό ήπαρ, καθώς και αδένωμα του παχέος εντέρου και του αδενοκαρκινώματος [11] – [14]. Στη συνέχεια επιλέγονται εκείνα τα γονίδια τα οποία ήταν τουλάχιστον δύο φορές απορυθμίζεται (ρ & lt? 0,05) πάνω από το φυσιολογικό ιστό. Αυτό το εκλεπτυσμένο συμπληρωματικό κατάλογο ΤΑΑ μας στις υπερεκφράζεται γονίδια CD44, ιντεγκρίνης α6 (CD49f), και ιντεγκρίνης β2 (CD49b) ως τα πιο ελπιδοφόρα υποψήφιοι (Σχήμα 2). Αξίζει να σημειωθεί ότι η έκφραση αυτών των γονιδίων ήταν σημαντικά υψηλότερη σε καρκίνο σε σχέση με το φυσιολογικό ήπαρ, υποδηλώνοντας μια πιθανή θεραπευτικό παράθυρο για στοχευμένες θεραπείες για τα ανταλλακτικά φυσιολογικό ιστό.

Oncomine ανάλυση heatmap σε 4 δημοσιεύθηκε σύνολα δεδομένων για την έκφραση των αντιγόνων όγκου που περιγράφεται στο Πίνακας 1. Μόνο τα γονίδια που ρυθμίζεται προς τα πάνω με συνέπεια σε όλη σύνολα δεδομένων με p & lt? 0.05 φαίνονται. Οι αριθμοί στις παρενθέσεις δείχνουν τον αριθμό των δειγμάτων που αναλύθηκαν. Συντομογραφίες: φυσιολογικό κόλον, NC? αύξουσα παχέος εντέρου, AC? φθίνουσα παχέος εντέρου, DC? σιγμοειδές κόλον, SC? εγκάρσιο κόλον, TC (n = 1).

Η

καρκινικός δείκτης επικύρωση

Για την επικύρωση των αποτελεσμάτων από την οθόνη του αντισώματος μας για την ανίχνευση καρκινικών κυττάρων σε δείγματα ασθενών πραγματοποιήσαμε ανοσοϊστοχημεία (IHC) και ανοσοφθορισμού (IFC) χρώση σε αρχειοθετημένα δείγματα ανθρώπινου από φυσιολογικό βλεννογόνο του κόλου και του πρωτογενούς καρκίνου του παχέος εντέρου, καθώς και μεταστάσεις από το ήπαρ και τους λεμφαδένες (η = 6 για το καθένα). Έχουμε επιλέξει α6 ιντεγκρίνης (CD49f) βάσει των ισχυρή αντιδραστικότητα του (& gt? 99%) με όλες τις κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου τριών σε οθόνη μας, που είναι γνωστή έκφραση στο έντερο, και προς τα πάνω ρύθμιση σε ογκογένεση [15]. Πράγματι, από την IHC, θα μπορούσε να ανιχνεύσει ιντεγκρίνης χρώση α6 σε καρκίνο του παχέος εντέρου, καθώς και σε παρακείμενες μη εμπλεκόμενο φυσιολογικού βλεννογόνου. Επιπλέον, όλοι οι ήπατος και των λεμφαδένων μεταστάσεων έδειξε ιντεγκρίνης χρώση α6, ενώ η γύρω στρώμα ήταν αρνητική. Η διαφορά στην ένταση χρώσης μεταξύ πρωτογενούς όγκου και των κανονικών ήταν λεπτή, αλλά περισσότερο έντονη στην μεταστατική δείγματα (Σχήμα 3). Αυτές οι τάσεις παρατηρήθηκαν επίσης με IFC (Σχήμα S3) χρησιμοποιώντας ένα διακριτό αντισώματος ιντεγκρίνης α6 στο οποίο συν-επισήμανση κυττάρων με επιθηλιακά EpCAM δείκτη ως αναφορά [16] έδειξε ότι ιντεγκρίνης α6 εντοπίζεται σε όλα τα επιθηλιακά κύτταρα του παχέος εντέρου σε κάθε δείγμα αναλύθηκαν (Σχήμα S3 ). Αυτά τα ευρήματα ενισχύουν την χρησιμότητα της μεθόδου διαλογής μας για τον εντοπισμό ΤΑΑ που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την ανίχνευση καρκινικών κυττάρων σε δείγματα ασθενών και /ή θεραπευτική στόχευση

