Αφηρημένο

Είναι γνωστό ότι πολλοί ασθενείς συνεχίζουν να καπνίζουν τσιγάρα, αφού διαγνωστεί με καρκίνο. Παρά το γεγονός ότι η διακοπή του καπνίσματος έχει τυπικά θεωρούνται ότι έχουν μικρή θεραπευτική αξία για τον καρκίνο, ένα αυξανόμενο σώμα της στοιχεία δείχνουν ότι η συνέχιση του καπνίσματος σχετίζεται με μειωμένη αποτελεσματικότητα της θεραπείας και μια υψηλότερη συχνότητα υποτροπής. Ως εκ τούτου, διερευνήθηκε η επίδραση του συμπυκνώματος καπνό του τσιγάρου (CSC) σχετικά με την αντίσταση φαρμάκου στον καρκίνο του πνεύμονα και κεφαλής και λαιμού γραμμές καρκινικών κυττάρων Α549 και UMSCC-10Β, αντιστοίχως. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η CSC αύξησε σημαντικά την κυτταρική εκροή της δοξορουβικίνης και μιτοξαντρόνης. Αυτό συνοδεύτηκε από εντοπισμό μεμβράνης και αυξημένη έκφραση του μεταφορέα ABCG2 πολυ-φαρμάκου. Η επαγόμενη εκροή της δοξορουβικίνης αντιστράφηκε κατά την προσθήκη του ειδικού αναστολέα ABCG2 Fumitremorgin C, επιβεβαιώνοντας το ρόλο του ABCG2. Η θεραπεία με CSC αύξησε τη συγκέντρωση της φωσφορυλιωμένης Akt, ενώ προσθήκη του αναστολέα ΡΙ3Κ LY294002 μπλοκαριστεί εξώθηση δοξορουβικίνη, υποδηλώνοντας ότι η ενεργοποίηση Akt απαιτείται για CSC επαγόμενης αποβολής του φαρμάκου. Επιπλέον, CSC βρέθηκε για την προώθηση της αντίστασης σε δοξορουβικίνη όπως προσδιορίζεται με δοκιμασίες MTS. Αυτό CSC επαγόμενη doxurbicin αντοχή μετριάστηκε από μεκαμυλαμίνη, ένας αναστολέας νικοτινικού υποδοχέα ακετυλοχολίνης, γεγονός που υποδηλώνει ότι η νικοτίνη είναι τουλάχιστον εν μέρει υπεύθυνη για την επίδραση της CSC. Τέλος, CSC αύξησε το μέγεθος της πλευράς πληθυσμού (SP), το οποίο έχει συνδεθεί με ένα κύτταρο φαινότυπο καρκινικά βλαστικά. Συνοπτικά, CSC προωθεί χημειοαντίσταση μέσω μεσολαβεί η ΑΚΤ ρύθμιση της δραστικότητας ABCG2, και μπορεί επίσης να αυξήσει το ποσοστό του καρκίνου βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν, συμβάλλοντας στην ανθεκτικότητα του όγκου. Τα ευρήματα αυτά υπογραμμίζουν τη σημασία της διακοπής του καπνίσματος μετά από τη διάγνωση του καρκίνου, καθώς και τη διαλεύκανση των μηχανισμών της συνεχούς καπνίσματος, που μπορεί να είναι επιζήμια για τη θεραπεία

Παράθεση:. Μια Y, Kiang Α, Lopez JP, Kuo SZ, Yu MA , Abhold EL, et al. (2012) ο καπνός του τσιγάρου Προωθεί ναρκωτικών Αντίστασης και Επέκταση του καρκίνου Stem Cell-Όπως Side πληθυσμού. PLoS ONE 7 (11): e47919. doi: 10.1371 /journal.pone.0047919

Επιμέλεια: Alfons Navarro, Πανεπιστήμιο της Βαρκελώνης, Ισπανία

Ελήφθη: 17, Απριλίου, 2011? Αποδεκτές: 24 Σεπ 2012? Δημοσιεύθηκε: 5 Νοέμβρη, 2012

Copyright: © 2012 Μια et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Υπουργείο άμυνας (CDMRP) για να WO και NCI /ΝΙΗ 5 U01 CA114810-03 να JWR. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

το κάπνισμα είναι ο μεγαλύτερος παράγοντας κινδύνου για το κεφάλι και το λαιμό ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (HNSCC) και μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC), κοινές κακοήθειες που επηρεάζουν μαζί πάνω από 150.000 νέους ασθενείς στις ΗΠΑ κάθε χρόνο [1 ]. Χημική ανάλυση δείχνει ότι μεταξύ των ~4800 ενώσεις που βρίσκονται σε συμπύκνωμα καπνού τσιγάρων (CSC), περίπου 100 παρουσιάζει μεταλλαξιογόνο δράση [2]. Άφθονα εντός CSC είναι Ν-νιτροζαμίνες, όπως 4- (μεθυλονιτροζαμινο) -1- (3-πυριδυλ) -1-βουτανόνη (ΝΚΚ), και οι πολυαρωματικοί υδρογονάνθρακες, όπως βενζο [α] πυρένιο (Β [α] Ρ), η οποία οδηγεί στο σχηματισμό προϊόντων προσθήκης DNA. Όλα πιστεύεται ότι είναι σημαντικοί παράγοντες σε καρκινώματα προκαλούνται από το κάπνισμα [3]. CSC επαγόμενη μεταλλάξεις σε κρίσιμα γονίδια καταστολής όγκων

ρ53 και ρ16

αποτέλεσμα στην ογκογένεση [4]. Βιοχημικές μελέτες έχουν επίσης αποκαλύψει ότι CSC μπορεί να ενεργοποιήσει το προ-φλεγμονώδη πρωτεΐνη NF-κΒ, μαζί με πρωτο-ογκογονίδια όπως ERK1 /2, EGFR και Akt [5], [6], [7], [8].

