Abstract

κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων (CTC) διαμεσολαβούν μεταστατική εξάπλωση πολλών στερεών όγκων και απαρίθμηση των CTCs χρησιμοποιείται σήμερα ως προγνωστικός δείκτης επιβίωσης σε ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του προστάτη. Ορισμένα στοιχεία δείχνουν ότι είναι δυνατόν να προκύψουν πρόσθετες πληροφορίες σχετικά με τους όγκους από την ανάλυση της έκφρασης της ΚΜΑ, αλλά η τεχνική δυσκολία της απομόνωσης και την ανάλυση των επιμέρους ΚΜΑ έχει περιορισμένη πρόοδο στον τομέα αυτό. Για να εκτιμηθεί η ικανότητα μιας νέας γενιάς MagSweeper να απομονώσουν άθικτο ΚΜΑ για τους μεταγενέστερους ανάλυση, εκτελέσαμε mRNA-Seq σε μονά ΚΜΑ που απομονώνονται από το αίμα ασθενών με μεταστατικό καρκίνο του προστάτη και σε μεμονωμένα κυτταρική σειρά καρκίνου του προστάτη LNCaP κύτταρα εμπλουτίστηκαν στο αίμα του υγιείς δότες. Βρήκαμε ότι η MagSweeper απομονωθεί αποτελεσματικά ΚΜΑ με μια απόδοση της δέσμευσης που ταυτοποίησε την CellSearch πλατφόρμα. Ωστόσο, σε αντίθεση με CellSearch, η MagSweeper διευκολύνει την απομόνωση των μεμονωμένων ζωντανών ΚΜΑ χωρίς να μολύνουν τα λευκοκύτταρα. Σημαντικά, mRNA-Seq ανάλυση έδειξε ότι η διαδικασία απομόνωσης MagSweeper δεν έχει αισθητή επίδραση επί της μεταγραφικής προφίλ του ενιαίου LNCaPs απομονωθεί από εμβολιασμένα ανθρώπινο αίμα, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι τυχόν διαταραχές που προκαλούνται από τη διαδικασία MagSweeper για την μεταγραφική υπογραφή των απομονωμένων κυττάρων είναι μέτρια. Αν και το RNA από ΚΜΑ ασθενής έδειξε σημάδια σημαντική υποβάθμιση, σε συνέπεια με αναφορές μικρούς χρόνους ημιζωής και την απόπτωση μεταξύ ΚΜΑ, μεταγραφική υπογραφές του ιστού του προστάτη και του καρκίνου ήταν εύκολα ανιχνεύσιμα με μονά CTC mRNA-Seq. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η MagSweeper παρέχει πρόσβαση σε άθικτο ΚΜΑ και ότι αυτά τα ΚΜΑ μπορεί δυνητικά να παρέχει κλινικά σχετική πληροφορία

Παράθεση:. Cann GM, Gulzar ZG, Cooper S, Li R, Luo S, Tat M, et al . (2012) mRNA-Seq της Ενιαίας Καρκίνος του προστάτη κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα αποκαλύπτει Ανακεφαλαίωση Gene Expression και Pathways Βρέθηκαν σε καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 7 (11): e49144. doi: 10.1371 /journal.pone.0049144

Επιμέλεια: Νατάσα Κυπριανού, Πανεπιστήμιο του Κεντάκι College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 30 Ιουνίου του 2012? Αποδεκτές: 4η Οκτωβρίου 2012? Δημοσιεύθηκε: 7 του Νοέμβρη 2012

Copyright: © 2012 Cann et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε εν μέρει από το τμήμα άμυνας χορηγούν W81XWH-10-1-0510 (με JDB). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και έχουν τα ακόλουθα συγκρούσεις: GMC, SC, RL, SL, MT, SS, GS, MR, και η AT απασχολούνται σήμερα από Illumina. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Τα κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα (CTC) είναι κύτταρα που μέρει από πρωτοπαθή όγκο ή μετάσταση και εισέλθουν στην κυκλοφορία του αίματος μέσω της διαρροής αγγείων που προκύπτει γύρω από έναν αυξανόμενο όγκο. Μόλις στο αίμα, ΚΜΑ αντιμετωπίζουν καταστροφικές τάσεις που συνδέονται με την αιμοδυναμική διάτμηση, συνθήκες χαμηλού οξυγόνου, η έλλειψη χώρων αγκυροβόλιο, και το ανοσοποιητικό επίθεση του συστήματος [1], [2]. Ένας μικρός αριθμός των CTCs επιβιώνουν όμως και εξαγγειώνονται σε περιβάλλοντες ιστούς στους σπόρους προς σπορά μετάσταση ή reseed τον πρωτοπαθή όγκο [3]. Περιγράφεται πριν από έναν αιώνα [4], ΚΜΑ μπορούν να απαριθμούνται χρησιμοποιούν τώρα η FDA ενέκρινε CellSearch πλατφόρμα για να παρέχουν προγνωστικές πληροφορίες σχετικά επιβίωσης για μεταστατικό καρκίνο του μαστού, του παχέος εντέρου και ασθενείς με καρκίνο του προστάτη [5] – [7]. Προχωρώντας πέρα ​​από την απαρίθμηση, αρκετές ομάδες έχουν δείξει ότι γενετικοί και μεταγραφική ανάλυση των επιμέρους CTCs θα μπορούσε να αξιοποιηθεί για να κάνουν εξατομικευμένες ιατρικές αποφάσεις για τη θεραπεία του καρκίνου και να παρέχει γνώσεις σχετικά με τις βιολογικές διεργασίες που εμπλέκονται στη μετάσταση [8] – [10].

Διάφορες μέθοδοι έχουν αξιοποιηθεί για την απομόνωση ΚΜΑ από κόκκινα και λευκά κύτταρα του αίματος (λευκά αιμοσφαίρια). Διαφοροποίηση φυσικές ιδιότητες και επιφανειακούς δείκτες των CTCs έχουν χρησιμοποιηθεί για την απομόνωση τους με διήθηση [11], μικοτσίπ [12], [13], φυγοκέντρηση επιπλέουσα πυκνότητα [14], ανοσομαγνητική επιλογή [15], [16], λειτουργικά εμπλουτισμό και ανίχνευσης [17], [18], και αυτοματοποιημένη ανοσοποιητικό μικροσκόπιο [19], [20]. Τα ανοσομαγνητικά σφαιρίδια εμπλουτισμός με αντι-ΕρΟΑΜ που ακολουθείται από ενεργοποιείται με φθορισμό ταξινόμηση κυττάρων έχει πρόσφατα δειχθεί ότι είναι μια αποτελεσματική προσέγγιση για την απομόνωση ΚΜΑ σχετικά ελεύθερη αιμοποιητικών κυττάρων [21]. Από τις πλατφόρμες που χρησιμοποιούνται σήμερα για την απομόνωση ΚΜΑ, η τεχνολογία MagSweeper παρέχει μεγάλη ευκολία στη χρήση και πρόσβαση σε υψηλής καθαρότητας, άθικτο, ατομική ΚΜΑ κατάλληλο για γενετικές και πρωτεομική ανάλυση [22], [23].