Α) Η &?. Ε (επάνω αριστερά) και ιντεγκρίνης α6 IHC (κορυφή δεξιά) από κλινικά δείγματα καρκίνου του παχέος εντέρου σε χαμηλή μεγέθυνση. Οι περιοχές του φυσιολογικού βλεννογόνου (Ν) και των παρακείμενων πρωτογενούς καρκίνου του παχέος εντέρου (Ρ) που υποδεικνύεται. Κάτω πάνελ παρέχουν υψηλότερα πεδία μεγέθυνση της ιντεγκρίνης α6 σε κανονική (αριστερά) και του όγκου (δεξιά). Β) Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα του ήπατος και των λεμφαδένων μεταστάσεων. Οι περιοχές των μεταστάσεων του καρκίνου του παχέος εντέρου (Μ) είναι ορατά από την Η &? Ε (αριστερά) και αντίστοιχη χρώση με ιντεγκρίνη α6 (δεξιά). Ένας χώρος φυσιολογικό ήπαρ (L) υποδεικνύεται. Όλα τα δείγματα λεμφαδένων περιείχε ένα υψηλό βαθμό ίνωσης γύρω από τη βλάβη που μετατοπίζεται φυσιολογικό λεμφικό ιστό από το οπτικό πεδίο. μπαρ κλίμακα:. 50 μm

Η

Πρωτοβάθμια έναντι μεταστατικού υπογραφές αντιγόνο επιφανείας

Στη συνέχεια εξετάσαμε την ικανότητα της μεθόδου μας διαλογής συστοιχία αντισωμάτων για να συγκρίνουν και να αντιπαραβάλλουν τα επιφανειακά υπογραφές από την πρωτοβάθμια και μεταστατική νόσο χρησιμοποιώντας κυτταρικές σειρές SW480 και SW620, αντίστοιχα. Επιφανειακή προφίλ εντοπίστηκαν 11 μεμβράνη πρωτεΐνες που σχετίζονται που ήταν παρόντες σε τουλάχιστον 5% των κυττάρων και με τουλάχιστον δύο φορές αυξημένη θετικότητα των κυττάρων σε SW620 σε σύγκριση με SW480 (Πίνακας 2, Εικόνα S4, και Πίνακας S4). CD10 (επίσης γνωστή ως μεμβράνη μεταλλο-ενδοπεπτιδάσης (ΜΜΚ)) είχε την υψηλότερη πολλαπλή μεταβολή στην έκφραση. Έχει ενζυματική δραστικότητα να υποβαθμίσει κλειδί μόρια σηματοδότησης και ρυθμίζεται αυξητικά σε μεταστατικό μελάνωμα [17] (Σχήμα 4Α). Η αύξηση στην έκφραση του CD10 που προσδιορίζονται από το αντίσωμα επιβεβαιώθηκε με κηλίδα Western, δείχνει υψηλό επίπεδο πρωτεΐνης σε SW620 κύτταρα, αλλά όχι σε SW480 (Σχήμα 4Β). Είναι ενδιαφέρον ότι, επτά από τις ταυτοποιημένες πρωτεΐνες έχουν γνωστές ρόλους στην λειτουργία του ανοσοποιητικού συστήματος, που υποδηλώνουν έναν ρόλο στην ανοσορρύθμιση διάρκεια μετάσταση (Πίνακας 2). Βρήκαμε επίσης 35 πρωτεΐνες με κύτταρο θετικότητα μειωμένη τουλάχιστον δύο φορές επί SW620 κύτταρα σε σύγκριση με SW480 (Πίνακας 3, Εικόνα S5, και Πίνακας S4) συμπεριλαμβανομένων των πολλαπλών εκπροσώπων των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στο μεταβολισμό των κυττάρων /σηματοδότηση, το ανοσοποιητικό σηματοδότηση σύστημα, και η κυτταρική πρόσφυση.