Παρά τις επιδράσεις του καπνού του τσιγάρου, υπάρχει έλλειψη έμφαση στη διακοπή του καπνίσματος κατά τη διάρκεια της θεραπείας του καρκίνου, που οφείλεται στην άποψη που επικρατεί ότι η θεραπεία της εξάρτησης από τον καπνό έχει μικρή ή καθόλου επίδραση στην έκβαση της θεραπείας. Ωστόσο, η συνεχιζόμενη έρευνα δείχνει ότι η συνεχής κάπνισμα μετά από μια διάγνωση μπορεί να περιορίζει την αποτελεσματικότητα της θεραπείας και να αυξήσει τον κίνδυνο θνησιμότητας σε ορισμένες μορφές καρκίνου. Αποδείχθηκε πρόσφατα ότι το κάπνισμα κατά τη διάρκεια της θεραπείας με ακτινοβολία συνδέθηκε με δυσμενή αποτελέσματα σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου [9]. Επιπλέον, συνέχισε το κάπνισμα κατά τη διάρκεια της θεραπείας του καρκίνου του πνεύμονα οδηγεί σε υψηλότερη συχνότητα υποτροπής, και συνδέεται με σημαντικά μεγαλύτερο κίνδυνο θνησιμότητας από κάθε αιτία [10], [11], [12]. Η διακοπή του καπνίσματος μετά από επιτυχή θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα συσχετίστηκε επίσης με χαμηλότερη επίπτωση της δεύτερης πρωτογενούς καρκίνου [12].

Έχουμε σκεφτεί ότι ο καπνός του τσιγάρου έχει άμεσο ρόλο στην προώθηση χημειοαντίσταση, με αποτέλεσμα την επιδείνωση των αποτελεσμάτων της θεραπείας. Επιπλέον, η υψηλότερη συχνότητα εμφάνισης υποτροπής που σχετίζονται με το κάπνισμα συνεχίστηκε μπορεί να αποτελεί ένδειξη της δραστικότητας του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων. Ως εκ τούτου, έστρεψε την προσοχή μας στο ΑΤΡ-δέσμευσης μεταφορέα κασέτας ABCG2 /BCRP1, η οποία διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην αντίσταση στο φάρμακο και έχει χρησιμοποιηθεί σε κάποιους ιστούς ως δείκτη βλαστικών κυττάρων. ABCG2 προσδίδει αντίσταση προς πολλαπλά κυτταροτοξικά φάρμακα, συμπεριλαμβανομένων topetcan, μπισαντρένη, μιτοξαντρόνη, και η δοξορουβικίνη, η τελευταία εκ των οποίων είναι συνήθως χρησιμοποιείται για τη θεραπεία τόσο HNSCC και NSCLC [13], [14]. έκφραση ABCG2 διατηρείται μεταξύ βλαστικών κυττάρων από μία μεγάλη ποικιλία προελεύσεων και είναι επίσης το μοριακό ορίζουσα της πλευράς πληθυσμού, τα κύτταρα που παρουσιάζουν αυξημένη εκροή Hoechst 33342 δέσμευσης DNA χρωστική [15]. Έχει δειχθεί ότι η έκφραση του ABCG2 σε συνδυασμό με CD133 προβλέπει υποτροπή στο στάδιο 1 NSCLC [16]. Σε οισοφαγικό καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων, έκφραση ABCG2 μόνη συνδέθηκε με δυσμενή πρόγνωση [17].

Η σχέση μεταξύ του καπνίσματος και συνέχισε χημειοαντίσταση είναι ασαφής. Η νικοτίνη που προκαλείται από προς τα πάνω ρύθμιση της survivin και ΧΙΑΡ μπορεί να προστατεύσει τα κύτταρα από προκαλούμενη από χημειοθεραπεία θάνατο [18], αλλά είναι άγνωστο αν ο καπνός του τσιγάρου θα μπορούσε να προωθήσει χημειοαντίσταση μέσω διαμόρφωσης της δραστηριότητας μεταφορέα φαρμάκου. Ως εκ τούτου, επιδιώξαμε να προσδιοριστεί αν η θεραπεία με CSC ενεργοποιημένη κύτταρα

in vitro

να αυξηθεί η έκφραση ABCG2 και δραστηριότητας, και κατά πόσο αυτή η αλλαγή να οδηγήσει σε ενισχυμένη βιωσιμότητα των κυττάρων παρουσία δοξορουβικίνης. Εξετάσαμε επίσης το κατά πόσον θα μπορούσε να επεκτείνει CSC την πλευρά του πληθυσμού, η οποία έχει αποδειχθεί ότι διαθέτει τον καρκίνο των βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με ιδιότητες [19]. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης θα βοηθήσει τη διαλεύκανση του ρόλου της χρήσης του καπνού στην εξέλιξη του καρκίνου, οδηγώντας σε πιο αποτελεσματική αντιμετώπιση και διαχείριση των καρκινωμάτων σχετίζονται με το κάπνισμα.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντισώματα και χημικών προϊόντων

μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού έναντι ABCG2 αγοράστηκε από την Chemicon International (Temecula, CA). β-ακτίνης μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού ελήφθη από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ). Κουνέλι ρ-Ακί και Akt ποντικού αντισώματα ήταν από τη Cell Signaling (Beverly, ΜΑ). αναστολέα ΡΙ3Κ LY294002 αγοράστηκε από την Calbiochem (San Diego, CA). Δοξορουβικίνη ελήφθη από την Ortho Biotech (Bridgewater, NJ) και συμπύκνωμα καπνού τσιγάρων λήφθηκε από ΜιιΠγ Pharmaceuticals (Lexington, KY).

Γραμμές κυττάρων και κυττάρων Πολιτισμού

Το ανθρώπινο κεφάλι και το λαιμό από πλακώδες επιθήλιο κυτταρική σειρά καρκινώματος, UMSCC10B παρασχέθηκε ευγενώς από το Δρ Thomas E. Carey (University of Michigan). Επίσης χρησιμοποιήθηκε ήταν το μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα Α549 κυτταρική σειρά καρκίνου, που ξεκίνησε από Giard et al [20]. Αυτές οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν και διατηρήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 10% βόειο εμβρυϊκό ορό και 1% πενικιλλίνη στρεπτομυκίνη.

Doxorubicin Θεραπεία

Μία τελική συγκέντρωση doxorubicin του 2,5 μg /ml χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη . Τα κύτταρα επωάστηκαν με δοξορουβικίνη για 1 ώρα στους 37 ° C με ανακίνηση κάθε 15-20 λεπτά. Στη συνέχεια, τα δείγματα εξώθηση τοποθετήθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 2% BSA επί 3 ώρες στους 37degrees, πάλι ανακινείται κάθε 15-20 λεπτά. Δεν-εξώθηση δείγματα τοποθετήθηκαν σε ρυθμιστικό Hanks και τοποθετούνται σε πάγο κατά τη διάρκεια της εξώθησης.

Ανάλυση Κυτταρομετρίας Ροής του Doxorubicin εκροή.

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της doxorubicin εκροής διεξήχθη όπως σε προηγούμενη μελέτη [21]. Τα κύτταρα επωάστηκαν με δοξορουβικίνη σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle που περιέχει 2% ορό εμβρύου μόσχου (FCS). Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν με ισορροπημένο διάλυμα άλατος του Hanks και επαναιωρήθηκαν σε δοξορουβικίνη ελεύθερο μέσο καλλιέργειας. Τα κύτταρα στη συνέχεια αφέθηκαν να εξωθήσει το φάρμακο για 2,5 ώρες στους 37 ° C, εκτός από τους ελέγχους χωρίς εξώθηση η οποία κρατήθηκαν σε πάγο, πριν από την ανάλυση με κυτταρομετρία ροής. Τα νεκρά κύτταρα εξαιρέθηκαν με ταυτόχρονη χρώση με ΡΙ. Τόσο Hoechst χρώση και δοξορουβικίνη εκροής αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ενεργοποιημένων με φθορισμό κυττάρων διαλογέα (FACSVantage SE, BD Biosciences, San Jose, CA) με CELLQuest (Largo, FL) λογισμικού. Η ποσοστιαία διαφορά στη δοξορουβικίνη εκροή υπολογιζόμενα με τον ακόλουθο τύπο:% μεταβολή = [(CSC

δεν εξολκεύσεως CSC

εξώθηση) – (Έλεγχος

δεν εξολκεύσεως Ελέγχου

εξώθηση)] /(Έλεγχος

όχι εξολκεύσεως Ελέγχου

εξώθηση) * 100. Η εκροή δοξορουβικίνη ορίζεται να είναι αντιστρόφως ανάλογη προς της κυτταρικής φθορισμός μετρήθηκε με FACS.

Ανάλυση Western Blot

15 μg /mL ή 30 μg /mL της CSC προστέθηκε σε κύτταρα 24 ώρες πριν από την λύση. Τα κύτταρα λύθηκαν επί πάγου για 10 λεπτά με ρυθμιστικό διάλυμα (0.1 Μ Tris, 2% SDS, 20% γλυκερίνη, και τα δισκία αναστολέα πρωτεάσης από την Roche Diagnostics, Indianapolis, ΙΝ). διαχωρισμένες πρωτεΐνες ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιώντας 10% NuPage δις-Τρις γέλη (20 ng ανά φρεάτιο), τα οποία στη συνέχεια μεταφέρθηκαν πάνω σε μεμβράνη PVDF. Μεμβράνη αποκλείστηκε για μία ώρα και επωάζεται όλη τη νύκτα σε πρωτογενές αντίσωμα αραιωμένο 1:100 εντός διαλύματος αποκλεισμού. Μετά την προσθήκη του δευτερογενούς αντισώματος αίγας έναντι αντισώματος ποντικού (1:1000 αραίωση σε διάλυμα αποκλεισμού), ειδικές πρωτεΐνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας SuperSignal West Pico λουμινόλη (Pierce, Rockford, IL). εντάσεις μπάντα ποσοτικά με πυκνομετρία χρησιμοποιώντας το ImageJ λογισμικό ανοιχτού κώδικα (http: //rsbweb.nih.govi/ij/) χρησιμοποιώντας μια μέθοδο που περιγράφεται στο https://lukemiller.org/index.php/2010/11/analyzing- πηκτές-και-δυτικό-blots-με-image-j /.

MTS Βιωσιμότητας κυττάρων δοκιμασία

δοκιμασία MTS πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το CellTiter 96 υδατικού δοκιμασία πολλαπλασιασμού κυττάρων μη-ραδιενεργού (Promega, Madison , WI) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και επιστρώθηκαν σε 100 μΙ κανονικού μέσου ή CSC (15 μg /ml) μέσου σε σχήμα 96 φρεατίων. Μετά από 24 ωρών επώαση σε 37 ° C και 5% CO

2, δοξορουβικίνη προστέθηκε στα φρεάτια, που ακολουθείται από άλλες 48 ώρες επώασης. Στη συνέχεια, 20 μΐ αντιδραστηρίου MTS προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο που ακολουθείται από μια περίοδο επώασης 4 ωρών. Ένας αναγνώστης πλάκα στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για την καταγραφή της απορρόφησης στα 490 nm.

