Αφηρημένο

Ιστορικό

μετατροπέας σήματος και ενεργοποιητής της μεταγραφής 3 (STAT3) είναι ένας παράγοντας μεταγραφής που ρυθμίζει διάφορες κυτταρικές διαδικασίες όπως κυτταρική επιβίωση, αγγειογένεση και πολλαπλασιασμό. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε αυτό το betulinic οξύ (ΒΑ), ένα τριτερπενίου από το φλοιό των λευκών σημύδα, είχε τα ανασταλτικά αποτελέσματα επί υποξίας διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της STAT3 ανδρογόνων ανεξάρτητο ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη PC-3 κύτταρα.

Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση

ΒΑ ανέστειλε την έκφραση πρωτεΐνης και τις μεταγραφικές δραστηριότητες της υποξίας-διεγέρσιμο παράγοντα-1α (HIF-1α) υπό υποξικές συνθήκες. Σταθερά, BA μπλοκάρει φωσφορυλίωση που προκαλείται από υποξία, δραστικότητα δέσμευσης DNA και πυρηνική συσσώρευση του STAT3. Επιπλέον, η ΒΑ μείωσε σημαντικά κυτταρικά και εκκρινόμενα επίπεδα του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF), μια κρίσιμη αγγειογόνο παράγοντα και ενός γονιδίου στόχου της STAT3 που προκαλείται υπό υποξία. Επιπλέον, η ΒΑ εμπόδισε

in vitro

τριχοειδή σχηματισμό σωλήνα σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιας φλέβας (HUVECs) διατηρήθηκαν σε ρυθμισμένο μέσο από υποξική PC-3 κύτταρα, υπονοώντας αντι-αγγειογενετική δραστηριότητα της ΒΑ κάτω από υποξικές συνθήκες. Αξίζει να σημειωθεί ότι, χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση (chip) δοκιμασία αποκάλυψε ότι η BA ανέστειλε δέσμευση του HIF-1α και STAT3 με υποκινητή του VEGF. Επιπλέον, φίμωση STAT3 χρησιμοποιώντας επιμόλυνση siRNA ενισχυθεί αποτελεσματικά η μειωμένη παραγωγή VEGF που επάγεται από τη θεραπεία ΒΑ κάτω από την υποξία.

Συμπεράσματα /Σημασία

Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η ΒΑ έχει αντι-αγγειογενετική δραστηριότητα με τη διατάραξη η σύνδεση του HIF-1α και STAT3 στον υποκινητή του VEGF σε υποξικά κύτταρα PC-3

Παράθεση:. Shin J, Lee HJ, Jung DB, Jung JH, Lee HJ, Lee ΕΟ, et al. (2011) Καταστολή της STAT3 και HIF-1 άλφα Παρεμβαίνει αντι-αγγειογενετική δραστηριότητα των betulinic Οξύ σε Υποξική PC-3 Τα κύτταρα του καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 6 (6): e21492. doi: 10.1371 /journal.pone.0021492

Επιμέλεια: Karen L. Mossman, Πανεπιστήμιο McMaster του Καναδά

Ελήφθη: 16 Μάρτη 2011? Αποδεκτές: 29η Μαΐου 2011? Δημοσιεύθηκε: 24 Ιουνίου του 2011

Copyright: © 2011 Shin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την επιχορήγηση του Ιδρύματος Κορέας Επιστημών και Μηχανικής (KOSEF) που χρηματοδοτείται από την κυβέρνηση της Κορέας (MEST) (αρ 2011-0063466). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

μετατροπέας σήματος και ενεργοποιητής της μεταγραφής 3 (STAT3) είναι ένα από την οικογένεια πρωτεϊνών STAT και συστατικά που δραστηριοποιούνται σε ένα ευρύ φάσμα των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων [1]. Ενεργοποιημένος πρωτεΐνες STAT3 από κυτοκίνες και αυξητικούς παράγοντες σχηματίζουν ομο- ή ετεροδιμερή, και στη συνέχεια, μετατοπίζονται από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα, όπου συνδέεται με τον υποκινητή των διαφόρων προϊόντων γονιδίων που εμπλέκονται στην αντι-απόπτωση (Bcl-2, Bcl-x

L και survivin), πολλαπλασιασμό (κυκλίνη D1), και αγγειογένεση (αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF)) [2]. Είναι ενδιαφέρον ότι, πρόσφατες μελέτες ανέφεραν ότι STAT3 ενεργοποιείται σε απόκριση προς υποξία, ένα κοινό χαρακτηριστικό των διαφόρων συμπαγών όγκων [3], [4]. Η ενεργοποιημένη STAT3 μεσολαβεί στην προς τα πάνω ρύθμιση της υποξίας επαγώγιμου παράγοντα άλφα (HIF-1α), ένα σημαντικό ρυθμιστή να προσαρμόζεται κάτω από υποξικές συνθήκες με την αύξηση της σταθερότητάς της και μεταγραφική δραστηριότητα [5]. Έτσι, πρόσφατα STAT3 και HIF-1α είναι ελκυστικά μόρια στόχου με φυσικές ενώσεις και τα φυτικά εκχυλίσματα στην έρευνα για τον καρκίνο.

betulinic οξύ (BA), αναφέρθηκαν αρχικά ως ένα ανθρώπινο αναστολέα μελάνωμα ειδικά, είναι ένα τριτερπενοειδείς προέρχονται κυρίως από το φλοιό της λευκής σημύδας (

Betula pubescens

) [6]. Πρόσφατες ενδείξεις υποδεικνύουν τις αντικαρκινικές επιδράσεις της ΒΑ [7], [8], αντι-φλεγμονώδη [9] και αντι-ιικά [10] δραστηριότητες μέσω διαφόρων οδών σηματοδότησης όπως ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) [11], hedgehog [12], μετατροπέα σήματος και ενεργοποιητής της μεταγραφής 3 (STAT3) [13] και του πυρηνικού παράγοντα-κάπα Β (NF-κΒ) [14]. Παρ ‘όλα αυτά, δεν υπάρχει καμία απόδειξη ότι η BA μεσολαβεί αντικαρκινική δράση μέσω της αναστολής της STAT3 σηματοδότησης σε συμπαγείς όγκους.

Έτσι, στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε τους ρόλους των STAT3 και HIF-1 α σε επαγόμενα BA αντι- αγγειογενετική δραστηριότητα σε υποξικά PC-3 καρκίνου του προστάτη κύτταρα με ανάλυση ΜΤΤ, κηλίδωση Western, ανοσοκυτοχημεία, ELISA και EMSA.

Αποτελέσματα

κυτταροτοξική δράση του betulinic οξέος (ΒΑ) έναντι PC-3 κύτταρα

κυτταροτοξική δράση του BA (Εικ. 1) αξιολογήθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ. κύτταρα PC-3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις ΒΑ (0, 12.5, 25, 50 ή 100 μΜ) για 24 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μειώθηκε σε 78,49 ± 5,67 και 62,64 ± 1,26% σε συγκεντρώσεις 12,5 και 25 μΜ, αντίστοιχα, και διατηρούμενες to~60% σε πάνω από 25 μΜ (Σχ. 2Α).

Μοριακό βάρος = 456.

Η

(Α) κύτταρα PC-3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις ΒΑ (0, 12.5, 25, 50 ή 100 μΜ) για 24 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων αναλύθηκε με ανάλυση ΜΤΤ. (Β) Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε νορμοξία ή υποξία για 0,5, 2, 4, 6, 8, 12 ή 24 ώρες. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western για να προσδιοριστεί η έκφραση του HIF-1α. (C) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς BA (5 ή 10 μΜ) κάτω από νορμοξικές ή υποξικές συνθήκες για 4 ώρες. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western για να προσδιοριστεί η έκφραση του HIF-1α. (D) Πυρηνικό εκχύλισμα παρασκευάστηκε από τα κύτταρα που υπέστησαν αγωγή με BA (0, 10, 20 ή 40 μΜ) κάτω από νορμοξία ή υποξία για 4 ώρες. δραστικότητα μεταγραφής HIF-1α μετρήθηκε με τη χρήση Transam HIF-1 κιτ προσδιορισμού παράγοντα μεταγραφής. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± S.D.

##, σ & lt? 0,01

vs

έλεγχο φυσιολογική οξυγόνωση, και

*, p & lt? 0,05 και

** & lt? 0.01

vs

έλεγχο υποξία.

Η

Επίδραση του betulinic οξέος (BA) στην ενεργοποίηση του HIF-1α υποξία που προκαλείται σε κύτταρα PC-3

Η υποξία είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα συμπαγών όγκων [15] και HIF-1α είναι ένας παράγοντας μεταγραφής ότι οι απαντήσεις στην υποξία [16]. Για να εξεταστεί αν η ΒΑ μπορεί να επηρεάσει HIF-1α που προκαλείται από υποξία, προσδιορίσαμε πρώτα το καλύτερο χρονικό σημείο της έκφρασης HIF-1α που προκαλείται από υποξία σε κύτταρα PC-3. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε νορμοξία ή υποξία για 0,5, 2, 4, 6, 8, 12 ή 24 ώρες. έκφραση HIF-1α ήταν δραματικά επάγεται υπό υποξικές συνθήκες για 4 ώρες (Εικ. 2Β). Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς BA υπό υποξία για 4 ώρες. BA μειωμένη υποξία έκφραση που προκαλείται από HIF-1α σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο σε σύγκριση με τον έλεγχο υποξία (σχ. 2C). Επιπλέον, η υποξία ενεργοποιείται σημαντικά μεταγραφής HIF-1α ενώ θεραπεία BA ανέστειλε την υποξία μεσολάβηση μεταγραφική ενεργοποίηση του HIF-1α με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 2D). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η ΒΑ έχει την ικανότητα να αναστέλλουν την έκφραση, καθώς και τη μεταγραφή του HIF-1α σε υποξικά κύτταρα PC-3.

Επίδραση του betulinic οξέος (ΒΑ) με την ενεργοποίηση STAT3 υποξία επάγεται σε PC-3 κύτταρα

Πρόσφατες μελέτες ανέφεραν ότι ένας παράγοντας μεταγραφής STAT3 εμπλέκεται στη μεταγραφική ρύθμιση του HIF-1α [17]. Στη μελέτη μας, υποξία ενισχυμένη φωσφο-STAT3 επίπεδο, ενώ νορμοξίας δεν την επηρεάζει. θεραπεία BA ανέστειλε STAT3 φωσφορυλίωση υποξία μεσολάβηση με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 3Α). Επίσης, ο EMSA αποκάλυψε ότι η ΒΑ εμπόδισε την δραστικότητα δέσμευσης STAT3 /DNA υπό υποξία με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 3Β). Επιπλέον, imunocytochemical (ICC) χρώση με αντι-HIF-1α αντίσωμα έδειξε σημαντική πυρηνική έκφραση του HIF-1α υπό υποξικές συνθήκες. Αντίθετα, η θεραπεία BA εξασθενημένα έκφραση HIF-1α στον πυρήνα σε υποξικά κύτταρα PC-3 (Εικ. 3C), υποδεικνύοντας ανασταλτική δράση της επί της πυρηνικής μετατόπισης του HIF-1α.

κύτταρα PC-3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με ή χωρίς BA (5 ή 10 μΜ) κάτω από νορμοξικές ή υποξικές συνθήκες για 4 ώρες. (Α) Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western για φωσφο-STAT3 και STAT3. (Β) Τα πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν και εφαρμόστηκαν σε EMSA για να αναλυθεί η δραστικότητα σύνδεσης-STAT3 DNA. (C) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς BA (10 μΜ) κάτω από υποξία. Η ανοσοκυτταροχημεία εκτελέστηκε για STAT3. DAB (καστανό) και αιματοξυλίνη-ηωσίνη χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα και ένα αντιχρωματισμός, αντίστοιχα.

Η

Επιδράσεις της betulinic οξέος (ΒΑ) επί υποξία προκαλούμενη αγγειογένεσης

Η υποξία είναι μια από επαγωγείς αγγειογένεσης μέσω της ενεργοποίησης HIF-1α [18]. Έτσι, η ανασταλτική επίδραση της ΒΑ αξιολογήθηκε επί υποξία μεσολάβηση αγγειογένεσης. VEGF, ένας κρίσιμος παράγοντας αγγειογένεσης [19], αξιολογήθηκε στις εκκρίνονται κυτταρικό και πρωτεΐνη επίπεδα με ELISA και κηλίδωση Western, αντιστοίχως. BA μείωσε σημαντικά την παραγωγή VEGF με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο με ELISA (Σχ. 4Α). Σταθερά, BA εξασθενημένη έκφραση της πρωτεΐνης VEGF με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο με κηλίδωση Western (Εικ. 4Β).

(Α και Β) κύτταρα PC-3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0, 5 ή 10 μΜ ΒΑ για 24 ώρες . επίπεδα (Α) VEGF στα υπερκείμενα καλλιέργειας μετρήθηκαν με τη χρήση ενός κιτ Quantikine VEGF ELISA. (Β) Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western για να προσδιοριστεί η έκφραση του VEGF. Γραφήματα αντιπροσωπεύουν σχετικές εντάσεις ζώνη του VEGF /β-ακτίνης. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± S.D.

##, σ & lt? 0,01

vs

έλεγχο φυσιολογική οξυγόνωση, και

*, p & lt? 0,05 και

** & lt? 0,01

vs

έλεγχο υποξία. (Γ) HUVECs υποβλήθηκαν σε αγωγή με VEGF (20 ng /ml) ως θετικός έλεγχος ή το υπερκείμενο της καλλιέργειας από κύτταρα PC-3 υποβάλλεται σε επεξεργασία με ή χωρίς BA (10 μΜ) κάτω από νορμοξία ή υποξία. δοκιμασία σχηματισμού Tube διεξήχθη χρησιμοποιώντας παράγοντα ανάπτυξης μειώνεται Matrigel. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με Diff-Quick λύση, φωτογραφήθηκε τυχαία υπό μία Axiovert S 100 μικροσκόπιο φωτός σε μεγέθυνση χ 100 και μετρήθηκαν.

Η

Επιπλέον, δοκιμασία σχηματισμού σωλήνα HUVEC, η οποία είναι γνωστή ως ένα τυπικό αγγειογένεσης

in vitro

μοντέλο, διεξήχθη για να επιβεβαιωθεί αντι-αγγειογενετική δράση της ΒΑ επί υποξίας μεσολάβηση αγγειογένεσης. VEGF χρησιμοποιήθηκε ως ένας θετικός έλεγχος της επαγωγής αγγειογένεσης. HUVECs αναμιγνύεται με τα υπερκείμενα από κύτταρα PC-3 καλλιεργήθηκαν απουσία ή παρουσία της ΒΑ κάτω από υποξία. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4C, σχηματισμός σωλήνα που προκαλείται από υποξία αποτράπηκε με κατεργασία ΒΑ σε PC-3 κύτταρα ενώ σαφής σχηματισμός σωλήνας εκτέθηκε σε μη επεξεργασμένο μάρτυρα υπό υποξία, γεγονός που υποδηλώνει ότι η BA αναστέλλει υποξία μεσολάβηση αγγειογένεσης.

Επιδράσεις της betulinic οξύ (BA ) επί της συνδέσεως του STAT3 και HIF1 α να προαγωγό VEGF σε υποξικά κύτταρα PC-3

Πρόσφατες μελέτες αποκάλυψαν ότι η ενεργοποίηση STAT3 είναι απευθείας συνδέουν τη μεταγραφική ρύθμιση VEGF με σύνδεση προς τον υποκινητή του VEGF [20], [ ,,,0],21]. Υπό το πρίσμα αυτού του γεγονότος, πραγματοποιήσαμε χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση (chip) δοκιμασία. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Α, η δραστικότητα δέσμευσης του STAT3 και HIF-1α προς τον υποκινητή του VEGF ανιχνεύθηκε υπό υποξία (διαδρομές 5-8) σε σύγκριση με τη φυσιολογική οξυγόνωση (διαδρομές 1-4). Αξίζει να σημειωθεί ότι, η θεραπεία BA κατέστειλε την πρόσδεση του STAT3 και HIF-1α προς προαγωγό VEGF σε υποξική κατάσταση (διαδρομές 9-12).

(Α) κύτταρα PC-3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς BA (10 μΜ) κάτω από νορμοξία ή υποξία για 4 ώρες. Το ανοσοκαταβυθισμένο DNA με κουνέλι φυσιολογική IgG, HIF-1α ή αντίσωμα STAT3 ενισχύθηκε με ανάλυση PCR για υποστηρικτής VEGF. (Β) Τα κύτταρα διαμολύνθηκαν παροδικά με siRNA για σκαρφάλωμα ή STAT3 για 24 ώρες και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ή χωρίς BA (10 μΜ) για 18 ώρες κάτω από υποξία. επίπεδα VEGF στα υπερκείμενα καλλιέργειας μετρήθηκαν με τη χρήση ενός κιτ Quantikine VEGF ELISA. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± S.D.

#, p & lt? 0,05

vs έλεγχο

, και

*, p & lt? 0,05

vs έλεγχο

siRNA. λύματα κυττάρων υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western για φωσφο-STAT3, STAT3 και HIF-1α.

Η

Για να επιβεβαιώσετε τον κρίσιμο ρόλο της STAT3 σε αντι-αγγειογενετική ρύθμιση της ΒΑ σε υποξικά κύτταρα PC-3, STAT3 siRNA διαμόλυνση διεξήχθη σε PC-3 κύτταρα. Η θεραπεία με είτε BA ή STAT3 siRNA μείωσε την παραγωγή του VEGF κατά 39,6% και 45,9% αντίστοιχα, σε σύγκριση με μη κατεργασμένο έλεγχο. Επιπλέον, η θεραπεία BA μείωσε σημαντικά την παραγωγή VEGF από 63,25% σε STAT3 siRNA επιμολυσμένα PC-3 κύτταρα (Σχ. 5Β). Κηλίδωση Western αποκάλυψε ότι siRNA για STAT3, αλλά όχι έλεγχο, αποτελεσματικά μπλοκάρει STAT3 (Εικ. 5Β).

Συζήτηση

Ο καρκίνος του προστάτη χαρακτηρίζεται ως αδενοκαρκίνωμα είναι η δεύτερη πιο συχνή κακοήθης όγκοι στην αμερικανική άνδρες , με τις εκτιμήσεις των 192.280 νέες περιπτώσεις και περίπου 27.360 θάνατοι το 2009 [22], [23]. Betulinic οξύ (ΒΑ), ένα φυτό που προέρχεται από πεντακυκλικόν lupane τύπου τριτερπενοειδείς, μπορούν να εξαχθούν από διάφορα φυτά, όπως

Sarracenia flava

[24],

Diospyros

spp.,

Inga punctata

[25],

Ziziphus

spp., και

Vauquelinia corymbosa

[26]. Αρκετές ομάδες ανέφεραν αντικαρκινική δράση της ΒΑ σε διάφορους καρκίνους συμπεριλαμβανομένου του πνεύμονα, του παχέος εντέρου, του μαστού, του προστάτη και του καρκίνου του τραχήλου [27], αλλά όχι κανονικά κύτταρα [28]. Επίσης, η ΒΑ ανέστειλε πλήρως την ανάπτυξη του όγκου χωρίς τοξικότητα σε αθυμικούς ποντικούς που φέρουν ανθρώπινα μελανώματα [6]. Επιπλέον, αντικαρκινική δράση της ΒΑ ασκήθηκε από επαγωγή απόπτωσης στα καρκινικά κύτταρα. Για παράδειγμα, η BA-επαγόμενη απόπτωση ήταν ανεξάρτητη της ρ53 σε neurorectodermal όγκου [29] και κύτταρα μελανώματος [30]. Σε κύτταρα νευροβλαστώματος, ΒΑ επαγόμενη απόπτωση μέσω της απώλειας του δυναμικού μιτοχονδριακής μεμβράνης, αντιδραστικά είδη οξυγόνου ενεργοποίηση της παραγωγής και της κασπάσης (ROS) [31].

Είναι ενδιαφέρον, Karna και συνεργάτες ανέφεραν πρόσφατα ότι η ΒΑ ανέστειλε την έκφραση του HIF- 1α και αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) στα ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του ενδομητρίου [32]. Ωστόσο, οι ρυθμιστικοί μηχανισμοί της BA αναστέλλει την αγγειογένεση δεν είναι πλήρως κατανοητοί. Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι η ΒΑ κατέστειλε συσσώρευση πρωτεΐνης υποξία μεσολάβηση, μεταγραφική ενεργοποίηση και την πυρηνική εντόπιση του HIF-1α σε PC-3 κύτταρα. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα της χαρτί Karna, τα δεδομένα μας έδειξαν επίσης ότι η ΒΑ ανέστειλε σημαντικά την έκκριση VEGF και της έκφρασης πρωτεΐνης σε υποξικά κύτταρα PC-3. Επιπλέον,

in vitro

δοκιμασία σχηματισμού σωλήνα περαιτέρω επιβεβαίωσε αντι-angiogenenic επίδραση της ΒΑ σε υποξικά κύτταρα PC-3.

Πρόσφατα, Niu και οι συνεργάτες του πρότειναν ότι μόνιμα ενεργοποιημένη STAT3 up-ρύθμιση του VEGF και η προκλητή αγγειογένεσης όγκου [20]. Επίσης, Wei και συνεργάτες ανέφεραν ότι η ενεργοποίηση STAT3 ρυθμίζει την έκφραση του VEGF και ανθρώπινου παγκρεατικού αγγειογένεση καρκίνος Επιπλέον, αρκετά χαρτιά περιέγραψε το ρόλο της STAT3 ως δυνητικού ρυθμιστή του HIF-1α-επαγόμενη σηματοδότηση VEGF σε καρκινικά κύτταρα [4], [33] . Από αυτή την άποψη, η επίδραση της ΒΑ στην ενεργοποίηση STAT3 και HIF-1α εξετάστηκε σε υποξικά κύτταρα PC-3 στη μελέτη μας. Σύμφωνα με τις ενδείξεις από Pandey και συνεργάτες ότι η ΒΑ καταστέλλεται η ενεργοποίηση STAT3 σε πολλαπλά κύτταρα μυελώματος [13], η ΒΑ εμπόδισε φωσφορυλίωση τυροσίνης που προκαλείται από υποξία, το DNA δραστικότητα και την πυρηνική translocalization του STAT3 δέσμευσης, υποδηλώνοντας την ανασταλτική επίδραση της ΒΑ στην ενεργοποίηση STAT3.

υποκινητή του VEGF περιέχει διάφορες θέσεις πρόσδεσης μεταγραφικού παράγοντα, συμπεριλαμβανομένων STAT3 [20], καθώς και HIF-1 [34]. Φυσική αλληλεπίδραση της STAT3 με τους ελέγχους HIF-1 VEGF μεταγραφική ενεργοποίηση μέσω δέσμευσης τους με τον υποκινητή του VEGF [4]. Στη μελέτη μας, η υποξία προώθησε την πρόσδεση του STAT3 και HIF-1α προς τον υποκινητή VEGF σε κύτταρα PC-3. Σε αντίθεση, η ΒΑ ανέστειλε αξιοσημείωτα την σύνδεση του STAT3 και HIF-1α στη θέση υποκινητή του VEGF υπό υποξικές συνθήκες. Επιπλέον, φίμωση STAT3 χρησιμοποιώντας ειδικά siRNA σημαντικά ενισχυμένη BA-μεσολαβούμενη αναστολή της παραγωγής VEGF, υποδηλώνοντας την εμπλοκή του STAT3 σε αντι-αγγειογενετική ρύθμιση της ΒΑ σε υποξικά κύτταρα PC-3. Παρόμοια με τη μελέτη μας, Gariboldi και συνεργάτες ανέφεραν ότι NVP-AEW541, ένας αναστολέας IGFR1, διαταράσσεται IGF /STAT3 /HIF1 μονοπάτι σε ανθρώπινα κύτταρα γλοιοβλαστώματος [35]. Leeman-Νιλ και συνεργάτες ανέφεραν επίσης ότι Guggulsterone ανέστειλε STAT3 και HIF-1α και πρότεινε μια βιολογική λογική για περαιτέρω κλινικές BA έρευνα για ανθρώπινο κεφάλι και το λαιμό ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (HNSCC) θεραπεία [36].

Συλλογικά, μας τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι η ΒΑ κατασταλεί έκφραση και διενεργοποίησης της υποξίας που επάγεται HIF-1α, STAT3, VEGF καθώς και σχηματισμός τριχοειδών σωλήνων σε PC-3 κύτταρα. Είναι αξιοσημείωτο ότι αντικαρκινική δράση της ΒΑ εξασκείται μέσω αναστολής της αγγειογένεσης μέσω αναστολής της δέσμευσης του STAT3 και HIF-1α προς τον υποκινητή του VEGF σε κύτταρα PC-3. Έτσι, τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι η ΒΑ μπορεί να είναι ένα ισχυρό αντι-αγγειογόνο παράγοντα μέσω στόχευσης STAT3 /HIF-1α /VEGF σηματοδότηση για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

Ενώσεις

betulinic οξύ (ΒΑ) (Σχήμα 1) αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ) και διαλύθηκε σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) ως διάλυμα 10 mM στοκ για πειραματική χρήση.

Κυτταροκαλλιέργεια

Ανθρώπινο προστάτη καρκινική κυτταρική σειρά PC-3 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) και διατηρήθηκαν σε RPMI1640 (Welgene, Daegu, Κορέα) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) και 1% διάλυμα αντιβιοτικού-antimyotic. Ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιας φλέβας (HUVECs) απομονώθηκαν από φρέσκο ​​φλέβα ανθρώπινου ομφάλιου λώρου και διατηρήθηκαν σε ΕΒΜ-2 (Lonza, Valais, Switzerland) συμπληρωμένο με 2% FBS, 0.04% υδροκορτιζόνη, 0,1% VEGF, 0,1% IGF-1, 0,4 % hFGF-Β, 0,1% hEGF, 0,1% ασκορβικό οξύ, και 1% ηπαρίνη.

υποξία επαγωγή

τα κύτταρα επωάστηκαν σε αναερόβιο επωαστή σε 94% Ν

2, 5% CO

2 και 1% O

2 (Thermo επιστημονική, Rockford, IL) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [37].

η κυτταροτοξικότητα δοκιμασία

Για να αξιολογηθεί η κυτταροτοξικότητα της BA, 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ) δοκιμασία διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [38]. PC-3 κύτταρα απλώθηκαν πάνω σε 96-φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο και εκτέθηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις ΒΑ (0, 12.5, 25, 50 ή 100 μΜ) για 24 ώρες. διάλυμα ΜΤΤ (1 mg /ml) (Sigma-Aldrich) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκε για 2 ώρες στους 37 ° C. ρυθμιστικού εκχύλισης (20% SDS και 50% διμεθυλοφορμαμίδιο) προστέθηκε στη συνέχεια και η οπτική πυκνότητα (OD) μετρήθηκε χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλακός (Tecan Austria GmbH, Grödig, Αυστρία) στα 570 nm. Η βιωσιμότητα των κυττάρων υπολογίστηκε ως ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων σε BA-ομάδα αγωγής έναντι μη επεξεργασμένου ελέγχου, ακολουθώντας την εξίσωση

Η βιωσιμότητα των κυττάρων (%) = [OD (BA) – OD (Blank)]. /[OD (Control ) – OD (τυφλό)] χ 100

κηλίδος Western ανάλυση

εκχυλίσματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα λύσης [50 mM Tris (ρΗ 7.5), 150 mM NaCl, 1% Triton Χ -100, 0,01% SDS, 1 mM EDTA (ρΗ 8.0) και δισκία κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche Applied Science, Inndianapolis, ΙΝ)]. Πυρηνικά και κυτταροπλασματικά εκχυλίσματα που λαμβάνονται με κλασματοποιήθηκαν με τη χρήση NE-PER αντιδραστήρια πυρηνικά και κυτταροπλασματικά εκχύλισης (Thermo επιστημονικές, Rockford, IL). Τα δείγματα πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν σε πήκτωμα 10% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Η μεμβράνη αποκλείστηκε σε 5% άπαχο γάλα αποβουτυρωμένο, και ανιχνεύθηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα για HIF-1α (1:500, Gene Tex, Irvine, CA), STAT3 (1:1000, κυτταρική σηματοδότηση, Danvers, ΜΑ), φωσφο-STAT3 (1:500, Cell Signaling, Danvers, ΜΑ), VEGF (1:500, Santa Cruz βιοτεχνολογίες, Santa Cruz, CA) και β-ακτίνης (Sigma, St. Louis, ΜΟ) επί μία νύκτα στους 4 ° C. Οι μεμβράνες εκτέθηκαν σε συζευγμένο με HRP δεύτερα αντισώματα για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου και η έκφραση πρωτεΐνης ανιχνεύθηκε με χρήση ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL) αντιδραστήριο κηλίδωσης Western ανίχνευση (GE Health Care Bio-Sciences, Piscataway, NJ).

HIF-1α δραστικότητα μεταγραφής δοκιμασία

μεταγραφική δραστικότητα HIF-1α αναλύθηκε με δοκιμασία του παράγοντα μεταγραφής HIF-1α χρησιμοποιώντας Transam HIF-1 κιτ δοκιμασίας παράγοντα μεταγραφής (Active Motif, Carlsbad, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, πυρηνικά εκχυλίσματα προστέθηκαν σε μικροπλάκα 96-φρεατίων επικαλυμμένες με ολιγονουκλεοτίδια που περιέχουν το στοιχείο απόκρισης υποξίας (HRE) (5′-TACGTGCT-3 ‘) από το γονίδιο ερυθροποιητίνης (ΕΡΟ). διμερή HIF παρούσα σε πυρηνικά εκχυλίσματα δεσμεύονται με υψηλή εξειδίκευση σε αυτό το στοιχείο απόκρισης και στη συνέχεια ανιχνεύεται με ένα αντίσωμα που κατευθύνεται έναντι HIF-1α. Η προσθήκη ενός δευτερογενούς αντισώματος συζευγμένο με υπεροξειδάση (HRP) παρέχει μία ευαίσθητη χρωματομετρική ένδειξη που είναι εύκολα ποσοτικά με φασματοφωτομετρία. Οι τιμές εκφράζονται ως οπτική πυκνότητα (OD) στα 450 nm με ένα μήκος κύματος αναφοράς 655 nm.

Η ανοσοκυτταροχημεία

PC-3 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 4 θαλάμων σε πυκνότητα 3 × 10

4 κύτταρα ανά θάλαμο και να αντιμετωπίζονται είτε με είτε χωρίς BA (10 μΜ) κάτω από υποξία, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [37]. Τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε διάλυμα φορμαλδεΰδης 4% επί 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και αποκλείστηκαν σε ρυθμιστικό αποκλεισμού (10% BSA /Triton Χ-100 σε PBS) που περιέχει 6% ορό αλόγου για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Τα πλακίδια επωάστηκαν με αντι-STAT3 (1: 100) αντίσωμα όλη τη νύκτα στους 4 ° C και έπειτα ανιχνεύθηκαν με βιοτινυλιωμένα αντισώματα αντι-ποντικού ή κουνελιού (Vector Labs, Burlingame, CA) επί 1,5 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Η έκφραση ανιχνεύθηκε με τη χρήση Vector ABC σύμπλοκο /σετ HRP (Vector Labs, Burlingame, CA) και το χρώμα αναπτύχθηκε με-3,3′-διαμινοβενζιδίνη τετραϋδροχλωρική σε σκοτάδι. Τα δείγματα στη συνέχεια βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη-ηωσίνη (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) και αναλύθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο (Leica Microsystems Res., Wetzlar, Germany).

δοκιμασία μετατόπισης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας (EMSA)

Η πρόσδεση αναλύθηκε με δοκιμασία μετατόπισης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας (EMSA) με χρήση κιτ Gelshift χημιφωταύγειας EMSA (Active Motif, Carlsbad, CA) όπως περιγράφεται προηγουμένως STAT3-DNA [39]. Εν συντομία, πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν από κύτταρα ανηθόλη επεξεργασία και επωάζονται με STAT3 συναίνεση ολιγονουκλεοτίδια (5′-CTT CAT TTC CCG ΤΑΑ ATC ΚΔ ΑΑΑ GCT-3 ‘) (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA). Το σύμπλοκο DNA-πρωτεΐνης που σχηματίζεται διαχωρίζεται από το ελεύθερο ολιγονουκλεοτίδια σε γέλες φυσικής πολυακρυλαμίδης 5%. Χημειοφωταύγειας ανίχνευση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση αντιδραστηρίων ECL σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του προμηθευτή (GE Health Care Bio-Sciences, Piscataway, NJ).

In vitro σωλήνα δοκιμασία σχηματισμού

In vitro δοκιμασία σχηματισμού σωλήνα διεξάγεται όπως περιγράφηκε προηγουμένως [40]. Matrigel (BD) προστέθηκε σε πλάκες 24 φρεατίων και πολυμερίζεται με επώαση για 1 ώρα στους 37 ° C. HUVECs σπάρθηκαν επί Matrigel επικαλυμμένες πλάκες και επωάστηκαν σε ΕΒΜ-2 συμπληρωμένο με VEGF (20 ng /ml) ή το υπερκείμενο από κύτταρα PC-3 υποβάλλεται σε επεξεργασία με BA (0 ή 10 μΜ) κάτω από νορμοξία ή υποξία για 24 ώρες. Μετά από 8 ώρες επώασης, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 4% φορμαλδεΰδη και τυχαία επιλεγμένα πεδία φωτογραφήθηκαν υπό Axiovert S 100 μικροσκόπιο φωτός (Carl Zeiss, Weimar, Γερμανία) στα 100 × μεγέθυνση.

Ένζυμο-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία ( ELISA) για τον VEGF

κύτταρα PC-3 καλλιεργήθηκαν σε 60-mm δίσκο σε πυκνότητα 1 × 10

6 κύτταρα /πλάκα και επωάζονται απουσία ή παρουσία του BA (10 μΜ) κάτω από νορμοξία ή υποξία για 24 ώρες. επίπεδο VEGF στο υπερκείμενο μετρήθηκε με χρήση ανθρώπινων κιτ VEGF ELISA σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Biosource International Inc., Camarillo, CA).

χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση (chip) δοκιμασία

PC-3 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία των 100 mm σε πυκνότητα 1,5 × 10

6 κύτταρα /δίσκο, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΒΑ για 4 ώρες κάτω από νορμοξικές ή υποξικές συνθήκες και στη συνέχεια 1% φορμαλδεΰδη και 0.125 Μ γλυκίνη. Τα διαλυτά χρωματίνη απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας EZ-προζύμι kit χρωματίνης prep (Millipore, Billerica, ΜΑ) και ανοσοκατακρημνίσθηκαν με αντισώματα της κανονικής IgG κουνελιού (EMD Biosciences, Gibbstown, NJ), ο HIF-1α ή STAT3. διασταυρωμένες συνδέσεις ιστόνης /DNA αντιστράφηκαν με την προσθήκη 5 Μ NaCl στους 65 ° C για 4 ώρες, που ακολουθείται από εκχύλιση φαινόλης /χλωροφορμίου και καταβύθιση αιθανόλης. αντίδραση PCR διεξήχθη για να ενισχύσει υποκινητή VEGF χρησιμοποιώντας εκκινητές τσιπ (αίσθηση 5′-AGACTCCACAGTGCATACGTG-3 ‘και 5′-αντινόημα AGTGTGTCCCTCTGACAATG-3’.

siRNA trasnfection

PC-3 κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με σκαρφάλωμα ή STAT3 siRNA (SantaCruz βιοτεχνολογία, SantaCruz, CA) σε 50 ηΜ με τη χρήση ΠΑΡΕΜΠΟΔΙΣΗ siRNA αντιδραστηρίου επιμόλυνσης (Polyplus επιμόλυνση Inc., New York, ΝΥ). Μετά από επώαση για 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με BA και διατηρήθηκε για 18 ώρες κάτω από υποξία.

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± SD στατιστική σημαντικότητα αναλύθηκε με έλεγχος τ.