Ιστόγραμμα οικόπεδα από συστοιχία αντισωμάτων για το αντιγόνο CD10 στο SW480 (Α) και SW620 (Β). Κόκκινο υποδεικνύει τον έλεγχο ισοτόπου, ενώ η μπλε γραμμή είναι η χρώση για CD10. Ο αριθμός στην πάνω αριστερή είναι το κύτταρο θετικότητα. Υπάρχει μια σαφής μετατόπιση από ένα μικρό πληθυσμό ώμο σε SW480 για να ολοκληρωθεί δεσμευτικός ως προς SW620 κύτταρα. C) Ανοσοκηλίδωση για CD10 επιβεβαιώνει την ισχυρή αλλαγή στην έκφραση CD10.

Η

Η

Η έκφραση των δεικτών των βλαστικών κυττάρων

Για να ολοκληρώσετε προφίλ επιφανειακό αντιγόνο μας αυτών των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου γραμμές, ερευνήσαμε την έκφραση της μεμβράνης που σχετίζεται με τον καρκίνο του βλαστοκυττάρων (CSC) δείκτες. Αξίζει να σημειωθεί ότι, τα πρόσφατα στοιχεία έχουν δείξει ότι οι μεταστάσεις αποικιστεί από αυτά τα ΚΕΠ που κατέχουν τις λειτουργικές ικανότητες της αυτο-ανανέωσης και της διαφοροποίησης πολυ-γράμμωσης [18] – [20]. ΚΕΠ μπορεί επίσης να λειτουργήσει μέσα σε όγκους να προπαγανδίσει και /ή τη διατήρηση των όγκων πάροδο του χρόνου και την ανταπόκριση στη θεραπεία. Πολλές ομάδες έχουν προτείνει διάφορα ενδοκυττάρια και εξωκυττάρια εντοπισμό δεικτών για τα ΚΕΠ που συχνά έχουν ανοσοφαινοτυπικές ομοιότητες με φυσιολογικά βλαστικά κύτταρα ιστού. Σημαντικά, η ανίχνευση του ΚΕΠ μπορεί να εξαρτάται από πρόσδεση του μετα-μεταφραστική (π.χ. γλυκοζυλιωμένη) επίτοπους αντισωμάτων. Η προσθήκη τέτοιων τμημάτων σε πεπτίδια συχνά αποσυνδέεται επίπεδα μεταγραφής από το ποσό που ανιχνεύεται από αντισώματα (π.χ.

προμινίνη-1 /CD133

μεταγραφές και το CD133 (AC133) επιτόπου στην ΚΕΠ καρκίνου του παχέος εντέρου [21]). Επί του παρόντος, σπούδασε επιφανειακές πρωτεΐνες CSC στον καρκίνο του παχέος εντέρου περιλαμβάνουν EpCAM

υψηλή, CD133, CD26, CD166, και CD44, ανεξάρτητα ή σε συνδυασμό [18], [20], [22] – [25]. CD26, μια προτεινόμενη δείκτης του μεταστατικού βλαστοκυττάρων [20], και CD166 [24] συμπεριλήφθηκαν στη συστοιχία αντισωμάτων και τα αποτελέσματα παρέχονται στο Σχήμα S1. Πραγματοποιήσαμε πρότυπο ροής πολύχρωμα κυτταρομετρίας για EpCAM, CD133, CD44 και να καθορίσει την έκφρασή τους ξεχωριστά, καθώς και δίκλινα και τρίκλινα χρώσης (Πίνακας 4 και Σχήμα S6). Αν και δεν δοκιμάσει τις λειτουργικές ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων οποιωνδήποτε κυττάρων του όγκου πληθυσμούς, ήμασταν σε θέση να ανιχνεύσει την ποικίλη έκφραση των δεικτών ανοσοφαινότυπο βλαστικών κυττάρων που κυμαίνονται από κοντά απούσα για να ολοκληρωθεί επισήμανσης. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ανοσοφαινότυπους δείκτης βλαστικών κυττάρων μπορεί να διαφέρουν σημαντικά μεταξύ των όγκων και δεν είναι πάντα περιορίζεται σε σπάνιες πληθυσμούς. Περαιτέρω χαρακτηρισμός αυτών των πληθυσμών, πέρα ​​από το πεδίο εφαρμογής της παρούσας μελέτης, μπορεί να καθορίσει τη σημασία αυτών των προτύπων έκφρασης των λειτουργικών φαινοτύπων.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Κανονική παχέος εντέρου και του όγκου δείγματα από ασθενείς που έλαβαν θεραπεία στην Κλινική Κλίβελαντ ελήφθησαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα έχουν εγκριθεί από το Διοικητικό συμβούλιο Institutional Review Cleveland Clinic (IRB 4134), συμπεριλαμβανομένων των γραπτή συγκατάθεση.

οι κυτταρικές σειρές

Ανθρώπινα κόλον καρκινικές κυτταρικές σειρές SW480, SW620, HCT116 και ήταν όλα αποκτήθηκαν από την American Type Collection Tissue (ATCC) [7], [8], [26]. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 50 U /mL πενικιλλίνη, 50 μg /mL στρεπτομυκίνη σε τυποποιημένες πλάκες ιστοκαλλιέργειας (BD Biosciences) σε υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C και 5% CO

2. Πριν από την ανάλυση, τα κύτταρα ήταν σε ανάπτυξη και & lt λογαριθμικής φάσης? 70% συρροή. Αποκόλληση των κυττάρων από τις πλάκες καλλιέργειας ιστού διεξήχθη χρησιμοποιώντας TrypLE (Gibco) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (10 λεπτά στους 37 ° C). Η παπαΐνη κιτ διαχωρισμού ελήφθη από Worthington Biochemical. Η βιωσιμότητα των κυττάρων ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας αποκλεισμό μπλε Τρυπάνης και βρέθηκε να είναι & gt? 98%. Όλα τα κύτταρα αναπτύχθηκαν και επεξεργασία παράλληλα.

High throughput ροής ανάλυση κυτταρομετρίας

Υψηλή όλη ανάλυση κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκε σε τρεις κυτταρικές γραμμές που περιγράφονται παραπάνω χρησιμοποιώντας μια μέθοδο διαλογής αντίσωμα που αναπτύχθηκε από BD Biosciences [ ,,,0],27]. διαλογή αντισωμάτων έγινε με χρήση του πίνακα BD Lyoplate ανθρώπινη κυτταρική επιφάνεια διαλογής δείκτη (560,747) που περιέχει λυοφιλισμένο αντισώματα σε μορφή πλάκας 96-φρεατίων σε 0.5 μg /φρεάτιο. Για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής, τα κυτταρικά εναιωρήματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ϋΝΑση (σε 1 ml PBS με Ca

2+, Mg

2+, 100 μονάδες /ml, 10 μΙ αποθέματος DNAse) για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Πριν από την κηλίδωση αντισώματος, οι κυτταρικές γραμμές έχουν γραμμικό κώδικα με διαφορετικές χρωστικές βιωσιμότητα για ταυτόχρονη ανάλυση [28]. SW480 κύτταρα σημάνθηκαν με Horizon Violet διάδοσης Dye 450 (BD Biosciences 562158) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή σε 1 μΜ. HCT116 σημάνθηκε με CFSE (Invitrogen, C34554) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή σε 1 μΜ. SW620 αφέθηκε μη σημασμένο και ανιχνεύονται επί τη βάσει της ύπαρξης VPD450 και CFSE αρνητική. Αποτελεσματικότητα της σήμανσης ήταν & gt? 99%. Μετά την κατάλληλη πλύση, οι τρεις κυτταρικές σειρές αναμίχθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε BD Pharmingen Stain Buffer (BD Biosciences) με την προσθήκη 5 mM EDTA για την πρόληψη επανασυσσωμάτωση. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων με στρογγυλό πυθμένα (BD Biosciences) στα 30,000 κύτταρα (10.000 για κάθε κυτταρική σειρά) ανά φρεάτιο για χρώση. χρώσης κυτταρικής επιφάνειας έγινε με αντισώματα ανασυσταθεί με 1 χ PBS σε μια συγκέντρωση 0,5 mg ανά εξέταση και κύτταρα βάφτηκαν ζωντανά σε πάγο για 20 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα χρώσης και μετά χρωματίστηκαν με συγκεκριμένα είδη Alexa647 δευτερογενή αντισώματα (BD Biosciences) για 20 λεπτά επί πάγου. Τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές περισσότερα σε χρώση ρυθμιστικό, μετά επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό χρώσης με 7ΑΑΌ (BD Biosciences) για τον προσδιορισμό ζωντανών κυττάρων. Τα κύτταρα αναλύθηκαν σε ένα σύστημα FACS Canto (BD Biosciences) εξοπλισμένο με υψηλής Throughput Sampler (με φορτωτή πλάκα) και τα δεδομένα που συγκεντρώθηκαν με τη χρήση του λογισμικού με FlowJo και ένα πρότυπο του Microsoft Excel 2007 από την BD Biosciences (https://www.bdbiosciences.com /support/resources/stemcell/index.jsp#stemtools) για την παραγωγή των χαρτών θερμότητας.

η ανοσοϊστοχημεία

οι ιστοί για IHC και IFC ελήφθησαν μέσω ειδικής ομάδας προμήθεια ιστών στο εσωτερικό του Τμήματος Ανατομικά παθολογία στο Cleveland Clinic. Δείγματα για IHC σταθεροποιήθηκαν σε 4% φορμαλίνη ρυθμισμένου με φωσφορικά και ενσωματωμένα σε παραφίνη κερί για την κοπή. χρώση IHC διεξήχθη σε Ventana Benchmark ΧΤ αυτοματοποιημένη ανοσοκηλιδωτή χρησιμοποιώντας ένα Ventana Optiview DAB IHC Detection Kit με ανάκτηση αντιγόνου CC2. Πρωτογενές αντίσωμα, πολυκλωνικό κουνελιού αντι-ITGA6, (Sigma-Aldrich, HPA012696) αραιώνεται 1:10.

ανοσοφθορισμού

πρόσφατης συγκομιδής όγκο ή φυσιολογικού ιστού καταψύχθηκε και κλίση στους -80 ° ΝΤΟ. Μια γαστρεντερικό παθολόγος επιβεβαίωσε την ιστοπαθολογική διάγνωση της κάθε δείγμα ανεξάρτητα. Κανονική ιστός ελήφθη από μία θέση σε απόσταση από τον πρωτογενή όγκο παχέος εντέρου. Φρέσκα κατεψυγμένοι ιστοί κόπηκαν σε πάχος 6 μm. Τα πλακίδια σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη, ξηραίνεται στον αέρα, και αποθηκεύτηκαν στους -20 ° C μέχρι τη χρήση. Μετά τη θεραπεία με 10% φυσιολογικό ορό κατσίκας και 0.1% Triton Χ-100 (Sigma-Aldrich) για 45 λεπτά, τα πλακίδια επωάστηκαν με μονοκλωνικά συγγένεια καθαρισμένο ποντικού αντι-ανθρώπινου EpCAM (ab20160, Abcam) σε τελική αραίωση 1:200 και μονοκλωνικά συγγένεια καθαρισμένο αρουραίου αντι-ανθρώπινο ιντεγκρίνης α6 (MAB1378, Milipore) σε τελική αραίωση 1:100 όλη τη νύκτα στους 4 ° C, πλύθηκαν τρεις φορές με PBS που ακολουθείται από επώαση για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού IgG1 AlexaFluor 568 (1:1000 αραίωση) και AlexaFluor (αραίωση 1:1000) κατσίκας αντι-αρουραίου 488, τόσο από την Invitrogen. Τα πλακίδια πλύθηκαν τρεις φορές με PBS και βάφτηκαν αντίθετα με πυρηνική χρώση Hoechst 33342 (1:10000) για 2 λεπτά. Μετά από πλύση με PBS, τα πλακίδια τοποθετημένα με FluorSave (Calbiochem).

κηλίδωση Western

Τα κύτταρα λύθηκαν σε 50 mM Tris ρΗ 8,0, 120 mN NaCl, 0,5% ΝΡ-40, πρωτεάση αναστολείς (Sigma-Aldrich) και αναστολείς φωσφατάσης (Sigma-Aldrich). Ίσες ποσότητες κυτταρολύματος φορτώθηκαν και διαχωρίστηκαν σε ένα πήκτωμα βαθμίδωσης δις-τρις 4-12% (Life Technologies) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF (Millipore). Η μεμβράνη ανιχνεύθηκε ταυτόχρονα όλη τη νύκτα στους 4 ° C για αντι-CD10 (ποντίκι, 1:500, Abcam), και αντι-β-ακτίνης (ποντίκι, 1:8000, Sigma). δευτερογενές αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού συζευγμένο με υπεροξειδάση ραδικιού ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ενισχυμένο υπόστρωμα χημειοφωταύγειας (1:3000, Santa Cruz).