ανοσοφθορισμού

CSC προστέθηκε σε κύτταρα 24 πριν από τη μονιμοποίηση. Τα κύτταρα πλύθηκαν επιθυμία PBS και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη. 10% φυσιολογικό ορό κατσίκας χρησιμοποιήθηκε ως παράγοντα αποκλεισμού. Το πρώτο αντίσωμα (αραιωμένο 1:100) στη συνέχεια εφαρμόστηκε επί μία νύκτα σε θάλαμο υγρασίας. Δευτερογενής αντισώματα (αραιωμένα 1:1000) Alexa Fluor 488 από Molecular Probes (Carlsbad, CA) ή γίδινου αντι-ποντικού IgG από την Chemicon International (Temecula, CA) προστέθηκαν στη συνέχεια στα κύτταρα λεκέ. Τα δείγματα πλύθηκαν διαδοχικά με PBS, H

2O, και αιθανόλη. Χρωματισμένα κύτταρα στερεώθηκαν και οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία.

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής για τη Hoechst εκροής (Side Δοκιμασία πληθυσμού)

Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με 5 μg /mL του Hoechst 33342 (Sigma) σε 4 mL του Dulbecco τροποποιημένο μέσο Eagle που περιείχε 2% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) στους 37 ° C για 90 λεπτά. Μετά την επώαση, τα κύτταρα πλύθηκαν με ισορροπημένο διάλυμα άλατος του Hanks και επωάστηκαν περαιτέρω σε 15 μg /ml ή 30 μg /ml CSC για 24 ώρες. Επιπλέον, 2 μg /ml ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) προστέθηκε για τους νεκρούς διάκριση κυττάρων. Hoechst εκροής αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ένα φθορισμού που ενεργοποιείται διαλογέα κυττάρων (FACSVantage SE, BD Biosciences, San Jose, CA) με CELLQuest (Largo, FL), το λογισμικό. Η περιοχή του πλευρικού πληθυσμού προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα ξεχωριστό δείγμα (δεν φαίνεται) στον οποίο Hoecsht εκροή σε μη CSC-κατεργασμένα κύτταρα μπλοκαρίστηκε από το verapamil φαρμάκου. Η περιοχή στην οποία τα κύτταρα είχαν χαθεί κατά την κατεργασία με βεραπαμίλη ορίστηκε ως η περιοχή που περιείχε το υποθετικό πλευρά του πληθυσμού, και διατηρήθηκε σταθερή για όλα τα τρία δείγματα (έλεγχος, 15 μg /ml, 30 μg /ml).

Αποτελέσματα

θεραπεία CSC αυξάνει δοξορουβικίνη εκροής μέσω ABCG2

Για να προσδιοριστεί εάν η θεραπεία CSC θα μπορούσε να ρυθμίζουν τη δραστηριότητα του μεταφορέα ναρκωτικών, μετρήσαμε πρώτα τις αλλαγές στην εξώθηση δοξορουβικίνη που παρατηρείται μετά την προσθήκη της CSC. Οι δόσεις του CSC (15 μg /ml, 30 μg /ml) επιλέχθηκαν με βάση την δόσεις που χρησιμοποιούνται σε προηγούμενες μελέτες [22], [23], [24]. Τα ενδοκυτταρικά επίπεδα doxorubicin προσδιορίστηκαν με τη χρήση κυτταρομετρίας ροής για τη μέτρηση του φθορισμού του φαρμάκου σε μεμονωμένα κύτταρα. Ένα βέλτιστο χρονικό πλαίσιο εξώθησης (2,5 ώρες) επιλέχθηκε για να εξισορροπήσουν τις επιδράσεις του κυτταροτοξικότητα έναντι ανιχνεύσιμες αλλαγές δοξορουβικίνη εκροή. Προκειμένου να λογοδοτήσει για το φόντο φθορισμού που προκαλείται από CSC, οι διαφορές στην μέση φθορισμού μεταξύ ενός δείγματος εξώθησης (διατηρείται στους 37 ° C) και κανένα δείγμα εξώθησης (διατηρείται σε πάγο) συγκρίθηκαν όχι απόλυτα επίπεδα φθορισμού. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η CSC αυξημένη doxorubicin εκροή με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 1α, β). Ένας ειδικός αναστολέας για τη δραστηριότητα ABCG2 μεταφορές, Fumitremorgin C (FTC), εισήχθη σε κύτταρα που πρόκειται να εξεταστεί από τη δοκιμασία δοξορουβικίνη εκροής. Η προσθήκη του FTC αντέστρεψε την επίδραση της CSC, γεγονός που υποδηλώνει ότι ABCG2 είναι ο μεταφορέας υπεύθυνος για την CSC επαγόμενη εκροής δοξορουβικίνη. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται σε αυτό το σχήμα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον δύο ανεξάρτητες δοκιμές.

(Α) 15 και 30 μg /mL συμπυκνώματος καπνό του τσιγάρου (CSC) αυξάνει δοξορουβικίνη εκροή στις δύο κυτταρικές σειρές 10Β και Α549 σε μία δοσο εξαρτάται μοτίβο. Η ειδικός αναστολέας ABCG2 fumitremorgin C (FTC) είναι σε θέση να αντιστρέψει την CSC μεσολάβηση αύξηση δοξορουβικίνη εκροή. Ποσοστιαία μεταβολή προήλθε από την ανάλυση με κυτταρομετρία ροής του διάμεσου ενδοκυτταρικά επίπεδα doxorubicin και υπολογίζεται με τον τύπο που περιγράφεται στο τμήμα των μεθόδων. (Β) CSC αυξάνει δοξορουβικίνη εκροής δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Σχετική εκροή εκτιμηθεί με σύγκριση των διαφορών στα διάμεση doxorubicin κανάλια φθορισμού της εξώθησης και χωρίς δείγματα εξώθηση. Αριθμητική ετικέτα αντανακλούν το διάμεσο κανάλι φθορισμού doxorubicin όπως μετράται σε ένα δείγμα της ανάλυσης κυτταρομετρίας ροής των ενδοκυτταρικών επιπέδων δοξορουβικίνης σε 10Β. Παρά το γεγονός ότι τα απόλυτα επίπεδα φθορισμού στα επεξεργασμένα δείγματα οφείλονται υψηλότερες σε φθορισμό του CSC, η μείωση από καθόλου εξώθηση προς εξώθηση είναι μεγαλύτερη για τα δείγματα αυτά σε σύγκριση με τον έλεγχο.

