Αφηρημένο

Σπάζοντας την ισορροπία μεταξύ πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης σε κύτταρα ζώου μπορεί να οδηγήσει σε καρκίνο, αλλά οι μηχανισμοί διατήρησης Η ισορροπία αυτή παραμένουν σε μεγάλο βαθμό απροσδιόριστες. Το ενεργοποιημένο ασβέστιο κανάλι χλωριούχο Α1 (CLCA1) είναι ένα μέλος της χλωριούχου ασβεστίου ευαίσθητο αγωγιμότητα οικογένεια πρωτεϊνών και εκφράζεται κυρίως στο κόλον, το λεπτό έντερο και το προσάρτημα. Δείχνουμε ότι CLCA1 παίζει ένα λειτουργικό ρόλο στην διαφοροποίηση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Caco-2 και του εντερικού ιστού. κύτταρα Caco-2 διαφοροποιούνται αυθόρμητα είτε σε καλλιέργεια συρρέουσα ή όταν υποβάλλεται σε επεξεργασία με βουτυρικό, ένα μόριο υπάρχουν εκ φύσεως στη διατροφή. Εδώ, συγκρίναμε CLCA1 εκφραστική επίπεδα μεταξύ ασθενών με και χωρίς καρκίνο του παχέως εντέρου (CRC) και προσδιορίζεται ο λειτουργικός ρόλος του CLCA1 στη διαφοροποίηση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Caco-2. Δείξαμε ότι: 1) CLCA1 και CLCA4 έκφρασης κάτω-ρυθμίζονται σημαντικά σε ασθενείς CRC? 2) έκφραση CLCA1 ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω σε κύτταρα Caco-2 επάγεται προς διαφοροποίηση με συρρέουσα καλλιέργεια ή με κατεργασία με βουτυρικό νάτριο (NaBT)? 3) εξόντωση CLCA1 με siRNA αναστέλλει σημαντικά την διαφοροποίηση των κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων που προωθούνται σε καλλιέργειες Caco-2 συρρέουσες, και 4) Caco-2 3D καλλιέργεια, η καταστολή της CLCA1 αυξήθηκε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και σε κίνδυνο NaBT επαγόμενη αναστολή του πολλαπλασιασμού. Συμπερασματικά, CLCA1 μπορεί να συμβάλει στην προώθηση της αυθόρμητης διαφοροποίησης και ελάττωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων Caco-2 και μπορεί να είναι ένας στόχος της NaBT επαγόμενη αναστολή του πολλαπλασιασμού και, συνεπώς, ένας δυνητικός διαγνωστικός δείκτης για CRC πρόγνωση

Παράθεση:. Yang Β Ο Cao L, Liu Β, McCaig CD, Pu J (2013) Η μετάβαση από την διάδοση των πυρηνικών όπλων σε διαφοροποίηση στον Καρκίνο του παχέος εντέρου ρυθμίζεται από το ασβέστιο ενεργοποιημένο χλωριούχο Κανάλι Α1. PLoS ONE 8 (4): e60861. doi: 10.1371 /journal.pone.0060861

Επιμέλεια: Hiromu Suzuki, Σαπόρο Ιατρικό Πανεπιστήμιο, την Ιαπωνία

Ελήφθη: 14η Δεκεμβρίου του 2012? Αποδεκτές: 3 Μαρτίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 12η Απριλίου, 2013

Copyright: © 2013 Yang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από NHS Κληροδότημα (12/50) με LC, JP και CDM, και οι Φίλοι της άγκυρας προς την JP και CDM. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Στο έντερο των θηλαστικών τα εντερικά κύτταρα ανανεώνονται συνεχώς κάθε 4-8 ημέρες. Αυτό συμβαίνει μέσω μιας συντονισμένης σειράς γεγονότων που αφορούν τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση, τη μετανάστευση και από τον εντερικό κρύπτες προς τα πάνω προς τον αυλό [1]. Διατάραξη της ισορροπίας μεταξύ διαίρεση και διαφοροποίηση των κυττάρων μπορεί να οδηγήσει σε καταστάσεις ασθένειας όπως ο καρκίνος [2]. Αλλοιώσεις του σφιχτά ρυθμιζόμενη ισορροπία μεταξύ των ιδιαίτερα πολλαπλασιαστικών /λιγότερο διαφοροποιημένες εντεροκύτταρα και τη μη-πολλαπλασιαστικά /υψηλά διαφοροποιημένη κατάσταση μπορεί να οδηγήσει σε υπερπλασία, καλοήθη (πολύποδες) ή κακοήθεις όγκους [3]. Το μονοπάτι σηματοδότησης Wnt είναι ο κύριος μηχανισμός που ελέγχει τον πολλαπλασιασμό των εντεροκυττάρων στα εντερικά κρύπτες [4].

Κανάλια

Ion συμβάλλουν σε όγκους με τη ρύθμιση των βασικών κυτταρικών διεργασιών πολλαπλασιασμού, διαφοροποίησης και απόπτωσης [5]. Για παράδειγμα, KCNK9 (υποοικογένεια διαύλου καλίου K μέλος 9) υπερεκφράζεται και συμβάλλει στην ογκογένεση, με την προώθηση της κυτταρικής επιβίωσης του καρκίνου στον καρκίνο του μαστού [6]. GIRK1 (G-πρωτεΐνη εσωτερικής ανόρθωσης διαύλου καλίου 1) έκφραση αυξήθηκε σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα 50/72 μη-μικρών κυττάρων και η παρουσία αυτού του mRNA συσχετίστηκε με σημαντικά μειωμένα ποσοστά πενταετούς επιβίωσης [7]. Επιπλέον, η πρωτεΐνη κανάλι TRPM8 (Transient δυναμικό υποδοχέα υποοικογένεια κανάλι κατιόν Μ μέλος 8) ένας προστάτη-ειδικός δείκτης ήταν ρυθμισμένη σε καρκινικό ιστό [8]. Οι μελέτες που περιγράφουν την εμφάνιση των επιμέρους διαύλων ιόντων σε κύτταρα όγκου και λειτουργικές συνέπειες τους σχετικά με την ανάπτυξη, τη μετανάστευση, ή εισβολή αυξάνοντας [9].

Στο κόλον, τα κανάλια χλωρίδιο (CLCS) σχηματίζουν ένα μεγάλο λειτουργικό οικογένεια με δομικά ποικίλα μέλη που παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση των επιθηλιακών και μεταφορά υγρού ηλεκτρολύτη [10]. Η ενεργοποίηση του ρεύματος χλωριδίου μέσω εξειδικευμένων όγκος ρυθμίζεται κανάλια ανιόν (VRACs) σε απόκριση προς τη διόγκωση των κυττάρων (I

Cl, διογκώνονται) είναι ένας από τους κύριους μηχανισμούς με τους οποίους τα κύτταρα αποκατασταθεί ο όγκος τους ακόλουθους υπο-ωσμωτική πίεση (RVD) [ ,,,0],11]. Αυτό είναι σημαντικό, δεδομένου ότι υπάρχει μια άμεση σχέση μεταξύ αποπτωτικών αντίσταση που παρέχεται από αντιαποπτωτικού πρωτεΐνης Bcl-2 και την ενίσχυση της ικανότητας RVD λόγω up-ρύθμιση του I

Cl, πρήζονται [12]. Επιπλέον, το κανάλι Χλωριούχο 3 (CLC3) πρωτεΐνη είναι μεταξύ των ειδικό προστατικό VRACs και είναι up-ρυθμίζεται με ανδρογόνο καρκίνου του προστάτη ανεξάρτητη κύτταρα [13]. Ασβέστιο-ενεργοποιημένα κανάλια χλωρίδιο (CLCAs) επίσης εκφράζονται σε βοοειδών [14], το ποντίκι [15] και την ανθρώπινη [16] εντεροκύτταρα και υπάρχει μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων του χλωριούχου διαύλου (CLCA1 και CLCA2) έκφραση και ογκογονικότητα, υποδεικνύοντας ότι δρουν ως καταστολείς του μαστού και του παχέος εντέρου [17], [18], [19]. Ωστόσο, η λεπτομερής βιολογική λειτουργία του CLCAs μένει να καθοριστεί. Συνεπώς, διερευνήσαμε αν CLCA1 συμβάλλει στην ογκογένεση με τη ρύθμιση της ισορροπίας μεταξύ πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης σε εντεροκύτταρα.

Η ανθρώπινη εντερική κυτταρική σειρά καρκίνου Caco-2 είναι ένα καθιερωμένο σύστημα μοντέλο για τη μελέτη κυτταρική διαφοροποίηση των ανθρώπινων εντεροκυττάρων αφού διαφοροποιεί αυθόρμητα σε πολωμένα κύτταρα με μορφολογικές και βιοχημικές λειτουργίες του λεπτού εντέρου εντεροκύτταρα [20]. Επιπροσθέτως, τα κύτταρα Caco-2 διαφοροποιούνται επίσης όταν εκτίθενται στον φυσιολογικώς σχετικό λιπαρό οξύ μικρής αλυσίδας, βουτυρικό [19]. Οι σύντομες αλυσίδας λιπαρά οξέα (SCFA), κυρίως βουτυρικό, προπιονικό και οξικό, που παράγονται στο έντερο μέσω της ζύμωσης των διαιτητικών ινών από την κολονική μικροχλωρίδα [21]. Βουτυρικό, ειδικότερα, είναι η προτιμώμενη πηγή ενέργειας για τα κύτταρα του βλεννογόνου του παχέως εντέρου και ασκεί διάφορες βιολογικές επιδράσεις σε καλλιεργημένα κύτταρα θηλαστικών, συμπεριλαμβανομένων της αναστολής του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, την απόπτωση και την επαγωγή της διαφοροποίησης [22], [23]. Εξαιτίας αυτού, το θεραπευτικό δυναμικό του στο καρκίνο του παχέος εντέρου έχει προταθεί [23]. κύτταρα Caco-2, όταν αναπτύσσονται ως μονοστοιβάδα συρρέουσα ή εκτεθεί σε βουτυρικό νάτριο (NaBT) κατεργασία, διαφοροποιούνται για να μιμηθούν φαινοτυπικά και λειτουργικά ώριμα κολονικό επιθήλιο και είναι ένα χρήσιμο μοντέλο για τη διερεύνηση των μοριακών μηχανισμών της διαφοροποίησης σε CRC. Εδώ, έχουμε αποδείξει ότι CLCA1 (Calcium-ενεργοποιημένου χλωριούχου κανάλι μέλος της οικογένειας 1) παίζει ένα λειτουργικό ρόλο στην ρύθμιση της διαφοροποίησης και του πολλαπλασιασμού των κυττάρων Caco-2.

Αποτελέσματα

κάτω ρύθμιση του CLCA1 η έκφραση σε καρκίνο του παχέος (CRC) ασθενείς

Αρχικά, ερευνήσαμε το επίπεδο έκφρασης σε ανθρώπους των διόδων χλωρίου στην φυσιολογικών και καρκινικών ιστών χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων των μικροσυστοιχιών του NCBI (http: //www.ncbi.nlm.nih. gov /geo /). Τα επίπεδα έκφρασης του ΟΙ_ΟΝ2, CLCN3, CLCA1, CLCA4 και CFTR στις αρχές του ασθενούς CRC είχαν μειωθεί σημαντικά κατά 31%, 59%, 74%, 41% και 58% αντίστοιχα σε σχέση με την κανονική βλεννογόνο του κόλου (Σχ. 1Α). Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η προς τα κάτω ρύθμιση CLCA1 σε ασθενείς CRC, χρησιμοποιήσαμε χρώση ανοσοφθορισμού για την ανίχνευση της έκφρασης CLCA1 τόσο CRC και φυσιολογική εντερική ιστούς και βρήκε την έκφραση του CLCA1 μειωθεί σημαντικά σε CRC εντερικούς ιστούς (Εικ. 1Β). Ένα από τα χαρακτηριστικά γνωρίσματα σε ογκογένεση είναι η υψηλή πολλαπλασιασμός /χαμηλό ποσοστό διαφοροποίηση των κυττάρων. Ίσως CLCA1 συμβάλλει στην ογκογένεση με τη ρύθμιση της ισορροπίας μεταξύ πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης σε εντεροκύτταρα.

A. Κανονικοποιημένες τιμές των πρώτων έκφραση του χλωριούχου μέλη της οικογένειας του καναλιού αναλύθηκαν σε ανθρώπινο κολικό βλεννογόνο και στις αρχές ιστούς CRC από την έκφραση γονιδίων Omnibus (σειρά αναφοράς είναι GSE4017). CLCA1, CLCA4, ΟΙ_ΟΝ2, CLCN3 και CFTR ήταν κάτω-ρυθμίζονται σημαντικά στις αρχές ασθενείς CRC. Οι τιμές είναι μέση τιμή ± s.e.m, *

σ

& lt? 0,01. B. Ανάλυση ανοσοφθορισμού έδειξε ότι η έκφραση του CLCA1 μειώθηκε σε ιστούς CRC σε αντίθεση με την κανονική βλεννογόνο του κόλου. Bar = 50 μm.

Η

Up-ρύθμιση των CLCA1 Induced από βουτυρικό νάτριο σε Caco-2 κύτταρα

Μια προ-διαφοροποίηση επίδραση του βουτυρικού νατρίου (NaBT) έχει μελετηθεί εκτενώς σε διάφορες κακοήθεις κυτταρικές γραμμές [24], [25]. Αναλύσαμε Ca

2 + -εξαρτώμενη πρότυπα έκφρασης χλωριούχου διαύλου σε κύτταρα Caco-2 χρησιμοποιώντας ποσοτικό προσδιορισμό RT-PCR (qPCR). Βρήκαμε ότι τα επίπεδα έκφρασης του CLCA1 και CLCA3 έγιναν αυξητικά 35 φορές και πάνω από 100 φορές, αντίστοιχα μετά από 2 θεραπεία mM NaBT για 24 ώρες (Σχ. 2Α). Κηλίδες Western επιπλέον έδειξε ότι η αύξηση της πρωτεΐνης CLCA1 ήταν εξαρτώμενη από το χρόνο. Όταν τα κύτταρα Caco-2 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με NaBT για 24 ώρες, η έκφραση CLCA1 ρυθμίζεται αυξητικά σημαντικά σε σύγκριση με την μη ομάδα θεραπείας (Εικ. 2Β). Ωστόσο, δεν υπήρχε μικρή ή καθόλου έκφραση του CLCA1 ακόλουθη συντομότερη έκθεση (8 και 12 ωρών θεραπείες, Σχ. 2Β). Έκφραση CLCA1 σε μονοστιβάδες που δεν αντιμετωπίζονται με NaBT εμφανίζεται επίσης μία σημαντική αύξηση στις 24 ώρες (σε σύγκριση με 8 και 12 ωρών καλλιέργειες) λόγω της αυθόρμητης διαφοροποίησης των κυττάρων Caco-2 σε συρρέουσες καλλιέργειες (Εικ. 2Β). NaBT αυξημένα επίσης την έκφραση της εντερικής αλκαλικής φωσφατάσης (ALPI) και β-κατενίνης σε κύτταρα Caco-2 (Σχ. 2C). Και οι δύο είναι δείκτες διαφοροποίησης εντεροκυττάρων και αυξορυθμίζονται στα διαφοροποιημένα κύτταρα. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι CLCA1 μπορεί να προκαλεί τη διαφοροποίηση των κυττάρων που προκαλείται από τον πολιτισμό συρροή και από NaBT σε κύτταρα Caco-2.

Α. Η έκφραση του mRNA του CLCA1, Α2, Α3 και Α4 μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ποσοτική RT-PCR. CLCA1 και CLCA3 ρυθμίστηκαν προς τα πάνω αντίστοιχα σε κύτταρα Caco-2 μετά από θεραπεία με 2 mM NaBT για 24 ώρες. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± s.e.m από τρία ανεξάρτητα πειράματα, *

ρ

& lt? 0,01. Β Caco-2 μονοστρωματική καλλιεργήθηκε για διαφορετικές χρονικές περιόδους με /χωρίς 2 θεραπεία mM NaBT. Έκφραση των CLCA1 ανιχνεύθηκε με κηλίδα western. Σε 8 και 12 ωρών συρρέουσα καλλιέργεια, ούτε έλεγχο ούτε NaBT αύξησε την έκφραση της CLCA1. Όταν Caco-2 μονοστοιβάδες καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες, και οι δύο τον έλεγχο και NaBT έκφραση CLCA1 επάνω ρυθμισμένη, αλλά NaBT ενισχυμένη CLCA1 έκφραση πολύ περισσότερο από ό, τι παρατηρήθηκε σε ελέγχους. Γ NaBT αυξημένα ALPI και έκφραση β-κατενίνης (δείκτες διαφοροποίησης) σε συρρέουσες καλλιέργειες κυττάρων Caco-2. Τα ιστογράμματα στο Β και Γ δείχνουν την σχετική ένταση του CLCA1 90 KD, ALPI και β-κατενίνης εκφράζεται ως αναλογία σε σχέση με τον έλεγχο GAPDH. Όλα τα αποτελέσματα ήταν από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

CLCA1 απορυθμίζεται σε πρώιμο στάδιο, κατά τη διάρκεια της αυθόρμητης διαφοροποίησης των Caco-2 κύτταρα σε συρρέουσες Πολιτισμού

Πολιτισμός στην συμβολή προκαλεί την αυθόρμητη διαφοροποίηση των Caco -2 κύτταρα [19], [24], [25], [26]. Χρησιμοποιώντας αυτό το μοντέλο, αναρωτηθήκαμε εάν CLCA1 συνέβαλε στην διαφοροποίηση των κυττάρων Caco-2. Πρώτον, ανιχνεύσαμε την έκφραση της CLCA1 και οι δύο δείκτες διαφοροποίησης ALPI και σακχαράσης-ισομαλτάσης (SI) σε καλλιέργεια συρροή. Βρήκαμε ότι η έκφραση του CLCA1 (συμπεριλαμβανομένων των δύο διαφορετικών κυτταρική επιφάνεια που σχετίζεται με υπομονάδες 38 KD και 90 KD [16]) ανιχνεύθηκε σε πολύ χαμηλά επίπεδα κατά την έναρξη της καλλιέργειας. Ωστόσο, όπως οι καλλιέργειες έγιναν συρρέουσες, έκφραση CLCA1 άρχισε να αυξάνεται σε έναν χρόνο εξαρτώμενο τρόπο. Αυτή η αύξηση στην έκφραση ήταν εμφανής μέσα σε 1 ημέρα (σχ. 3Α, 3Β). Έκφραση των ALPI και SI έδειξε επίσης μια σημαντική στιγμή εξαρτάται από τη ρύθμιση, αλλά αυτό δεν συμβεί μέχρι την ημέρα 4, το αργότερο μέχρι την έκφραση CLCA1 (Σχ. 3C, 3D). Επιπλέον, ανιχνεύσαμε επίσης την έκφραση της β-κατενίνης σε διαφορετικές ημέρες από Caco-2 κυτταρική καλλιέργεια συρροή. Βρήκαμε ότι η β-κατενίνη αυξήθηκε ελαφρώς σε Caco-2 συρρέουσα μονοστιβάδα (Σχ. 3Ε). Υποκυτταρική μελέτες κλασματοποίηση έδειξαν ότι η αύξηση του β-κατενίνης οφειλόταν στην αύξηση στο κλάσμα μεμβράνης του β-κατενίνης, ενώ κυτοσολική επίπεδα παρέμεινε αμετάβλητη (Εικ. 4Β) [27]. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η έκφραση του CLCA1 μπορεί να συμβάλει στην αυθόρμητη διαφοροποίηση των κυττάρων Caco-2.

Α και Β Έκφραση των υπομονάδων CLCA1 (38 KD και 90 KD) ήσαν πάνω ρυθμισμένα μετά από 24 ώρες σε συρροή πολιτισμό και κορυφώθηκε σε 10 ημέρες καλλιέργειας. Γ ALPI ως ένας δείκτης της διαφοροποίησης των κυττάρων Caco-2 ρυθμίζεται προς τα πάνω σημαντικά μετά από 4 ημέρες καλλιέργειας συρροή. Δ Έκφραση της σακχαράσης-ισομαλτάσης (SI), ένα άλλο δείκτη της κυτταρικής διαφοροποίησης, επίσης αυξήθηκε σημαντικά μετά από 4 ημέρες καλλιέργειας συρροή. Ε Έκφραση β-κατενίνης ενισχύθηκε ελαφρώς την πάροδο του χρόνου σε καλλιέργεια. Τα ιστογράμματα στο Α έως Ε δείχνουν την σχετική ένταση του CLCA1, ALPI, SI και β-κατενίνης εκφράζεται ως αναλογία σε σχέση με τον έλεγχο GAPDH. Όλα τα αποτελέσματα αναλύθηκαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Α. Caco-2 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με 0, 50, 100, 150 και 200 ​​ηΜ siRNA

clca1 και στυπώθηκε για CLCA1. siRNA

clca1 στα 100 nm ή άνω αποτελεσματικά ανέστειλε CLCA1 και μειωτικά την έκφραση της ALPI και β-κατενίνης. χρώση ανοσοφθορισμού Β έδειξαν την έκφραση του β-κατενίνης σε συρρέουσες καλλιέργειες κυττάρων Caco-2. β-κατενίνης βρισκόταν κυρίως στον πυρήνα των κυττάρων σε πρώιμα στάδια της καλλιέργειας (2 ημέρες). Μετά από 10 ημέρες καλλιέργειας, β-κατενίνης είχε μετατοπίζεται στην κυτταρική μεμβράνη. Εξόντωση CLCA1 μειωμένη διανομή του β-κατενίνης επί της μεμβράνης. C. κύτταρα Caco-2 υπέστησαν αγωγή είτε με siRNA αρνητικού ελέγχου ή siRNA

clca1 και στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν για 72 ώρες. Τα κυτταρολύματα συλλέχθηκαν για την ανίχνευση της δραστικότητας ALP χρησιμοποιώντας το κιτ ανίχνευσης αλκαλική φωσφατάση ή για ALP έκφραση με κηλίδα western. Το αποτέλεσμα δείχνει ότι τόσο η ALP δραστικότητα και έκφραση μειώθηκαν σημαντικά σε CLCA1 knockdown κυττάρων. Τα ιστογράμματα στο Α έδειξε την σχετική ένταση του CLCA1 38 KD, 90 Κϋ, ALPI και β-κατενίνης εκφράζεται ως αναλογία σε σχέση με τον έλεγχο GAPDH. Όλα τα αποτελέσματα ήταν από τρία ανεξάρτητα πειράματα. **

σ

& lt?. 0.01

Η

CLCA1 απαιτείται για αυθόρμητη διαφοροποίηση των Caco-2 κύτταρα

Για τον προσδιορισμό του λειτουργικού ρόλου της CLCA1 σε Caco-2 διαφοροποίηση των κυττάρων, χρησιμοποιήσαμε ένα stealth μικρής παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA

clca1) να knock-down της έκφρασης της CLCA1 σε κύτταρα Caco-2. Μετά από 72 ώρες διαμόλυνσης, τα κύτταρα ελέγχθηκαν ως προς την έκφραση του CLCA1, ALPI και β-κατενίνης με κηλίδα western (Σχ. 4Α). Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι CLCA1 έκφραση ρυθμίζεται προς τα κάτω σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε απόκριση σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις επιμόλυνση siRNA

clca1. Για να αποφευχθεί η εκτός στόχου επιδράσεις με υψηλότερη συγκέντρωση του siRNA, επιλέξαμε 100 ηΜ siRNA

clca1 ως βέλτιστη συγκέντρωση για τα επόμενα πειράματα.

ALPI και έκφραση β-κατενίνης είχαν μειωθεί σημαντικά κατά CLCA1 knockdown. Επιπλέον, συνεστιακή απεικόνιση έδειξε μία μειωμένη κηλίδωση κυτταρική μεμβράνη των β-κατενίνης σε siRNA

clca1 knockdown κυττάρων (Εικ. 4Β). Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η προ-διαφοροποίηση ρόλο των CLCA1 σε κύτταρα Caco-2, ανιχνεύσαμε ALP δραστικότητα χρησιμοποιώντας ένα κιτ ανίχνευσης κυτταρική διαφοροποίηση σε κύτταρα Caco-2. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι δραστικότητα ALP αναστάλθηκε σημαντικά σε CLCA1 knockdown κυττάρων (Εικ. 4C). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η CLCA1 διαδραματίζει καίριο ρόλο στη ρύθμιση της αυθόρμητης διαφοροποίησης των κυττάρων Caco-2.

CLCA1 Παίζει αντι-πολλαπλασιαστική Ρόλος στο Caco-2 κύτταρα

Η αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του NaBT έχει μελετηθεί εκτενώς σε διάφορες κακοήθεις κυτταρικές γραμμές [25]. Για να επαληθευθεί αν CLCA1 παρουσίασε μια αντι-πολλαπλασιαστική δράση σε κύτταρα Caco-2, καλλιεργήσαμε κύτταρα σε 3D Matrigel για 5 ημέρες για να σχηματίσουν αποικίες. Βρήκαμε ότι το μέσο μέγεθος αποικίας σε κύτταρα Caco-2 CLCA1KD αυξήθηκε σημαντικά σε σύγκριση με κύτταρα άγριου τύπου (ρ & lt? 0,01, n = 50 το καθένα). Όταν κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 2 mM NaBT, το μέγεθος της αποικίας αναστάλθηκε σημαντικά σε κύτταρα Caco-2, αλλά σε CLCA1KD κύτταρα με θεραπεία του NaBT το μέγεθος της αποικίας δεν μειώθηκε σημαντικά (

σ

& gt? 0,05, η = 50 το καθένα) (Εικ. 5Α). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αντιπολλαπλασιαστική επίδραση των NaBT μπορούσε να διαμεσολαβείται από CLCA1. Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η επίδραση της CLCA1 στον πολλαπλασιασμό, εκτιμήσαμε αυτό μέσω ethynyldeoxyuridine (EDU) η ενσωμάτωση σε κύτταρα Caco-2. Βρήκαμε ότι ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων Caco-2 μειώθηκε σε 3 ημέρες συρρέουσες καλλιέργειες. Ωστόσο, πολλαπλασιασμό κυττάρων Caco-2 προήχθη σημαντικά σε siRNA

κύτταρα επεξεργασμένα clca1 σε σύγκριση με ένα siRNA κύτταρα αρνητικού ελέγχου (

ρ

& lt? 0,01, η = 100 έκαστο) (Σχήμα 5Β).. Μαζί με την καλλιέργεια 3D, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η έκφραση του CLCA1 συμβάλλει στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού σε κύτταρα Caco-2.

A. Caco-2 κυττάρων είτε θεραπεύονται με siRNA αρνητικού ελέγχου, ή με CLCA1 siRNA μόνο, ή με προσθήκη NaBT σπάρθηκαν σε 25% Matrigel και διατηρήθηκαν σε 5% CO

2 και 37 ° C για 5 ημέρες. Η διάμετρος των κύστεων μετρήθηκε και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Metamoph. Το μέσο μέγεθος των αποικιών σε Caco 2-CLCA1 νοκ ντάουν κυττάρων αυξήθηκε σημαντικά σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. NaBT ανέστειλε σημαντικά το μέγεθος της αποικίας, αλλά knockdown του CLCA1 παραβιαστεί NaBT επαγόμενη μείωση του μεγέθους της αποικίας. Μεγέθυνση στόχος είναι 10 ×. 50 κύστεις μετρήθηκαν σε κάθε ομάδα σε ένα πείραμα. Β κύτταρα Caco-2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με αρνητικό μάρτυρα ή CLCA1 siRNA και καλλιεργούνται για τις ημέρες που αναφέρονται. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων ανιχνεύθηκε με δοκιμασία ενσωμάτωσης edu. Edu οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Alexa Fluor 594 (Κόκκινο) και ΟΝΑ για DAPI (μπλε). Το ιστόγραμμα παρουσιάζει την ΕΠΑ θετικά% των κυττάρων σε διαφορετικές ομάδες και δείχνει ότι knockdown του CLCA1 αύξησε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων.

Οι P

τιμές που εμφανίζονται στο ιστόγραμμα. N = 100 σε κάθε ομάδα σε ένα πείραμα. Κλίμακα ράβδου = 100 μm σε Α, 50 μm σε Β Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση ± SEM από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Συζήτηση

Ο πολλαπλασιασμός με τη μετάβαση διαφοροποίησης (PDT ) είναι ένα κρίσιμο βήμα στην συνεχή ανανέωση ενός φυσιολογικού εντερικού επιθηλίου [1] και τα επιθηλιακά κύτταρα του παχέος εντέρου είναι από τα καλύτερα μελετημένα μοντέλα της ογκογένεσης από την συνεχή ανανέωσή τους απαιτεί στενή ρύθμιση της PDT [3], [28]. Πολλές γενετικές αλλοιώσεις, συμπεριλαμβανομένων μετάλλαξη APC και ρ53, παράγουν νεοπλαστικό μετασχηματισμό του εντεροκυττάρων παχέος εντέρου. Επιπλέον, κατά την οργανογένεση, τα βλαστικά κύτταρα να εκτελέσει την αποσιώπηση γονιδίων πολλαπλασιασμό και την ενεργοποίηση των γονιδίων διαφοροποίησης σε μια σταδιακή χρονική τρόπο. Σημαντικές πληροφορίες σχετικά με τα μόρια που μπορούν να χρησιμεύσουν ως στόχοι για θεραπεία θα έχει αποκτηθεί από την πλήρη κατανόηση των μοριακών μηχανισμών αυτών των διεργασιών. Εδώ, βρήκαμε ότι το ενεργοποιημένο ασβέστιο CLCA1 κανάλι χλωριούχο διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση και τη συντήρηση των PDT στην εντεροκυττάρων του παχέος εντέρου, δεδομένου ότι η απώλεια της CLCA1 οδήγησε στην επαναφορά των κυττάρων σε μια οικονομία χαμηλών διαφοροποιημένη κατάσταση.

CLCA1 ρυθμίζει την PDT σε εντερικά επιθηλιακά κύτταρα

Η PDT του ενιαίου προγονικών κυττάρων ρυθμίζεται στενά από μορφογόνα, αυξητικούς παράγοντες και ορμόνες [29] και μοριακές αλλαγές σε συγκεκριμένα συστατικά των οδών σηματοδότησης που χρησιμοποιούνται από αυτές τις διαφορετικές κατηγορίες μορίου είναι σημαντικό κατά τη διάρκεια η ανάπτυξη του καρκίνου [30]. Αυτών των αλλαγών, προς τα πάνω ρύθμιση των αναστολέων CDK (ΟΚΙ) p21

Cip1 /WAF1 και p27

Kip1 σε πολλά τερματικά διαφοροποίηση των κυττάρων [31], σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης επαγωγή διαφοροποίησης των κυττάρων των μυών [32], SOX9-εξαρτώμενη ΡΚΟα καταστολή που ευνοεί τον πολλαπλασιασμό και την αναστολή της διαφοροποίησης [33] έχουν αναφερθεί. προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι CLC-2, CLC-4 (κανάλι χλωριούχο 2 και 4) και CFTR (διαμεμβρανικού ρυθμιστή κυστικής ίνωσης, ένα κανάλι χλωριούχο) εκφράστηκαν σε σημαντικά υψηλότερο επίπεδο σε προσφάτως απομονωμένους ιστούς κερατοειδούς ανθρώπου σε σχέση με καλλιεργημένα επιθηλιακά κύτταρα ( πρωτογενής καλλιέργεια ή κυτταρική γραμμή) [34]. Καθώς ο αριθμός των κυτταρικών στοιβάδων αυξάνει, το επίπεδο έκφρασης του γονιδίου και της πρωτεΐνης ένταση χρώσης του CLCA2 (χλωριούχο μέλος διαύλου ασβεστίου-ενεργοποιημένη 2) αυξήθηκε σημαντικά [35]. Αυτό δείχνει ότι οι CLCS (κανάλια Chloride) μπορεί να συμβάλλει στη ρύθμιση της διαφοροποίησης όσον αφορά την ανάπτυξη των επιθηλιακών ιστών. Επιπλέον, η δραστηριότητα των Cl

– κανάλια ποικίλλει ανάλογα με τον κυτταρικό κύκλο και την απώλεια των διαύλων χλωριούχο ασβέστιο ενεργοποιούμενη θα δώσει ένα σημαντικό πλεονέκτημα ανάπτυξης σε κύτταρα όγκου [14], [15], [35], [36], [37]. Στο CRC, CLCA1 και CLCA2 ήταν μειωτικά σημαντικά σε περίπου 80% των ασθενών [19]. Η απώλεια της έκφρασης και των δύο mCLCA1 και mCLCA2 κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης πρότεινε ότι η ισχυρή ενεργοποίηση είτε θα μπορούσαν να αναστείλουν την επιβίωση των κυττάρων όγκου [16]. CLCA2 απαιτείται για επιθηλιακή διαφοροποίηση και η απώλεια της κατά τη διάρκεια της προόδου του όγκου συμβάλλει στην μετάσταση [38]. κύτταρα πολλαπλασιαζόμενα Caco-2 κινήσει αυθόρμητα τη διαδικασία διαφοροποίησης όταν τα κύτταρα έχουν φθάσει σε συρροή. Αυτή η κυτταρική διαφοροποίηση πρόγραμμα ξεκινά με την επαφή κυττάρου-κυττάρου και η μετάβαση από τον πολλαπλασιασμό σε διαφοροποίηση μπορεί να προκληθεί από ειδικές βιοχημικά γεγονότα συμπεριλαμβανομένων μεσολάβηση της Ε-καδερίνης προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου [20]. κανάλια Chloride είναι πρωτεΐνη μεμβράνης και μπορεί να παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην επικοινωνία κυττάρου-κυττάρου μετά προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου. Συλλογικά, αυτό συνεπάγεται ότι οι CLCAs μπορεί να παίζει ένα λειτουργικό ρόλο στην ογκογένεση μέσω του ελέγχου του πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης ισορροπία.

Ο πρόδρομος CLCA1 είναι περίπου 900 αμινοξέα σε μήκος με μία θέση αποκοπής πρωτεολυτικής μετά την αμινο-τερματική αλληλουχία σήμα. Τελικά, δύο προϊόντα ενός 90-kDa και 30-40-kDa παίζουν λειτουργικό ρόλο [15], [16], [36], [37]. CLCA1 συσχετίζεται στενά με τη μεταγραφή του c-

myc,

ένα πρωτο-ογκογονίδιο του οποίου το προϊόν είναι στενά εμπλέκεται στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και απόπτωσης [39]. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχιών ότι η έκφραση του CLC2, CLC3, CLCA1, CLCA4 και CFTR ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω σημαντικά σε πρώιμο ασθενείς CRC και αυτό μείωσε την έκφραση του CLCA1 επιβεβαιώθηκε με χρώση ανοσοφθορισμού των ιστών από ασθενείς CRC (Σχ. 1 ). Επιπλέον,

in vitro

δείξαμε ότι CLCA1 συμμετείχε στη ρύθμιση της διαφοροποίησης και του πολλαπλασιασμού των κυττάρων Caco-2. Όταν CLCA1 σε κύτταρα Caco-2 ανεστάλη με siRNA

clca1, τόσο NaBT επαγόμενη και αυθόρμητη διαφοροποίηση μειώθηκε σημαντικά (Εικ. 4), ενώ ο πολλαπλασιασμός αυξήθηκε σημαντικά (Εικ. 5). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η ενεργοποίηση του CLCA1 μπορεί να είναι κρίσιμη για τη διατήρηση της ισορροπίας μεταξύ πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης των εντεροκυττάρων.

Επιπλέον, η υψηλή εξειδίκευση ιστού της μεταγραφής ορισμένων CLCS [40], η οποία αρχικά πρότεινε ότι η ανίχνευση του mRNA τους σε συγκεκριμένους ιστούς μπορεί να είναι χρήσιμη για την έγκαιρη διάγνωση, μοριακή σταδιοποίηση και μετεγχειρητική επιτήρησης [19]. Σημαντικά, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι οι ακατάλληλες μεταγραφή κανάλια χλωριούχου περιλαμβάνονται όχι μόνο CLCA1, αλλά και CLC2, CLC3, CLCA4 και CFTR, υποδεικνύοντας ότι τα ελαττώματα της μεταφοράς χλωριδίου ή της τρέχουσας χλωριούχου μπορεί να παίξει καθοριστικό ρόλο στην CRC. Η ενεργοποίηση της τρέχουσας χλωριούχο μέσω εξειδικευμένων όγκος ρυθμίζεται κανάλια ανιόν (VRACs) είναι ένας από τους κύριους μηχανισμούς με τους οποίους τα κύτταρα αποκατασταθεί ο όγκος τους ακόλουθους υπο-ωσμωτική πίεση (RVD) [11], ενώ η μεταφορά διεπιθηλιακής χλωριούχου συμβάλλει επίσης στην διεπιθηλιακό δυναμικό διαφορά (TEP) στο έντερο [41]. Η ΤΕΡ είναι μια εγγενής ιδιότητα της μεταφοράς επιθήλια και προκύπτει από κλίσεις ιόντων που μεταφέρονται κατευθυνόμενης σε όλη επιθηλιακά στρώματα των κυττάρων. Απέναντι ανθρώπινο έντερο, υπάρχει ένα ΤΕΡ από -25 ± 7 mV, αυλού αρνητική. Θα είναι ενδιαφέρον να δοκιμαστεί η νέα αντίληψη ότι η ΔΟΕ μπορεί να παίξει ρυθμιστικό ρόλο στον έλεγχο PDT και ογκογένεση του εντέρου.

β-κατενίνης εμπλέκεται σε CLCA1 με γνώμονα κυτταρικού πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης

Η Wnt μονοπάτι είναι εντόνως διατηρημένο σε όλο τον κόσμο των ζώων [4]. β-κατενίνη είναι ένα κεντρικό μόριο στην κανονική Wnt οδού η οποία ρυθμίζει την εντερική επιθηλιακή διαφοροποίηση [4], [42], [43]. Επιπλέον, η β-κατενίνης /TCF (παράγοντας Τ-κυττάρων) οδού ρυθμίζει επίσης κολικών επιθηλιακών τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [33]. Σε κύτταρα μυοβλαστών ποντικού C2C12, σηματοδότηση Wnt μέσω β-κατενίνης μπορεί να δρα ως μοριακός διακόπτης που ρυθμίζει τη μετάβαση από πολλαπλασιασμό των κυττάρων να μυογονικές διαφοροποίηση [44]. Επιπλέον οι περισσότερες περιπτώσεις CRCs προκύπτουν από την αδρανοποίηση μεταλλάξεις στο αδενωματώδη πολυποδίαση coli (

APC

) γονίδιο, που ελέγχει αποικοδόμηση β-κατενίνης [28], [45], [46]. Συλλογικά, αυτό υποδηλώνει ότι η οδός β-κατενίνης διαδραματίζει βασικό ρόλο στην PDT. Σε Caco-2 συρρέουσες καλλιέργειες, καθώς διαφοροποιούνται β-κατενίνης έδειξαν αύξηση που εξαρτάται από το χρόνο επί της κυτταρικής μεμβράνης (Σχ. 3) [27] και όταν CLCA1 χτυπήθηκε κάτω, β-κατενίνης ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω δραματικά στην κυτταρική μεμβράνη (Εικ. 4). Τα στοιχεία μας υποδηλώνει ότι η β-κατενίνης εμπλέκεται στον καταρράκτη των γεγονότων που οδηγούν στη διαφοροποίηση και αυτή οδηγείται από την ενεργοποίηση CLCA1 σε κύτταρα Caco-2.

CLCA1 ως στόχος της βουτυρικό στο Pro-διαφοροποίηση και αντι-πολλαπλασιασμού

το βουτυρικό είναι ένα από τα πιο άφθονα λιπαρά οξέα βραχείας αλύσου (SCFAs) και παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην ομοιόσταση του κόλου επιθήλιο. Είναι οξειδώνεται σε ακετυλο CoA στα μιτοχόνδρια και αντιπροσωπεύει το κύριο καύσιμο για την κανονική εντεροκύτταρα [47], [48], καθώς και για τα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου [49]. Σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου, βουτυρικό αναστέλλει την κυτταρική ανάπτυξη [49], [50], [51] και προάγει κυτταρική διαφοροποίηση [52]. Επιπλέον, το βουτυρικό επαγόμενη διαφοροποίηση των PC12 κυττάρων προς κύτταρα χρωμαφίνης εμπλέκει σφιχτά κυτταρική προσκόλληση και την επαγωγή των εξωκυτταρικών πρωτεϊνών προσκόλλησης κυττάρου [53]. Οι Anticarcinogenic επιδράσεις του βουτυρικού έχουν παρατηρηθεί χρησιμοποιώντας κυτταρικές γραμμές καρκινώματος

in vitro

. Σε αυτά τα μοντέλα, βουτυρικό οδηγεί σε αναστολή του πολλαπλασιασμού, διέγερση απόπτωσης, ή διαφοροποίηση των κυττάρων του όγκου [54], [55], [56], [57]. Επιπλέον, πολλοί μηχανισμοί αντικαρκινικών επιδράσεων βουτυρικού έχουν αναφερθεί, για παράδειγμα, είναι ένας αναστολέας της αποακετυλάσης ιστόνης [58], [59], [60], [61], αυξάνει p21 (

WAF1

) έκφραση γονιδίων και προκαλεί G1 διακοπή του κυτταρικού κύκλου [62]. Βουτυρικό επίσης ρυθμίζει προς τα κάτω το πλήκτρο αποπτωτικών και αγγειογένεση ρυθμιστής νευροπιλίνη-1 (ΕΠΜ-1) να αναστέλλει τη μετανάστευση καρκινικών κυττάρων και την επιβίωση στον καρκίνο του παχέος εντέρου [63]. Επιπλέον, butryrate dysregulates Bcl2 οικογένεια πρωτεϊνών [64], [65], επάγει την έκφραση GPR109A και ενεργοποίηση του υποδοχέα να προκαλεί κυττάρου όγκου-ειδική απόπτωση [66], και διαμορφώνει κανονική σηματοδότηση Wnt [67]. Το βουτυρικό αυξάνει επίσης τη διαφοροποίηση των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου LIM2537, μειώνει GSK-3β δραστηριότητα και αυξάνει τα επίπεδα τόσο δεσμευμένη σε μεμβράνη και APC /αξίνη /GSK-3β σύμπλεγμα που σχετίζεται με δεξαμενές β-κατενίνης [39]. Βουτυρικό αναγνωρίζεται για τις δυνατότητές της να δράσει για τη δευτεροβάθμια χημειοπροφύλαξη [68]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι CLCA1 ως στόχο του βουτυρικού, ρυθμίζουν αποτελεσματικά υπέρ της διαφοροποίησης και αντι-πολλαπλασιασμό των κυττάρων Caco-2 (Εικ. 2 και 5).

Εν κατακλείδι, αποκαλύπτουμε ένα νέο μηχανισμό που ρυθμίζει CLCA1 η Wnt /β-κατενίνης οδηγείται αυθόρμητη και βουτυρικό επαγόμενη διαφοροποίηση των εντεροκυττάρων. Αυτό δείχνει ότι μπορεί να ελέγχει CLCA1 PDT των εντεροκυττάρων και ως εκ τούτου ενεργεί ως καταστολέας όγκων σε ορθοκολικό ογκογένεση. Η απώλεια της έκφρασης CLCA1 αναστέλλει τη διαφοροποίηση των εντεροκυττάρων και μπορεί να οδηγήσει σε ανάπτυξη του κόλου καρκίνου. Έτσι, η καλύτερη κατανόηση του φαινοτύπου CLCA1 σε κολονικό επιθήλιο και τους μηχανισμούς που διέπουν την απώλεια της έκφρασης σε καρκινώματα μπορεί να παρέχει ένα μέσο θεραπευτικής παρέμβασης μέσω αντιστροφή της εξέλιξης του ανθρώπινου ορθοκολικού καρκινογένεσης.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

το κόλον και του ορθού ιστούς ελήφθησαν από την επέμβαση των ασθενών στο Τμήμα Γενικής Χειρουργικής, της 309ης Νοσοκομείο PLA, Πεκίνο, Κίνα. Δεοντολογική έγκριση για τη μελέτη χορηγήθηκε από την 309η Νοσοκομείο της Επιτροπής Δεοντολογίας PLA. Ενημέρωσε γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους συμμετέχοντες που εμπλέκονται στη μελέτη.

Cell Culture

Caco-2 κύτταρα (ATCC, ΗΤΒ-37) καλλιεργήθηκαν σε Μέσο Eagle Τροποποιημένο Medium (DMEM) (Invitrogen , UK), συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 2 mM L-γλουταμίνη, μη απαραίτητα αμινοξέα, 50 U /ml πενικιλίνη και 50 μg /ml στρεπτομυκίνη σε 37 ° C σε επωαστή 5% CO2. βουτυρικό νάτριο αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich, UK.

Νοκ ντάουν της CLCA1 με siRNA

Νοκ ντάουν της CLCA1 πραγματοποιήθηκε με τη χρήση μηχανών αναζήτησης BLOCK-it ™ RNAi Express (Invitrogen, UK). Stealth RNAi ™ siRNA διπλής όψης με ακολουθίες αίσθηση-κλώνου 5′-CAAUGCUACCCUGCCUCCAAUUACA-3 ‘υποβλήθηκε σε μια αναζήτηση BLAST της ανθρώπινης βιβλιοθήκες EST για να εξασφαλιστεί ότι άλλα ανθρώπινα γονίδια δεν ήταν στοχευμένη. Εν συντομία, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FBS χωρίς αντιβιοτικά μία ημέρα πριν από την επιμόλυνση. Caco-2 κύτταρα στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με CLCA1 συγκεκριμένες siRNAs χρησιμοποιώντας λιποφεκταμίνη 2000 αραιώνεται σε Ορίί-ΜΕΜ Ι μέσο σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Invitrogen, UK) με τελική συγκέντρωση siRNA 50-200 ηΜ για τη βελτιστοποίηση του siRNA διαμόλυνσης. Μη στόχευση αρνητικός έλεγχος siRNA χρησιμοποιήθηκε για τα μη-αλληλουχίας-ειδικές επιδράσεις αυτών των μορίων. Για 10 ημέρες μονοστρωματικές καλλιέργειες, 5 καλυπτρίδες × 10

4 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε κολλαγόνο Ι προ-επικάλυψη ή 12 φρεατίων. 100 ηΜ siRNA διπλής όψης μετασκευάστηκε για το 2

ου και 6

ου ημέρα του πολιτισμού. Μετά από 10 ημέρες σε καλλιέργεια, τα κύτταρα πάνω σε λουρίδες κάλυψης σταθεροποιήθηκαν και κύτταρα σε πλάκα 12-φρεατίων υποβλήθηκαν σε λύση για ανάλυση στυπώματος western.

ποσοτική PCR

Caco-2 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ με /χωρίς 2 θεραπεία mM NaBT για 24 ώρες στους 37 ° C με 5% CO

2. Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο TRIzol® (Invitrogen, UK). cDNA συντέθηκε με Cells SuperScript ™ III Direct cDNA Σύστημα Synthesis (Invitrogen, UK). επίπεδο έκφρασης της CLCA1, CLCA2, CLCA3 και CLCA4 mRNA προσδιορίστηκαν με τη χρήση ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (qPCR). PCR εκκινητές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας Primer3 σύνδεση [34]. Ανθρώπινα CLCA1, CLCA2, CLCA3 και CLCA4 mRNA ακολουθίες είχαν κατεβάσει από το National Center for Biotechnology Information (NCBI) GenBank. Περιοχές που ταυτοποίησε την αλληλουχία συναίνεσης για CLCA1, CLCA2, CLCA3 και CLCA4 επιλέχθηκαν για PCR εκκινητές (Πίνακας 1). Οι εκκινητές επιλέγονται να είναι 20 bp σε μήκος, με περιεκτικότητα σε GC του 55% και όχι μακρά επαναλήψεις μιας ενιαίας βάσης. 1:05 αραιωμένο cDNA χρησιμοποιήθηκε για να τρέξει qPCR (SYBR πράσινο, Roche, Ελβετία) στο LightCycler®

480

συστήματος.