Βλαστικά δείκτη κυτταρικής ανάλυσης

Επιπλέον αντισώματα για multi-χρώμα κυτταρομετρίας ροής CD44 ΡΕ (Miltenyi? 1:1000), EpCAM-FITC (BD Biosciences κλώνος EBA-1? 1:1000), και CD133-APC (Miltenyi AC133? 1:1000). Τα κύτταρα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω. FITC-συζευγμένο ελέγχους ισοτύπου (Santa Cruz) χρησιμοποιήθηκαν χωριστά για κάθε αντίσωμα για να προσδιοριστεί χρώση βασική γραμμή και αποζημίωση πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με πρότυπες τεχνικές. Για την ανάλυση πολλαπλών χρωμάτων, ένα και μόνο κυτταρική γραμμή σημάνθηκε με τα τρία αντισώματα σε ένα μόνο σωλήνα, πλύθηκε, και φορτώθηκε σε μια ροή FACS Aria II κυτταρόμετρο (BD Biosciences). Gatings και οικόπεδα κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας το πακέτο λογισμικού FlowJo.

Oncomine ανάλυση

Βιοπληροφορική αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του Oncomine βάση δεδομένων (www.oncomine.org). Γονίδια που παρουσιάζουν ενδιαφέρον αξιολογήθηκαν με βάση μια οριακή τιμή ρ 0,05 και χωρίς το φίλτρο επίπεδο έκφρασης χρησιμοποιήθηκε.

Συζήτηση

Βελτίωση αποτελεσμάτων για τους ασθενείς με καρκίνο κατά πάσα πιθανότητα θα βασίζονται σε νέους τρόπους ανίχνευσης και θεραπείας για πρωτογενή και μεταστατική νόσο. Εδώ, χρησιμοποιήσαμε μία νέα τεχνική υψηλής διεκπεραιωτικότητας χρησιμοποιώντας ένα γραμμικό κώδικα συστοιχία αντισωμάτων για να καθορίσει τα προφίλ αντιγόνο επιφανείας κυτταρικών σειρών καρκίνου του παχέος εντέρου προέρχονται από πρωτογενή και μεταστατικό ιστό του όγκου. Εντοπίσαμε μια σειρά κοινών και διαφορικά εκφρασμένων επιφανειακά αντιγόνα, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που κέρδισε και έχασε κατά τη μετάβαση σε προχωρημένο στάδιο της νόσου (Πίνακες 1, 2 και 3). Η αντοχή του συστήματος που περιγράφεται στο παρόν ερευνητές όπλα με την ικανότητα για διαλογή παγκόσμια έκφραση πρωτεΐνης σε όλη νοσηρές καταστάσεις και /ή την απόκριση των κυττάρων σε συγκεκριμένα ερεθίσματα. Ανάμεσα στις εφαρμογές αυτής της προσέγγισης, επιφανειακά ΤΑΑ θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν για την παρακολούθηση και θεραπεία της νόσου. Μερικά ΤΑΑ, όπως EpCAM, έχουν ήδη εισέλθει στην κλινική σφαίρα με τη δυνατότητα να παρακολουθούν επιβάρυνση της νόσου. Πρόσθετες ΤΑΑ θα πρέπει να καταστήσει δυνατή η προσθήκη εξειδίκευση και αξιοπιστία στην ανίχνευση κυττάρων όγκου είτε in situ, σε κυκλοφορία, ή ως διαδίδονται κύτταρα. Στόχευση των ΤΑΑ με μονοκλωνικά αντισώματα μπορούν επίσης να παρέχουν κατευθύνσεις για την επίτευξη της αναστολής των όγκων, όπως έχει ήδη αποδειχθεί στην πράξη με cetuximab (Erbitux? Εναντίον EGFR), ριτουξιμάμπη (Rituxan? Στόχευση CD20), και tositumomab (στόχευση CD20). HER2-θετικό προχωρημένο καρκίνο τέρας μπορεί να ανασταλεί με trastuzumab emtansine (αντίσωμα αντι-HER2 σε συνδυασμό με έναν αναστολέα μικροσωληνίσκων) [29]. Επιπλέον, ραδιοανοσοθεραπεία, όπως ibritumomab tiuxetan (στόχευση CD20), χρησιμοποιεί μονοκλωνικά αντισώματα για να παραδώσει δόσεις ακτινοβολίας κατευθείαν στον ιστό του όγκου.

σύγκριση υποψήφιων δεικτών μας εντοπίζονται στο επίπεδο της πρωτεΐνης μέσω κυτταρομετρίας ροής κατά μικροσυστοιχιών γονιδιακής έκφρασης RNA που βασίζεται βάσεις δεδομένων του καρκίνου του παχέος εντέρου (Oncomine) βοήθησε στην ιεράρχηση μας. Ωστόσο, εγγενής βιολογικός αποσυνδέει μεταξύ RNA μεταγραφές και εξοπλίστηκε πολυπεπτίδια προειδοποιούν ενάντια χρησιμοποιώντας αυτό το φίλτρο ως τελικός καθοριστικός παράγοντας για την επιλογή των ΤΑΑ [5]. Μάλλον, ευνοούμε την επικύρωση του πληροφοριακού περιεχομένου του ΤΑΑ με βάση επιπλέον δοκιμασίες πρωτεΐνης-επίπεδο σε μεγαλύτερο αριθμό δειγμάτων ασθενών (π.χ. ανοσοϊστοχημεία σε μικροσυστοιχίες ιστού). Εμείς επικυρωθεί ιντεγκρίνης α6 σε βιοψίες ασθενών ως βιοδεικτών υποψηφίου όγκου επιλέγονται από επιτροπή μας αντισωμάτων. Περαιτέρω εργασία θα είναι αναγκαία για την αντιμετώπιση της κλινική χρησιμότητα για ιντεγκρίνης α6 και άλλες εντοπισμένες επιφανειακά αντιγόνα στην ανίχνευση των καρκινικών κυττάρων και το σχεδιασμό της θεραπείας.

Τα αποτελέσματα μας προφίλ ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου επεκταθεί σε εκείνους με Zhou et al. ότι χρησιμοποιείται επίσης ένα πολυπλεγμένο συστοιχία αντισωμάτων [30] – [32]. Η μελέτη τους χρησιμοποίησαν ένα τυπωμένο πίνακα slide-based αντίσωμα (DotScan ™) με κάλυψη του 122 δείκτες κυτταρικής επιφάνειας. Βρήκαμε συνεπής σήματα με τα περισσότερα, αλλά όχι όλα, από τα αντισώματα που αντιδρούν με τους SW480 και κυτταρικές σειρές SW620, η οποία μπορεί να αποδοθεί στην προετοιμασία του δείγματος ή ανάλυση τεχνική. Σε αντίθεση με την συστοιχία αντισωμάτων DotScan, η συστοιχία αντίσωμα που χρησιμοποιείται εδώ ανιχνευτές σχεδόν διπλάσιες αντιγόνα χρησιμοποιώντας πρότυπες τεχνικές κυτταρομετρίας ροής διαθέσιμη στις περισσότερες ερευνητικές εγκαταστάσεις χωρίς την ανάγκη για επιπλέον εξοπλισμό ή λογισμικό (δηλαδή DotReader). Η barcoding των κυτταρικών γραμμών μπορεί να κλιμακωθεί περαιτέρω χρησιμοποιώντας αραιώσεις 10 φορές των ενδοκυτταρικών βαφών ή /και διπλά επισημασμένου κύτταρα [28]. Παρόμοια με τη μέθοδο DotScan, ωστόσο, συστοιχία αντισωμάτων μας μπορούν επίσης να πολυπλεχθούν να αναλύουν δείγματα πρωτογενούς όγκου που περιέχουν πολλαπλών υποπληθυσμών που μπορεί να αναγνωριστεί με φθορισμό συζευγμένων αντισωμάτων (π.χ. επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα με CEA-FITC και αιμοποιητικών κυττάρων με CD45-APC), ενώ η τα αντισώματα στη συστοιχία επισημαίνονται με Alexa647. Εναλλακτικά, υποπληθυσμοί όγκου μπορεί να διακρίνονται επί τη βάσει της φυσικής (π.χ. πλευρά πληθυσμού) ή λειτουργικά (π.χ. βλαστικών κυτταρική ανάλυση) ιδιότητες, με την επισήμανση αυτών των κυττάρων σε βάρος τουλάχιστον ενός καναλιού φθορισμού ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί για barcoding. Για παράδειγμα, ο προσδιορισμός Aldefluor είναι δυνατή με την επισήμανση ΑΙ_ϋΗ1 εκφράζουν βλαστικά κύτταρα στο πράσινο κανάλι ενώ θυσιάζει CFSE barcoding.

Διάφοροι παράγοντες επηρεάζουν το προφίλ της επιφάνειας των καρκινικών κυττάρων. Μεταξύ αυτών περιλαμβάνεται η φάση ανάπτυξης των κυττάρων, μέσα καλλιέργειας, το υπόστρωμα καλλιέργειας πιάτο, και το είδος της ενζυματικής απόσπασης /αποσύνδεσης, η οποία μπορεί να διασπάσει επιτόπια. Για παράδειγμα, η θεραπεία του καρκίνου του κόλου HCT116 κυττάρων με παπαΐνη (ένζυμο που χρησιμοποιείται για διαχωρισμό μερικών συμπαγών όγκων) μείωσε την ανίχνευση της CD44 από 93,4% στο 0,5% των κυττάρων, ενώ EpCAM και CD133 (AC133) δεν επηρεάστηκαν σημαντικά (Σχήμα S7) . Έτσι, πρέπει να δίνεται προσοχή κατά το σχεδιασμό των πειραμάτων και ερμηνείας των δεδομένων από τις οθόνες που βασίζονται σε αντισώματα. Επιπλέον, το 5% των κυττάρων θετικότητα αποκοπής μας μπορεί να παραλείψει σπάνια, αλλά βιολογικά σχετικών κυτταρικών πληθυσμών και βιοδείκτες ΤΑΑ.

Η συνδυασμένη barcoding και συστοιχίες αντισωμάτων που χρησιμοποιούνται στην παρούσα μελέτη θα μπορούσε να επεκταθεί για την ταχεία προφίλ πρόσθετα καρκινικά κύτταρα από του παχέος εντέρου και άλλων τύπων ιστών. Η ικανότητα να multiplex αντιδράσεις μειώνει πειραματική μεταβλητότητα, η κατανάλωση του αντισώματος από 10 έως 100 φορές, και ο χρόνος για να ολοκληρωθεί μια δοκιμασία. Επιπλέον, αυτή η προσέγγιση μπορεί να προσαρμοστεί για την ταυτόχρονη δημιουργία προφίλ του ασθενούς που προέρχεται από την κανονική, πρωτογενή και /ή μεταστατική δείγματα σε ένα μόνο προσδιορισμό σε ένα κλάσμα του χρόνου και των δαπανών. Τέλος, η σύνδεση των γνωστών επιτόπων χρησιμοποιώντας εμπορικά διαθέσιμα αντισώματα επισπεύδει μεταφραστικής μελέτες που αποσκοπούν στην ανάπτυξη ενισχυμένη κλινική πόρους.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Πλήρης αποτελέσματα συστοιχία αντισωμάτων. Πλήρη αποτελέσματα από το γραμμικό κώδικα διαλογή συστοιχία αντισωμάτων κυτταρικών σειρών SW480, SW620 και HCT116 CRC. Η θέση του κάθε αντισώματος στην πλάκα υποδεικνύεται από σειρές Α-Η και στήλες 1-12. Για τη δημιουργία ενός heatmap της έκφρασης των αντιγόνων, τα μεμονωμένα κύτταρα χρωματισμένα με βάση την αξία τους έκφραση από 0 (λευκό) έως 100 (κόκκινο). Σημειώστε ότι ο αρουραίος CD326 /EpCAM σε καλά F10 έχει εγκριθεί μόνο για την αντιδραστικότητα του ποντικιού από τον κατασκευαστή και είναι ένα διαφορετικό αντίσωμα από αυτό που χρησιμοποιείται σε ανοσοφθορισμό μας και πολύχρωμες κυτταρομετρία ροής

doi:. 10.1371 /journal.pone.0053015. S001

(DOCX)

Εικόνα S2.

Ιστόγραμμα οικόπεδα από αντιγόνα στον Πίνακα 1. Τα αντιγόνα που εκφράζονται σε & gt? 50% όλων των κυττάρων σε όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές. Οικόπεδο στο κόκκινο αντίστοιχο έλεγχο ισοτόπου.