Αφηρημένο

Στόχος

Ο καρκίνος του πνεύμονα παραμένει νούμερο ένα αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους παγκοσμίως. απορρύθμιση του κυτταρικού κύκλου παίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεση του μη-μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC). Cdc25A αντιπροσωπεύει ένα κρίσιμο ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου, που θα ενισχύει την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου. Στην παρούσα μελέτη στοχεύει να διερευνήσει το ρόλο ενός νέου cdc25A μεταγραφική παραλλαγή, cdc25A

Q110del, σχετικά με τη ρύθμιση της πρωτεΐνης cdc25A, και τον αντίκτυπό της στην πρόγνωση των ασθενών με NSCLC.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Εδώ αναφέρουμε μια νέα παραλλαγή cdc25A απομαγνητοφώνηση με κωδικόνιο 110 (γλουταμίνη) διαγραφή, ότι ονομάζεται cdc25A

Q110del στα κύτταρα NSCLC. Σε 9 (75%) των 12 κυτταρικών σειρών NSCLC, cdc25A

έκφραση Q110del αντιπροσώπευαν πάνω από το 20% των μεταγραφών cdc25A. Βιολογικές επιδράσεις των cdc25A

Q110del ερευνήθηκαν σε κύτταρα Η1299 και ΗΕΚ-293F χρησιμοποιώντας ακτινοβολία UV, κυτταρομετρία ροής, κυκλοεξαμίδιο θεραπεία, και συνεστιακή μικροσκοπία. Σε σύγκριση με cdc25A

κ.β., cdc25A

Q110del πρωτεΐνη είχε μεγαλύτερο χρόνο ημίσειας ζωής? κύτταρα που εκφράζουν cdc25A

Q110del ήταν πιο ανθεκτική σε ακτινοβολία UV και έδειξε πιο μιτωτική δραστηριότητα. Taqman-PCR χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση cdc25A

επίπεδα έκφρασης Q110del σε 88 πρωτοπαθή όγκο NSCLC φυσιολογικό ζεύγη /ιστού. Σε ασθενείς με NSCLC, καμπύλες Kaplan Meier έδειξε όγκων που εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα cdc25A

Q110del σε σχέση με τα παρακείμενα ιστούς των πνευμόνων να έχουν σημαντικά κατώτερη συνολική επιβίωση (

P

= 0,0018).

σημασία

Εδώ θα προσδιορίζονται cdc25A

Q110del ως νέο μεταγραφικό παραλλαγή της cdc25A σε NSCLC. Η αλληλουχία-ειδική φύση της ανωμαλίας θα μπορούσε να είναι ένας προγνωστικός δείκτης σε ασθενείς με NSCLC, καθώς και ένας υποψήφιος στόχος για τις μελλοντικές θεραπευτικές στρατηγικές

Παράθεση:. Γιουνίς RH, Cao W, Lin R, Xia R, Liu Ζ, Edelman MJ, et al. (2012) cdc25A

Q110del: Ένα μυθιστόρημα κυτταρική διαίρεση Κύκλου 25Α Ισόμορφης εκφράζονται ανώμαλα σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 7 (10): e46464. doi: 10.1371 /journal.pone.0046464

Επιμέλεια: Sumitra Deb, Βιρτζίνια Πανεπιστήμιο της Κοινοπολιτείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 11 Ιουνίου, 2012? Αποδεκτές: 30ης Αυγούστου 2012? Δημοσιεύθηκε: 5 Οκτώβρη, 2012

Copyright: © Γιουνίς DDS, MDS, PhD, et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από ΝΙΗ επιχορηγήσεις R01 CA126818 και R01 CA136635. Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση ελήφθη για τη μελέτη αυτή

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του πνεύμονα παραμένει η κύρια αιτία της κακοήθειας. -σχετικών θανάτων σε όλο τον κόσμο, παρά τις προόδους σε θεραπευτικές μεθόδους [1]. Μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) είναι ο πιο κοινός τύπος καρκίνου του πνεύμονα και είναι αποτέλεσμα της συσσωρευμένης μοριακές αλλαγές που οδηγούν στην απορρύθμιση αρκετών κυτταρικών διεργασιών, συμπεριλαμβανομένου του ελέγχου του κυτταρικού κύκλου [2]. Στο NSCLC, αρκετές ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου που παίζουν έναν κρίσιμο ρόλο στην ελέγχων σημείο ελέγχου του κυτταρικού κύκλου μεταβάλλεται, η οποία επιτρέπει στα καρκινικά κύτταρα παρακάμπτουν διαφορετικά σημεία ελέγχου, ειδικά στις G1 /S και G2 /M με επακόλουθη ανεξέλεγκτο κυτταρικό πολλαπλασιασμό [3] – [ ,,,0],7].

25Α κύκλου κυτταρικής διαίρεσης (cdc25A) είναι ένα μέλος της οικογένειας CDC25 διπλά ειδικών φωσφατασών και διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου [8], [9]. λειτουργίες cdc25A για την απομάκρυνση των ανασταλτικών φωσφορικών αλάτων από θρεονίνης και τυροσίνης στις θέσεις συνδέσεως ΑΤΡ των CDK, την προώθηση της προόδου του κυτταρικού κύκλου [10], [11]. Cdc25A είναι επίσης ένας προς τα κάτω στόχος του Chk1 μεσολάβηση μονοπάτι σημείου ελέγχου: ενεργοποίηση της Chk1 με DNA επιβλαβείς συνθήκες στόχους cdc25A για την αποικοδόμηση πρωτεασώματος, η οποία εμποδίζει τα κύτταρα με χρωμοσωμικές ανωμαλίες από την πρόοδο μέσω του κύκλου του κυττάρου [10], [12], [13]. Ενώ CDK1 διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο για cdc25A σταθεροποίηση κατά την διάρκεια της μίτωσης [8], [10], [11]. Cdc25A συχνά υπερεκφράζεται σε καρκίνους συμπεριλαμβανομένου NSCLC. Αυτή η υπερέκφραση συνδέεται με μια πιο επιθετική κλινική συμπεριφορά και κατώτερα επιβίωση [7], [8], [12] – [19]. Αν και cdc25A έχει μελετηθεί εκτεταμένα για το ρόλο της στην πρόοδο του όγκου και ως πιθανός στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου, οι μηχανισμοί του cdc25A υπερέκφραση στον καρκίνο παραμένει να διερευνηθεί [12]. Μερικές μελέτες έχουν δείξει ότι η υπερέκφραση του cdc25A σε καρκίνους θα μπορούσαν να προκύψουν από μετα-μεταγραφικές απορρυθμίσεις [20], όπως η υπερέκφραση του υδρολάσης DUB3 ουβικιτίνης [21], η αδρανοποίηση των κινάση συνθάση γλυκογόνου-3βήτα (GSK-3β), η οποία φωσφορυλιώνει cdc25A να προωθήσει της πρωτεόλυση στις αρχικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου [22], η ενεργοποίηση των LIN28A που ρυθμίζει την έκφραση cdc25A αναστέλλοντας τη βιογένεση των αφήνω-7 miRNA [23], και microRNA-21, η οποία ρυθμίζει αρνητικά cdc25A, έτσι ώστε να υπο-έκφραση των αποτελεσμάτων του cdc25A υπερέκφραση στον καρκίνο του παχέος εντέρου [24].

Εδώ αναφέρουμε την ταυτοποίηση ενός νέου, εναλλακτικού ματίσματος cdc25A ισομορφή που είχε ως αποτέλεσμα την εξάλειψη του κωδικονίου 110 ονομαστεί cdc25A

Q110del. Δείχνουμε ότι cdc25A

Q110del εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα σε 75% των κυτταρικών γραμμών NSCLC. Cdc25A

πρωτεΐνη Q110del είχε μεγαλύτερη σταθερότητα και περισσότερη πυρηνική διανομής. Τα κύτταρα που εκφράζουν υψηλό επίπεδο cdc25A

Q110del ήταν πιο ανθεκτικά στην υπεριώδη ακτινοβολία. Σε ασθενείς με ΜΜΚΠ, υψηλότερα επίπεδα cdc25A

Q110del στους όγκους σχετίστηκαν με την κακή κλινική έκβαση. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η έκφραση cdc25A

Q110del είναι κοινή σε NSCLC και μπορεί να διαδραματίσει έναν ρόλο στην πνευμονική ογκογένεση και την εξέλιξη του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές

ΗΕΚ293 και τα κύτταρα NSCLC ελήφθησαν από την ATCC (Manassas, VA), και διατηρήθηκαν σε DMEM – 5% ορό εμβρύου μόσχου. Αθανατοποιημένα ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κυτταρικές γραμμές (HBEC), HBEC2, HBEC3, HBEC4 και HBEC5 (δώρο από Drs. John Minna και Jerry Shay του Πανεπιστημίου του Τέξας Southwestern Medical Center, Dallas, Texas) [25], διατηρήθηκαν σε ελεύθερο ορού κερατινοκυττάρων δωρεάν (KSF) media με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (rEGF) και εκχύλισμα βόειας υποφύσεως (Invitrogen, Carlsbad, CA). διαμόλυνση πλασμιδίου πραγματοποιήθηκε με τη χρήση λιποφεκταμίνης 2000 (Invitrogen).

κηλίδωση Western

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA με αναστολέα πρωτεάσης (Roche Bioscience), και διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE. Πρωτογενή αντισώματα έναντι cdc25A (κλώνοι 144 και F-6), cdc2 Ρ34 (Η-297), Chk1, GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, CA), φωσφο-Chk1 (Ser345) (Cell Signaling Biotechnology, Danvers, ΜΑ), φωσφο- CDK1 (Tyr15) (Calbiochem EMD Chemicals Inc, Gibbstown, NJ) χρησιμοποιήθηκαν. κιτ εκχύλισης πρωτεΐνης NE-PER (Pierce Biotech, Rockford, IL) χρησιμοποιήθηκαν για την κλασματοποίηση του κυτοσολίου και πυρηνικές πρωτεΐνες. Κυκλοεξαμίδη (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) ανασυστάθηκε εντός DMSO.

εξαγωγή RNA, αντίστροφη μεταγραφή, και σε πραγματικό χρόνο PCR

Το ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ, και μετατρέπεται σε cDNA χρησιμοποιώντας κιτ SuperScript III First-Strand Synthesis (Invitrogen). Πλήρους μήκους cdc25A cDNA ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας iProof Υψηλής Πιστότητας DNA πολυμεράση (Bio-Rad, Hercules, CA), και κλωνοποιήθηκε σε pEF6 /V5 His (Invitrogen, Carlsbad, CA) ή pEGFP-N1 (εργαστήρια Clontech, CA) για την πραγματική τυποποίηση αντιδράσεις time PCR, UV ακτινοβολία, θεραπείες CHX, ανάλυση αλληλουχίας και πέψης ενζύμου περιορισμού, ρΕΟΡΡ-Ν1 συγχωνευμένο με EGFP ή μ-Cherry χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση απεικόνισης και κυτταρομετρία ροής ή όπου υποδεικνύεται Όλοι οι χειρισμοί DNA διεξήχθησαν σε βιοασφάλεια επιπέδου 1 ή 2 εργαστήρια.

Για να ποσοτικοποιηθεί η συνολική cdc25A μεταγραφή, σε πραγματικό χρόνο ανάλυση PCR συναρμολογήθηκαν χρησιμοποιώντας τον πρόσθιο εκκινητή 5′-GCTCCTCCGAGTCAACAGAT -3 ‘, αντίστροφος εκκινητής 5′-TGGACTACATCCCAACAGCTT-3’, και FAM ™ βαφής-σημασμένο ανιχνευτή 5 «-ATTCTCCTGGGCCATTGGACA-3 ‘? να ποσοτικοποιηθεί η άγριου τύπου cdc25A μεταγραφής, η δοκιμασία συναρμολογήθηκε χρησιμοποιώντας τον πρόσθιο εκκινητή 5 ‘-GCTCCTCCGAGTCAACAGAT -3′, αντίστροφος εκκινητής 5’-ACTACATCCCAACAGCTTCTG- 3 ‘και FAM ™ βαφή-σημασμένο ανιχνευτή 5′-ATTCTCCTGGGCCATTGGACA-3’. Ο προσδιορισμός διεξήχθη εις τριπλούν με TaqMan Fast κύριο μείγμα Οικουμενική PCR (Applied Biosystem, Carlsbad, CA) στην Εφαρμοσμένη Biosystem 7900HT γρήγορο σύστημα πραγματικού χρόνου PCR. Σε όλες τις αντιδράσεις, GAPDH δοκιμασία Fast TaqMan VIC χρωστική σημασμένο ανιχνευτή προστέθηκαν ως έλεγχος φόρτωσης RNA.

Όταν το συνολικό έκφραση του cdc25A έχει οριστεί ως το ενδογενές γονίδιο αναφοράς, η αφθονία του cdc25A

Q110del μπορεί να είναι υπολογίζεται ως ΔCt = Ct

wT-Ct

tot. Ως εκ τούτου, η σχετική αφθονία CDC25

κβ σε ζεύγη όγκου έναντι φυσιολογικό ιστό υπολογίζεται με 2

-ΔΔCt μέθοδος, όπου ΔΔCt = ΔctTumor- ΔctNormal (Δελτίο Χρήστη # 2 Applied Biosystem). Εάν τα επίπεδα έκφρασης του cdc25A

Q110del και CDC25

wt είναι ίσες στο αντίστοιχο όγκο και το παρακείμενο φυσιολογικό ιστό πνεύμονα, η υπολογισθείσα τιμή σχετικής αφθονίας θα είναι 1. Η τιμή & lt? 1 υποδεικνύει ότι ο όγκος εκφράζει ένα υψηλότερο επίπεδο της cdc25A

Q110del από την αντιστοιχισμένη φυσιολογικό πνευμονικό ιστό. Αντίθετα, μια τιμή & gt?. 1 δείχνει ότι η κανονική πνευμονικό ιστό εκφράζει ένα υψηλότερο επίπεδο cdc25A

Q110del από το αντιστοιχισμένο όγκο

Η ανάλυση της αλληλουχίας και του ενζύμου περιορισμού της πέψης

κλώνων του DNA αλληλουχία σε το Πανεπιστήμιο του καταλύματος αλληλούχισης Maryland Βαλτιμόρη ή Genewiz Inc., (South Plainfield, NJ). Ευθυγράμμιση έγινε εναντίον αναφορά cdc25A NM_001789. Οι κλώνοι cDNA που χρησιμοποιήθηκαν για τις λειτουργικές δοκιμασίες ενισχύθηκαν από κυτταρικές γραμμές NSCLC (Πίνακας S1). Για ενζυματική ανάλυση χώνευση, ένα θραύσμα 292 bp του cdc25A cDNA ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας εκκινητές: 5′-διαβιβάσει CACTGGAGGTGAAGAACAACAG-3 ‘και αντίστροφος 5′-CAGCCACGAGATACAGGTCTTA-3’, σε πέψη με την περιοριστική ενδονουκλεάση Bpu10I (New England Biolabs, Ίπσουιτς, ΜΑ) συνέχεια διαχωρίστηκαν επί γέλης αγαρόζης.

UV ακτινοβολία

για τη θεραπεία UV καλλιεργημένων κυττάρων, το μέσο απομακρύνθηκε, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό και κατόπιν ακτινοβολείται σε ακάλυπτα πιάτα καλλιέργειας ιστών με 254 nm υπεριώδες φως (UVC) σε Stratalinker υν Crosslinker (Stratagene, La Jolla, CA). Φρέσκο ​​μέσο καλλιέργειας προστέθηκε πίσω, και τα κύτταρα επωάστηκαν περαιτέρω για τις περιγραφόμενες χρονικά σημεία.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, μονιμοποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη, εναιωρήθηκε σε PI /RNase Buffer χρώση (BD Pharmingen ™, San Jose, CA) που περιέχει 0.1% κιτρικό νάτριο και 0,1% Triton Χ-100. Η ανάλυση των δεδομένων έγινε στο Πανεπιστήμιο του Maryland Baltimore Medical Center, κυτταρομετρία ροής Core και αναλύονται με το λογισμικό FlowJo.

Απεικόνιση ανάλυση

Τα κύτταρα που εκφράζουν cdc25A

κβ ή cdc25A

Q110del- συγχωνεύονται με mCherry ή EGFP σταθεροποιήθηκαν σε 2% παραφορμαλδεΰδη, κατέστησαν διαπερατά με 0.5% TritonX-100, χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ. Οι εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα Zeiss LSM 510 Meta Laser Scanning Ομοεστιακή Μικροσκόπιο με DAPI, FITC και fiters ροδαμίνη. Το ιστόγραμμα εκπρόσωπος της έκφρασης FITC και ροδαμίνη παρήχθη χρησιμοποιώντας το

εικόνα J

λογισμικού.

Η βιωσιμότητα των κυττάρων δοκιμασία

Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με τη χρήση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού αντιδραστηρίου WST-1 ( Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN).

ασθενείς και ιστοί

Πρωτοβάθμια NSCLC όγκων και των αντίστοιχων καλοήθεις παρακείμενους ιστούς των πνευμόνων τους από 88 άτομα με παθολογική στάδιο Ι έως ΙΙΙα NSCLC αξιολογήθηκαν. Όλοι οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε θεραπεία με χειρουργική επέμβαση και μόνο, εκτός από εκείνα με το στάδιο της νόσου IIIa που θα μπορούσαν επίσης να είχαν λάβει μετεγχειρητική ακτινοθεραπεία και η επικουρική χημειοθεραπεία, στο Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson Κέντρο Καρκίνου (MDACC) από το 1995 έως το 2000. Τα δείγματα ήταν αμέσως καταψύχεται και αποθηκεύεται στους -80 ° C. Η επιλογή των ασθενών αυτών βασίστηκε στη διαθεσιμότητα των αρχειοθετούνται φρέσκο ​​όγκου και αντίστοιχοι φυσιολογικοί ιστοί των πνευμόνων για τους ερευνητές. Κλινικές πληροφορίες και πληροφορίες παρακολούθησης για τη μελέτη βασίστηκαν σε ανασκόπηση διαγραμμάτων και τη μορφή εκθέσεων από την υπηρεσία MDACC μητρώου όγκου. Ενημερωμένη συγκατάθεση για τη χρήση των υπολειμματικών εκτομή ιστών για την έρευνα λήφθηκε από όλους τους ασθενείς που συμμετείχαν στη μελέτη.

Δήλωση Ηθικής

γραπτή συγκατάθεση για χρήση υπολειμματικών εκτομή ιστού για την έρευνα λήφθηκε από όλους ασθενείς που συμμετείχαν στη μελέτη. Η διαδικασία συναίνεσης και η χρήση αυτών των υλικών και κλινικές πληροφορίες εξετάστηκε και εγκρίθηκε από την επιτροπή εποπτείας του Πανεπιστημίου του Τέξας MDACC.

Η στατιστική ανάλυση

Φοιτητής

t-test

χρησιμοποιήθηκε για τη στατιστική ανάλυση των λειτουργικών προσδιορισμών. ανάλυση επιβίωσης Kaplan Meier καμπύλες παρήχθησαν με ανάλυση log rank χρησιμοποιώντας Proc Lifetest στην SAS 9.2. Όλες οι δοκιμές είναι διπλής όψης και Ρ τιμές & lt? .05 Θεωρείται στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Αναγνώριση cdc25A

Q110del σε NSCLC

Για να διερευνήσει πιθανές αλλοιώσεις της. cdc25A σε επίπεδο mRNA, εμείς αλληλουχία cdc25A cDNA κλώνων που προέρχονται από ένα πάνελ 10 κυτταρικών σειρών NSCLC. Μεταξύ σύνολο 16 κλώνοι cDNA από τις κυτταρικές γραμμές 10, παρατηρήσαμε μια συγκεκριμένη διαγραφή τρινουκλεοτιδίου σε 7 από τα 16 κλώνων από 5 από τις κυτταρικές γραμμές 10 (Εικ. 1Α) (Πίνακας S1). Η διαγραφή τοποθετεί στις θέσεις 328 έως 330 στην αναφορά NM_001789.2, cdc25A μεταγραφής 1, το οποίο προβλέπει μια διαγραφή γλουταμίνη στο κωδικόνιο 110 (Εικ. 1Β). Αυτό το υπόλειμμα αμινοξέος βρίσκεται εντός του ρυθμιστικού πεδίου του cdc25A και διατηρείται μεταξύ διαφόρων σπονδυλωτών (Εικ. 1 C και D). Εμείς ονομάζουμε το μυθιστόρημα ισομορφή cdc25A με κωδικόνιο 110 διαγραφής όπως cdc25A

Q110del. Η διαγραφή αυτή είναι πιθανόν ένα αποτέλεσμα εναλλακτικού ματίσματος RNA, δεδομένου ότι δεν μεταβολή της γονιδιωματικής αλληλουχίας DNA βρέθηκαν στις κυτταρικές σειρές NSCLC (τα δεδομένα δεν δείχνονται) (Εικ. 1 Ε) Για να επιβεβαιωθεί η παρουσία του cdc25A

Q110del σε κυτταρικές γραμμές NSCLC και πρωτεύοντες ιστούς NSCLC όγκου, εξετάσαμε cDNA από 4 κυτταρικές σειρές NSCLC και 5 πρωτεύοντες ιστούς NSCLC όγκου χρησιμοποιώντας πέψη με περιοριστικές ενδονουκλεάσες με Bpu10I, η οποία μπορεί να διασπάσει την αλληλουχία 5′-CCTNAGC, μια μοναδική θέση σε cdc25A

αλληλουχία Q110del, για να παραχθεί ένα μικρότερη διασπασμένου συγκρότημα DNA. Όλα τα δείγματα έδειξαν την μικρότερη διασπασμένο συγκρότημα DNA σε διάφορες πυκνότητες (Εικ. S1).

Α. αλληλουχία νουκλεϊκού οξέος του τριπλούν διαγραφή cdc25A-CAG (328 – 30) σε κυτταρικές σειρές NSCLC. Β cdc25A-CAG (328-30) μεταφράζεται σε διαγραφή Q110 (cdc25A

Q110del). Γ αμινοξέων Q110 του cdc25A είναι εξελικτικά συντηρημένη σε άλλους οργανισμούς. Δ Q110 βρίσκεται στον κανονιστικό τομέα, που βρίσκεται πλησιέστερα προς CDK1 ιστοσελίδα μιτωτικής σταθεροποίηση φωσφορυλίωσης (S116) και Chk1 θέση φωσφορυλίωσης αποικοδόμηση (S124). Κόκκινο: CAG (328-30) διαγραφή νουκλεϊκών οξέων και αντίστοιχη Q110 αμινοξύ, σκιά: θέσεις φωσφορυλίωσης της σερίνης (S116 και S124). Ε Σχηματική απεικόνιση του πρότεινε θέση εναλλακτικού ματίσματος. ιστοσελίδα εναλλακτική δότη: 5 ‘κόμβο ματίσματος (δότρια περιοχή), την αλλαγή του ορίου 3’ του ανάντη εξόνιο, θα παράγουν το cdc25A

κβ μεταγραφή, ενώ μια εναλλακτική θέση δέκτη: διασταύρωση 3 ‘θέση ματίσματος (θέση δέκτη), αλλαγή του ορίου 5 ‘του κατάντη εξόνιο, θα παράγουν το cdc25A

Q110del μεταγραφή.

η

επόμενο επινοήσει μια δοκιμασία PCR πραγματικού χρόνου (Εικ. 2Α) για την εκτίμηση της ποσότητας των cdc25A

Q110del μεταξύ των συνολικών μεταγραφές cdc25A σε κυτταρικές σειρές NSCLC και δείγματα ιστών, για να αποδειχθεί ότι η δοκιμασία μπορεί να μετρήσει ποσοτικά τη σχετική αφθονία των ισομορφών cdc25A, κατασκευάσαμε μια καμπύλη Ct χρησιμοποιώντας καθαρισμένα πλασμίδια DNA που περιέχει είτε cdc25A

κ.β. ή cdc25A

Q110del cDNA ένθετο. Το αποτέλεσμα έδειξε μία σχεδόν γραμμική σχέση με διαφορετικές άγριου τύπου και αναλογία Q110del (Εικ. 2Β) μέθοδος .Αυτό στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση cdc25A

Q110del έκφραση σε κυτταρικές σειρές και ιστούς. Σε 4 κυτταρικές σειρές HBEC, cdc25A

έκφραση Q110del ήταν ανιχνεύσιμη αλλά σε γενικά λιγότερο από το 20% του συνόλου των μεταγραφημάτων cdc25A (Σχ. 2C). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι αυτές οι κυτταρικές σειρές που προέρχονται από αθανατοποιημένα ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα. Σε σύγκριση, 9 (75%) από τα 12 κυτταρικές γραμμές NSCLC εκφράζεται cdc25A

Q110del μεγαλύτερη από το 20% του συνόλου των μεταγραφημάτων cdc25A συμπεριλαμβανομένων 3 (20%) από τις κυτταρικές γραμμές εξέφρασαν cdc25A

Q110del σε επίπεδο σχεδόν το 50% (Σχ. 2C). Η διαφορά των cdc25A

επίπεδα έκφρασης Q110del μεταξύ των κυτταρικών σειρών HBEC και τις κυτταρικές γραμμές NSCLC ήταν στατιστικώς σημαντική (

P

= 0,003). Είναι ενδιαφέρον ότι η οι κυτταρικές σειρές H549 που δείχνουν cdc25A

Q110del σε & gt Η596 και? 50% των συνολικών cdc25A, έχει υψηλή τροπική χρωμοσωμικό αριθμό σε υψηλό ποσοστό, NCI-H596 αριθμό τρόπων μεταφοράς = 71? εύρος = 65 έως 75.This είναι κοντά τριπλοειδείς ανθρώπινη κυτταρική γραμμή. Ενώ Α549 είναι ένα υποτριπλοειδές ανθρώπινη κυτταρική σειρά με τον υποθετικό αριθμό χρωμοσώματος 66, που εμφανίζεται στο 24% των κυττάρων (σύμφωνα με την «Συλλογή Καλλιεργειών Αμερικανικού Τύπου»). Αυτό υποδηλώνει cdc25A

Q110del να παίξει ένα ρόλο στη γενωμική αστάθεια και σωρευτικά κακοήθεις αλλαγές [26]. Μια συσχέτιση μεταξύ cdc25A

Q110deland συσσώρευση hyperploid κυττάρων περιγράφεται παρακάτω στην κατανομή του κυτταρικού κύκλου.

Α. Real-time PCR δοκιμασία για την εκτίμηση της ποσότητας των cdc25A

Q110del σε σχέση με τα συνολικά μεταγραφές cdc25A σε κυτταρικές σειρές NSCLC και δείγματα ιστών, το «Σύνολο» πραγματική δοκιμασία του χρόνου-PCR καθορίζει συνολικό πρότυπο cdc25A στην αντίδραση (Ct

tot ), ενώ το «βάρος» δοκιμή σε πραγματικό χρόνο-PCR καθορίζει το γονίδιο-στόχο που είναι η cdc25A

κ.β. πρότυπο (Ct

κβ), στη συνέχεια να υπολογίσει το cdc25A

Q110del = ΔCt = (Ct

κ.β. Ct

tot). καμπύλη Β απεικονίζει Πρότυπο τιμές Ct που αντιστοιχούν σε διαφορετικές αναλογίες cdc25A

κβ: cdc25A

Q110del, pEF6-V5-His-cdc25A

κβ και pEF6-V5-His-cdc25A

Q110del ενσωματώθηκαν μαζί σε διάφορες αναλογίες ως πρότυπο σε κάθε UNIPLEX πραγματικό χρόνο PCR αντίδρασης, τρέχει εις τριπλούν, τότε η cdc25A

Q110del υπολογίζεται (cdc25A

Q110del = ΔCt = Ct

wT-Ct

tot). C. 50% του NSCLC δείχνουν cdc25A

αξίες Q110del που αντιστοιχούν σε 30-50% του συνόλου των προτύπων cdc25A σε σχέση με την πρότυπη καμπύλη (Β), ενώ οι κυτταρικές γραμμές εκφράζουν HBEC ~ 20% του συνόλου των προτύπων cdc25A (

P

= 0,003).

η

cdc25A

Q110del επιβίωση της σταθερότητας των πρωτεϊνών και κυττάρων

cdc25A είναι ένα ασταθές πρωτεΐνη, καλά ρυθμίζεται μέσω διαφόρων εκδηλώσεων φωσφορυλίωσης στα της ρυθμιστικό πεδίο [8]. Για να διερευνηθεί η επίδραση της διαγραφής Q110 σχετικά με την τύχη της ρύθμισης πρωτεΐνης cdc25A, ελέγξαμε τον ρυθμό υποβάθμισης της cdc25A

Q110del χρησιμοποιώντας κυκλοεξαμίδιο (CHX) θεραπεία. Σε Η1299 κύτταρα κατεργασμένα με CHX, παρατηρήσαμε ότι cdc25A

Q110del έχει ένα μεγαλύτερο χρόνο ημίσειας ζωής σε σύγκριση με cdc25A

wt (Εικ. 3Α). Επιπλέον, όταν cdc25A

κβ και cdc25A

Q110del συν-επιμολύνθηκαν, περισσότερες cdc25A

Q110del συσσωρεύτηκε από cdc25A

wt σε 72 ώρες μετά την επιμόλυνση (Εικ. S2) τόσο Η1299 και 293F κύτταρα.

Α. κυκλοεξαμίδιο πορεία του χρόνου (50 μg /ml) μεταχείριση των Η1299 κυττάρων επιμολυσμένων με pEGFPN1-cdc25A

κβ ή pEGFPN1-cdc25A

Qdel υπό ατάραχος συνθήκες έδειξαν αυξημένη ημίσεια ζωή του cdc25A

Q110 (-15 λεπτά) έναντι cdc25A

κβ. B. UV ακτινοβολία που ακολουθείται από 30 λεπτά επώασης του 293F κυττάρων σε 37 ° C, cdc25A

Q110del έδειξε μεγαλύτερη σταθερότητα σε σύγκριση με cdc25A

wt. κύτταρα Γ 293F απλώνονται σε ίση πυκνότητα κυττάρων και επιμολύνονται με ίση ποσότητα EGFP επισημανθεί cdc25A

Q110del ή cdc25A

κβ. Μετά από 72 ώρες επιμόλυνσης, κυτταρομετρία ροής ανάλυση περίφραξη ίσο αριθμό EGFP κυττάρων που εκφράζουν για κάθε ισομορφή. Ιστόγραμμα δείχνει την ένταση της έκφρασης των cdc25A

Q110del-EGFP (μέσος όρος 59,2) έναντι cdc25A

WT-EGFP (μέσος όρος 40,5) (t-test

P

= .05). D. Το ίδιο πληθυσμό κυττάρων περιφραγμένη για έκφραση ΕΟΡΡ- cdc25A μελετήθηκε για διανομή του κυτταρικού κύκλου. Η cdc25A

WT-EGFP έδειξε να συλλάβει κατά τη φάση μετά G2 (& gt? G2 /M) σε σύγκριση με τον έλεγχο (p = 0,055). Οι ΕΟΡΡ- cdc25A

Q110del εκφράζουν κύτταρα παρουσίασαν μικρότερη συσσώρευση hyperploid πληθυσμού κυττάρου στο & gt? G2 /M φάση και επιτάχυνε τα κύτταρα περισσότερο μέσω μίτωσης σε σύγκριση με το ΕΟΡΡ- cdc25A

wt κυττάρων που εκφράζουν (p = 0,0047). Ε κυτταρική ανάλυση βιωσιμότητας του Η1299 που εκφράζει cdc25A

κ.β. έναντι cdc25A

Q110del μετά από 24 ώρες από αρκετές δόσεις ακτινοβολίας UV. Cdc25A

Q110del έκφραση διασωθεί Η1299 ευαισθησία στην υπεριώδη ακτινοβολία σε σχέση με την ομάδα ελέγχου.

Η

Σε 293F κύτταρα επιμολυσμένα είτε με cdc25A

κβ ή cdc25A

Q110del και κατεργάζεται με 10 και 20 j /m

2 UV ακτινοβολία, κύτταρα επιμολυσμένα με cdc25A

Q110del παρουσίασαν αυξημένη σταθερότητα της πρωτεΐνης 30 λεπτά μετά την ακτινοβολία UV αλλά όχι τα κύτταρα που επιμολύνθηκαν με cdc25A

wt (Σχ. 3Β).

Για να πάρετε μια πιο ποσοτική μέτρηση της cdc25A

Q110del και cdc25A

κβ επίπεδα, μετρήσαμε την ένταση φθορισμού των πρωτεϊνών σύντηξης cdc25A-EGFP gating ίσο αριθμό κυττάρων 293F που εκφράζουν cdc25A

wT-EGFP ή cdc25A

Q110del-EGFP και παρατήρησε ένα σημαντικά υψηλότερο επίπεδο της έντασης φθορισμού στην cdc25A

Q110del-EGFP επιμολυσμένα κύτταρα (Σχ. 3C). Η ανάλυση του κυτταρικού κύκλου από το ίδιο περιφραγμένο πληθυσμό κυττάρων, έδειξαν αύξηση του πληθυσμού μετά G2 (hyperploid κύτταρα) του cdc25A

WT-EGFP κύτταρα που εκφράζουν σε σύγκριση με το cdc25A

Q110del-EGFP, ενώ η cdc25A

Q110del -EGFP επιτάχυνε τα κύτταρα περισσότερο μέσα από τη φάση μετά G2 (μίτωση) σε σύγκριση με το cdc25A

κβ (p = 0,0047) (Εικ. 3D). Αυτό υποδηλώνει ότι η cdc25A

Q110del να καταργήσει το σημείο ελέγχου G2 /M σε σύγκριση με το cdc25A

κ.β., οδηγώντας τα κύτταρα περισσότερο μέσω της μίτωσης [26], [27].

Για να διερευνηθεί αν η cdc25A

Q110del μπορεί να επηρεάσει την επιβίωση των κυττάρων NSCLC υπό διαταραγμένο συνθήκες, τα κύτταρα Η1299 επιμολυσμένα με cdc25A

Q110del υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ακτινοβολία UV σε διαφορετικές δόσεις, Η1299 που εκφράζει cdc25A

Q110del ήταν πιο ανθεκτικά στην υπεριώδη ακτινοβολία θάνατος επαγόμενο κυτταρικό σύγκριση στα κύτταρα επιμολυσμένα με τον φορέα ελέγχου ή cdc25A

κ.β., ιδιαίτερα σε υψηλές δόσεις υπεριώδους (Σχ. 3Ε).

Κυτταρικός εντοπισμός και μιτωτική δραστηριότητα των cdc25A

Q110del

κύτταρα Η1299, cdc25A

Q110del παρουσίασαν σημαντική αύξηση πυρηνικού εντοπισμού από cdc25A

κβ (Σχ. 4Α). 24 ώρες μετά την υπεριώδη ακτινοβολία, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με cdc25A

Q110del έδειξαν μεγαλύτερη σταθερότητα της πρωτεΐνης αν και η αυξημένη φωσφορυλίωση του ανάντη απόκριση βλάβης DNA (DDR) δείκτης pChk1-ser345 (Εικ. 4Β). Ως νέα στοιχεία δείχνουν cdc25A ως μέλος της οικογένειας CDC25 απαιτείται για την πλήρη ενεργοποίηση των πυρηνικών CDK1 [11], [28], [29], και δεδομένου ότι Q110del βρίσκεται πλησιέστερα στο S116 – τη θέση φωσφορυλίωσης CDK1 κρίσιμη για τη σταθεροποίηση cdc25A σε έναν βρόχο ανάδρασης κατά τη διάρκεια της μίτωση – [11], εκτός από τα ευρήματά μας, που έδειξαν την cdc25A

Q110del να οδηγούν τα κύτταρα περισσότερο μέσω μίτωσης σε σύγκριση με το βάρος cdc25A

(Εικ. 3D), εμείς μελέτησε να διερευνηθεί η επίδραση της cdc25A

Q110del στην μιτωτική δραστηριότητα και την ενεργοποίηση CDK1. Μετά την επιμόλυνση 293F κυττάρων με cdc25A

Q110del-EGFP, παρατηρήσαμε μια αύξηση στην αναλογία των κυττάρων σε μιτωτική φάση, ένα φαινόμενο που δεν παρατηρήθηκε στα κύτταρα επιμολυσμένα με cdc25A

WT-EGFP (Εικ. 4C). Σε σύγκριση με τα κύτταρα που επιμολύνθηκαν με cdc25A

WT-EGFP, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με cdc25A

Q110del-EGFP έδειξε ένα χαμηλότερο επίπεδο φωσφορυλίωσης CDK1- Tyr15, 24 ώρες μετά την επιμόλυνση (Εικ. 4D), που είναι συνεπής με την παρουσία του πιο ενεργό CDK1 για την προώθηση της G2 /M μετάπτωσης φάσης (Σχ. 3D). Η μείωση του συνολικού CDK1 στο cdc25A

κβ και cdc25A

Q110del επιμολυσμένα κύτταρα-σε σύγκριση με τους ελέγχου-αναμένεται, μετά τη σύλληψή στο G2 του κυτταρικού κύκλου /Μ φάση (Σχ. 3D), μπορεί να προκαλέσει καταστολή του έκφραση CDK1 σε μεταγραφικό επίπεδο σε ένα χρόνο και εξαρτάται από τον κυτταρικό τύπο τρόπο [30].

Α. Ανοσοστύπωμα Η1299 κυττάρων έδειξε cdc25A

Q110del να εντοπίζεται περισσότερο στον πυρήνα σε σύγκριση με την cdc25A

wt. B. 24 ώρες μετά από την υπεριώδη ακτινοβολία, cdc25A

Q110del έδειξαν μεγαλύτερη σταθερότητα στην Η1299 και αντιστοιχούσαν με περισσότερο φωσφορυλίωση της DDR δείκτη Chk1-ser345. Γ Ομοεστιακή Μικροσκοπίας των κυττάρων 293F μετά από 24 ώρες επιμόλυνσης: cdc25A

Q110del έκφρασης έδειξαν συχνή μιτωτικής στοιχεία (μετάφαση «λεπτή βέλη»). Συν-έκφραση cdc25A

κβ και cdc25A

Q110del στο (1:01) αναλογία, μιτωτική δραστηριότητα εξακολουθεί να παρατηρήσει (κυτταροκίνηση, «τολμηρή βέλη»). Το ιστόγραμμα είναι αντιπροσωπευτική της αριθμό pixel για την FITC ανά συνθήκη και την ροδαμίνη. Δ pCDK1-Tyr15 αποφωσφορυλίωσης ως μεταγενέστεροι αναγνώστη για τη σχετική αυξημένη δραστηριότητα φωσφατάσης της cdc25A

Q110del σε σύγκριση με cdc25A

κβ μετά από 24 ώρες από την επιμόλυνση σε 293F κύτταρα.

Η

cdc25A

Q110delexpression σε NSCLC και η σύνδεσή της με κλινικές παραμέτρους

για να προσδιορίσει αν υπάρχει ένας πιθανός αντίκτυπος της cdc25A

έκφραση Q110del σε όγκους σε ασθενείς με ΜΜΚΠ, έχουμε ποσοτικά cdc25A

έκφραση Q110del στις πρωτογενείς όγκους και τους γειτονικά ζεύγη των ιστών του πνεύμονα από 88 ασθενείς με ΜΜΚΠ. Cdc25A

έκφραση Q110del κυμαίνονταν από μη ανιχνεύσιμα μέχρι κοντά στο 100% του συνόλου των μεταγραφημάτων cdc25A στους όγκους, με το 50% των όγκων που εκφράζουν cdc25A

Q110del υπερβαίνει το 20% μεταξύ των συνολικών μεταγραφές cdc25A. Είναι ενδιαφέρον, πολλοί από τους γειτονικούς κανονικούς ιστούς των πνευμόνων από τους ίδιους τους ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα εκφράζεται επίσης cdc25A

Q110del, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτό είναι ένα πρώιμο γεγονός στην καρκινογένεση του πνεύμονα.

Στη συνέχεια αναλύσαμε την συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης του cdc25A

Q110del στον ιστό του όγκου και κλινικές παθολογικές παραμέτρους. Εκτός από την οριακή συσχέτιση με αδενοκαρκίνωμα ιστολογίας (

P

= 0,068), καμία άλλη σχέση παρατηρήθηκε (Πίνακας S2 και S3). Συγκεκριμένα, δεν υπήρχε καμία συσχέτιση με το στάδιο, το φύλο ή το ιστορικό καπνίσματος. Ωστόσο, οι ασθενείς των οποίων οι όγκοι είχαν υψηλότερα cdc25A

επιπέδων έκφρασης Q110del έδειξε μια μη σημαντική τάση προς τις φτωχότερες συνολική επιβίωση (

P

= 0,074 με δοκιμή Log-rank) (Σχήμα 5Α?. Πίνακας S2). Είναι ενδιαφέρον, αν ληφθεί υπόψη cdc25A

Q110del έκφραση στα γειτονικά φυσιολογικούς ιστούς των πνευμόνων, παρατηρήσαμε ότι οι ασθενείς των οποίων οι όγκοι εκφράζονται σημαντικά υψηλότερο cdc25A

Q110del από ζεύγη παρακείμενων φυσιολογικών ιστών των πνευμόνων τους είχαν σημαντικά χειρότερη συνολική επιβίωση (

P

= 0,0018 με τη δοκιμασία Log-rank) (Σχήμα 5Β?. Πίνακας S4 και S5)

Α.. Καμπύλες επιβίωσης Kaplan Meier έδειξε cdc25A

Q110del στον ιστό του όγκου να συσχετίζονται με κακή συνολική επιβίωση των ασθενών με NSCLC (log rank

P

= 0,074). καμπύλες Β Kaplan Meier επιβίωσης έδειξαν ότι όταν cdc25A

βάρος είναι μεγαλύτερο σε όγκο σε σχέση με την κανονική ζευγάρι ιστού, που συσχετίζεται με την καλύτερη συνολική επιβίωση (log rank

P

= 0,0018). Σχετική ποσοτικοποίηση της γονιδιακής στόχος «cdc25A

wt» σε NSCLC ιστό όγκου σε σχέση με την κανονική ζεύγος ιστό των ασθενών με NSCLC σύμφωνα με τον τύπο: 2

-ΔΔct. Cdc25A πρότυπο του όγκου ή της κανονικής διεξήχθη εις τριπλούν των UNIPLEX αντίδρασης για κάθε ένα από τα

κβ και Ct

δοκιμασίες tot Ct, και η μέση τιμή υπολογίζεται για κάθε δοκιμασία.

Η

Συζήτηση

επίπεδο cdc25A ρυθμίζεται αυστηρά, έτσι ώστε εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και το σημείο ελέγχου μετάβαση διατηρείται σε φυσιολογικές συνθήκες [20], [26], [31] – [35]. Προηγουμένως, αναφέραμε ότι cdc25A είναι συχνά υπερεκφράζεται σε NSCLC στο επίπεδο της μεταγραφής [7]. Σε αυτή τη μελέτη, αναφέρουμε την ταυτοποίηση ενός νέου ισομορφής cdc25A, cdc25A

Q110del, προκύπτει από εναλλακτικό μάτισμα RNA. Βρήκαμε ότι cdc25A

Q110del εκφράστηκε στην πλειοψηφία των κυτταρικών γραμμών NSCLC καθώς και πρωτογενείς όγκους. Επιπλέον, η διαπίστωση ότι ιστολογικά φυσιολογικούς ιστούς που γειτνιάζουν με καρκίνο συχνά εκφράζεται cdc25A

Q110del σημαίνει ότι αυτό είναι ένα πρώιμο γεγονός και μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό βιολογική λειτουργία των πνευμόνων ογκογένεση.

cdc25A

Q110del στερείται γλουταμίνη στη θέση 110 που είναι δίπλα στο 2 διατηρημένες θέσεις φωσφορυλίωσης σερίνης στις θέσεις 116 και 124 (Εικ. 1). S116 μπορεί να φωσφορυλιωθεί από Cdk1 να σταθεροποιηθεί cdc25A στη μίτωση μέσω μιας θετικής ανάδρασης, ενώ S124 μπορεί να φωσφορυλιωθεί από Chk1, Chk2, και MAPKAPK-2 για την επιτάχυνση του κύκλου εργασιών cdc25A [11], [14], [27], [36] . Ιοντίζουσα ακτινοβολία μπορεί να προκαλέσει φωσφορυλίωση του S124 μέσω Chk1 και Chk2 κινασών [37], [38]. Σε ένα διαγονιδιακό ζωικό μοντέλο με S124 αντικαθίσταται με αλανίνη, cdc25A βρέθηκε βρίσκεται στο κεντροσωμάτια και ότι τα επίπεδα cdc25A δεν μειώθηκαν μετά την ιονίζουσα ακτινοβολία [39]. Σε αυτή τη μελέτη, παρατηρήσαμε ότι cdc25A

Q110del έχει παρατεταμένη ημιζωή της πρωτεΐνης από cdc25A

κ.β., ιδιαίτερα μετά UV ακτινοβολία, γεγονός που υποδηλώνει ότι cdc25A

έκφραση Q110del μπορεί να επηρεάσουν την κυτταρική απόκριση στην βλάβη που προκαλείται από ιονίζουσα ακτινοβολία . Σύμφωνα με αυτή την έννοια, βρήκαμε ότι τα κύτταρα που επιμολύνθηκαν με cdc25A

Q110del είναι ανθεκτικές στην επαγόμενη από UV κυτταρικό θάνατο από τα κύτταρα που επιμολύνθηκαν με τον έλεγχο-φορέα ή cdc25A

wt (Εικ. 3Ε), σύμφωνα με μια βαθύτερη ενεργοποίηση των Cdk1 (Εικ. 4D).

cdc25A φωσφατάση ρυθμίζεται κυρίως μέσω της υποβάθμισης της πρωτεΐνης [8], [21], [31]. Η φωσφορυλίωση συγκεκριμένων καταλοίπων σερίνης ή θρεονίνης από κινάσες πρωτεΐνης, κυρίως Chk1, ρ38 και GSK-3β, είναι αναγκαίες για ουβικιτίνη μεσολάβηση πρωτεόλυση του [22], [37], [40], ενώ φωσφορυλίωση σε S18 και S116 με CDK1 μπορεί να σταθεροποιήσει cdc25A [11]. Φωσφορυλίωση ρυθμίζει επίσης την κατάσχεση των cdc25A από 14-3-3 πρωτεΐνη [41]. Στη μελέτη μας, παρατηρήσαμε ότι cdc25A

Q110del πρωτεΐνη έχει ένα χαμηλότερο ποσοστό του κύκλου εργασιών, ακόμη και μετά την υπεριώδη ακτινοβολία (Εικ. 3Β και 4Β), και περισσότερα πυρηνικά συσσώρευσης. Δύο δυνατότητες μπορεί να εξηγήσει αυτές τις παρατηρήσεις. Κατ ‘αρχάς, η διαγραφή Q110 στο πολυπεπτίδιο μπορεί να παράγει σημαντικές δομικές αλλαγές στο άμεσο περιβάλλον ή /και των γειτονικών περιοχή, αλλάζοντας την συγγένεια σύνδεσης με κινάσες της, οδηγώντας σε χαμηλότερο ποσοστό του κύκλου εργασιών της cdc25A

Q110del. Δεύτερον, cdc25A

πρωτεΐνης Q110del μπορεί να έχει διαφορετική ικανότητα να shuttle μεταξύ κυτταροπλασματικών και πυρηνικών διαμερίσματα μέσω 14-3-3 πρωτεϊνών [42]. Η αλληλουχία αμινοξέων αμέσως προηγούμενη Q110, RRIHSLP, αποτελούν μια συναίνεση 14-3-3 θέση πρόσδεσης, (R) RxxSxP [43]. Δεδομένου ότι η δέσμευση του 14-3-3 στον στόχο του είναι φωσφορυλίωση εξαρτώμενη και επηρεάζεται από το πλαίσιο αλληλουχίας, αυτό εγείρει την ενδιαφέρουσα δυνατότητα ότι μια άγνωστη κινάση πρωτεΐνης μπορεί να φωσφορυλιώνει το site και να επηρεάσει την διακίνηση cdc25A. Αυτά τα ευρήματα έχουν δυνητική σημασία στο πλαίσιο της αντίστασης σε βλάβη του DNA σε κύτταρα με εκτοπικά εκφράζουν cdc25A

Q110del (Σχ. 3Ε). Θα χρειαστούν πρόσθετες έρευνα για να διαπιστωθεί αν όγκων με υψηλότερα cdc25A

Q110del είναι πιο ανθεκτικά σε παράγοντες βλάβης του DNA ή ακτινοθεραπεία και αν στοχεύουν cdc25A

Q110del θα ευαισθητοποιήσει αυτούς τους όγκους σε αυτές τις θεραπείες [44].

μια ενδιαφέρουσα παρατήρηση είναι η έκφραση της cdc25A

Q110del στους φυσιολογικούς ιστούς των πνευμόνων που εμφανίζονται δίπλα στο NSCLC, μερικές φορές με μεγάλη αφθονία, γεγονός που υποδηλώνει την ανωμαλία είναι ένα πρώιμο συμβάν κατά τη διάρκεια των πνευμόνων καρκινογένεση [44].