Αφηρημένο

προηγούμενες μελέτες μας έχουν δείξει ότι PMS1077, ένας παράγοντας ενεργοποίησης των αιμοπεταλίων (PAF), θα μπορούσαν να προκαλέσουν απόπτωση των κυττάρων Raji. Ωστόσο, ο μηχανισμός δράσης δεν έχει ακόμη προσδιοριστεί. Ο πυρηνικός μεταγραφής παράγοντα-κάππα Β (NF-κΒ) οδού σηματοδότησης διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων, τον πολλαπλασιασμό, την εισβολή, τη μετάσταση, και την αγγειογένεση, έτσι ώστε να καθορίζονται οι επιδράσεις της PMS1077 και δομικά ανάλογα της για παράγοντα νέκρωσης όγκων-α ( TNF-α) που προκαλείται από την ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ σηματοδότηση. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι PMS1077 ανέστειλε ΤΝΡ-α επαγόμενη έκφραση του γονιδίου ρεπόρτερ ρυθμιζόμενης ΝΡ-κΒ σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο. δοκιμασία κηλίδος Western έδειξαν ότι PMS1077 κατέστειλε την ΤΝΡ-α που προκαλείται από αναστολέα του κΒ-α (ΙκΒ-α) φωσφορυλίωση, η υποβάθμιση ΙκΒ-α, και φωσφορυλίωση ρ65. PMS1077 μπλοκάρει σταθερά ΤΝΡ-α που επάγεται ρ65 πυρηνικής μετατόπισης, όπως καταδεικνύεται στην δοκιμασία ανοσοφθορισμού που χρησιμοποιείται. Μελέτες σύνδεσης με μοριακή μοντελοποίηση προβλέψει ότι PMS1077 μπορεί να αλληλεπιδρά άμεσα με την ΙκΒ κινάση-β (ΙΚΚ-β) υπομονάδα. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι PMS1077 μπορούσαν να καταστείλουν την ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ μέσω στόχευσης ΙΚΚ-β που εμπλέκονται στην οδό σηματοδότησης ΝΡ-κΒ. Τέλος, δείξαμε ότι PMS1077 ευαισθητοποιημένα κύτταρα σε TNF-α επαγόμενη απόπτωση με την καταστολή της έκφρασης του NF-κΒ ρυθμιζόμενη αντι-αποπτωτικών γονιδίων. Τα αποτελέσματά μας αποκαλύπτουν μια νέα λειτουργία του PMS1077 για το NF-κΒ μονοπατιού σηματοδότησης και υπονοούν ότι PMS1077 μπορεί να θεωρηθεί ως μια ένωση μολύβδου αντι-όγκου

Παράθεση:. Shi J, Chen J, Serradji Ν, Xu Χ, Zhou Η, Ma Y, et al. (2013) PMS1077 ευαισθητοποιεί ΤΝΡ-α απόπτωση που επάγεται ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη από το κλείδωμα ΝΡ-κΒ μονοπάτι σηματοδότησης. PLoS ONE 8 (4): e61132. doi: 10.1371 /journal.pone.0061132

Επιμέλεια: Jun Li, η Sun Yat-sen University Medical School, Κίνα

Ελήφθη: 17 Οκτωβρίου του 2012? Αποδεκτές: 5 Μαρ 2013? Δημοσιεύθηκε: 9, Απριλίου 2013

Copyright: © 2013 Shi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τις Chun Hui Έργα (αριθμός Z2009-1-62001, https://www.moe.edu.cn) από το Υπουργείο Παιδείας της Κίνας και εν μέρει από την επιστήμη και την Υποστήριξη Έργα Τεχνολογίας της επαρχίας Gansu (αριθμός 1104FKCA123, https://www.gsstc.gov.cn), Κίνα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα τελευταία χρόνια, συνθέσαμε έναν ορισμένο αριθμό παραγώγων πιπεραζίνης η οποία έδειξε ισχυρή διπλή αντι-ΡΑΡ και δραστηριότητες κατά του HIV-1 [1], [2], [3], [4]. Ενώ περαιτέρω βελτίωση αυτών των ιδιοτήτων και λαμβάνοντας υπόψη την ευελιξία αυτών των ενώσεων, ήμασταν δραστηριοποιείται επίσης να μελετήσει τις πιθανές επιπτώσεις αυτών των ενώσεων και σε άλλες παθολογικές καταστάσεις, όπως η φλεγμονή και η καρκινογένεση. προηγούμενη εργασία μας έδειξε ότι PMS1077 θα μπορούσε να προκαλέσει την απόπτωση των κυττάρων Raji, αλλά ο μηχανισμός δράσης παραμένει ασαφής [5].

Λόγω του κρίσιμου ρόλου των προϊόντων ρυθμιζόμενων γονιδίων NF-κΒ στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την επιβίωση, την εισβολή, μετάσταση, και την αγγειογένεση [6], [7], [8], μπορούμε αιτιολογημένη ότι PMS1077 μπορούσε να μεσολαβήσει την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων με τη διαμόρφωση της καταρράκτη σηματοδότησης ΝΡ-κΒ. Η οικογένεια NF-κΒ αποτελείται ουσιαστικά από πέντε πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένων rel-Α (p65), rel-Β, Γ-συνδεδεμένη, p50 και ρ52 [9]. Το τυπικό θηλαστικών ΝΡ-κΒ αποτελείται από ένα ετεροδιμερές ρ50 /ρ65. Σε μη διεγερμένα κύτταρα, NF-κΒ προσδένεται σε αναστολέα πρωτεϊνών κΒ και διαχωρίζεται στο κυτταρόπλασμα ως ένα ανενεργό σύμπλοκο. Κατά τη διέγερση, για παράδειγμα από TNF-α, ο καταρράκτης σηματοδότησης οδηγεί στην ενεργοποίηση του συμπλέγματος κινάσης ΙκΒ, η οποία οδηγεί στη φωσφορυλίωση, ουβικιτινίωση, και αποικοδόμηση του ΙκΒ από το πρωτεάσωμα 26S [9], [10]. Στη συνέχεια, το απελευθερωμένο ΝΡ-κΒ μετατίθεται ετεροδιμερές ταχέως στον πυρήνα, όπου συνδέεται με την τοποθεσία κΒ και διεγείρει τη μεταγραφή μιας μεγάλης ποικιλίας γονιδίων-στόχων που εμπλέκονται στην ανάπτυξη και την πρόοδο [8] του καρκίνου, [11].

στην παρούσα μελέτη, υποθέσαμε ότι PMS1077 μπορεί να ρυθμίζουν την οδό ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, προσδιορίσαμε τις επιδράσεις της PMS1077 και δομικά ανάλογα της για το TNF-α επαγόμενης ενεργοποίηση ΝΡ-κΒ. Τα ευρήματά μας έδειξαν ότι PMS1077 μπορεί να αναστείλει την ΤΝΡ-α αποικοδόμηση προκαλούμενη ΙκΒ-α, α-ΙκΒ φωσφορυλίωση, φωσφορυλίωση ρ65, και ρ65 πυρηνικής μετατόπισης. Μελέτες σύνδεσης με μοριακή μοντελοποίηση προβλέψει ότι PMS1077 μπορούσε να καταστείλει την ενεργοποίηση ΝΡ-κΒ με άμεση αλληλεπίδραση με το ΙΚΚ-β. Επιπλέον, PMS1077 βρέθηκε επίσης να καταστείλει την ΤΝΡ-α επαγόμενη έκφραση του ΝΡ-κΒ ρυθμίζεται αντι-αποπτωτικών γονιδίων, οδηγώντας σε ευαισθητοποίηση του ΤΝΡ-α επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα όγκου. Με αυτόν τον τρόπο, τα δεδομένα από τη μελέτη βοηθήσει στην κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην αντικαρκινική δράση της PMS1077, και μπορεί να μας βοηθήσει στην περαιτέρω βελτιστοποίηση των ιδιοτήτων τους για τις δυνατότητες ανάπτυξης του φαρμάκου.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια και αντιδραστήρια

ΗΕΚ293Τ (ανθρώπινα εμβρυονικά νεφρικά), DU145 (ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη) και PC3 (ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη) κύτταρα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ (Dulbecco τροποποιημένο μέσο Eagle) συμπληρωμένο με 10% FBS (ορός εμβρύου βοός), 100 μονάδες /ml πενικιλίνη, και 100 mg /mL στρεπτομυκίνη και επωάζονται στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 θερμοκοιτίδα . PMS1077 και δομικών αναλόγων του συντέθηκαν όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [4]. Τα εν λόγω ανάλογα διαλύθηκαν σε DMSO για να παραχθεί ένα διάλυμα αποθέματος /L 50 mmol για in vitro πειράματα. TPCA-1 (ένας ειδικός αναστολέας του ΝΡ-κΒ) αγοράστηκε από την Sigma Aldrich (St. Louis, ΜΟ, Η.Π.Α.). Αντισώματα έναντι Ρ-p65, p65, Ρ-ΙκΒ-α, α-ΙκΒ, Bcl-XL, Bcl-2, survivin και PARP αγοράστηκαν από Cell Signaling Technology. TNF-α αγοράστηκε από την Pepro Tech. Αντιδραστήριο επιμόλυνσης GenEscort ™ αγοράστηκε από Wisegen Biotechnology Corporation (Nanjing, Κίνα).

Επιμόλυνση και αναφοράς λουσιφεράσης

δοκιμασία

DU145 και PC3 κύτταρα σπάρθηκαν σε δίσκους ιστοκαλλιέργειας 60 mm, αντίστοιχα. ΝΡ-κΒ εξαρτώμενο λουσιφεράση πυγολαμπίδας πλασμίδιο αναφοράς (4 × κΒ-pGL4.20) διαμολύνθηκε σε σπαρμένα κύτταρα χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο διαμόλυνσης GenEscort ™ σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από 48 ώρες, επιλέχθηκαν και πολλαπλασιάστηκαν σε μέσο συμπληρωμένο με 5 μg /mL πουρομυκίνης έως ότου εμφανίστηκαν ανθεκτικών κλώνων κυττάρων. Οι δύο κλώνοι επικυρωθεί ονομάστηκαν DU145-NF-κΒ-Luc και PC3-NF-κΒ-Luc. διαλογή υψηλής απόδοσης για τις υποδεικνυόμενες ενώσεις εκτελέστηκε σε αυτές τις κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας έναν-Glo σύστημα δοκιμασίας λουσιφεράσης (Promega).

Για να μελετηθεί η ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ σε κύτταρα ΗΕΚ293 από TNF-α, ο ΝΡ-κΒ-εξαρτώμενο λουσιφεράση πυγολαμπίδας ρεπόρτερ (4 × κΒ-pGL4.20) ήταν συν-επιμολύνθηκαν παροδικώς μαζί με το πλασμίδιο λουσιφεράσης Renilla (pGL4.74) σε κύτταρα ΗΕΚ-293Τ line χρησιμοποιώντας ένα αντιδραστήριο επιμόλυνσης GenEscort ™ σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά την επεξεργασία, τα κύτταρα λύθηκαν με παθητική ρυθμιστικού λύσης (Promega), και η δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα Dual-Luciferase Assay System Reporter (Promega) με ένα Wallac1420 VICTOR (Perkin-Elmer, Wellesely, ΜΑ, Η.Π.Α.). Σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης εκφράσθηκε ως μία αναλογία δραστικότητας λουσιφεράσης πυγολαμπίδας να Renilla δραστικότητα λουσιφεράσης. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τρία ανεξάρτητα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

3- (4, 5-cimethylthiazol-2-υλ) -2, 5-διφαινυλ τετραζόλιο (ΜΤΤ)

Κυτταρική βιωσιμότητα προσδιορίσθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία ΜΤΤ. Εν συντομία, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων (1 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο), υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διάφορες ενώσεις σε διάφορες συγκεντρώσεις, και στη συνέχεια διατηρήθηκαν σε καλλιέργεια για περαιτέρω 12 ή 24 ώρες. Στο τέλος αυτής της περιόδου, 20 μι ΜΤΤ (5 mg /mL) προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας και επωάζονται στους 37 ° C για 2 ώρες. Στη συνέχεια, το μέσο απομακρύνθηκε. Τα αδιάλυτα στο νερό κρύσταλλοι φορμαζάνης διαλύθηκαν εντός DMSO (100 μL /φρεάτιο). Η οπτική πυκνότητα εκάστου φρεατίου μετρήθηκε με ένα Wallac1420 VICTOR (Perkin-Elmer, Wellesley, ΜΑ, Η.Π.Α.) στα 570 nm με ένα μήκος κύματος αναφοράς 630 nm. Για κάθε συγκέντρωση που δοκιμάζεται, φρεάτια που περιέχουν όλα τα αντιδραστήρια εκτός από τα κύτταρα χρησίμευσαν ως μάρτυρες. Η επιβίωση των κυττάρων είναι εδώ περιγράφεται ως σχετική απορρόφηση (Α) ποσοστό, όπως ορίζεται από (Α

φαρμάκου /A

ελέγχου × 100) (Ye et al., 2004).

ανάλυση Western κηλίδωση

κηλίδωση Western των πρωτεϊνών πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται σε ένα από προηγούμενες μελέτες μας [12]. Εν συντομία, επεξεργασμένα κύτταρα συλλέχθηκαν σε RIPA ρυθμιστικό λύσης που περιέχει 50 mM Tris-HCl (ρΗ 7.5), 150 mM NaCl, 1% ΝΡ-40, 0.5% DOC, 0,1% SDS, 5 mM EDTA, 1 mM EGTA, 20 mM NaF , 2 mM ορθοβαναδικό νάτριο και κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche). Μετά τη λύση, τα προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν για 10 λεπτά στα 13.000 g στους 4 ° C. Δείγματα συνολική πρωτεΐνη (30-60 μg) μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF μετά από ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό σε 12% SDS γέλη πολυακρυλαμιδίου. Μετά τον αποκλεισμό με 5% άπαχο γάλα σε TBST (0,1%) για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου, οι μεμβράνες επωάστηκαν όλη τη νύχτα με το πρωτογενές αντίσωμα στους 4 ° C και πλύθηκαν πέντε φορές σε TBST, και ακολούθως επωάζονται με υπεροξειδάση κοχλιαρίας συζευγμένη δευτερογενή αντισώματα σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες. Οι μεμβράνες πλύθηκαν πέντε φορές σε TBST, και στη συνέχεια επωάζεται με ένα σύστημα ενισχυμένης χημειοφωταύγειας δυτική ανίχνευση (Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, ΜΑ, ΗΠΑ) και εκτέθηκαν σε φιλμ ακτίνων Χ.

ΝΡ-κΒ /ρ65 πυρηνική μετατόπιση δοκιμασία

Ανοσοκυτταροχημική ανάλυση του ΝΡ-κΒ /p65 πυρηνική μετατόπιση σε PC-3 κύτταρα εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ένα κυτταρικό ΝΡ-κΒ μετατόπιση Kit (Beyotime Biotech) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13 ], [14]. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων στα 4000 κύτταρα /φρεάτιο. 24 ώρες αργότερα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με PMS1077 (50 μΜ) επί 2 ώρες, ακολουθούμενη από κατεργασία με 20 ng /ml ΤΝΡ-α για 30 λεπτά. Τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με 0,2% DMSO και 2 μΜ TPCA-1 χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί και θετικοί μάρτυρες αντίστοιχα. Μετά την επεξεργασία, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και επωάστηκαν με ένα ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα για την καταστολή μη-ειδική σύνδεση. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν για όλη τη νύχτα με το πρωτογενές αντίσωμα ρ65 ΝΡ-κΒ στους 4 ° C, που ακολουθείται από επώαση με ένα Cy3-συζευγμένο δευτερογενές αντίσωμα σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα, στη συνέχεια με ϋΑΡΙ για 5 λεπτά πριν την παρατήρηση. Η πρωτεΐνη ρ65 εμφανίστηκε κόκκινη υπό μικροσκοπία φθορισμού και οι πυρήνες εμφανίστηκαν μπλε. Τα κόκκινα και μπλε εικόνες συγχωνεύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό J Εικόνα για την παραγωγή μωβ φθορισμού σε περιοχές του συν-εντοπισμού.

Η πυρηνική μετατόπιση του NF-κΒ /p65 ανιχνεύθηκε επίσης σε κύτταρα DU145 με κηλίδωση Western ανάλυση της παρουσίας του ρ65 σε κυτταρόπλασμα και στον πυρήνα. Μετά την επεξεργασία, τα κύτταρα κυτταροπλασματικό και πυρηνικό κλάσματα παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο που περιγράφεται σε μία από τις μελέτες μας προηγουμένως [12]. Στη συνέχεια, τα δείγματα πρωτεΐνης αναλύθηκαν με κηλίδωση Western.

RT-PCR δοκιμασία

Ολικό RNA των κατεργασμένων κυττάρων παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας τη RNAprep καθαρό Kit κυττάρου (TIANGEN, Bei Jing, Κίνα), σύμφωνα με το τις οδηγίες του κατασκευαστή. 5 μg ολικού RNA από κάθε δείγμα υποβλήθηκαν σε αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας τα M-MLV αντίστροφη μεταγραφάση (Promega). Οι ακόλουθοι εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν: GAPDH προς τα εμπρός, GTCAACGGATTTGGTCGTATT και GAPDH- αντιστραφεί, AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT? Bcl-XL-προς τα εμπρός, CTGAATCGGAGATGG AGACC και Bcl-XL-αντίστροφη, TGGGATGTCAGGTCACTGAA? Bcl-2 προς τα εμπρός, TGCACCTGACGCCCT tcaC και AGACAGCCAGGAGAAATCAAACAG και Bcl-2-αντίστροφη, AGACAGCCAGGAGA AATCAAACAG? survivin-προς τα εμπρός, CCTTTCCTAAGACATTGCTAAG και survivin-αντίστροφη, ΟΤΟ AATTTTTGAAACTGGACAG. PCR διεξήχθη στους 94 ° C για 30 s, στους 56 ° C για 30 s και 1 λεπτό στους 70 ° C για 30 κύκλους. Τα προϊόντα PCR αναλύθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης 2% και οπτικοποιήθηκαν με χρώση βρωμιούχου αιθιδίου.

Προσδιορισμός απόπτωσης

Η ανίχνευση των αποπτωτικών κυττάρων διεξήχθη χρησιμοποιώντας FITC-συζευγμένο Annexin-V και ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) . κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0, 40 και 80 μΜ PMS-1077 για 24 ώρες και στη συνέχεια στη συνέχεια σφαιροποιήθηκαν με φυγοκέντρηση, πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό PBS, και φυγοκεντρήθηκαν στις 1000 rpm για τη συλλογή των κυττάρων. Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 200 μι ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης, και στη συνέχεια 10 μι αννεξίνης-ν-ΡΙΤΟ, προστέθηκαν 5 μι του ΡΙ. Τα κύτταρα επωάστηκαν στο σκοτάδι για 30 λεπτά και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. FACS διεξήχθη χρησιμοποιώντας 488 nm ως μήκος κύματος διέγερσης και η ζώνη διέλευσής φίλτρα 515-545 nm (για ανίχνευση αννεξίνης-ν-ΡΙΤΟ) και 563-607 nm (για ανίχνευση ΡΙ). Η ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα Cell Quest.

Μοριακή βάση σύνδεσης μελέτη

Η ΙΚΚ-β πεδίο κινάσης (υπολείμματα 16-310) εκχυλίστηκε από κρυσταλλική δομή του ΙΚΚ-β σε σύμπλοκο με ένα αναστολέα (ΠΠ ID: 3RZF) [15]. Ενώσεις PMS1077 και PMS601 χτίστηκαν χρησιμοποιώντας Avogadro, με MMFF94 πεδίο δυνάμεων ελαχιστοποίηση ενέργειας, συμπεριλαμβανομένων 5.000 βήματα απότομη κάθοδο και 2000 βήματα συζυγών κλίσεων [16]. Όλες οι δομές για ελλιμενισμό παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας AutoDockTools [17]. Προστέθηκαν χρέωση Gasteiger και τη συγχώνευση των μη-πολικό υδρογόνα.

Μοριακή βάση σύνδεσης διεξήχθη από ΑυΤΌϋΟΟΚ Vina [18]. Οι ενώσεις που ως ευέλικτες δομές, και οι δεσμευτικές συμμορφωτών αναζητήθηκαν χρησιμοποιώντας Επαναλαμβανόμενη Local Search παγκόσμια βελτιστοποίησης. Τελική σύμμορφα δεσμευτική επιλέχθηκαν σύμφωνα με την καλύτερη βαθμολογία ΑυΤΌϋΟΟΚ Vina, συνδυασμός της γνώσης και εμπειρική προσέγγιση Εξ. 1. (1)

Εδώ,

ΔG

είναι η συνολική ενέργεια σύνδεσης?

ΔG

Gauss

είναι δύο Gaussian συναρτήσεις περιέχουν ελκυστική διάρκεια της διασποράς?

ΔG

απώθηση

είναι η πλατεία του

δ

(απόσταση επιφάνεια) όταν

d & lt? 0

?

ΔG

υδρόφοβο

και

ΔG

hbond

είναι υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις και δεσμούς υδρογόνου, αντίστοιχα? και

ΔG

συγγραφής

είναι ένωση περιστρεφόμενο ομόλογα.

Η συγγένεια δέσμευσης αξιολογήθηκε επίσης χρησιμοποιώντας ΑυΤΌϋΟΟΚ πληγή 4.1 (Εξ. 2) και NNScore 2.0 [19]. (2)

Εδώ,

W

VDW

,

W

hbond

,

W

ηλεκ

, και

W

sol are Κίνα οι σταθερές στάθμιση των Van der Waals αλληλεπιδράσεις, δεσμούς υδρογόνου, ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις, και η ενέργεια αποδιαλύτωσης, αντίστοιχα?

W

tor

είναι το βάρος των ενώσεων στρέψης.

NNScore 2.2 παίρνει πολύ περισσότερα χαρακτηριστικά υποδοχέα-συνδετήρα να συμβάλει για την συγγένεια δέσμευσης, συμπεριλαμβανομένων των όρων ΑυΤΌϋΟΟΚ Vina και 12 διακριτά χαρακτηριστικά σύνδεσης από BINANA [20]. Στην παρούσα μελέτη, BINANA και Ligplot + [21] εισήχθησαν για να αναλύσει την αλληλεπίδραση των PMS1077 και ΙΚΚ-β.

Στατιστικά και ανάλυση δεδομένων

Όλα τα πειράματα εκτελέστηκαν ανεξάρτητα τουλάχιστον τρεις φορές και ο τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Η στατιστική σημαντικότητα μεταξύ των ομάδων και χωρίς θεραπεία ομάδων που υπέστησαν αγωγή προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) και το t-test. P & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική

Αποτελέσματα

PMS1077 κατέστειλε TNF-α επαγόμενη έκφραση του NF-κΒ-ρυθμιζόμενη γονίδιο αναφοράς

Σε αυτή τη μελέτη, για τη διαλεύκανση του μηχανισμού που εμπλέκονται. σε δραστηριότητες κατά του όγκου του PMS1077 (Εικ. 1), μπορούμε καθιερωμένες κυτταρικές γραμμές DU145-NF-κΒ-Luc και PC3-NF-κΒ-Luc εκφράζουν σταθερά ένα προαγωγό 4 × κΒ οδήγησης αναφοράς λουσιφεράσης και προσδιορίζονται τα αποτελέσματα των PMS1077 για την TNF-α επαγόμενης ενεργοποίησης του ΝΡ-κΒ σε αυτές τις κυτταρικές σειρές. Σε αυτή τη δοκιμασία γονιδίου αναφοράς, PMS1077 παρατηρήθηκε να αναστέλλει ΤΝΡ-α επαγόμενη δραστικότητα ΝΡ-κΒ κατά περισσότερο από 50% σε κύτταρα DU145 και τα κύτταρα PC3. τα δεδομένα στα κελιά DU145 φαίνεται μόνο στο σχ. 2Α.

Η

(Α) DU145-NF-κΒ-λουσιφεράσης κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με PMS1077 και δομικά ανάλογα του σε τελική συγκέντρωση 50 μΜ. TPCA-1 (2 μΜ) είναι ένας ειδικός αναστολέας του ΝΡ-κΒ για θετικό έλεγχο και DMSO ως όχημα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα αφέθηκαν χωρίς αγωγή ή εκτεθεί σε TNF-α (20 ng /ml) για 12 ώρες. Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μία-Glo® σύστημα προσδιορισμού λουσιφεράσης (Promega). (Β) κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με PMS601, PMS1077, PMS1120 και PMS1144 στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 12 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ΜΤΤ δοκιμασία. Οι τιμές είναι η μέση τιμή ± Τ.Α. για τρεις ανεξάρτητες επαναλήψεις. *

P

& lt?. 0,05 έναντι TNF α-ομάδα διεγείρεται

Η

Για να βρείτε πιο ισχυρές ενώσεις, μια σειρά αναλόγων (Εικ. 1), δομικά πολύ κοντά στο PMS1077 , υποβλήθηκαν στην ίδια δοκιμασία. PMS1120, ένα ισομερές θέσης της PMS1077 έδειξε τις συγκριτικές δραστηριότητες όπως PMS1077 στις δύο κυτταρικές σειρές, ενώ PMS1141 ήταν τόσο δραστικό όσο PMS1077 μόνο σε PC3 κυτταρική γραμμή. Άλλα ανάλογα ήταν λιγότερο δραστική από PMS1077 σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές και PMS601 ήταν ένα από τα πλέον αδρανείς ενώσεις σε αυτή τη σειρά. Όσο για PMS1077, μόνο τα δεδομένα στα κελιά DU145 φαίνεται στο Σχ. 2Α.

Για να αποκλείουν τα αποτελέσματα της κυτταροτοξικότητας, προσδιορίσαμε τις επιδράσεις αυτών των ενώσεων στη βιωσιμότητα των κυττάρων. ΜΤΤ δοκιμασία έδειξε ότι PMS601, PMS1077, PMS1120 και PMS1141 έδειξε μόνο μέτρια κυτταροτοξικότητα (& lt? 30%) σε κύτταρα DU145 σε συγκεντρώσεις τόσο υψηλές όσο 80 μΜ (Σχήμα 2Β).. Τέλος, επιλέξαμε PMS1077 ως το καλύτερο ένωση και PMS601 ως έλεγχος για τα επόμενα πειράματα.

Για την περαιτέρω επικύρωση των αποτελεσμάτων αυτών στην πιο ακριβή σύστημα διπλής λουσιφεράσης προσδιορισμό, κύτταρα ΗΕΚ293Τ πρόσκαιρα συν-επιμολύνθηκαν με ΝΡ-κΒ -regulated πλασμίδιο αναφοράς λουσιφεράσης (4 × κΒ-MinIP /PGL4.20) και το πλασμίδιο εσωτερικού ελέγχου (PGL4.74). Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Α, δραστηριότητα σχετική λουσιφεράσης ΝΡ-κΒ προκλήθηκε με ΤΝΡ-α κατά εξαρτώμενο από τη δόση τρόπο, και αυτή η δράση καταστέλλεται από έναν γνωστό αναστολέα της ΙΚΚ-β TPCA-1 (Σχ. 3Β). Όταν κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με PMS1077, βρήκαμε ότι ο ΤΝΡ-α που επάγεται ΝΡ-κΒ σχετική δραστικότητα γονιδίου αναφοράς λουσιφεράσης κατεστάλη με δοσοεξαρτώμενο τρόπο (Σχ. 3C). Ωστόσο, PMS601, ένας αρνητικός έλεγχος, δεν έδειξε σημαντική επίδραση στην δραστηριότητα αυτή (Εικ. 3D).

ΗΕΚ293Τ κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν παροδικώς με ΝΡ-κΒ-λουσιφεράση πυγολαμπίδας και Renilla ΤΚ-φορέων αναφοράς λουσιφεράσης για NF δοκιμασία -κB δραστηριότητα. (Α) ΝΡ-κΒ-εξαρτώμενη έκφραση γονιδίου ανταποκριτή που επάγεται από ΤΝΡ-α. Τα επιμολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα ή ΤΝΡ-α (1, 5, 10, 20 και 50 ng /ml) για 12 ώρες? (Β) TPCA-1 ανέστειλε την έκφραση του ΤΝΡ-α που επάγεται ΝΡ-κΒ γονίδιο που εξαρτάται ανταποκριτή. Τα επιμολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα ή TPCA-1 (1, 2, 3, και 4 μΜ), στη συνέχεια επωάστηκαν με TNFa (20 ng /ml) για 12 ώρες? (Γ) PMS1077 ανέστειλε προκαλούμενη TNF-α, ο ΝΡ-κΒ έκφραση γονιδίου που εξαρτάται ανταποκριτή. Τα επιμολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα ή PMS1077 (20, 40, 60 και 80 μΜ), στη συνέχεια επωάστηκαν με TNF-α (20 ng /ml) για 12 ώρες? (D) PMS601 δεν έδειξε καμία επίδραση επί ΤΝΡ-α που επάγεται ΝΡ-κΒ έκφραση γονιδίου που εξαρτάται ανταποκριτή. Τα επιμολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα ή PMS601 (20, 40, 60 και 80 μΜ), στη συνέχεια επωάστηκαν με TNF-α (20 ng /ml) για 12 ώρες. Μετά τη θεραπεία, η δραστηριότητα της λουσιφεράσης στο (Α), (Β), (Γ), και (Δ) μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα δοκιμασίας διπλής λουσιφεράσης (Promega). Τα στοιχεία που παρουσιάζονται αντιπροσωπεύουν την σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης ομαλοποιήθηκε έναντι δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla. Οι τιμές είναι η μέση τιμή ± Τ.Α. για τρεις ανεξάρτητες επαναλήψεις. *

P

& lt? 0,05 έναντι ομάδας διεγείρονται TNF-α? NS, δεν είναι σημαντική.

Η

PMS1077 αναστέλλεται ο ΤΝΡ-α που εξαρτώνται από ΙκΒ-α φωσφορυλίωση και αποικοδόμηση

Η φωσφορυλίωση και ουβικιτίνης πρωτεασώματος μεσολάβηση αποικοδόμηση της ΙκΒ-α πρωτεΐνη διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην η ενεργοποίηση του μονοπατιού σηματοδότησης ΝΡ-κΒ. Ενώ ανίχνευση φωσφορυλίωσης και αποικοδόμηση της ΙκΒ-α σε ΗΕΚ293Τ, βρήκαμε ότι η υποβάθμιση ΤΝΡ-α που επάγεται ΙκΒ-α φτάσει το μέγιστο σε 0,5 ώρες σε 1 ώρα και ότι επανασύνθεση του ΙκΒ-α εμφανίστηκε 2 ώρες και 4 ώρες μετά ΤΝΡ-α θεραπεία (Σχ. 4Α). Για να καθοριστεί εάν η αναστολή του ΤΝΡ-α επαγόμενη ενεργοποίηση ΝΡ-κΒ που προκαλείται από την καταστολή αποικοδόμησης ΙκΒ-α, εμείς προεπεξεργασμένα ΗΕΚ293Τ κυττάρων με PMS1077 και στη συνέχεια να τους εκτίθενται σε ΤΝΡ-α για 0,5 ώρα. Αξιοσημείωτα, PMS1077 βρέθηκε να αναστέλλει αποικοδόμηση της ΙκΒ-α κατά εξαρτώμενο από τη δόση τρόπο (Σχ. 4Β). Σε αντίθεση, παρατηρήσαμε καμία προφανή επίδραση στην αποικοδόμηση της ΙκΒ-α σε PMS601 (80 μΜ) σε προεπεξεργασία κύτταρα (Σχ. 4Β). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι PMS1077 μπορεί να καταστείλει τον TNF-α που προκαλείται από αποικοδόμηση της ΙκΒ-α, η οποία οδηγεί σε καταστολή της ενεργοποίησης του ΝΡ-κΒ.

(Α) ΤΝΡ-α αποικοδόμηση προκαλούμενη ΙκΒ-α, α-ΙκΒ φωσφορυλίωσης. κύτταρα ΗΕΚ293Τ υποβλήθηκαν σε αγωγή με ΤΝΡ-α (20 ng /ml) για τους υποδεικνυόμενους χρονικές περιόδους? (Β) PMS1077 ανέστειλε ΤΝΡ-α επαγόμενη αποικοδόμηση της ΙκΒ-α. κύτταρα ΗΕΚ293Τ υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα ή PMS1077 (20, 40, 60 και 80 μΜ) ή PMS601 (80 μΜ) και TPCA-1 (1 μΜ), στη συνέχεια επωάστηκαν με TNF-α (20 ng /ml) για 0,5 ώρα? (Γ) PMS1077 ανέστειλε προκαλούμενη TNF-α φωσφορυλίωση ΙκΒ-α. κύτταρα ΗΕΚ293Τ υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα ή PMS1077 ή PMS601 ή TPCA-1 όπως στο (Β), στη συνέχεια επωάστηκαν με TNF-α (20 ng /ml) για 2 ώρες? (D) κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα ή PMS1077 (40 και 80 μΜ) και TPCA-1 (1 μΜ), στη συνέχεια, τα κύτταρα είτε αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή εκτεθεί σε TNF-α (20 ng /ml) για 12 ώρες. Μετά την επεξεργασία, το σύνολο κυτταρολύματα στο (Α), (Β), (Γ), και (D) παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western με αντισώματα για ΙκΒ-α, φωσφορυλίωση-ΙκΒ-α (Ser-32), η φωσφορυλίωση -p65 (Ser-536) και GAPDH. Όλα τα στοιχεία που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Για να καθοριστεί εάν η αναστολή του ΤΝΡ-α επαγόμενη αποικοδόμηση της ΙκΒ-α προκλήθηκε από την αναστολή της φωσφορυλίωσης του ΙκΒ-α, μελετήσαμε τα αποτελέσματα του PMS1077 επί ΤΝΡ-α επαγόμενη φωσφορυλίωση του ΙκΒ-α σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Α, επανασύνθεση του ΙκΒ-α φθάσει σε επίπεδο παρόμοιο με αυτό του ελέγχου 2-4 ώρες μετά τη θεραπεία και την φωσφορυλίωση ΙκΒ-α κατέληξε σε μέτριο επίπεδο σε 1-2 ώρες μετά από TNF-α θεραπεία, έτσι ώστε να πραγματοποιηθεί ανάλυση στυπώματος Western των ΙκΒ -α φωσφορυλίωση 2 ώρες μετά τη διέγερση ΤΝΡ-α. Τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης έδειξαν ότι προκατεργασία PMS1077 ανέστειλε ισχυρά επάγεται ΤΝΡ-α ΙκΒ-α φωσφορυλίωση σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο, αλλά PMS601 δεν έδειξε καμία επίδραση σε αυτή την φωσφορυλίωση (Εικ. 4C).

Στο σύνολό τους, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι PMS1077 ανέστειλε ΤΝΡ-α επαγόμενη ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ μέσω καταστολής φωσφορυλίωση και αποικοδόμηση της ΙκΒ-α. Ωστόσο, η δομική αναλογική PMS601 δεν έδειξε σημαντική επίδραση στην φωσφορυλίωση και αποικοδόμηση της ΙκΒ-α.

PMS1077 ανέστειλε τη συστατική και TNF-α επαγόμενη φωσφορυλίωση της p65

Έχει επίσης αποδειχθεί ότι η φωσφορυλίωση σερίνης 536 της ρ65 παίζει ένα σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της δραστικότητας του ΝΡ-κΒ και μπορεί να προκληθεί από μια ποικιλία από προ-φλεγμονώδη ερεθίσματα, συμπεριλαμβανομένων των ΤΝΡ-α [22], [23], [24], [25]. Για το λόγο αυτό, ερευνήσαμε επίσης τις επιπτώσεις της PMS1077 επί επαγόμενης ΤΝΡ-α φωσφορυλίωση της ρ65. Η ανάλυση στυπώματος Western έδειξε ότι η φωσφορυλίωση του p65 εμφανίστηκε σε κύτταρα DU145 αγωγή TNF-α και αυτή η φωσφορυλίωση του p65 αναστάλθηκε κατά δοσοεξαρτώμενο τρόπο στα προεπεξεργασμένα κυττάρων με PMS1077 (40 και 80 μΜ) (Σχ. 4D, δεξιά).

DU145 και PC3 κύτταρα είναι γνωστό ότι έχουν ουσιαστικώς δραστικής ΝΡ-κΒ [26], [27]. Για να καθοριστεί εάν PMS1077 επηρεάζει επίσης την συστατική έκφραση ΝΡ-κΒ στα κύτταρα αυτά, υποβάλλαμε σε αγωγή DU145cells με PMS1077 (40 και 80 μΜ), χωρίς TNF-α. Όπως φαίνεται στο Σχήμα. 4D (αριστερά), PMS1077 κατέστειλε πλήρως την συστατική φωσφορυλίωση ρ65 σε κύτταρα DU145 με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Επιπλέον, PMS601 βρέθηκε να έχει σημαντική επίδραση τόσο στην επαγώγιμοι και ιδιοσυστατικοί φωσφορυλίωση της ρ65 (Εικ. S1). Έτσι, αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι PMS1077 μπορεί να καταστείλει τόσο την επαγώγιμη και συστατική ενεργοποίηση ΝΡ-κΒ.

PMS1077 μπλοκάρει ΤΝΡ-α που επάγεται ΝΡ-κΒ /p65 πυρηνική μετατόπιση

Επειδή αποικοδόμηση της ΙκΒ-α είναι που απαιτούνται για την πυρηνική μετατόπιση του p65, επιδιώξαμε να διαπιστωθεί αν PMS1077 θα μπορούσε επίσης να καταστείλει την επαγόμενη από τον TNF-α πυρηνική μετατόπιση του p65. Η ανάλυση στυπώματος Western έδειξε ότι η πυρηνική μετατόπιση του p65 εμφανίστηκαν σε DU145 μετά από θεραπεία TNF-α. Ωστόσο, όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με PMS1077 (50 μΜ) ή TPCA-1, TNF-α απέτυχαν να διεγείρουν την πυρηνική μετατόπιση του ρ65 (Εικ. 5Α). Για να επιβεβαιώσουν αυτά τα αποτελέσματα, πραγματοποιήσαμε ανοσοκυτταροχημεία να παρατηρήσουμε p65 σε PC3 και DU145 κύτταρα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι σε χωρίς θεραπεία, όπως επίσης και PMS1077 (50 μΜ) ή TPCA-1 προεπεξεργασμένων κυττάρων, p65 εντοπίστηκε στο κυτταρόπλασμα, ενώ σε κύτταρα κατεργασμένα με ΤΝΡ-α μόνο, p65 ήταν μετατοπίζεται προς τον πυρήνα (Σχ. 5Β και Fig.S2). Ωστόσο, PMS601 δεν έδειξε καμία επίδραση σε αυτή την μετατόπιση του p65 (Εικ. S2). Αυτά τα δεδομένα επιβεβαίωσαν ότι PMS1077 μπλοκάρει την ΤΝΡ-α που προκαλείται από την πυρηνική μετατόπιση της p65.

(Α) κύτταρα DU145 προκατεργάστηκαν με PMS1077 (50 μΜ) ή TPCA-1 (2 μΜ) για 6 ώρες και ακολούθησε TNF -α (20 ng /ml) διέγερσης για 0,5 ώρα. Κυτταροπλασματικά και πυρηνικά εκχυλίσματα που αντιπροσωπεύουν ίσο αριθμό κύτταρα αναλύθηκαν με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. (Β) κύτταρα PC-3 υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με PMS1077 (50 μΜ) για 6 ώρες και ακολούθησε ΤΝΡ-α (20 ng /ml) διέγερσης για 0,5 ώρα. TPCA-1 (2 μΜ) και DMSO χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός αναστολέας του ΝΡ-κΒ και αρνητικός έλεγχος, αντίστοιχα. Μετά την επεξεργασία, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με πρωτεύον αντίσωμα αντι-ρ65 και Cy3 φλουορεσκεΐνη συζευγμένο με δευτερογενές αντίσωμα (Κόκκινο), και στη συνέχεια ο πυρήνας ήταν αντίθετη χρώση με ϋΑΡΙ (μπλε) και εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φθορισμού. Εικόνες αποκτήθηκαν για κάθε κανάλι φθορισμού, χρησιμοποιώντας κατάλληλα φίλτρα με 40 × στόχο. Τα κόκκινα και μπλε εικόνες συγχωνεύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό J Image. Όλα τα στοιχεία που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Docking μελέτη με μοριακή μοντελοποίηση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ PMS1077 ή PMS601 και ΙΚΚ-β

Μια ποικιλία παραγόντων, συμπεριλαμβανομένων των ΤΝΡ-α, ιντερλευκίνη-1 βήτα (beta), οξική μυριστική φορβόλη (ΡΜΑ), και το οκαδαϊκό οξύ (ΟΑ) έχουν αναφερθεί ότι ενεργοποιούν ΝΡ-κΒ, και ΡΜΑ μπορεί να επάγει ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ μέσω της ΙΚΚ σύμπλοκο [28], [29] . Στην παρούσα μελέτη, PMS1077 μπορεί τόσο να αναστέλλουν ΤΝΡ-α και ΡΜΑ επαγόμενη δραστικότητα ΝΡ-κΒ (Σχ. 2Α και το σχ. S3). Η επαγόμενη ΤΝΡ-α φωσφορυλίωση της ΙκΒ-α καταλύεται από ΙΚΚ. Με βάση το γεγονός ότι μπορούν να αναστείλουν PMS1077 ΙκΒ-α φωσφορυλίωση, αλλά PMS601 δεν έδειξε καμία επίδραση σε αυτό το φωσφορυλίωσης (Εικ. 4C), έχουμε σκεφτεί εάν PMS1077 θα μπορούσαν να στοχεύουν ΙΚΚ. Για να διερευνηθεί αυτή η πιθανότητα, συγκρίναμε τη συγγένεια δέσμευσης αυτών των δύο ενώσεων και ΙΚΚ-β χρησιμοποιώντας υπολογιστικές μεθόδους. PMS1077 και PMS601 ήταν αγκυροβολημένο στην περιοχή της κινάσης ΙΚΚ-β, και συγγένεια πρόσδεσης εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τρεις διαφορετικές λειτουργίες σκορ που ήταν ΑυΤΌϋΟΟΚ βαθμολογία Vina, ΑυΤΌϋΟΟΚ σκοράρει 4.1 και NNScore 2.0 (βλέπε Υλικά και μέθοδοι). Από το αποτέλεσμά Vina ΑυΤΌϋΟΟΚ, το σκορ του PMS1077 είναι χαμηλότερη από εκείνη PMS601, και η υπολογισθείσα Κ

δ της PMS1077 ήταν Κατά προσέγγιση 15 φορές χαμηλότερη από εκείνη του PMS601. Αυτό επιβεβαιώθηκε από άλλο σύστημα δύο βαθμολογίας (πίνακας 1). Τόσο ΑυΤΌϋΟΟΚ στείλει 4.1 και 2.0 NNScore έδειξε ότι το υπολογιζόμενο K

d του PMS1077 ήταν περισσότερο από δύο εκατοντάδες χαμηλότερη από εκείνη του PMS601. Ο υπολογισμός αυτός είναι σε συμφωνία με τα αποτελέσματα που δίνονται παραπάνω (Σχ. 4Β), το οποίο δεν έδειξε εμφανή μεταβολή στη φωσφορυλίωση του ΙκΒ-α σε συγκεντρώσεις PMS601 έως 80 μΜ. Οι λεπτομέρειες των αλληλεπιδράσεων μεταξύ PMS1077 και ΙΚΚ-β δείχθηκε στο Σχ. 6. υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις βρέθηκαν να συνεισφέρουν περισσότερα στην συγγένεια δέσμευσης, όπως υπολείμματα LUE21, VAL29, TYR98 και ILE165. Δύο δεσμοί υδρογόνου που σχηματίζονται μεταξύ THR23 και PMS1077.

(Α) Το 3D μοντέλο της PMS1077 (μπάλα και ραβδί στυλ) αλληλεπίδραση με ΙΚΚ-β πεδίο κινάσης (υπολείμματα φαίνεται στο μοντέλο stick), οι δεσμοί υδρογόνου εμφανίζονται με διακεκομμένες γραμμή. (Β) Το διάγραμμα 2D αλληλεπιδράσεων μεταξύ PMS1077 και ΙΚΚ-β.

Η

Με τον τρόπο αυτό, οι υπολογισμοί αυτοί αποκάλυψαν ότι PMS1077 μπορεί να αναστέλλει την ενεργοποίηση του NF-κΒ με απευθείας σύνδεση με το ΙΚΚ-β και διαφορετική συγγένεια δέσμευσης με ΙΚΚ-β οδηγεί σε διαφορετική δραστηριότητα από PMS1077 και PMS601.

PMS1077 ευαισθητοποιημένα κύτταρα καρκίνου του προστάτη σε TNF-α απόπτωση που επάγεται μέσω καταστολή του ΤΝΡ-α που επάγεται μεταγραφή των αντι-αποπτωτικών γονιδίων

προηγούμενη εργασία μας έχει αποδείξει ότι PMS1077 θα μπορούσε να επάγει απόπτωση των κυττάρων Raji [5]. Στην εργασία αυτή, βρήκαμε ότι PMS1077 επάγεται επίσης απόπτωση στα DU145 και σημαντικά ευαισθητοποιημένα ΤΝΡ-α απόπτωση, όπως αποδεικνύεται από την ανάλυση ΜΤΤ (Εικ. 7Α) και με διαφορική μικροσκοπία αντίθεσης παρεμβολή (Εικ. 7Β). Αυτό επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με κυτταρομετρία ροής διαμέσου αννεξίνης-ν-ΡΙΤΟ και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) χρώση του PMS1077 αντιμετωπίζονται DU145 κυττάρων όπως φαίνεται στο Σχ. 7C.

(Α) κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα, PMS1077 ή PMS601 ως την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση (0-80 μΜ) και στη συνέχεια επωάστηκαν με ή χωρίς ΤΝΡ-α (20 ng /ml) για 24 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ. (Β) κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα ή PMS1077 (40 και 80 μΜ), και στη συνέχεια επωάστηκαν με TNF-α (20 ng /ml) για 24 ώρες. Τα επεξεργασμένα κύτταρα παρατηρήθηκαν με διαφορική μικροσκόπιο αντίθεσης παρεμβολές. (C) κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία ως (Β) και ανάλυση απόπτωσης διεξήχθη με κυτταρομετρία ροής διαμέσου αννεξίνης-ν-ΡΙΤΟ και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) χρώση επεξεργασμένα κύτταρα. (D) κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα ή PMS1077 (40 και 80 μΜ), στη συνέχεια επωάστηκαν με TNF-α (20 ng /ml) για 12 ώρες. Μετά την επεξεργασία, το σύνολο κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western με αντισώματα όπως υποδεικνύεται. (Ε) κύτταρα DU145 επωάστηκαν με ΤΝΡ-α (20 ng /ml) για 1 ώρα, με όχημα ή PMS1077 προεπεξεργασίας για 6 ώρες. Το επίπεδο του mRNA των γονιδίων στόχων ΝΡ κΒ εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας RT-PCR. (F) κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία ως (D) και τα προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western με αντισώματα για PARP και GAPDH. Όλα τα στοιχεία που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Έχει εδραιωθεί ότι η αναστολή του μονοπατιού σηματοδότησης ΝΡ-κΒ ευαισθητοποιεί TNF-α που προκαλείται από το κυτταρικό θάνατο και TNF-α χρησιμοποιείται συχνά για να προκαλέσει κυτταρική απόπτωση [30], [31], [32]. ΝΡ-κΒ σηματοδότηση ανταγωνίζεται TNF-α και χημειοθεραπευτικών παραγόντων απόπτωση που επάγεται με την προώθηση της μεταγραφής των αντι-αποπτωτικών γονιδίων, όπως c-flip, CIAP-1, CIAP-2, ΧΙΑΡ, survivin, Bcl-xL και Bcl-2. Με τον τρόπο αυτό, το κλείδωμα του ΝΡ-κΒ σηματοδότηση μπορεί να ενισχύσει ΤΝΡ-α επαγόμενη απόπτωση [31], [32], [33], [34]. Στη συνέχεια προσδιορίζεται αν PMS1077 μπορούν να διαμορφώσουν την ΤΝΡ-α επαγόμενη έκφραση των γονιδίων αντι-απόπτωση Bcl-XL, Bcl-2 και survivin σε κύτταρα DU145. Αξίζει να σημειωθεί ότι, μετά την επεξεργασία του TNF-α, η έκφραση αυτών των γονιδίων ενισχύθηκε, αλλά προεπεξεργασία των κυττάρων με PMS1077 κάτω-ρυθμίζεται η έκφραση αυτών των γονιδίων σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο τόσο σε πρωτεΐνη και το επίπεδο mRNA (Σχ. 7D και 7Ε). Βρήκαμε επίσης ότι ο ΤΝΡ-α επαγόμενη διάσπαση της PARP αυξήθηκε σημαντικά από την PMS1077 (Σχ. 7F).