Η

CSC επάγει εντοπισμός μεμβράνης και έκφραση του ABCG2

Μόνο ABCG2 εντοπισμένη στην μεμβράνη του πλάσματος είναι σε θέση να εκρέει δοξορουβικίνη. Για να βεβαιωθείτε ότι η CSC προωθεί την αντίσταση του φαρμάκου με ρύθμιση της δραστικότητας ABCG2, ένα πείραμα ανοσοφθορισμού διεξήχθη για να προσδιοριστεί η επίδραση της CSC επί ABCG2 εντοπισμού. Φωτογραφίες συγκρίνοντας κύτταρα ελέγχου να CSC-επεξεργασμένα κύτταρα έδειξαν ότι η CSC αύξησε τις συγκεντρώσεις στο πλάσμα της μεμβράνης των ABCG2 (Σχήμα 2α). Είναι ενδιαφέρον, κυτταροπλασματικά επίπεδα πρωτεΐνης του ABCG2 δεν ήταν εμφανώς χαμηλότερο μετά τη μετατόπιση, γεγονός που υποδηλώνει ότι η CSC ίσως ρυθμίζει προς τα πάνω και τα συνολικά επίπεδα της ABCG2. Πράγματι, κηλίδωση Western ολόκληρων κυττάρων λύμα αποκάλυψε ότι CSC αύξησε επίσης το συνολικό έκφραση ABCG2 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 2β). έκφραση ABCG2 ήταν χαμηλότερη στην υψηλότερη δόση, πιθανότατα ως αποτέλεσμα της CSC κυτταροτοξικότητας. δοκιμασίες ανοσοφθορισμού επίσης επαναλήφθηκε με μη διαπερατών κυττάρων με σκοπό την περαιτέρω απεικονίσει την μετατόπιση του ABCG2, δεδομένου ότι μόνο πρωτεΐνες επί της κυτταρικής επιφανείας θα βάφονται σε αυτήν την περίπτωση. Σύμφωνα με την υπόθεσή μας, χρώση ABCG2 ήταν μόλις ορατές σε μη διαπερατά κύτταρα ελέγχου, αλλά ήταν σαφώς παρούσα στην επιφάνεια του CSC επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 3). Οι φωτογραφίες που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον δύο ανεξάρτητες μελέτες. Μικροσκόπιο

(Α) ανοσοφθορισμού προσδιορίζει την κυτταρική εντόπιση της ABCG2 με και χωρίς CSC. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η έκθεση CSC επάγει μετατόπιση του ABCG2 στην μεμβράνη πλάσματος σε 10Β και Α549. (Β) Ανάλυση στυπώματος Western δείχνει δοσοεξαρτώμενη αύξηση στην έκφραση ABCG2 σε απόκριση σε θεραπεία CSC.

Η

Ανοσοφθορισμός επαναλήφθηκε σε μη διαπερατών κυττάρων για να αποδειχθεί η αύξηση στις συγκεντρώσεις μεμβράνη ABCG2. Τα αποτελέσματα δείχνουν ασθενής χρώση του ABCG2 στην επιφάνεια των μη επεξεργασμένων κυττάρων, ενώ πολύ ισχυρότερο χρώση παρατηρήθηκε στην επιφάνεια των κατεργασμένων κυττάρων CSC.

Η

CSC επαγόμενη εκροής δοξορουβικίνη και ABCG2 μετατόπιση προκαλούνται από ΡΙ3Κ /Akt σηματοδότησης

Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι Akt ρυθμίζει τη λειτουργία των ABCG2 σε HSNCC [25]. Ως εκ τούτου υποθέσαμε ότι CSC προωθούσε doxorubicin εκροή μέσω της ενεργοποίησης του Akt. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, έχουμε εκ νέου αναλύθηκαν το ρυθμό της δοξορουβικίνης εκροή παρουσία του αναστολέα ΡΙ3Κ LY294002. Η προσθήκη LY ανέστρεψε την CSC προκαλούμενη αύξηση της doxorubicin εκροής (Σχήμα 4α). Η ανάλυση στυπώματος Western αποκάλυψε ότι CSC αύξησε τα επίπεδα της φωσφο-Ακί δοσοεξαρτώμενο (Σχήμα 4β). Όπως ήταν αναμενόμενο, η προσθήκη του αναστολέα ΡΙ3Κ LY294002 μπλοκάρει CSC-επαγόμενη ενεργοποίηση του Akt (Σχήμα 4γ). Είναι ενδιαφέρον ότι, η θεραπεία με LY μόνο δεν μειώνουν σημαντικά τα επίπεδα του ABCG2 σχέση με το μάρτυρα (Σχήμα 4γ). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ΡΙ3Κ /Akt είναι ένας από τους κύριους μηχανισμούς που εμπλέκονται στην ρύθμιση της λειτουργίας ABCG2, αλλά μπορεί να μην είναι κρίσιμο ρόλο στην ρύθμιση της έκφρασης ABCG2.

(Α) αναστολέα ΡΙ3Κ LY294002 (LY) μειώνεται δοξορουβικίνη εκροή σε κυτταρικές γραμμές 10Β και Α549. Οι τιμές προέρχονται από ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του intraceulluar επιπέδων doxorubicin, και υπολογίζονται σε σχέση με το μη-LY κατεργασία ελέγχους. (Β) ανάλυση κηλίδας Western που δείχνει την μεταβολή των επιπέδων της φωσφο-Ακί και Akt με την αύξηση της δοσολογίας του CSC. (Γ) ανάλυση κηλίδας Western που δείχνει την αντιστροφή της ενεργοποίησης Akt με κατεργασία με LY, και η έκφραση του ABCG2 παρουσία LY.

Η

θεραπεία CSC αυξάνει μιτοξαντρόνη εκροής

Αν CSC μεσολάβηση αντίσταση δοξορουβικίνη εμπλέκονται οριστικά ABCG2, τότε CSC θα πρέπει επίσης να είναι σε θέση να προστατεύσει έναντι άλλων υποστρωμάτων ABCG2. Έτσι, ελέγξαμε εάν CSC θα μπορούσε επίσης να ενισχύσει την κυτταρική εκροή μιτοξαντρόνη, ένα υπόστρωμα του ABCG2 [26]. Σύμφωνα με προτεινόμενο μηχανισμό μας, CSC αύξησε σημαντικά την κυτταρική εκροή της μιτοξαντρόνης, επιβεβαιώνοντας την εμπλοκή του ABCG2 (Σχήμα 5).

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των ενδοκυτταρικών επιπέδων μιτοξαντρόνης αποκάλυψαν σημαντικά υψηλότερα ποσοστά εξώθηση σε CSC-επεξεργασμένα κύτταρα. Οι τιμές που παρουσιάζονται είναι οι ποσοστιαίες διαφορές σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα δείγματα.

Η

θεραπεία CSC προωθεί τη βιωσιμότητα των κυττάρων κατά τη διάρκεια της έκθεσης δοξορουβικίνη

Παρά το γεγονός ότι η CSC προκαλεί σαφώς μεγαλύτερη εκροή φαρμάκου, ρωτήσαμε αν αυτό μεταφράζεται σε μια ανιχνεύσιμη αλλαγή στην αντίσταση του φαρμάκου. Μία δοκιμασία MTS, η οποία μετρά το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων, διεξήχθη για να συγκρίνει τις καμπύλες επιβίωσης μεταξύ των κυττάρων ελέγχου και CSC-επεξεργασμένα κύτταρα με την παρουσία αυξανόμενης συγκέντρωσης ντοξορουμπικίνης (Σχήμα 6). Προκειμένου να λογοδοτήσει για τις αποκλίσεις στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, όλες οι απορροφήσεις τιμές σε ένα δείγμα χωρίστηκαν από την απορρόφηση των αντίστοιχων 0 ελέγχων μΜ δοξορουβικίνη τους. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ένα σημαντικά υψηλότερο ποσοστό CSC-κατεργασμένων κυττάρων παρέμειναν βιώσιμα σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα, υποδηλώνοντας ότι η CSC προστατεύει τελικά τα κύτταρα από δοξορουβικίνη θάνατο που προκαλείται. Το Σχήμα 6 δείχνει αντιπροσωπευτικά πειράματα που εκτελέστηκαν εις τριπλούν.

MTS προσδιορισμούς κυτταρικής βιωσιμότητας δοκιμή της βιωσιμότητας του ελέγχου έναντι CSC επεξεργασμένου 10Β και Α549 κύτταρα παρουσία της δοξορουβικίνης. (Υ-άξονας) τιμές απορρόφησης ομαλοποιήθηκαν διαιρώντας πάνω από την απορρόφηση των δειγμάτων ντοξορουμπικίνης 0 μΜ. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η CSC έχει μια προστατευτική επίδραση έναντι δοξορουβικίνη-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν SEM.

Η

θεραπεία CSC αυξάνει την πλευρά του πληθυσμού

Side πληθυσμού κυττάρων (SP) ορίζεται ως κύτταρα που παρουσιάζουν υψηλότερο εκροή της Hoechst 33342 βαφής, ένα ειδικό υπόστρωμα για ABCG2 , σε σχέση με τον κύριο πληθυσμό. Ελέγξαμε εάν CSC θα μπορούσε να αυξήσει το μέγεθος του SP στον 10Β κύτταρα. Πράγματι, ένας προσδιορισμός Hoechst-εξώθηση αποκάλυψε ότι το μέγεθος του SP ήταν μεγαλύτερη σε CSC-κατεργασμένα κύτταρα σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 7). Με την παρουσία της βεραπαμίλης, η αύξηση του SP μερικώς καταργηθεί, γεγονός που υποδηλώνει ότι ABCG2 είναι τουλάχιστον εν μέρει υπεύθυνη για την αύξηση του πληθυσμού πλευρά, αν και παραμένει δυνατό ότι άλλες αντλίες φάρμακο θα μπορούσε να διαδραματίσει ένα ρόλο στην CSC επαγόμενη πλευρά πληθυσμού. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν τη συμμετοχή της ABCG2 σε CSC επαγόμενη αντίσταση στο φάρμακο και υποδεικνύουν την πιθανότητα ότι η CSC μπορεί να ρυθμίζει τις ιδιότητες του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων, δεδομένου ότι τα κύτταρα SP έχει δειχθεί ότι είναι πολύ πιο ανθεκτική στη χημειοθεραπεία και ογκογόνα από κύτταρα μη-SP [15], [19 ], [27].

δοκιμασία εξώθηση Hoechst

βασιζόμενη σε FACS δείχνει το μέγεθος των πλευρικών πληθυσμού (SP) σε 10Β κύτταρα επωάστηκαν με δύο δόσεις CSC. Το μέγεθος της SP αυξάνεται με την αύξηση της δοσολογίας της CSC. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε 5 μg /ml του Hoechst για 90 λεπτά και στη συνέχεια σε DMEM w /CSC ή κανονικά DMEM επί 24 ώρες.

Η

θεραπεία νικοτίνη προάγει την κυτταρική βιωσιμότητα κατά την διάρκεια της έκθεσης δοξορουβικίνη

Επειδή συμπύκνωμα καπνού του τσιγάρου είναι ένα μίγμα ενός μυριάδα ενώσεων, θα ήταν χρήσιμο να καθοριστεί η συγκεκριμένη ένωση εντός CSC που θα μπορούσε να είναι υπεύθυνη για την προώθηση αντοχή φαρμάκου. Ως εκ τούτου, με στόχο να καθοριστεί αν η νικοτίνη, ένα συγκεκριμένο στοιχείο του CSC, θα μπορούσε να είναι υπεύθυνος για την CSC-επαγόμενη ανθεκτικότητα στα φάρμακα. Μία δοκιμασία MTS εκτελέστηκε για σύγκριση καμπυλών επιβίωσης μεταξύ των κυττάρων ελέγχου και 10 μΜ κύτταρα νικοτίνη επεξεργασμένα με την παρουσία αυξανόμενης συγκέντρωσης ντοξορουμπικίνης (Σχήμα 8α). Τα αποτελέσματα αυτού του πειράματος έδειξαν ότι η νικοτίνη παρέχεται ένα σημαντικό πλεονέκτημα σε βιωσιμότητα των κυττάρων κατά τη διάρκεια της έκθεσης σε δοξορουβικίνη. Για να επιβεβαιωθεί ότι η νικοτίνη είναι σημαντική στην CSC προκαλούμενη αντοχή φαρμάκου, μια δοκιμασία MTS πραγματοποιήθηκε για να προσδιοριστεί αν η μεκαμυλαμίνη, ένας μη εκλεκτικός αναστολέας νικοτινικό υποδοχέα της ακετυλοχολίνης, θα μπορούσε να αντιστρέψει το φάρμακο-προστατευτική επίδραση της CSC. Τα αποτελέσματα έδειξαν ένα πλεονέκτημα επιβίωσης σε CSC-επεξεργασμένα κύτταρα που μετριάζεται κατά την κατεργασία με 1 μΜ μεκαμυλαμίνης (Σχήμα 8β).

(Α) δοκιμασία πολλαπλασιασμού MTS δοκιμή της βιωσιμότητας των κυττάρων ελέγχου έναντι νικοτίνη επεξεργασμένα με την παρουσία της δοξορουβικίνης. (Υ-άξονας) τιμές απορρόφησης ομαλοποιήθηκαν διαιρώντας πάνω από την απορρόφηση των δειγμάτων ντοξορουμπικίνης 0 μΜ. δοκιμασίες βιωσιμότητας (Β) MTS αποδεικνύοντας την αντιστροφή της CSC επαγόμενης αντίστασης δοξορουβικίνη η μεκαμυλαμίνη αναστολέα nAChR. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η νικοτίνη είναι τουλάχιστον εν μέρει υπεύθυνη για την προστατευτική επίδραση της CSC κατά δοξορουβικίνη-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν SEM.

Η

Συζήτηση

Αν και προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η CSC έχει τη δυνατότητα να προωθήσει χημειοαντίσταση [18], [28], [29], τον προσδιορισμό του μηχανισμού της δράσης παραμένει ένα σημαντικό εύρημα. Τα δεδομένα μας υποστηρίζει ένα μοντέλο όπου CSC ενεργοποιεί Akt να επάγει την μετατόπιση του ABCG2 στη μεμβράνη του πλάσματος, ενισχύοντας έτσι την εξώθηση του φαρμάκου και χημειοαντίσταση. Παρατηρήσαμε επίσης ότι η CSC είναι σε θέση να επάγει την έκφραση του ABCG2 πέρα ​​από τη ρύθμιση μετατόπισης. Είναι ενδιαφέρον, στην υψηλότερη δόση της CSC (30 μΜ), η έκφραση ABCG2 μειώθηκε λόγω ίσως κυτταροτοξικότητα, αν και δοξορουβικίνη εκροής παρέμεινε υψηλό. Αυτό υποδηλώνει ότι ABCG2 μετατόπιση μόνο είναι περισσότερο από επαρκής για να λογοδοτήσουν για CSC που προκαλείται εκροής δοξορουβικίνη.

Αν και η συμμετοχή της Akt σε ABCG2 μετατόπιση είναι καλά υποστηρίζεται από τα δεδομένα μας και από την εργασία των άλλων [30], [31], είναι ασαφές εάν CSC-επαγόμενη έκφραση του ABCG2 επίσης διαμεσολαβείται από Akt. δεδομένα Western Blot μας (Σχήμα 4C) φαίνεται να υποδηλώνουν ότι η CSC μπορεί να ρυθμίζει την έκφραση του ABCG2 ανεξάρτητα από ΡΙ3Κ /Akt σηματοδότηση. Αυτό είναι σύμφωνο με τις παρατηρήσεις των Bleau κ.ά., ο οποίος διαπίστωσε ότι Akt ρυθμίζει τη λειτουργία (δηλαδή μετατόπιση) του ABCG2, αλλά όχι την έκφραση του [32]. Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι ο υποδοχέας αρυλ υδρογονάνθρακα (Ahr) είναι ένας άμεσος μεταγραφικός ενεργοποιητής του ABCG2 στον καρκίνο του μαστού [33]. Βενζο [α] πυρένιο (B [a] P), ένα από τα βασικά καρκινογόνες ουσίες στον καπνό του τσιγάρου, είναι ένας ισχυρός ενεργοποιητής του Ahr [34]. Έτσι, είναι πιθανό ότι B [a] P δεσμεύεται σε Ahr, η οποία στη συνέχεια ενεργοποιεί τη μεταγραφή του ABCG2 και εξηγεί την παρατηρούμενη αύξηση στην πρωτεΐνη ABCG2. Μια άλλη πιθανότητα είναι ότι η CSC ενεργεί μέσω της ρύθμισης microRNA για να αυξήσει τα επίπεδα της πρωτεΐνης ABCG2. CSC έχει αποδειχθεί ότι διαμορφώνουν την έκφραση μιας ποικιλίας microRNAs [35], [36]. Είναι πιθανό ότι miR-519c, η οποία έχει αποδειχθεί ότι καταστέλλει τη μετάφραση ABCG2 [37], περιλαμβάνεται μεταξύ των microRNAs που ρυθμίζεται προς τα κάτω από την έκθεση σε CSC. Παρά το γεγονός ότι αυτές οι θεωρίες δεν έχουν ακόμη επιβεβαιωθεί από τις μελλοντικές εργασίες, αυτό που είναι σαφές είναι ότι ABCG2 είναι ένα βασικό συστατικό της CSC που προκαλείται χημειοαντίσταση, καθιστώντας το ένα πιθανό θεραπευτικό στόχο για καρκίνους προκαλούνται από το κάπνισμα. Οι θεραπείες που συνδυάζουν τη χορήγηση αναστολέων ABCG2 και συμβατική χημειοθεραπεία μπορεί να αποδειχθεί αποτελεσματικό στην εξάλειψη τόσο του όγκου και χημειοθεραπεία πληθυσμούς ενός όγκου, μειώνοντας έτσι την πιθανότητα επανάληψης.

Παρατηρήσαμε ότι η CSC έχει τη δυνατότητα να επεκτείνει την πλευρά του πληθυσμού . Εξ ορισμού, τα κύτταρα μέσα σε έναν πληθυσμό που εμφανίζουν υψηλότερη εκροή της βαφής σύνδεσης DNA Hoechst 33342 μέσω ABCG2 αποτελούν το SP. Σε πολλαπλά καρκίνους έχουν αυτά τα κύτταρα έχουν παρατηρηθεί να είναι πιο καρκίνο βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν στη φύση, δηλαδή είναι περισσότερο ογκογονικά κύτταρα από μη-SP. Στη θεωρία, καρκινικά βλαστικά κύτταρα είναι υπεύθυνα για την υποτροπή της νόσου, λόγω της ικανότητάς τους να επιβιώνουν χημειοθεραπείας και εν συνεχεία ανακεφαλαίωση του αρχικού όγκου μέσω της αυτο-ανανέωση και διαφοροποίηση. Η παρατήρηση ότι τα κύτταρα SP δείχνουν υψηλότερη εκροής της βαφής σύνδεσης DNA και εμφανίζουν βλαστοκυττάρων-όπως συμπεριφορά είναι συνεπής με την ιδέα ότι καρκινικά βλαστικά κύτταρα πρέπει να αποτελέσει το χημειοανθεκτική πληθυσμού εντός ενός όγκου. Υπήρξε επίσης ενδείξεις που υποδηλώνουν ότι καρκινικά βλαστικά κύτταρα είναι υπεύθυνα για την εισβολή και τη μετάσταση. Έτσι, CSC που προκαλείται από την επέκταση της SP θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως απόδειξη μιας δυνητικά μυθιστόρημα παράδειγμα στο οποίο ο καπνός του τσιγάρου προκαλεί καρκίνο με την προώθηση ενός φαινοτύπου των κυττάρων του καρκίνου του στελέχους στο πλαίσιο των υφιστάμενων καρκινικά κύτταρα. Αρχικά, αυτά τα κύτταρα είναι καλοήθεις και άκρως διαφοροποιημένου, αλλά να ληφθεί ένα κακοήθη, αδιαφοροποίητα «καρκίνος βλαστικών κυττάρων» φαινότυπος κατόπιν υπέστη την έκθεση στον καπνό του τσιγάρου. . Περαιτέρω έρευνα σε αυτό το μοντέλο θα παρέχουν κριτική κατανόηση του πώς το κάπνισμα ξεκινά ο καρκίνος

Παρά το γεγονός ότι ορισμένες επιπτώσεις του εντάλματος CSC περαιτέρω έρευνα, οι συνέπειες αυτής της μελέτης παραμένουν σαφείς: οι ασθενείς με καρκίνο οι οποίοι συνεχίζουν να καπνίζουν τσιγάρα κατά τη διάρκεια της χημειοθεραπείας μπορεί να σταθεί για να φέρουν πολύ φτωχότερη πρόγνωση. Ως εκ τούτου, η διακοπή του καπνίσματος κατά τη διάρκεια της θεραπείας μπορεί να παίζει ένα σημαντικό ρόλο στη μεγιστοποίηση της πιθανότητας επιτυχίας. Επιπλέον, έχουμε προσδιορίσει νικοτίνη ως μεσολαβητής του φαρμάκου αντίστασης αποτέλεσμα προαγωγής της CSC. Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι η νικοτίνη, μία ένωση η οποία έχει εμπλακεί σε ογκογένεση μπορεί επίσης να έχει ένα ρόλο στην αντοχή φαρμάκου, πιθανώς μέσω της ρύθμισης της ABCG2. Είναι σημαντικό να διερευνηθούν περαιτέρω οι λεπτομερείς μηχανισμούς που διέπουν CSC-μεσολάβηση έκφραση ABCG2, και να αξιολογήσει την αποτελεσματικότητα των ABCG2 ως πιθανός στόχος φαρμάκου. Επίσης, θα ήταν χρήσιμο να καθορίσει τις άλλες συνέπειες της CSC που μπορεί να βοηθήσει την εξέλιξη του καρκίνου, ιδιαίτερα εκείνων που έχουν ως στόχο τον καρκίνο ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων.