Αφηρημένο

Δύο βασικά γεγονότα, δηλαδή την προσκόλληση και την εισβολή, είναι ζωτικής σημασίας για την εμφάνιση της μετάστασης. Είναι σημαντικό ότι η kDa υποδοχέα λαμινίνης 37 kDa /67 (LRP /LR) έχει ενοχοποιηθεί για την ενίσχυση αυτών των δύο γεγονότων διευκολύνοντας έτσι την πρόοδο του καρκίνου. Στην παρούσα μελέτη, ο ρόλος του LRP /LR στην προσκόλληση και εισβολή καρκίνου του ήπατος (HUH-7) και κυττάρων λευχαιμίας (Κ562) ερευνήθηκε. Η κυτταρομετρία ροής έδειξε ότι τα κύτταρα ΗυΗ- 7 εμφανίζεται επίπεδα σημαντικά υψηλότερα κυτταρική επιφάνεια LRP /LR σε σύγκριση με την κακώς-διηθητικού καρκίνου του μαστού (MCF-7) κύτταρα ελέγχου, ενώ τα κύτταρα Κ562 που εμφανίζονται επίπεδα σημαντικά χαμηλότερα κυτταρική επιφάνεια LRP /LR σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου MCF-7. Ωστόσο, κηλίδωση Western και πυκνομετρική ανάλυση απεκάλυψε ότι και οι τρεις ογκογόνες κυτταρικές σειρές δεν διέφεραν σημαντικά σε σχέση με τα συνολικά επίπεδα LRP /LR. Επιπλέον, η θεραπεία των ηπατικών καρκινικών κυττάρων με αντι-LRP /LR ειδικό αντίσωμα IgG1-iS18 ​​(0,2 mg /ml) μείωσε σημαντικά τη συγκολλητική δυναμικό των κυττάρων σε λαμινίνη-1 και την επεμβατική δυναμικό των κυττάρων μέσω της ECM-όπως Matrigel, ενώ λευχαιμία κύτταρα δεν έδειξαν σημαντικές διαφορές στις δύο περιπτώσεις. Επιπλέον, οι συντελεστές συσχέτισης Pearson πρότεινε την άμεση αναλογικότητα μεταξύ LRP επίπεδα κυτταρικής επιφάνειας /LR και την κόλλα και επεμβατικές δυνατότητες του καρκίνου του ήπατος και των κυττάρων λευχαιμίας. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν την πιθανή χρήση των αντι-LRP /LR ειδικό αντίσωμα IgG 1-iS18 ​​ως εναλλακτικό θεραπευτικό εργαλείο για τον μεταστατικό καρκίνο του ήπατος μέσω εμπόδιο της αλληλεπίδρασης LRP /LR- λαμινίνη-1

Παράθεση:. Chetty C, Khumalo T, Da Costa Dias Β, Reusch U, Knackmuss S, Μικρή M, et al. (2014) Αντι-LRP /LR Ειδική αντίσωμα IgG 1-iS18 ​​εμποδίζει πρόσφυση και διείσδυση των κυττάρων καρκίνου του ήπατος. PLoS ONE 9 (5): e96268. doi: 10.1371 /journal.pone.0096268

Επιμέλεια: Corinne Ida Lasmezas, Ο Scripps Research Institute Scripps Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 25, Νοεμβρίου 2013? Αποδεκτές: 4 του Απρίλη του 2014? Δημοσιεύθηκε: 5 Μαΐου του 2014

Copyright: © 2014 Chetty et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών, της Δημοκρατίας της Νοτίου Αφρικής και του Συμβουλίου Ιατρικών Ερευνών, της Δημοκρατίας της Νοτίου Αφρικής. Οποιεσδήποτε απόψεις, τα ευρήματα και τα συμπεράσματα ή τις συστάσεις που εκφράζονται σε αυτό το υλικό είναι αυτές του συγγραφέα (s), και, ως εκ τούτου, το Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών δεν αποδέχεται καμία ευθύνη σε αυτό το πλαίσιο αυτό. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. S.F.T.W. είναι σήμερα ένα PLoS ONE Συντακτική μέλος του Διοικητικού Συμβουλίου. U.R., S.K. και Μ.Ι. είναι συνδεδεμένες με ή που απασχολούνται από Affimed Therapeutics A.G., μία εμπορική εταιρεία η οποία παράγει θεραπευτικά αντισώματα για τη θεραπεία του καρκίνου και φλεγμονωδών νόσων. Περαιτέρω, τα αντισώματα αντι-LRP /LR που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη για τον αποκλεισμό της εισβολής και της προσκόλλησης έχουν περιγραφεί σε δύο διεθνή διπλώματα ευρεσιτεχνίας ως πιθανοί θεραπευτικοί αντικαρκινικά εργαλεία. Δηλαδή ευρεσιτεχνία, EP0984987, με τίτλο «Μια διαλυτός πρόδρομος του υποδοχέα λαμινίνης και μεθόδους για την αναστολή των αλληλεπιδράσεων του» έχει απαιτήσεις κατευθύνεται σε μια φαρμακευτική σύνθεση που περιλαμβάνει ένα διαλυτό πρόδρομο υποδοχέα λαμινίνης ή λειτουργικό παράγωγο ή θραύσμα αυτού και ανήκει στο Πανεπιστήμιο του Witwatersrand. Αυτό το δίπλωμα ευρεσιτεχνίας έχει επικυρωθεί στο Ηνωμένο Βασίλειο και τη Γερμανία. Το δεύτερο δίπλωμα ευρεσιτεχνίας, EP1670826, είναι συνιδιοκτησία από το Πανεπιστήμιο του Witwatersrand και Affimed Therapeutics AG και έχει τίτλο «αλυσίδα αντισώματος που δρουν ενιαία έναντι 37 kDa /67 υποδοχέα λαμινίνη kDa ως εργαλεία για τη διάγνωση και τη θεραπεία των ασθενειών prion και τον καρκίνο, την παραγωγή και τη χρήση τους ». Αυτό χορηγείται ευρωπαϊκό δίπλωμα ευρεσιτεχνίας ελέγχθηκε στο Ηνωμένο Βασίλειο, τη Γαλλία, τη Γερμανία, την Ελβετία και την Αυστρία. Οι απαιτήσεις κατευθύνεται σε ένα μόριο αντισώματος μονής αλυσίδας που στοχεύουν ειδικά LRP /LR για τη θεραπεία ασθενειών prion ή καρκίνο. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Ο καρκίνος είναι μια παγκόσμιας επιβάρυνσης που έχει αποδειχθεί ότι είναι η κύρια αιτία θανάτου σε οικονομικά ανεπτυγμένες χώρες και η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου στις οικονομικά αναπτυσσόμενες χώρες [1]. Σύμφωνα με το Παγκόσμιο Ταμείο καρκίνου Έρευνας (WCRF), εκτιμάται ότι 14,1 εκατ περιπτώσεις καρκίνου διαγνώστηκαν κατά το έτος 2012 και προβλέπεται ότι περίπου 24 εκατομμύρια νέες περιπτώσεις καρκίνου θα διαγνωστούν από το έτος 2035, σε παγκόσμιο επίπεδο (http: //www.wcrf.org/cancer_statistics/). Επί του παρόντος, ο καρκίνος του πνεύμονα έχει αναγνωριστεί ως η πιο συχνά διαγιγνώσκεται τύπου καρκίνου, με τα δύο είδη του καρκίνου κεντρικής σημασίας για την παρούσα μελέτη δηλαδή του καρκίνου του ήπατος και λευχαιμία, να κατατάσσονται ως έκτη και ενδέκατη πιο διαγνωστεί τύπους καρκίνου, αντίστοιχα (GLOBOCAN). Έχει αναφερθεί ότι περίπου 782.000 περιπτώσεις καρκίνου του ήπατος και 352.000 περιπτώσεις λευχαιμίας διαγνώστηκαν κατά το έτος 2012 (https://www.wcrf.org/cancerstatistics/world statistics.php καρκίνο), υποδεικνύοντας έτσι την επιτακτική ανάγκη για την ανάπτυξη αποτελεσματικών θεραπείες κατά του καρκίνου.

Cells εξαρτώνται από την εξωκυτταρική μήτρα (ECM), που είναι η μη κυτταρική συνιστώσα όλων των ιστών και οργάνων που παρέχει ένα φυσικό ικρίωμα από τα κυτταρικά συστατικά και επίσης σε μεγάλο βαθμό βοηθά με την έναρξη των απαραίτητων βιοχημικών διεργασίες που απαιτούνται για την σωστή διαφοροποίηση των ιστών, ομοιόσταση και μορφογένεση [2]. Κύτταρα να τηρούν την ECM μέσω της δράσης της ECM υποδοχέων [2]. Ιδιαίτερα, ο υποδοχέας λαμινίνης μη-ιντεγκρίνης 37-kDa /67-kDa (LRP /LR) είναι ένα σημαντικό συστατικό της εξωκυττάριας μήτρας, βοηθώντας σε πολλές φυσιολογικές διαδικασίες [3], [4], [5]. Προτείνεται ότι 37-kDa LRP είναι ο πρόδρομος του LR υποδοχέα λαμινίνης 67-kDa υψηλή συγγένεια, όμως, ο ακριβής μηχανισμός με τον οποίο ο πρόδρομος σχηματίζει τον υποδοχέα είναι άγνωστη [6].

LRP /LR είναι κατά κύριο λόγο ένας διαμεμβρανικός υποδοχέας, ωστόσο, είναι επίσης εμφανές στον πυρήνα και τα κυτοσόλιο [7], [8]. Στο πυρήνα, LRP /LR παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στη διατήρηση της πυρηνικής δομών ενώ στο κυτταρόπλασμα, βοηθά στην μεταφραστικές διεργασίες [8]. Ως υποδοχέα διαμεμβράνης, LRP /LR εξυπηρετεί αρκετές λειτουργίες, όπως η κυτταρική μετανάστευση [9], η προσκόλληση κυττάρου-μήτρας [10], η βιωσιμότητα των κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό [3], [4], [5].

LRP /LR έχει αποδειχθεί ότι έχουν υψηλή συγγένεια δέσμευσης για λαμινίνη-1. Λαμινίνη-1 είναι μέρος μιας οικογένειας λαμινίνες, οι οποίες είναι πρωτεΐνες εξωκυτταρικής μήτρας που συνιστούν διάφορες μη κολλαγονούχες γλυκοπρωτεΐνες που βρίσκονται στη βασική μεμβράνη [11], [12]. Αυτή η γλυκοπρωτεΐνη πιστεύεται ότι παίζουν κρίσιμους ρόλους στην κυτταρική προσκόλληση [11], η συναρμολόγηση της βασικής μεμβράνης [11], την κυτταρική ανάπτυξη και διαφοροποίηση [13], η κυτταρική μετανάστευση [11], [14], την έκφυση νευριτών [11], [15 ] και την αγγειογένεση [16]. Λαμινίνη-1 έχει αποδειχθεί επίσης για την προώθηση της επεμβατική φαινότυπο των ογκογόνων κυττάρων [17].

LRP /LR έχει βρεθεί να είναι υπερ-εκφράζεται στην επιφάνεια πολλών ογκογόνων κυττάρων [18]. Το αποτέλεσμα αυτής της υπερ-έκφραση είναι αυξημένη αλληλεπίδραση μεταξύ LRP /LR και λαμινίνη-1, και αυτή η αλληλεπίδραση έχει αποδειχθεί ότι είναι ζωτικής σημασίας για την ενίσχυση της πρόσφυσης και εισβολή – δύο βασικά συστατικά της μετάστασης [19]. Ουσιαστικά, η λαμινίνη-1 στη βασική μεμβράνη αλληλεπιδρά με LRP /LR στην επιφάνεια των ογκογονικών κυττάρων που οδηγεί σε προσκόλληση [19]. Αυτό, με τη σειρά του, έχει ως αποτέλεσμα την έκκριση πρωτεολυτικών ενζύμων όπως η κολλαγενάση IV τύπος προκειμένου να υδρολυθεί το κολλαγόνο τύπου IV στη βασική μεμβράνη, επιτρέποντας έτσι ογκογόνα κύτταρα να εισβάλουν και τελικά μετατοπίζονται στον δευτερεύοντα χώρο [19].

Δεδομένου ότι η αλληλεπίδραση LRP /LR-λαμινίνη-1 έχει ταυτοποιηθεί ως το κρίσιμο συμβάν στην προσκόλληση και εισβολή, απόφραξη αυτής της αλληλεπίδρασης θα μπορούσε να θεωρηθεί ως ένα ουσιαστικό μηχανισμό για τη θεραπεία του μεταστατικού καρκίνου. Αυτό εμπλέκει LRP /LR ως στόχος για τη θεραπεία του μεταστατικού καρκίνου. Επιπλέον, διάφορες μελέτες έχουν δείξει ότι η εφαρμογή του αντι-LRP /LR ειδικά αντισώματα μειώνει σημαντικά την κόλλα και επεμβατική δυναμικό ορισμένων ογκογόνων κυττάρων, όπως ΗΤ1080 ινοσαρκώματος [18], του πνεύμονα [4], του τραχήλου της μήτρας [4], του παχέος εντέρου [4] , του προστάτη [4], του μαστού [20] και του οισοφάγου [20] καρκινικά κύτταρα. Ιδιαίτερα, αντι-LRP /LR ειδικό αντίσωμα IgG 1-iS18 ​​έχει προταθεί να διακόψει την αλληλεπίδραση-λαμινίνη-1 LR LRP /[4], έτσι IgG1-iS18 ​​μπορεί να θεωρηθεί ως ένα πιθανό θεραπευτικό εργαλείο στη θεραπεία του μεταστατικού καρκίνου.

Στη μελέτη αυτή, η ικανότητα των αντι-LRP /LR-ειδικό αντίσωμα IgG1-iS18 ​​να εμποδίσουν την κόλλα και επεμβατική δυναμικό της λευχαιμίας και του καρκίνου του ήπατος κυττάρων διερευνήθηκε. Λόγω της υψηλής συχνότητας εμφάνισης και θνησιμότητας όσον αφορά αυτούς τους δύο τύπους καρκίνου, εναλλακτικές θεραπευτικές επιλογές καταστεί αναγκαία. Αξίζει να σημειωθεί ότι έχουν παρόμοιες μελέτες έχουν διεξαχθεί, ωστόσο, είναι πιθανό ότι δεν είναι όλοι οι μεταστατικού τύπους καρκίνου κύτταρο μπορεί να αποκρίνεται σε θεραπείες IgG1-iS18. Καθίσταται συνεπώς αναγκαία για την εκτέλεση αυτών μεταστατικό μελέτες σε διαφορετικούς τύπους καρκίνου, προκειμένου να αποκτήσουν γνώσεις σχετικά με την χρήση του αντισώματος ως εναλλακτική ευρύ φάσμα θεραπευτικών αντισωμάτων για την θεραπεία διαφόρων τύπων καρκίνου. Έτσι, αυτή η μελέτη διεξήχθη με σκοπό να καθοριστεί εάν IgG1-iS18 ​​είναι ικανό να μειώνει σημαντικά την κόλλα και επεμβατική δυναμικό της λευχαιμίας και του καρκίνου του ήπατος κύτταρα, παρέχοντας έτσι τη δυνατότητα του αντισώματος που πρόκειται να χρησιμοποιηθεί ως εναλλακτική λύση θεραπευτικό εργαλείο στην αντιμετώπιση αυτών των δύο τύπων καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια και συνθήκες

αδενοκαρκίνωμα ανθρώπινου μαστού (MCF-7), καρκίνωμα ήπατος (HUH7) και λευχαιμία (Κ562) κυτταρικές γραμμές ελήφθησαν από την ΑΤΟΟ καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Eagle του Dulbecco (DMEM) υψηλής γλυκόζης (4.5 g /l) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη σε 5% CO

2 και 37 ° C.

Αντιδραστήρια και αντισώματα

Matrigel που χρησιμοποιούνται για δοκιμασίες κυτταρικής εισβολής προέρχεται από το Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) σάρκωμα ποντικού και αποκτήθηκε από την BD Biosciences.

λαμινίνη 1used για δοκιμασίες κυτταρικής προσκόλλησης ελήφθη από την Sigma-Aldrich.

ακετυλοτρανσφεράση χλωραμφαινικόλης (CAT) αντίσωμα ελήφθη από την Sigma-Aldrich.

IgG1-iS18 ​​έγινε παράγεται με ανασυνδυασμό σε ένα σύστημα έκφρασης θηλαστικών, όπως αναφέρθηκε από

Zuber et al., (2008)

ομοεστιακή μικροσκόπιο

για να απεικονίσει τη θέση του LRP /LR στην επιφάνεια των κυττάρων, συνεστιακή μικροσκοπία χρησιμοποιήθηκε. Τα κύτταρα πρώτα σπάρθηκαν σε καλυπτρίδες και αφέθηκαν να φθάσουν 70% συρροή. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη σε PBS για περίπου 15 λεπτά ακολουθούμενο από αρκετές πλύσεις με PBS. Τα κύτταρα αποκλείστηκαν σε 0.5% BSA σε PBS για 5-10 λεπτά. Μετά από μία PBS πλύση, περίσσεια PBS καθάρισε μακριά. μπόλια Cover που περιέχουν κύτταρα τοποθετήθηκαν σε ένα γυάλινο slide (με κύτταρα βλέπει προς τα επάνω) και αυτό ακολουθήθηκε από προσθήκη του πρωτογενούς αντισώματος IgG1-iS18 ​​(1:100) αραιωμένο σε 0,5% BSA. Δημοσίευση μια ολονύκτια επώαση στους 4 ° C, καλυπτρίδες ξεπλύθηκαν τρεις φορές σε PBS /BSA. Μετά την προσθήκη του συζευγμένου με FITC δευτερογενές αντίσωμα που είχε αραιωθεί σε 0.5% BSA, επώαση στο σκοτάδι αφέθηκε για 1 ώρα. Ακολουθούμενη από τρεις εκπλύσεις όπως και πριν, ϋΑΡΙ αραιωμένο σε PBS στη συνέχεια χορηγείται επί 5-10 λεπτά ώστε να επιτραπεί για χρώση του πυρήνα. Τα κύτταρα τελικά πλένονται μία φορά σε PBS μόνο και τοποθετήθηκαν σε καθαρή αντικειμενοφόρο χρησιμοποιώντας GelMount (Sigma-Aldrich). Μια περίοδος 45 λεπτών διατέθηκε να καταστεί δυνατή η ρύθμιση να λάβει χώρα.

Η κυτταρομετρία ροής

Η ποσοτικοποίηση των επιπέδων της κυτταρικής επιφάνειας της LRP /LR διεξήχθη χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. EDTA (5 mM) σε PBS χρησιμοποιήθηκε για να διευκολύνει την αποκόλληση των προσκολλημένων κυττάρων η οποία ακολουθήθηκε από φυγοκέντρηση στις 1200 rpm, 10 min. Τα κύτταρα στη συνέχεια καθορίζεται από επαναιώρηση κυττάρων σε PFA για 10 λεπτά στους 4 ° C. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν ξανά σε φυγοκέντρηση σε 1Χ PBS που επέτρεψε την παρασκευή των πέντε κυτταρικών εναιωρημάτων, το ένα στο οποίο δεν προσετέθη αντίσωμα (εξυπηρετώντας έτσι ως ακηλίδωτος ελέγχου), με το οποίο αντίσωμα αντι-CAT προστέθηκε (που εξυπηρετεί ως ισοτυπικός έλεγχος) και ένα στο οποίο προστέθηκε αντι-LRP /LR ειδικό αντίσωμα IgG1-iS18. Τα υπόλοιπα δύο κυτταρικά εναιωρήματα επωάστηκαν μόνο σε PBS προκειμένου να χρησιμοποιηθούν ως αρνητικοί μάρτυρες για την IgG1-iS18 ​​και αντίσωμα αντι-CAT. Όλα τα αιωρήματα επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Μετά από τρεις βαθμίδες πλύσεως με 1Χ PBS, κατσίκα αντι-ανθρώπινο φυκοερυθρίνη (ΡΕ) -συζευγμένων δευτερεύον αντίσωμα (Beckman Coulter) προστέθηκε στο κυτταρικό εναιώρημα που περιέχει το πρωτογενές αντίσωμα IgG1-iS18 ​​καθώς και ένα από τα εναιωρήματα που επωάστηκε σε PBS μόνο . Το εναιώρημα των κυττάρων που επωάστηκε με το αντίσωμα αντι-CAT, καθώς και το υπόλοιπο κυτταρικό εναιώρημα που επωάστηκε μόνο σε PBS, αμφότερα συμπληρωθεί με αλλοφυκοκυανίνη κατσίκας αντι-κουνελιού (APC) -συζευγμένων δευτερογενές αντίσωμα που ακολουθείται από άλλη περίοδο 1 ώρα επώαση όλων των αναστολών των κυττάρων. Επιπλέον, τρεις εκπλύσεις μετα-επώασης διεξήχθησαν και εναιωρήματα κυττάρων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το BD Accuri C6 κυτταρόμετρο ροής. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

SDS PAGE και κηλίδωση Western

επίπεδα Σύνολο LRP /LR προσδιορίστηκαν με τη χρήση ηλεκτροφόρησης πηκτής πολυακρυλαμιδίου δωδεκυλ θειικού νατρίου (SDS-PAGE ). Για την εκτέλεση της SDS-PAGE, χρησιμοποιήθηκε 10 μg ολικής πρωτεΐνης. Οι πρωτεΐνες που διαχωρίστηκαν σύμφωνα με το μέγεθος με SDS-PAGE στη συνέχεια προσδιορίζονται από την εφαρμογή των ειδικών αντισωμάτων κατά τη διαδικασία της κηλίδωση Western. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου του μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη φθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) με τη χρήση ρυθμιστικού διαλύματος μεταφοράς 1Χ (20% μεθανόλη σε 192 mM γλυκίνη και 25 mM Tris) για 45 λεπτά στους 350 mV και μια συσκευή μεταβίβασης ημίξηρο. ρυθμιστικό διάλυμα (3% BSA σε PBS 1Χ Tween) Αποκλεισμός χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια για να μπλοκάρουν την κηλιδωμένη μεμβράνη για 1 ώρα. Μόλις μπλοκαριστεί, η μεμβράνη ανιχνεύτηκε με αντι-LRP /LR ειδικό πρωτογενές αντίσωμα IgG1-iS18 ​​(1:10000) για 1 ώρα. Πριν από την επώαση της μεμβράνης με κατσίκα-αντι-ανθρώπινο-υπεροξειδάσης (1:5000) δευτερεύον αντίσωμα, διεξήχθησαν τρεις πλύσεις με PBS 1Χ Tween. Τρεις περαιτέρω εκπλύσεις σε 1Χ PBS Tween διεξήχθησαν μετά την επώαση στο δευτερογενές αντίσωμα, που ακολουθείται από την ανίχνευση του HRP με χρήση ενισχυμένης χημειοφωταύγειας υποστρώματος (Thermo Scientific). Το προκύπτον φθορισμός αναπτύχθηκε και στερεώνεται πάνω σε ένα φιλμ ακτίνων Χ. Πειράματα εκτελέστηκαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τουλάχιστον 3 φορές.

Πρόσφυση δοκιμασία

Για να εκτιμηθεί η συγκολλητική δυναμικό των ποικίλες κυτταρικές σειρές ογκογόνων στη βασική μεμβράνη

in vitro

, λαμινίνη-1 (10 μg /ml) (BD Biosciences) χρησιμοποιήθηκε για την επίστρωση πλακιδίων 96 μικροοπών, αφήνοντας μη επικαλυμμένα φρεάτια που θα χρησιμοποιηθούν ως αρνητικοί έλεγχοι. Μετά την επίστρωση των φρεατίων για 1 ώρα και έκπλυση με 0.1% BSA σε DMEM, άλλες θέσεις πρόσδεσης πρωτεΐνης επί της μικροπλάκας φράχθηκαν χρησιμοποιώντας 100 μΐ 0,5% BSA σε DMEM για μία ώρα. Τα κύτταρα αιωρήθηκαν σε μέσο καλλιέργειας χωρίς ορό και προστέθηκαν στα φρεάτια σε πυκνότητα 4 Χ 10

5 κύτταρα /ml προκειμένου να αξιολογηθεί το δυναμικό πρόσφυση. Περαιτέρω, κύτταρα τα οποία έχουν προ-επωαστεί με IgG1-iS18 ​​(0,2 μg /ml) και με αντι-CAT (Sigma, 0,2 μg /ml) αντίσωμα ως αρνητικός έλεγχος προστέθηκαν στις σχετικές φρεάτια προκειμένου να εξεταστούν οι επιδράσεις της τα αντισώματα για τις δυνατότητες προσκόλληση των κυττάρων. Οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 ° C για 1 ώρα και στη συνέχεια, τα μη προσκολλημένα κύτταρα πλύθηκαν μακριά με PBS και τα προσκολλημένα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 10 λεπτά. Τα προσκολλημένα κύτταρα χρωματίσθηκαν με 0,1% κρυσταλλικό ιώδες. Η χρωστική εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας 1% SDS και η απορρόφηση του εκχυλίσματος του δείγματος στα 550 nm προσδιορίστηκε ως ένα μέτρο της κόλλας δυναμικό. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

Εισβολή δοκιμασία

In vitro

ανάλυση της ικανότητας των ογκογόνων κυτταρικών σειρών για να εισβάλουν τη βασική μεμβράνη διεξήχθη χρησιμοποιώντας το ECM-όπως Matrigel. Άνευ ορού μέσο καλλιέργειας κρύο (DMEM) χρησιμοποιήθηκε για να αραιώσει το Matrigel και αυτό αραιώνεται γέλη διανεμήθηκε επί της άνω θάλαμο 24 πλάκα transwell (BD Falcon, 8 μm μέγεθος πόρου). Αυτή η γέλη στη συνέχεια αφέθηκε να στερεοποιηθεί για περίπου 5 ώρες στους 37 ° C. Μετά τη συγκομιδή, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε μέσο καλλιέργειας χωρίς ορό σε πυκνότητα 1 × 10

6 κύτταρα /ml. Αντίσωμα επεξεργασίες που απαιτούνται για τα κύτταρα να επωάζονται με IgG1-iS18 ​​(0,2 μg /ml) ή αντι-CAT αρνητικού ελέγχου (Sigma, 0,2 μg /ml) αντισώματος. Τα κύτταρα στη συνέχεια φορτώθηκε επί της άνω Matrigel καλυμμένο θάλαμο και επωάστηκε για 18 ώρες. Η κάτω θάλαμος γέμισε με 500 μΙ μέσου καλλιέργειας που περιέχει 10% FCS (για τη δοκιμή) και δεν FCS (για τον έλεγχο), και επωάστηκαν στους 37 ° C για 18 ώρες. Αυτό ακολουθήθηκε από αναρρόφηση των μέσων μαζικής ενημέρωσης στην άνω και κάτω θάλαμο. Μη επεμβατική κύτταρα στη συνέχεια απομακρύνθηκαν με τη χρήση ενός μπατονέτα. Τα υπόλοιπα επεμβατική κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με 300 μΙ PBS και σταθεροποιήθηκαν χρησιμοποιώντας 300 μΐ 4% παραφορμαλδεΰδη, 10 λεπτά. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας 0,5% μπλε τολουϊδίνης βαφή και μετά την εκχύλιση της χρωστικής χρησιμοποιώντας 1% SDS, η απορρόφηση μετρήθηκε κατόπιν σε 620 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη ELISA. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

Στατιστική αξιολογήσεις

t-test των δύο ουρά του Student με διάστημα εμπιστοσύνης 95% χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των δεδομένων , με ρ-τιμές μικρότερες από 0.05 που θεωρείται σημαντική. Η έκταση ή το βαθμό συσχέτισης μεταξύ των επιπέδων LRP /LR στην επιφάνεια των κυττάρων και επεμβατικές /κόλλα δυναμικό μετρήθηκε με τη χρήση συντελεστή συσχέτισης του Pearson του. συντελεστή συσχέτισης του Pearson ήταν επίσης χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί η συσχέτιση μεταξύ της κόλλας και επεμβατική δυναμικό των κυτταρικών σειρών. Ένα θετικό συντελεστή ήταν μια ένδειξη της άμεσης αναλογικότητας μεταξύ των δύο μεταβλητών, ενώ αρνητικό συντελεστή σιωπηρή αντίστροφη αναλογικότητας.

Αποτελέσματα

καρκίνο του ήπατος και λευχαιμία κυττάρων αποκαλύπτουν LRP /LR στην επιφάνεια των κυττάρων

ζωτικής σημασίας για την εμφάνιση μετάστασης είναι η αλληλεπίδραση μεταξύ λαμινίνη-1 και LRP /LR στην κυτταρική επιφάνεια. Ως εκ τούτου, ήταν απαραίτητο να απεικονίσει επιφάνεια του κυττάρου LRP /LR ως μέσο για την επιβεβαίωση ότι τα κύτταρα πράγματι κάνουν επίδειξη LRP /LR στην επιφάνειά τους. Αμφότερες οι ογκογόνες κυτταρικές σειρές, όπως επίσης και ο κακώς-επεμβατική ελέγχου του καρκίνου του μαστού, αποκάλυψαν LRP /LR στην κυτταρική επιφάνεια όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 1 α). Το πράσινο φθορισμό στα παρακάτω εικόνες είναι ενδεικτική της κυτταρικής επιφάνειας LRP /LR ως κύτταρα ήταν μη-διαπερατά και το δευτερεύον αντίσωμα δείχθηκε να μην συνδέονται μη-ειδικά, όπως επιβεβαιώνεται από τα στοιχεία ελέγχου που απεικονίζεται στο σχήμα 1 β) και Σχήμα 1 γ) παρακάτω. αντίσωμα αντι-CAT χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος λόγω της ικανότητάς του να δεσμεύεται ειδικά με ακετυλοτρανσφεράση χλωραμφενικόλης (CAT), η οποία είναι μια βακτηριακή πρωτεΐνη και επομένως είναι απούσα σε κύτταρα θηλαστικών.

Τα κύτταρα ήταν μη-διαπερατά, ώστε να επιτρέπουν την οπτικοποίηση της επιφάνειας του κυττάρου. α) Τα κύτταρα σημάνθηκαν με πρωτογενές αντίσωμα IgG1-iS18 ​​και ΡΙΤΟ-συζευγμένο δευτερογενές αντίσωμα. β) Κύτταρα σημάνθηκαν με αντι-χλωραμφαινικόλη acteyltranferase (CAT) αντίσωμα ως αρνητικός έλεγχος. γ) Τα κύτταρα επισημαίνονται μόνο με το FITC-συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα για να επιβεβαιωθεί ότι το δευτερεύον αντίσωμα δεν δεσμεύεται μη ειδικά.

Η

Υψηλή ποσοστά ογκογονικά κύτταρα εμφανίζουν LRP /LR στην κυτταρική επιφάνεια

Αν και συνεστιακή μικροσκοπία επιβεβαίωσε ότι οι κυτταρικές σειρές πράγματι απεικόνιση LRP /LR στην κυτταρική τους επιφάνεια, απαιτούνταν περαιτέρω ποσοτικοποίηση των επιπέδων επιφανείας κυττάρου του LRP /LR. Η κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιήθηκε για αυτή την ποσοτικοποίηση.

Όπως φαίνεται στο σχήμα 2 Α, C και Ε, οι τρεις κυτταρικές σειρές ογκογόνων αποκάλυψε υψηλά ποσοστά των κυττάρων μέσα σε ένα συγκεκριμένο πληθυσμό που εμφανίζουν LRP /LR στην κυτταρική επιφάνεια, με τη μετατόπιση μεταξύ των δύο κορυφών σε κάθε γράφημα είναι ενδεικτική της αλλαγής στην ένταση φθορισμού εξαιτίας του κυττάρου-επιφανείας χρώση των κυττάρων με ειδικό αντίσωμα αντι-LRP /LR IgG1-iS18 ​​και το δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με ένα φθοριόχρωμα. ΗυΗ- 7 κύτταρα καρκίνου του ήπατος εμφανίζεται ένα υψηλότερο ποσοστό των κυττάρων που παρουσιάζουν LRP /LR στην κυτταρική επιφάνεια σε σύγκριση με τα κύτταρα λευχαιμίας Κ562, καθώς και την κακώς-διηθητικού καρκίνου του μαστού (MCF-7) κύτταρο ελέγχου γραμμής. Σύκο. 2 Β, D και F περιλαμβάνουν επιπλέον το μη-χρωματισμένα ελέγχου και αυτό έλεγχος χρησίμευσε για να δείξει ότι το δευτερεύον αντίσωμα ΡΕ δεν δεσμεύεται μη ειδικά. Οι μετατοπίσεις στην ένταση φθορισμού του μη χρωματισμένων, APC μόνο και αντι-CAT-APC επισημασμένα κύτταρα (οι αρνητικοί έλεγχοι) που αντιπροσωπεύεται στο Σχ S1. Αξιοσημείωτο είναι επίσης να προσθέσω ότι τα κυτταρικά υπολείμματα και κυτταρικών συσσωματωμάτων αποκλείστηκαν από την ανάλυση, καθώς ήταν έξω από την καθορισμένη πύλη (Εικ. S3).

Η πρώτη κορυφή στα διαγράμματα Α, C και Ε είναι αντιπροσωπευτική της μη επισημασμένα κύτταρα, δηλαδή κύτταρα επισημαίνονται με μόνο ΡΕ-συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα κατσίκας αντι-ανθρώπινης, ενώ η δεύτερη κορυφή είναι ενδεικτική κύτταρα επισημαίνονται με αμφότερα τα αντι-LRP /LR ειδικό αντίσωμα IgG1-iS18 ​​και το δευτερεύον αντίσωμα, τόσο σε μια συγκέντρωση 30 μg /ml. Γραφήματα Β, D και F απεικονίζουν τη συμπερίληψη ενός μη χρωματισμένων ελέγχου για να δείξει καμία δέσμευση μη ειδική δευτερογενούς αντισώματος. Τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές με 20 000 κύτταρα καταμετρώνται ανά δείγμα.

Η

καρκίνο του ήπατος κύτταρα εμφανίζουν σημαντικά υψηλότερη και κύτταρα λευχαιμίας εμφανίζουν σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα κυτταρικής επιφάνειας LRP /LR σε σύγκριση με κακώς-διηθητικού καρκίνου του μαστού κύτταρα

Εκτός από το ποσοστό των κυττάρων που εμφανίζουν LRP /LR στην κυτταρική τους επιφάνεια, τα πραγματικά επίπεδα κυτταρικής επιφάνειας LRP /LR μέσα σε ένα συγκεκριμένο πληθυσμό κυττάρων αναλύθηκε μέσω κυτταρομετρίας ροής. Ο ίδιος αριθμός κυττάρων (20.000 κύτταρα) εντός συγκεκριμένων πληθυσμών των τριών ογκογόνων κυτταρικές γραμμές σημάνθηκαν με την ίδια συγκέντρωση (30 μg /ml) του προηγουμένως αναφερθέντα πρωτογενή και δευτερογενή αντισώματα κατά την ίδια χρονική περίοδο. Έτσι, η πιο LRP /LR η οποία είναι παρούσα στην επιφάνεια των ογκογόνων κυττάρων, τόσο περισσότερο πρωτογενές αντίσωμα IgG1-iS18 ​​θα δεσμεύονται σε LRP /LR και στη συνέχεια, το πιο IgG-specifc φθοριόχρωμα συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα θα δεσμεύεται με το πρωτεύον αντίσωμα . Έτσι, οι διάμεσος εντάσεις φθορισμού (MFI) θα διέφερε μεταξύ των τριών κυτταρικών γραμμών (Πίνακας 1) και ως εκ τούτου μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης της LRP επιπέδων /LR κυτταρικής επιφάνειας. Παρατηρήθηκε ότι, σε σύγκριση με την κακώς-επεμβατική κυτταρική σειρά MCF-7 ελέγχου του καρκίνου του μαστού, ο καρκίνος του ήπατος κύτταρα (ΗυΗ- 7) εμφανίζονται υψηλότερα επίπεδα LRP /LR στην κυτταρική τους επιφάνεια (Εικ.3). Επιπροσθέτως, τα κύτταρα λευχαιμίας Κ562 αποκάλυψε επίπεδα χαμηλότερα κυτταρική επιφάνεια LRP /LR σε σύγκριση με τα κύτταρα MCF-7 (Σχήμα 3).

Τα κύτταρα σημάνθηκαν με πρωτογενές αντίσωμα IgG1-iS18 ​​(1:25) και αντι- ανθρώπινο φυκοερυθρίνη (ΡΕ) δευτερογενές αντίσωμα. 20.000 κύτταρα αναλύθηκαν σε όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές, και το μεσαίο εντάσεις φθορισμού (MFI) χρησιμοποιήθηκαν ως δείκτης του LRP επιπέδων /LR κυτταρικής επιφάνειας. Οι τιμές MFI που αναφέρεται στην τελευταία στήλη του Πίνακα 1 χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή αυτού του σχήμα και είναι αξιοσημείωτο ότι η αξία MFI που αντιστοιχεί στην κυτταρική σειρά MCF-7 ρυθμίστηκε στο 100%. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές. ** P = 0,0025, *** p & lt?. 0.0001

Η

Οι μέσες εντάσεις φθορισμού που λαμβάνονται μετά την επισήμανση αντι-CAT και ανίχνευση αποδείξει ότι δεν υπάρχει σημαντική διαφορά στο βαθμό σε κύτταρα χρώση επιφάνεια CAT σε όλες τις τρεις κυτταρικές σειρές (Εικ. S2)

Σύνολο LRP επίπεδα /LR δεν διαφέρουν σημαντικά μεταξύ των ογκογόνο κυτταρικές σειρές

Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, δεν συμβαίνει αποκλειστικά

LRP /LR στην κυτταρική επιφάνεια, αλλά επιπροσθέτως παρατηρήθηκε στον πυρήνα και κυτοσόλιο, ανάλυση κηλίδος Western ως εκ τούτου διεξήχθη προκειμένου να αξιολογηθεί συνολικά επίπεδα LRP /LR. Τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τρεις φορές. Μια αντιπροσωπευτική κηλίδα απεικονίζεται στο Σχ.4. Είναι αξιοσημείωτο να αναφερθεί ότι μόνο ο πρόδρομος υποδοχέα λαμινίνη 37 kDa μπορούσε να ανιχνευθεί με τη χρήση των αντι-LRP /LR ειδικό αντίσωμα IgG 1-iS18.

Anti-LRP /LR ειδικό αντίσωμα IgG 1-iS18 ​​χρησιμοποιήθηκε ως η πρωτογενές αντίσωμα σε συνδυασμό με ένα δευτερογενές αντίσωμα HRP-συζευγμένο. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Μετά την ανίχνευση της LRP, ποσοτικοποίηση των συνολικών επιπέδων LRP απαιτήθηκε και πυκνομετρία χρησιμοποιήθηκε για να επιτευχθεί αυτό. Εικ.5 απεικονίζει την πυκνομετρική ανάλυση, η οποία αποκάλυψε ότι στατιστικώς, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά παρατηρήθηκε στα επίπεδα ολικής LRP μεταξύ των τριών ογκογόνων κυτταρικών σειρών.

Ποσοτικοποίηση διεξήχθη χρησιμοποιώντας πυκνομετρία και τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά πειράματα που διεξάγονται τριπλούν και επαναλήφθηκε τρεις φορές. Μη σημαντική (NS):. P & gt? 0,05

Η

IgG1-iS18 ​​παρεμποδίζει σημαντικά την κόλλα δυναμικό των καρκινικών κυττάρων του ήπατος

ζωτικής σημασίας για την έναρξη της εισβολής είναι η προσκόλληση ενός ογκογόνο κυττάρου στην βασική μεμβράνη μέσω της αλληλεπίδρασης LRP /LR-λαμινίνη-1, καθώς επιτρέπει για άλλες αλληλεπιδράσεις να συμβεί ότι διευκολύνει την αποικοδόμηση της βασικής μεμβράνης. Τα κύτταρα επωάστηκαν με IgG1-iS18 ​​και αντισώματα αντι-CAT (0,2 mg /ml) και μετά από μια ώρα, οι αναγνώσεις της απορρόφησης του προκύπτοντος διαλύματος ήταν ενδεικτικά του βαθμού προσκόλλησης κυττάρου προς τις λαμινίνη-1-επικαλυμμένες πλάκες.

όπως απεικονίζεται στο σχήμα 6, η έλλειψη ελέγχου αντίσωμα επιτρέπεται για τον προσδιορισμό της κόλλας δυναμικού των κυτταρικών γραμμών και παρατηρήθηκε ότι και οι δύο καρκίνο του ήπατος (HUH-7), καθώς και κύτταρα λευχαιμίας (Κ562) ήταν περισσότερο προσκολλημένη από τα κύτταρα ελέγχου κακώς-διηθητικού καρκίνου του μαστού (MCF-7). Ωστόσο, IgG1-iS18 ​​ήταν αποτελεσματική μόνο στην παρεμπόδιση της κόλλας δυναμικό των καρκινικών κυττάρων του ήπατος και καμία σημαντική μείωση στην προσκόλληση παρατηρήθηκε για τα κύτταρα λευχαιμίας σε επεξεργασία με το αντι-LRP /LR ειδικό αντίσωμα IgG1-iS18. Όπως αναμενόταν, το αντίσωμα ελέγχου αντι-ΟΑΤ δεν είχε σημαντική επίδραση επί του συγκολλητικού δυναμικό των ογκογόνων κυτταρικών γραμμών

ρ-τιμές που φαίνονται στο κόκκινο (* ρ = 0,0238? *** Ρ = 0,0002). είναι ενδεικτικά της αύξησης της κόλλας δυναμικό του καρκίνου του ήπατος (HUH-7) και κυττάρων λευχαιμίας (Κ562) σε σύγκριση με τον καρκίνο του μαστού (MCF-7) κύτταρο ελέγχου γραμμής. ρ-τιμές που φαίνονται με μαύρο (** ρ = 0,0031? *** ρ = 0,0005) αντιπροσωπεύουν την μείωση της κόλλας δυναμικού μετά την επεξεργασία των κυττάρων με κατάλληλα αντισώματα. Μια μείωση του 63,35% στην κόλλα δυναμικό παρατηρήθηκε κατά τη χορήγηση της IgG1-iS18 ​​στα ΗυΗ- 7 καρκίνο του ήπατος κύτταρα. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν πειράματα που πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

Η

Εισβολή του Matrigel από καρκίνο του ήπατος κύτταρα (HUH-7) παρεμποδίζεται σημαντικά από αντι-LRP /LR ειδικό αντίσωμα IgG 1-iS18 ​​

εισβολή της βασικής μεμβράνης θεωρείται ως προαπαιτούμενο για την εξέλιξη ενός μεταστατικού καρκίνου, ως εκ τούτου, δοκιμασίες εισβολή χρησιμοποιώντας ένα Matrigel, η οποία μιμείται τα συστατικά της βασικής μεμβράνης, διεξήχθησαν για να προσδιοριστεί η επεμβατική δυναμικό της ογκογόνο κυτταρικές σειρές. Παρομοίως με τους προσδιορισμούς πρόσφυσης, ο έλεγχος δεν αντίσωμα επιτρέπεται για τον προσδιορισμό της επεμβατικής δυναμικού των κυτταρικών γραμμών. Περαιτέρω, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με ειδικό αντίσωμα αντι-LRP /LR IgG1-iS18 ​​και αντίσωμα αντι-ΟΑΤ (0,2 mg /ml).

Όπως φαίνεται στο σχήμα 7, ο καρκίνος του ήπατος (ΗυΗ- 7) κύτταρα είναι σημαντικά πιο επεμβατική σε σύγκριση με την κακώς-διηθητικού καρκίνου του μαστού (MCF-7) κυτταρική γραμμή αναφοράς, ενώ κύτταρα λευχαιμίας (Κ562) έδειξε ένα σημαντικά χαμηλότερο επεμβατική δυναμικό συγκριτικά με τον έλεγχο. Επιπλέον, IgG1-iS18 ​​παρεμποδίζεται επιτυχώς την επιθετική πιθανότητα εμφάνισης καρκίνου του ήπατος (ΗυΗ- 7) κύτταρα ενώ δεν παρατηρήθηκε σημαντική αποτέλεσμα παρατηρήθηκε για τα κύτταρα λευχαιμίας. Όπως ήταν αναμενόμενο, ο έλεγχος αντίσωμα αντι-ΟΑΤ δεν επηρέασε σημαντικά την επιθετική πιθανότητα των ογκογόνων κυτταρικών γραμμών

ρ-τιμές που υποδεικνύονται με κόκκινο (* ρ = 0,0485? ** Ρ = 0.0053). Αντιπροσωπεύουν τις αλλαγές στην επεμβατική δυναμικό των κυτταρικών γραμμών σε σύγκριση με τον έλεγχο MCF-7, ενώ ρ-τιμές που φαίνονται με μαύρο (* ρ = 0,0214? ** ρ = 0,0091) είναι ενδεικτικές της επίδρασης των κατάλληλων αντισωμάτων για την επεμβατική δυναμικό των κυτταρικών σειρών. Μετά τη χορήγηση του IgG1-iS18 ​​στα ΗυΗ- 7 κύτταρα καρκίνου του ήπατος, παρατηρήθηκε μία μείωση περίπου 39,75% σχετικά με την επεμβατική δυναμικό των κυττάρων. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά των πειραμάτων που διεξάγονται εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

Η

Συζήτηση

Αρκετές μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι, επί της επιφανείας του κυττάρου, διάφορες κυτταρικές σειρές ογκογόνων εμφανίζουν υπερέκφραση της 37 kDa /67 kDa LRP /LR, επομένως υποδηλώνοντας ότι η LR-λαμινίνη-1 αλληλεπίδραση /LRP μπορεί να είναι καθοριστική για τα καρκινικά κύτταρα να υποβληθούν σε μετάσταση [21]. Επομένως, μπορεί να είναι χρήσιμη για την αναστολή αυτής της αλληλεπίδρασης, ως μέσο που παρεμποδίζει την προσκόλληση και εισβολή – δύο γεγονότα βρέθηκε να είναι κρίσιμη για την εμφάνιση της διαδικασίας της μετάστασης. Μια μελέτη που διεξήχθη από Zuber

et al

απέδειξε ότι το αντίσωμα IgG 1-iS18 ​​είναι εξαιρετικά ειδικό για LRP /LR [18]. Επιπλέον, πρόσφατες έρευνες έχουν δείξει ότι ειδικό αντίσωμα αντι-LRP /LR IgG1-iS18 ​​παρεμποδίζει σημαντικά την κόλλα και επεμβατική δυναμικό του τραχήλου της μήτρας [4], του πνεύμονα [4], του προστάτη [4], του παχέος εντέρου [4], του μαστού [20] και οισοφαγική [20] καρκινικά κύτταρα. Η παρούσα μελέτη διερεύνησε το ρόλο του LRP /LR στην προσκόλληση και εισβολή καρκίνου του ήπατος (HUH-7), καθώς και κύτταρα λευχαιμίας (Κ562), και με στόχο να καθορίσει εάν η εφαρμογή του αντι-LRP /LR ειδικό αντίσωμα IgG1-iS18 ​​σημαντικά μειώνει την κόλλα και επεμβατική δυναμικό αυτών των δύο ογκογόνες γραμμές κυττάρων.

Αρχικά, συνεστιακή μικροσκοπία αποκάλυψε ότι και οι τρεις ογκογόνες κυτταρικές σειρές πράγματι απεικόνιση LRP /LR στην κυτταρική τους επιφάνεια (Σχ. 1α). Ωστόσο, αυτή η τεχνική περιορίζεται από το γεγονός ότι δεν είναι ποσοτική και περαιτέρω ανάλυση που απαιτείται για τον καθορισμό των επιπέδων στα οποία LRP εμφανίζεται /LR στην κυτταρική επιφάνεια αυτών των ογκογόνων κυτταρικών σειρών.

Σημαντικά υψηλή ποσοστά (& gt? 87%) και των τριών ογκογόνων κυτταρικών σειρών, δηλαδή ΗυΗ- 7, Κ562, και MCF-7 (κακώς-επεμβατική ελέγχου του καρκίνου του μαστού) κύτταρα εμφανίζονται LRP /LR στην κυτταρική τους επιφάνεια (Εικ.2). Επιπλέον, παρατηρήθηκε με ανάλυση των διαφορών σε διάμεση εντάσεις φθορισμού ότι, σε σύγκριση με την κυτταρική γραμμή ελέγχου MCF-7, καρκίνο του ήπατος κύτταρα (ΗυΗ- 7) αποκάλυψε σημαντικά υψηλότερο και κυττάρων λευχαιμίας (Κ562) αποκάλυψε σημαντικά χαμηλότερη επιφάνεια LRP κύτταρο /επίπεδα LR (εικ.3). Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, LRP /LR παίζει ουσιαστικό ρόλο στην προσκόλληση, εισβολή, πολλαπλασιασμό και μετανάστευση κυττάρων [9].