ΚΜΑ είναι γενικά σε χαμηλούς αριθμούς σε δείγματα αίματος ασθενών (τυπικά 1 ανά 10

7 εμπύρηνα κύτταρα στο αίμα) έτσι εκχύλιση μέγιστο αριθμό πληροφοριών από μονά ή διατίθενται CTCs απομονώνεται από δείγμα αίματος του ασθενούς είναι απαραίτητη. αλληλουχίας DNA επόμενη γενιά είναι ιδιαίτερα κατάλληλη για βαθιά ανάκριση των γονιδιωμάτων καρκίνο και transcriptomes [24], ακόμη και όταν εφαρμόζεται σε επίπεδο απλού κυττάρου [25]. Σε αυτή τη μελέτη, επικύρωσε την απόδοση μιας νέας γενιάς του MagSweeper χρησιμοποιώντας εμβολιασμένο LNCaP κύτταρα καρκίνου προστάτη σε φυσιολογικό αίμα. Στη συνέχεια προέβη σε σύγκριση της ευαισθησίας σύλληψη της ΚΜΑ καρκίνου του προστάτη μεταξύ CellSearch και την MagSweeper για όμοια δείγματα ασθενών. Ολόκληρο μελέτες αλληλουχίας μεταγραφικό των μεμονωμένων κυττάρων LNCaP αποκάλυψε ότι MagSweeper απομόνωση έχει ελάχιστες επιπτώσεις στη γονιδιακή έκφραση. Επιπλέον, το mRNA-Seq προφίλ μεσολάβηση μεταγραφικό μεμονωμένων CTCs προστάτη που απομονώνονται από το αίμα του ασθενούς μεταστατικό συγκρίθηκαν με δείγματα φυσιολογικού ιστού προστάτη και κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη και μόνο. Παρά κελί σε κελί ετερογένειας και ένα ευρύ φάσμα της ποιότητας CTC RNA, υψηλότερη έκφραση των γονιδίων που σχετίζονται με προστάτη, όπως υποδοχέα ανδρογόνων (AR), KLK3 (PSA) και TMPRSS2 μπορούσαν να διακριθούν σε CTCs προστάτη. Βιοπληροφορικής οθόνες για τα γονίδια που εκφράζονται 100 φορές υψηλότερη σε κέντρα θεραπείας χολέρας σε σύγκριση με φυσιολογικά δείγματα προστάτη αποκάλυψε άλλες οδούς γνωστό γονίδιο και τις υπογραφές που αναμένεται από καρκίνο του προστάτη και της ιστορίας της θεραπείας υποδοχής τους.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Αυτή η μελέτη αναθεωρήθηκε και εγκρίθηκε από το Διοικητικό συμβούλιο Συμμόρφωσης Έρευνας Ανθρωπίνων Θέματα Στάνφορντ και να τηρείται κανονισμούς HIPPA. Όλα τα ανθρώπινα υποκείμενα υπέγραψε συγκατάθεση πριν από τη συλλογή δείγματος αίματος.

Τα δείγματα ασθενών και συλλογής αίματος

Τα δείγματα ασθενών συλλέχθηκαν σε σωλήνες EDTA 10 ml (Beckton Dickenson) και υποβάλλονται σε επεξεργασία εντός 12 ωρών από τη συλλογή. Τα δείγματα συλλέχθηκαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές που καθορίζονται και εγκρίνονται από την Institutional Review Board και μετά από ενημερωμένη συγκατάθεση. Για συγκρίσεις μεταξύ MagSweeper και CellSearch, ένα δεύτερο δείγμα 7,5 ml αίματος συλλέχθηκε σε ένα σωλήνα CellSave. CellSearch δοκιμασίες διεξήχθησαν με διαγνωστικά Quest. Ολικό RNA από τρεις ιστολογικά φυσιολογικούς ιστούς του προστάτη ελήφθησαν από χειρουργικά αφαιρεθεί προστάτες κάτω από ένα ξεχωριστό IRB-εγκεκριμένο πρωτόκολλο.

Cell Culture and Cell κεντρίσματος

LNCaP, κύτταρα PC-3, και Τ24 είχαν αγοραστεί και καλλιεργήθηκαν σύμφωνα με τις συνθήκες που καθορίζονται από την American Type Culture Collection (ATCC). Μετά διαχωρισμό ζωντανά και νεκρά κύτταρα προσδιορίστηκαν με αποκλεισμό μπλε Τρυπάνης. Για εμβολιασμού, τα κύτταρα αραιώθηκαν σε περίπου 3 × 10

3 κύτταρα ανά ml και κύτταρο συγκέντρωση επαληθεύονται με κηλίδωση και μετρώντας έξι, δέκα μικρόλιτρα κλασμάτων κυττάρων εναποτεθεί στην γυάλινη αντικειμενοφόρο πλάκα μικροσκοπίου. Χωρίς διόρθωση για τα νεκρά κύτταρα βασίζονται σε αποκλεισμό μπλε Τρυπάνης χρησιμοποιήθηκε πριν καρφώσει κύτταρα.

Χάντρα βιβλιοδεσίας και χρώση κυτταρικής επιφανείας

Προσαρμοσμένη 1,5 um επικαλυμμένα με στρεπταβιδίνη μαγνητικά σφαιρίδια λειτουργικό με μια προσαρμοσμένη βιοτινυλιωμένο μονοκλωνικό αντίσωμα στρέφεται κατά εξωκυτταρικό επιτόπιο ανθρώπινου EpCAM. Δύο 3,75 ml όγκοι αίματος ανά δείγμα υποβλήθηκαν σε λύση ερυθρών αιμοσφαιρίων με 10 όγκους 1 χ PharmLyse (BD Biosciences) για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Υπόλοιπα κύτταρα σφαιροποιήθηκαν στους 4 ° C για 15 λεπτά στους 300 χ g. Οι σβώλοι κυττάρων μεταφέρθηκαν με 2 × 1 υποπολλαπλάσια ml 1% BSA /PBS /5 mM EDTA σε 2 ml με επίπεδο πυθμένα σωλήνα μικροφυγοκέντρου (VWR International). Τα κύτταρα στη συνέχεια σφαιροποιήθηκαν για 5 λεπτά σε 510 χ g. Οι σβώλοι κυττάρων επαναιωρήθηκαν σε συνολικό όγκο 1 ml 1% BSA /PBS /5 mM EDTA που περιείχε 15 μΐ Alexa 488 αντι-ανθρώπινης CD45 (Life Technologies) και 30 υΙ σφαιριδίων αντι-ΕρΟΑΜ έθιμο μας. Τα δείγματα περιστράφηκαν για 30 λεπτά στους 4 ° C που ακολουθείται από προσθήκη 20 υΐ φυκοερυθρίνη (ΡΕ) αντι-ανθρώπινο EpCAM μονοκλωνικό αντίσωμα (BD Biosciences 347198). Τα δείγματα στη συνέχεια περιστράφηκε σε 4 ° C για επιπλέον 30 λεπτά και στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε ένα φρεάτιο σε μία πλάκα 6 φρεατίων που περιέχει 6 ml 1% BSA /PBS /5 mM EDTA. Τα δείγματα αναμίχθηκαν μία φορά με σιφωνισμό πάνω και κάτω σε ένα σιφώνιο 10 ml, και οι πλάκες περιδινήθηκαν επί 5 λεπτά στις 400 στροφές ανά λεπτό, που ακολουθείται από επώαση για 15 λεπτά στους 4 ° C πριν από την MagSweeper απομόνωση. Σε μερικά πειράματα εμβολιασμού, τα κύτταρα LNCaP είχαν επισημανθεί πριν από την καρφώσει με CFDA (Τεχνολογίες Ζωής) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.

MagSweeper και ενιαία απομόνωση κυττάρων

Οι πιθανοί ΚΜΑ απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας δύο γύρους απομόνωσης MagSweeper. Τα κύτταρα απομονώθηκαν μετά τον πρώτο γύρο του MagSweeping απελευθερώθηκαν και χρωματίστηκαν σε ένα φρεάτιο μιας 6-φρεατίων που περιείχε 500 ηΜ μεμβράνη αδιαπέραστη DAPI (Life Technologies), έτσι ώστε μεμβράνη παραβιαστεί κύτταρα θα μπορούσαν να ταυτοποιηθούν. Μετά ένα δεύτερο γύρο MagSweeping κύτταρα διασπάρθηκαν και ιζηματοποιήθηκαν σε 400 rpm για 1 λεπτό σε ένα φρεάτιο μιας 6-φρεατίων χαμηλή πλάκα προσκόλλησης σε 10% Superblock (ThermoFisher) /PBS. Τα φρεάτια είδαν με ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο της Olympus είναι εξοπλισμένα για epiflouresence. Υποθετικά CTCs ταυτοποιήθηκαν ως κύτταρα που βάφτηκαν θετικά για ΡΕ αντι-ΕρΟΑΜ και αρνητικό για Alexa 488 αντι-CD45. Υποθετική ΚΜΑ που ήταν DAPI + αποκλείστηκαν από την περαιτέρω ανάλυση. ΫΑΡΙ αρνητική υποθετική CTCs απομονώθηκαν σε 1 υΐ 10% Superblock /PBS με ένα pipetteman σε ένα σωλήνα 0.2 ml PCR που περιέχει 2,5 μΐ 5% ριβονουκλεάση Αναστολέας (Life Technologies) /0.2% Triton Χ-100 (διάλυμα 10%, Sigma) παρασκευάζεται σε νερό χωρίς νουκλεάση. Συλλεχθέντα κύτταρα καταψύχθηκαν σε ξηρό πάγο και αποθηκεύονται στους -80 ° C. καθαρότητα των κυττάρων μετρήθηκε ως ο αριθμός των αιχμηρών κυττάρων που ανακτώνται διαιρείται με τον αριθμό των αιχμηρών κυττάρων που ανακτήθηκαν συν τον αριθμό των λευκοκυττάρων.

απλού κυττάρου mRNA-Seq

Ενιαία κύτταρα λύθηκαν και το RNA μεταγράφεται ανάστροφα χρησιμοποιώντας την πιο έξυπνη Ultra Low RNA εισόδου για το κιτ αλληλουχίας Illumina (Clontech). cDNA ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ Advantage 2 PCR (Clontech) για 18-25 κύκλους πριν από τη μετατροπή σε μια βιβλιοθήκη συμβατή αλληλούχιση του DNA με τη χρήση της Illumina NextEra DNA Δείγμα Prep Kit (Illumina) και 12 κύκλους PCR για την ενίσχυση της βιβλιοθήκης. Βιβλιοθήκες ποσοτικά με τη χρήση ενός BioAnalyzer (Agilent) και qPCR χρησιμοποιώντας ένα κιτ Κάππα Syber Πράσινη PCR (Kappa Biosciences) σε ένα μηχάνημα IIlumina ECO qPCR. Αξιόπιστες κύτταρα ροής τέλος παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας 20:00 της NextEra βιβλιοθήκης ανά λωρίδα σε CBOT (Illumina) και την αλληλουχία τους χρησιμοποιώντας μόνο 50 bp διαβάζει σε μια Illumina GAIIx.

Ευθυγράμμιση

δεδομένα αλληλουχίας συλλέχθηκαν με RTA έκδοση 1.9 και fastq αρχεία δημιουργήθηκαν με Casava 1.8. Διαβάζει που δεν περάσει πρότυπο ποιότητας φίλτρο Illumina είχαν αφαιρεθεί από προεπιλογή. Διαβάζει ευθυγραμμίστηκαν με hg19 με ΤΟΡΗΑΤ C v1.3.3 και μετρήσεις ανά μεταγραφή υπολογίστηκαν για hg19 στο iGenomes χρησιμοποιώντας μανικετόκουμπα v1.1 με τις επιλογές: -GTF & lt? Genes.gtf & gt? -Max-πακέτο-frags 20000000. Gene-από-το γονίδιο πρώτες μετρήσεις και θραύσματα ανά kilobase του εξονίου ανά εκατομμύριο τεμάχια χαρτογραφηθεί (FPKM) παρήχθησαν από τα μανικετόκουμπα isoform.fpkm_tracking αρχείο με τον εντοπισμό όλων των μεταγραφές με το ίδιο όνομα γονιδίου και λαμβάνοντας, αντίστοιχα, το άθροισμα των κάλυψη πολλαπλασιαζόμενο με το μήκος μεταγραφήματος /διαβάσει μήκος για κάθε μεταγράφημα και το άθροισμα των FPKM για κάθε μεταγράφημα. Οι πρώτες μετρήσεις και FPKMs χρησιμοποιήθηκαν σε όλα τα κατάντη ανάλυση, εκτός από το βήμα QC.

RNA-Seq Ποιοτικού Ελέγχου Δεδομένων

Ο ποιοτικός έλεγχος (QC) έγινε χρησιμοποιώντας ένα εσωτερικό Illumina RNA-Seq σενάριο QC. Base-με-βάση κάλυψης υπολογίστηκε σε ένα χέρι-διάλεξε σύνολο των γονιδίων ελέγχου 600 ποιότητας που έχουν επιλεγεί από REFSEQ και είναι ιδιαίτερα δυνατότητα αντιστοίχισης και εξαιρετικά πλούσια σε οικουμενικά ανθρώπινα RNA (UHR) δείγματα (Agilent). Εξαιρετικά δυνατότητα αντιστοίχισης μέσα που & gt? 90% των βάσεων για μια επιλεγμένη μεταγραφή έχουν 100% mappability. Υψηλή έκφραση σε UHR σημαίνει ότι μόνο τα γονίδια, με μέση κάλυψη & gt? Επιλέχθηκαν 1 ×. Έτσι, για μια δεδομένη μεταγραφή 1000 bp σε μήκος υπάρχουν τουλάχιστον 20 διαβάζει από 50 bp χαρτογραφούνται σε αυτό. Γονίδια σε αυτό το σύνολο με περισσότερο από 1 FPKM χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό πρόσθετων στατιστικών. Η μεσαία κάλυψη σε όλο το μήκος κανονικοποιημένη QC γονίδια με περισσότερο από 1 FPKM παραστάθηκε γραφικά. Για κάθε γονίδιο ελέγχου ποιότητας με περισσότερο από 1 FPKM, ο συντελεστής διακύμανσης υπολογίστηκε σε όλη την γονιδίου, και το μεσαίο όλων των βιογραφικών σημειωμάτων καθορίστηκε.

Μη επιβλεπόμενη ομαδοποίηση

Ανεξέλεγκτη ιεραρχική ομαδοποίηση [26 ] έγινε με τη λειτουργία heatmap στο R, με την προεπιλεγμένη Ευκλείδια απόσταση που χρησιμοποιείται ως ανομοιότητας μετρική. Για κάθε δείγμα, τα 100 γονίδια με την υψηλότερη FPKM επιλέχθηκαν και το προκύπτον δεξαμενή 312 γονιδίων χρησιμοποιήθηκε στην ομαδοποίηση.

LNCaP έκφραση ανάλυση

Edger [27] διεξήχθη χρησιμοποιώντας μετριάστηκε tagwise διασπορές με τις πρώτες μετρήσεις ανά γονιδίων ως είσοδο. Συσχέτιση μεταξύ των δειγμάτων υπολογίστηκε με βάση την ακατέργαστη αριθμό των αναγνώσεις χαρτογραφηθούν σε κάθε γονίδιο.

Genes υπερ-εκφράζεται σε ΚΜΑ

Λόγω της εγγενούς μεταβλητότητας στα δεδομένα μόνο κύτταρο, σε συνδυασμό με τις ποικίλους βαθμούς της φαινομενικής αποσύνθεση mRNA που παρατηρήθηκε στην ΚΜΑ, μια απλή μέθοδος κατωφλίου χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση υπερ-εκφρασμένων γονιδίων. Για κάθε γονίδιο υπολογίστηκε η αναλογία του 2

ος υψηλότερη τιμή FPKM μεταξύ του συνόλου του ΚΜΑ στο FPKM στην κανονική RNA προστάτη. Επελέγησαν γονιδίων με μία αναλογία τουλάχιστον 100 × και τουλάχιστον 10 συνολικά διαβάζει σε μία από τις CTCs. GO οντολογίες δημιουργήθηκαν με τη χρήση του Συστήματος Panther Ταξινόμηση (https://www.pantherdb.org/) [28].

Αποτελέσματα

MagSweeper μετρήσεις για την απομόνωση CTC

νέο πρωτότυπο της Magsweeper [22] αναπτύχθηκε που είναι συμβατή με τη λειτουργία στις περισσότερες ντουλάπια βιοασφάλεια (Σχήμα 1Α). Για να αξιολογηθεί η απόδοση της πλατφόρμας αυτής, κατά τη διάρκεια μιας περιόδου 11 μηνών, 100 κύτταρα LNCaP επανειλημμένα εμπλουτίστηκαν σε 3,75 ml φυσιολογικού αίματος και απομονώνονται με τη MagSweeper (n = 54 πειράματα και 11 δότες αίματος). Πριν από εμβολιασμού, η βιωσιμότητα των κυττάρων LNCaP μετρήθηκε με αποκλεισμό μπλε Τρυπάνης ήταν 89% ± 8%. Κατά τη διάρκεια της απομόνωσης από κύτταρα LNCaP εμβολιασμένο αίματος έχει επισημανθεί διά φθορισμού με αντισώματα έναντι EpCAM και CD45 να διακρίνει κύτταρα LNCaP από λευκά αιμοσφαίρια, και η μη διαπερατή μεμβράνη DAPI πυρηνική χρώση χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση κυττάρων (παραβιαστεί μεμβράνης) νεκρός. Μετα-απομόνωση ανακτήσαμε κατά μέσο όρο 81% ± 16% των ζωντανών εμπλουτισμένου LNCaP κυττάρων (EpCAM + /CD45-/DAPI-) (Σχήμα 1Β, μπλε γραμμή) ενώ χρώση ϋΑΡΙ έδειξε ένα επιπλέον 12% ± 6% των απομονωμένων κυττάρων LNCaP ότι ήταν μεμβράνης σε κίνδυνο (EpCAM + /CD45-/DAPI +). Δεδομένου ότι η αρχική κυτταρική ακίδα περιέχονται νεκρών κυττάρων 11% (μετρούμενη με αποκλεισμό μπλε Τρυπάνης) ανάκτηση του 12% ϋΑΡΙ θετικών κυττάρων μετά MagSweeping υποδεικνύει ότι η βλάβη να εμβολιάζεται LNCaP κύτταρα κατά τη διάρκεια της η όλη διαδικασία είναι ελάχιστη. Κανονική, αμιγές δείγματα αίματος απέτυχαν να δώσουν EpCAM θετικά κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α) Εικόνα του κουκούλα πρωτότυπο του MagSweeper. (Β) Ποσοστό σύλληψη των 100 κυττάρων LNCaP εμπλουτίστηκε σε 3,75 ml φυσιολογικού αίματος (Ν = 54 πειράματα και 11 δότες). Μπλε κύκλοι δείχνουν σημαίνει τοις εκατό ανακτήσεις των ζωντανών EpCAM (+) /CD45 (-) /ϋΑΡΙ (-) κύτταρα και κόκκινο κύκλοι δείχνουν μέσες ανακτήσεις μεμβράνη παραβιαστεί EpCAM (+) /CD45 (-) /ϋΑΡΙ (+) κυττάρων. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν +/- 1 S.D. (C) Ποσοστό σύλληψη και την καθαρότητα του 10 LNCaP κυττάρων απομονώθηκε μετά μετρώντας σε 7,5 ml φυσιολογικού αίματος. Μπλε γραμμές είναι η μέση ανάκτηση τοις εκατό των κυττάρων μετά από MagSweeper απομόνωση (Capture κυττάρων) και να πάρει και την απομόνωση μόνο κύτταρο χειροκίνητη θέση (κελί απομόνωσης), ενώ μωβ μπάρες δείχνουν την καθαρότητα των κυττάρων LNCaP μετά MagSweeper και απομόνωση απλού κυττάρου (Ν = 6 πειράματα και 4 δότες ). καθαρότητα των κυττάρων υπολογίστηκε ως ο αριθμός των αιχμηρών κυττάρων απομονωμένων διαιρείται με τον αριθμό των κυττάρων που μετρήθηκαν αιχμηρών συν τα λευκά αιμοσφαίρια μετρήθηκαν. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν +/- 1 S.D. (D) Φωτεινό πεδίου (BF) και οι εικόνες φθορισμού χρωματισμένο ΚΜΑ απομονωθεί από καρκίνο του προστάτη δείγμα αίματος του ασθενούς, και μολύνοντας WBC βρέθηκαν μετά την απομόνωση MagSweeper. μπαρ κλίμακας = 20 μm. (Ε) MagSweeper έναντι CellSearch σύγκριση των δειγμάτων των ασθενών. Δείγματα με 0 CTC είχαν ανατεθεί μια τιμή 1 για τη χάραξη σκοπούς.

Η

Για να εκτιμηθεί η καθαρότητα της εξαιρετικά σπάνια κύτταρα μετά MagSweeping, 7,5 ml φυσιολογικού αίματος του δότη εμπλουτίστηκε με 10 CFDA σημασμένα κύτταρα (n = 6 πειράματα και 4 δότες) και υποβάλλονται σε επεξεργασία σύμφωνα με το πρωτόκολλο μας για απομόνωση CTC. Κατέλαβε LNCaP κύτταρα ταυτοποιήθηκαν με ανίχνευση φθορισμού με CFDA, ενώ μολύνουν λευκά αιμοσφαίρια ταυτοποιήθηκαν με θετική χρώση CD45. Μετά μαγνητική διαλογή μία μέση ανάκτηση ποσοστό LNCaP του 63% ± παρατηρήθηκε 25%. Καταμέτρηση των CD45 θετικών κυττάρων έδωσε μια αρχική καθαρότητα απομονωθεί κυττάρων LNCaP μετά την απομόνωση κυττάρων MagSweeper 10% απομόνωσης ± 6% και 100% μετά μονοκύτταροι χρησιμοποιώντας ένα pick and μέθοδο θέση (Εικ. 1Γ).

επόμενη πραγματοποιηθεί μια συγκριτική ανάλυση των MagSweeper έναντι CellSearch στην απαρίθμηση της CTC σε δείγματα αίματος από ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του προστάτη. Κατά τη στιγμή της κλήρωσης, δύο 7,5 ml δείγματα του αίματος συλλέχθηκαν, ένα δείγμα σε ένα πρότυπο σωλήνα EDTA για την απομόνωση των κυττάρων MagSweeper και ένα δεύτερο σε ένα σωλήνα CellSave για ανάλυση από ένα ανεξάρτητο εργαστήριο (Quest Diagnostics) χρησιμοποιώντας το CellSearch προσδιορισμού. χρώση ανοσοφθορισμού των απομονωμένων κυττάρων MagSweeper προσδιορίζονται ΚΜΑ ως EpCAM θετικές και αρνητικές CD45. ΚΜΑ ήταν εύκολα διακρίνεται από WBC που ήταν CD45 θετικά, αρνητικά EpCAM (Σχ. 1D). Αριθμοί εντελώς καθαρισμένο ΚΜΑ που απαριθμούνται από την απομόνωση MagSweeper και CellSearch συγκρίθηκαν και βρέθηκαν να είναι εύλογα παρόμοια, με μια ήπια τάση που παρατηρείται προς την καλύτερη σύλληψη CTC χρησιμοποιώντας το MagSweeper σε δείγματα με χαμηλό αριθμό CTC (Σχήμα 1 Ε).

MagSweeper απομόνωση έχει ελάχιστες επιπτώσεις στην ενιαία transcriptomes κυττάρων

για να εκτιμηθεί κατά πόσον η διαδικασία απομόνωσης MagSweeper επηρέασαν την παγκόσμια προφίλ μεταγραφική των απομονωμένων κυττάρων, εκτελέσαμε μόνο κύτταρο του mRNA-Seq στις 4 φρέσκα κύτταρα LNCaP ακριβώς πριν από την καρφώσει στο αίμα, και στις 4 LNCaPs μετά την απομόνωση MagSweeper από εμβολιασμένα κανονικό αίμα. Απομονωμένα κύτταρα αποθηκεύτηκαν κατεψυγμένα για τουλάχιστον ένα μήνα για να μιμηθεί τις συνθήκες αποθήκευσης. BioAnalyzer ίχνη ενισχυμένων cDNA από ένα φρέσκο ​​και ένα MagSweeper απομονωμένο κύτταρο αποκάλυψε παρόμοιες κορυφές μοριακού βάρους των προϊόντων ενίσχυσης κεντραρισμένη κατά προσέγγιση 1000 ζεύγη βάσεων (Σχ. 2Α).

(Α) Bioanalyzer ίχνη ενισχυμένων cDNAs από απλά LNCaP κύτταρα προ (Single LNCaP (προ)) και μετά MagSweeping (Single LNCaP (μετά)), και τον θετικό μάρτυρα (12 pg των LNCaP ολικού RNA) και αρνητικό μάρτυρα (αρνητικός μάρτυρας). (Β) Heatmap των συσχετίσεων μεταξύ του νωπού και MagSwept δεδομένων μονοκύτταροι RNA-Seq και τον πίνακα των συσχετίσεων μεταξύ του νωπού και MagSwept δείγματα. Κίτρινο υποδεικνύει υψηλότερες συσχετίσεις και κόκκινο κάτω συσχετισμούς. (C) ίχνη Εκπρόσωπος BioAnalyzer του καλού, τους ενδιάμεσους, και η κακή προϊόντα ενίσχυσης CTC cDNA. (Δ) Ποσοστό ξεμπλοκάρισμα της CTC ποιότητας του RNA με βάση την ταξινόμηση των προϊόντων ενίσχυσης cDNA – πράσινο δείχνει καλής ποιότητας, κίτρινο δείγματα είναι μερικώς υποβαθμισμένη RNA και το κόκκινο δείχνει δείγματα υποβαθμισμένη RNA. (Ε) Σειριακή ΚΜΑ, την ποιότητα RNA και% τους ευθυγράμμιση πέρασμα του φίλτρου mRNA-Seq διαβάζει στο ανθρώπινο γονιδίωμα hg19 κατασκευής. Ασθενής ID CTC δείχνει μόνο ΚΜΑ ασθενή που αναγνωρίζεται ως αριθμό ασθενών. αριθμός CTC (Π1.1). RNA ποιότητας βασίζεται σε ίχνη BioAnalyzer ενισχυμένου cDNA και Ευθυγράμμιση% είναι η ευθυγράμμιση% του mRNA-Seq διαβάζει.

Η

Για τη μελέτη των γονιδίων που εκφράζονται διαφορικά μεταξύ του νωπού και MagSweeper απομονωθεί μεμονωμένα κύτταρα, που χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά το Bioconductor Edger πακέτο. Εντοπίσαμε μόνο 1 γονιδίου ως διαφορικά εκφρασμένων μεταξύ MagSweeper απομονωμένο και τον έλεγχο των κυττάρων LNCaP σε ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη (FDR) αποκοπής του 0.05 και κανένας σε αποκοπής 0,01.

Θα διερευνηθούν επίσης διάφορες άλλες μεθόδους για τον προσδιορισμό των διαφορών μεταξύ των νωπών και MagSweeper απομονωμένα κύτταρα. Πρώτον, για να χαρακτηριστεί ο βαθμός κυττάρου-προς-κύτταρο μεταβλητότητα, ζητήσαμε από πόσα γονίδια είχε ένα πολύ υψηλό FPKM (& gt? 10) σε τουλάχιστον 1 δείγμα και ένα πολύ χαμηλό FPKM (& lt? 0,1) σε τουλάχιστον ένα δείγμα. Θεωρήσαμε τρεις διαφορετικές ομάδες των δειγμάτων: (1) 4 φρέσκα κύτταρα (2) 4 MagSwept κύτταρα και (3) 2 φρέσκα και 2 κύτταρα MagSwept. Ο αριθμός των εξαιρετικά μεταβλητή γονιδίων σε τέσσερα φρέσκα κύτταρα (215), τέσσερα κύτταρα MagSwept (268) και ένας συνδυασμός των 2 φρέσκα και 2 κύτταρα MagSwept (239) ήταν παρόμοια σε όλες τις ομάδες και πιθανόν αντανακλά κύτταρο σε κύτταρο ετερογένεια. Σε μία άλλη σύγκριση υπολογίσαμε τη συσχέτιση του αριθμού των διαβάζει ανά γονιδίου μεταξύ κάθε ζεύγους των δειγμάτων, και διαπίστωσαν ότι οι συσχετίσεις εντός-ομάδα δεν ήταν ισχυρότερη από το μεταξύ συσχετίσεις ομάδα – δηλαδή, τα κύτταρα δεν του συμπλέγματος που βασίζεται σε μέθοδο απομόνωσης ( Σχήμα 2Β). Τέλος, σε μια ξεχωριστή μελέτη, κάναμε ένα μικροσυστοιχιών έκφραση Illumina στις πισίνες των 10.000 κύτταρα LNCaP απομόνωσης πριν και μετά MagSweeper. Πάλι, δεν υπήρχε υψηλός διασυσχέτισης (R

2 = 0.985) μεταξύ MagSweeper απομονωμένα κύτταρα και των ελέγχων δείχνουν ότι MagSweeper παράγει ελάχιστη μεταβολές στη γονιδιακή έκφραση (δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

mRNA-Seq του ενιαίου προστάτη καρκίνο του ΚΜΑ

ετοιμάσαμε ενισχυμένου cDNA από 67 κέντρα θεραπείας χολέρας απομονώθηκαν από ασθενείς με καρκίνο του προστάτη 13. ΚΜΑ απομονώθηκαν μετά MagSweeping βασίζεται σε χρώση ανοσοφθορισμού για κύτταρα που ήταν (ΕρΟΑΜ + /CD45-/DAPI-). Σε αντίθεση με καλλιεργημένα κύτταρα LNCaP (Σχήμα 2Α), διαπιστώσαμε ότι υπήρχε ένα ευρύ φάσμα των μεγεθών των ενισχυμένων cDNA σε ΚΜΑ που λαμβάνονται από ασθενή, αντανακλαστική της αρχικής ποιότητας RNA. Εμείς χαρακτηρίζεται ίχνη των προϊόντων ενίσχυσης σε 3 ομάδες: 1) εκείνοι με αιχμές επικεντρωμένη γύρω από 1000 bps (καλής ποιότητας), 2) τα ίχνη με προϊόντα ενίσχυσης ενδιάμεσου μήκους (μερικώς υποβαθμισμένη), και 3) ανιχνεύει με προϊόντα κυρίως χαμηλού μοριακού ενίσχυση βάρους (υποβαθμισμένη ) (Σχ. 2C). Εξετάζοντας όλα τα 67 κέντρα θεραπείας χολέρας, το 21% είχε καλή ποιότητα του RNA, το 37% ήταν μερικώς υποβαθμισμένη, και το 42% των δειγμάτων είχαν υποβαθμιστεί (Σχ. 2D). ποιότητα RNA έτειναν να είναι κάπως συγκεκριμένες ασθενής – για παράδειγμα ασθενής 2 έδωσε τον υψηλότερο αριθμό (8/12) καλής ποιότητας δειγμάτων RNA. Χρησιμοποιώντας την ποιότητα του RNA ως οδηγό, μπορούμε αλληλουχία των βιβλιοθηκών της 24ης ΚΜΑ που περιλάμβανε εκπροσώπους των τριών ταξινομήσεων της ποιότητας του RNA, και ευθυγραμμισμένες σειρές στο ανθρώπινο γονιδίωμα (build hg19). Με βάση την βαθμολογία ευθυγράμμισης αλληλουχίας μεγαλύτερη από πέντε τοις εκατό, τα δεδομένα αλληλουχίας για 20 ΚΜΑ που συλλέγονται από 4 ασθενείς (Ρ1, Ρ2, Ρ3 και Ρ4) επιλέχθηκαν για περαιτέρω μελέτη σε βάθος (Εικ. 2Ε)

.

mRNA- επόμενα ποιότητας των δεδομένων

Για να εκτιμηθεί το mRNA-Seq την ποιότητα των δεδομένων, η κάλυψη υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας μια δέσμη ενεργειών ελέγχου της ποιότητας και μια διάλεκτος σύνολο των γονιδίων ελέγχου 600 ποιότητα που είναι ιδιαίτερα δυνατότητα αντιστοίχισης και εκφράζεται σε οικουμενικά ανθρώπινα RNA (βλέπε Μέθοδοι, RNA -SEQ δεδομένων Ποιοτικού Ελέγχου για τον ορισμό). Τα δεδομένα αλληλουχίας από το ενιαίο LNCaP, PC-3, και Τ24 κύτταρα πέρασαν τα πρότυπα ελέγχου ποιότητας για & gt? 60% ευθυγράμμιση και & lt? 65% μέση CV ευθυγράμμιση συνήθως εφαρμόζονται σε μεγάλα σύνολα δεδομένων εισόδου RNA mRNA-Seq (Σχήμα 3Α). . Σε αντίθεση, ΚΜΑ εμφανίζεται υψηλότερη κάλυψη μέση βιογραφικά και χαμηλότερο ποσοστό ευθυγραμμίσεις από καλλιεργημένα κύτταρα. Τυπικές οικόπεδα κάλυψη για κυτταρικές σειρές, φυσιολογικούς ιστούς του προστάτη και CTCs δείχνεται στο Σχήμα 3Β. Οι κυτταρικές γραμμές που εμφανίζονται ομαλή κάλυψη σε όλο το μήκος της μεταγραφής, ενώ τα φυσιολογικά δείγματα προστάτη είχε μια ελαφρά 3 ‘προκατάληψη, χαρακτηριστική για τα δείγματα ιστού (Σχ. 3Β). Οι ΚΜΑ είχε ένα ευρύ φάσμα προκατάληψη κάλυψης, όπως φαίνεται. Από ολιγο-dT χρησιμοποιήθηκαν για τη σύνθεση του cDNA prime, ένα 3-prime προκατάληψη στα δεδομένα κάλυψης προτείνει η υποβάθμιση του mRNA.

(Α) Ποσοστό επιτυχίας φίλτρου (PF) αναφέρει ότι ευθυγραμμισμένες, ποσοστό ευθυγραμμίσεις που αντιστοιχούν σε κωδικές περιοχές, η μέση βιογραφικό κάλυψη, και το ποσοστό των διαβάζει αυτό το χάρτη στα πέντε γονίδια με τον υψηλότερο αριθμό χαρτογραφηθεί διαβάζει. Για τον υπολογισμό της «Median CV», πρώτα το βιογραφικό της κάλυψης υπολογίστηκε σε κάθε μια από 600 γονίδια σε ένα χέρι-διάλεξε σύνολο των γονιδίων ελέγχου της ποιότητας που εκφράζονται σε οικουμενικά ανθρώπινα RNA (Agilent), και στη συνέχεια λαμβάνεται η μέση τιμή αυτών των βιογραφικών σημειωμάτων (θεωρώντας μόνο τα γονίδια με τουλάχιστον 1 κάλυψη ×). Το «% ευθυγραμμισμένο» είναι το ποσοστό του PF διαβάζει που ευθυγραμμίζονται προς το γονιδίωμα ή σε μια θέση ματίσματος, εξαιρουμένων των μιτοχονδρίων και ριβοσωμικό RNA. Βάσει ιστορικών δεδομένων, αναμενόμενες τιμές για μέση βιογραφικό σημείωμα και% ευθυγραμμισμένο είναι & lt? 65% και & gt? 60%, αντίστοιχα. Κωδικοποίηση ευθυγραμμίσεις είναι η% του αναφέρει ότι χάρτη για εξώνια. Η% διαβάζει ευθυγραμμιστούν με τα κορυφαία 5 γονίδια για κάθε δείγμα φαίνονται (Β) Παραδείγματα του μέσου μήκους κανονικοποιημένη κάλυψη σε όλα τα γονίδια ελέγχου 600 ποιότητας, από δείγματα LNCaP.3, Ν.1, P2.1, P3.4 . Θέση 0 είναι το 5′-τέλος των μεταγραφών και 100 είναι η ακραία 3′-άκρο του αντιγράφου.

Η

mRNA-Seq περιεχόμενο των δεδομένων

Για να καταλάβετε μεταγραφή αφθονία, παραλλαγή και το εύρος σε ΚΜΑ, συγκρίναμε τις κατανομές των τιμών FPKM όλων των RNAs REFSEQ ανιχνεύθηκε σε ΚΜΑ και LNCaP κύτταρα (πίνακες S1 και S2). Μετρήσεις των μεταγραφών REFSEQ με ≥10 FPKM αποκάλυψε σε κύτταρα LNCaP (n = 4) 4622 ± 136,2 μεταγραφών (με ένα εύρος από 4485 να 4786 μεταγραφές). Αντίθετα, σε ΚΜΑ (n = 20) ο αριθμός των αντιγράφων REFSEQ με ≥10 FPKM ήταν 2362 ± 865 προϊόντα μεταγραφής (με ένα εύρος από 1233 να 3987 μεταγραφές).

Στη συνέχεια, εξετάσαμε τα επίπεδα έκφρασης αρκετών διαμορφωτές του προστάτη και ένα δείκτη λευκοκυττάρων να διαπιστωθεί ότι τα κύτταρα που λαμβάνονται από ασθενή ήταν προστατικής προέλευσης: ανδρογόνων υποδοχέων (AR), του ειδικού προστατικού αντιγόνου (PSA, KLK3), TMPRSS2, και το CD45 δείκτη λευκοκυττάρων σε όλα τα δείγματα CTC. Το Σχήμα 4Α δείχνει την FPKM καθενός από αυτούς τους δείκτες σε ΚΜΑ ασθενή, κυτταρικές σειρές καλλιέργειας ιστών και φυσιολογικό προστάτη, με τιμές & gt? 1 FPKM σκιασμένο στο πράσινο. Όλοι εκτός από έναν από τους ΚΜΑ ήταν θετικό για τουλάχιστον έναν από τους δείκτες του προστάτη. LNCaP και φυσιολογικό προστάτη έδειξαν την αναμενόμενη έκφραση αυτών των δεικτών του προστάτη. PC-3 έλειπε KLK3 και AR εκφράζεται, όπως αναμένεται [29], αλλά έκανε ρητή TMPRSS2. Σημαντικά, όλα τα ΚΜΑ και οι κυτταρικές γραμμές ήταν αρνητικά για το WBC CD45 δείκτη. Κανονικό προστάτη, η οποία αποτελείται από πολλούς τύπους κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων WBCs, ήταν θετικά για έκφραση CD45, όπως ήταν η ενιαία WBC που υποβλήθηκε σε mRNA-Seq. Τέλος, Τ24, μια κυτταρική γραμμή καρκίνου της ουροδόχου κύστης δεν εκφράζουν καμία από αυτούς τους δείκτες. Για να καταλάβουμε πώς ασθενή ΚΜΑ σχετίζονται μεταξύ τους, πραγματοποιήσαμε μια ανεξέλεγκτη ανάλυση ομαδοποίησης όλων των CTCs ασθενούς. Η ανάλυση αποκάλυψε ότι με την εξαίρεση των δύο ΚΜΑ (P2.9 και Ρ1.2), όλα τα CTCs από μεμονωμένους ασθενείς συγκεντρωμένα σε έναν ασθενή ειδικό τρόπο (Εικ. 4Β).

(Α) Εκφραση του καρκίνου του προστάτη συνδεδεμένων γονιδίων. Για κάθε γονίδιο, θραύσματα ανά kilobase του εξονίου ανά εκατομμύριο θραύσματα χαρτογραφηθεί (FPKM) για κάθε CTC και τους ελέγχους που φαίνεται. FPKM τιμές μεγαλύτερες από 5 είναι σκιασμένα πράσινο και εκείνα με τιμές μεταξύ 1 και 5 είναι σκιασμένα ανοικτό πράσινο. AR (υποδοχέα ανδρογόνων), KLK3 (ειδικό προστατικό αντιγόνο), και TMPRSS2are δείκτες του ιστού του προστάτη. CD45 είναι ένα λευκό δείκτης κυττάρων του αίματος. καρκινικές κυτταρικές γραμμές του προστάτη περιλαμβάνουν LNCaP και PC-3, ενώ Τ24 είναι ένας καρκίνος της ουροδόχου κύστης, και WBC είναι ένα ενιαίο λευκών αιμοσφαιρίων. Κανονική δηλώνει φυσιολογικό ιστό του προστάτη. (Β) Ανεξέλεγκτη ομαδοποίηση των υπερ-εκφρασμένων γονιδίων σε CTCs ασθενή. Χρωματιστές μπάρες σε όλη την κορυφή του σχήματος δείχνουν διαφορετικούς ασθενείς, ενώ οι ατομικές ΚΜΑ ασθενή που παρατίθενται στο κάτω μέρος του ταμπλό. (C) Λειτουργική ταξινόμηση των γονιδίων που υπερεκφράζεται στην CTC χρησιμοποιώντας Gene Ontology (GO) ταξινομήσεις. Για κάθε λειτουργική ομαδοποίηση του% των γονιδίων υπερ-εκφράζεται σε κάθε GO κατηγορία ενδείκνυται.

Η

CTC Διαδρομή Ανάλυση

Για να βρείτε τα γονίδια και τα μονοπάτια που διαφορικά δραστηριοποιείται στην ΚΜΑ συγκρίναμε μεταγραφή προφίλ της ΚΜΑ σε όσους από φυσιολογικό ιστό του προστάτη και επικεντρώθηκε σε γονίδια που ήταν πάνω από εκφράζονται στις ΚΜΑ. Για την κανονικοποίηση των δεδομένων RNA-Seq με βάση τα μεγέθη γονίδιο και τον αριθμό των θραυσμάτων χαρτογραφήθηκαν, χρησιμοποιήσαμε ΤΟΡΗΑΤ C και μανικετόκουμπα για τον προσδιορισμό FPKM. Εμείς αιτιολογημένη ότι τους διαφορετικούς βαθμούς αποικοδόμησης RNA στα CTCs θα οδηγούσε σε ψευδώς θετικά καταμέτρηση των υπό εκφρασμένων γονιδίων στην ΚΜΑ, ιδίως δεδομένου ότι ο χρόνος ημιζωής του RNA κυμαίνεται από γονίδιο σε γονίδιο. Χρησιμοποιήσαμε μια χειροκίνητη μέθοδο κατωφλίου για τον εντοπισμό γονιδίων που υπερεκφράζεται σε ΚΜΑ. Συγκεκριμένα, επιλεγμένα γονίδια που ήταν τουλάχιστον 100 φορές υψηλότερη σε τουλάχιστον 2 από τα CTCs σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό του προστάτη και ότι περιέχεται τουλάχιστον 10 χαρτογραφήθηκε διαβάζει σε τουλάχιστον ένα δείγμα.

Εντοπίσαμε 181 γονίδια πάνω -expressed σε ΚΜΑ σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό του προστάτη (Πίνακας S3). Για να αποκτήσετε μια γενική εικόνα του φάσματος των βιολογικών λειτουργιών που σχετίζονται με αυτές τις μεταγραφές, Gene Ontology σχολιασμούς που προέρχονται από τη βάση δεδομένων GoSlim χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα περιήγησης Panther Σύστημα Ταξινόμησης [28] (Εικ. 4C) και κατηγοριοποιούνται για βιολογικές διαδικασίες. Από 181 γονίδια, 110 απέδωσε 173 hits διαδικασία που ταξινομήθηκαν σε 14 βιολογικές διαδικασίες. Αυτά εμφανίζονται με τη λειτουργία καλαθιού Panther Pie (Εικ. 4C). Μεταξύ των υπολοίπων 71 γονίδιο σχολιασμούς που δεν έχουν ταξινομηθεί από GoSlim, 37 ήταν μη-κωδικοποίησης RNAs συμπεριλαμβανομένων και των μελών των οικογενειών MIR, SCARNA, SNAr, SNORA, SNORD και VTRNA. Τα υπόλοιπα 34 μεταγραφές θα μπορούσε να ανιχνευθεί με τη χρήση GeneCards. Εξέταση των μεταγραφών που ταξινομούνται με βιολογικές διαδικασίες αποκάλυψε ότι το ένα τρίτο συσχετίστηκαν είτε με μεταβολικές διεργασίες (23%, GO: 0008152) ή του κυτταρικού κύκλου (10%, GO: 0007049), σύμφωνα με μιτωτικώς δραστικά κύτταρα (σχήμα 4Γ).. του κυτταρικού κύκλου και της μίτωσης που σχετίζονται μεταγραφές στην άκρως εξέφρασε σετ γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων TPX2, CCNA2, CCNB1 και Β2, CDC20, CSK2, CDC2, CDKN3, CENPE, CD28, TOP2A, ORC1L, NUF2, CDK1, KIF2C, PTTG1 και TTK.

Είναι ενδιαφέρον, ο κατάλογος περιέχει πολλές μεταγραφές σχετικός με τη βιολογία του καρκίνου του προστάτη. Για παράδειγμα, οι 3 CTCs από τον ασθενή 1 εξέφρασαν υψηλά επίπεδα SPINK1, ενός αντιγράφου και πρωτεΐνη ταυτοποιήθηκε ως αυξημένα σε TMPRSS2-ERG σύντηξης καρκίνους του προστάτη και αρνητικά που συνδέονται με επιθετικό καρκίνο του προστάτη [30]. ΚΜΑ από ασθενείς 1 και 2 εξέφρασαν υψηλά επίπεδα του BIRC5 (Survivin), ένα αντι-αποπτωτικό γονίδιο εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα σε ευνουχισμό ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη.