Abstract

υποξία παράγοντα-1 (HIF-1) και το πιο σημαντικό υπομονάδα, HIF-1α του, παίζει έναν κεντρικό ρόλο στην πρόοδο του όγκου με τη ρύθμιση των γονιδίων που εμπλέκονται στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων, τον πολλαπλασιασμό και τη μετάσταση . δραστηριότητα HIF-1α σχετίζεται με πυρηνική συσσώρευση του μεταγραφικού παράγοντα και ρυθμίζεται από διάφορους μηχανισμούς που περιλαμβάνουν διαμόρφωση της σταθερότητας και της υποβάθμισης της πρωτεΐνης. Μεταξύ πρόσφατες πρόοδοι είναι οι ανακαλύψεις που φλεγμονή που προκαλείται από κυτοκίνες και αυξητικούς παράγοντες επηρεάζουν τη συσσώρευση πρωτείνης του HIF-1α κάτω από συνθήκες νορμοξία. TNFa, μια σημαντική προ-φλεγμονώδης κυτοκίνη που προάγει την ογκογένεση είναι γνωστό ως διεγέρτης της δραστηριότητας HIF-1α. Για την καλύτερη κατανόηση του TNFα με τη μεσολάβηση ρύθμιση της πυρηνικής συσσώρευσης HIF-1α σε διαλογή μια βιβλιοθήκη siRNA κινάσης ειδικά χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία χίμαιρα ρεπόρτερ HIF-1α-eGFP κυττάρων απεικόνισης που βασίζονται. Είναι ενδιαφέρον, αυτή η συστηματική ανάλυση καθορίζεται ότι η εξάντληση των κινασών που εμπλέκονται στα συμβατικά σηματοδότησης TNFa (ΙΚΚ /NFκB και μονοπάτια ΙΝΚ) δεν έχει δυσμενή επίδραση στην συσσώρευση HIF-1α. Από την άλλη πλευρά, η εξάντληση των PRKAR2B, ADCK2, TRPM7, και TRIB2 μειώνει σημαντικά την επίδραση του TNFa επί HIF-1α σταθερότητα σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου οστεοσαρκώματος και του προστάτη. Αυτά που ανακαλύφθηκαν πρόσφατα ρυθμιστές μετέφερε τους δραστηριότητα μέσω μιας μη-συμβατικό RELB-εξαρτιόταν NFκB οδού και τη ρύθμιση του υπεροξειδίου δραστηριότητας σηματοδότησης. Στο σύνολό τους τα δεδομένα μας επιτρέπουν να συμπεράνουμε ότι ο TNFα χρησιμοποιεί μια ξεχωριστή και πολύπλοκο μηχανισμό σηματοδότησης για να προκαλέσει συσσώρευση του HIF-1α σε καρκινικά κύτταρα. Συνοπτικά, τα αποτελέσματα μας φωτίζει ένα νέο μηχανισμό, μέσω του οποίου μπορεί να προωθηθεί έναρξη και την εξέλιξη του καρκίνου με φλεγμονώδεις κυτοκίνες, αναδεικνύοντας νέες πιθανές κατευθύνσεις για την καταπολέμηση αυτής της ασθένειας

Παράθεση:. Schoolmeesters Α, Μπράουν DD, Fedorov Υ (2012) Kinome-Wide Functional Genomics Screen αποκαλύπτει ένα νέο μηχανισμό επαγόμενη από τον ΤΝΡα πυρηνική συσσώρευση της μεταγραφής Παράγοντα HIF-1α σε καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 7 (2): e31270. doi: 10.1371 /journal.pone.0031270

Επιμέλεια: Ying Xu, University of Georgia, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 13 Σεπτέμβρη του 2011? Αποδεκτές: 5 του Γενάρη 2012? Δημοσιεύθηκε: 15 Φεβ 2012

Copyright: © 2012 Schoolmeesters et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από Thermo Fisher Scientific. Δεν υπάρχουν τρέχουσες εξωτερικές πηγές χρηματοδότησης για τη μελέτη αυτή

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και έχουν την ακόλουθη ανταγωνιστικών συμφερόντων: Όλες οι συντάκτες που απασχολούνται από Thermo Fisher Scientific. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων για όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Εισαγωγή

Η φλεγμονή είναι μια βασική διαδικασία άμυνα κατά των διαφόρων εξωκυττάριας ερεθίσματα, όπως οι ιοί, παθογόνα, τα τρόφιμα, και περιβαλλοντικούς ρύπους. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η ογκογένεση σε πολλούς καρκίνους είναι στενά συνδεδεμένο με χρόνια φλεγμονή. Οι ανώμαλες κυτταρικές αλλοιώσεις που συνοδεύουν τη χρόνια φλεγμονή, όπως το οξειδωτικό στρες, η μετάλλαξη του γονιδίου, επιγενετική αλλαγή, και αποδέσμευσης των φλεγμονωδών κυτοκινών από κοινού με καρκινογόνες διαδικασίες, οι οποίες αποτελούν μια κρίσιμη διασταυρούμενη σύνδεση μεταξύ χρόνιας φλεγμονής και καρκινογένεσης. Σχεδόν το 25% των καρκίνων αναφερθεί ότι εμφανίζεται μέσω της χρόνιας διεργασίες που σχετίζονται με φλεγμονή [1], [2]. Οι προ-φλεγμονώδεις ρυθμιστικές όπως TNFa και άλλων κυτοκινών και των δικτύων του υποδοχέα τους φαίνεται να παίζουν κρίσιμο λειτουργίες σε ογκογένεση [3].

υποξία παράγοντα-1 (HIF-1) και το πιο σημαντικό υπομονάδα της, HIF -1α, παίζει έναν κεντρικό ρόλο στην πρόοδο του όγκου με τη ρύθμιση των γονιδίων που εμπλέκονται στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων, τον πολλαπλασιασμό και τη μετάσταση [4]. HIF-1 είναι ένα κύριο συστατικό του συστήματος ανίχνευσης οξυγόνου που διέπει κυτταρικές αποκρίσεις σε μειωμένη διαθεσιμότητα οξυγόνου. Η υποξία παράγοντας επαγώγιμη μεταγραφή HIF-1 είναι ένα ετεροδιμερές που αποτελείται από την έλικα-βρόχος-έλικα-Per-Arnt-Sim (bHLH-PAS) πρωτεΐνες HIF-1α και της πυρηνικής μεταθέτη αρυλ υδρογονάνθρακα (ARNT), επίσης γνωστή ως HIF-1β. Διενεργοποίησης του HIF-1 μεταδίδει ένα υποξικό σήματος σε ένα πλήθος παθοφυσιολογικών αποκρίσεων με ρύθμιση πολλών γονιδίων στόχων [4], [5].

Εκτός από υποξία, πιο πρόσφατα στοιχεία υποδηλώνουν ότι HIF-1 μπορεί να είναι συσσωρευμένη και ενεργοποιούνται κατά τη διάρκεια νορμοξίας από αυξητικούς παράγοντες, κυτοκίνες και άλλους παράγοντες που σχετίζονται με τη φλεγμονή [5]. Αρκετές αναφορές έχουν δείξει ένα σημαντικό ρόλο του TNFa σε ρύθμιση του HIF-1α σταθερότητα και δραστικότητα [6] – [8]. Ωστόσο, οι λεπτομέρειες της ρύθμισης HIF-1 από TNFα παραμένουν ασαφείς.

Εδώ, περιγράφουμε μηχανισμούς που υποκινούν τη συσσώρευση HIF-1α σε απάντηση TNFα σηματοδότησης. Για την καλύτερη κατανόηση του HIF-1 ρύθμιση από την κυτοκίνη, που προβλήθηκε μια μικρή παρεμβολή RNA (siRNA) βιβλιοθήκη κινάσης ειδικά χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία χίμαιρα ρεπόρτερ HIF-1α-eGFP υπό θεραπεία TNFα. Αυτή η οθόνη προσδιορίζεται ότι η εξάντληση των

ADCK2

,

PRKAR2B

,

TRIB2

και

TRPM7

ρυθμίζει προς τα κάτω πιο σημαντικά πυρηνική συσσώρευση του HIF-1α σε απάντηση της επεξεργασία των κυττάρων οστεοσαρκώματος. Επιπλέον, τα αποτελέσματα μας υποδεικνύουν ότι αυτή η οδός είναι επίσης παρούσα σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Παραδόξως, ο μηχανισμός ρύθμισης του HIF-1α συσσώρευση ΤΝΡα-προκαλούνται συνδέθηκε με μια μη-συμβατική οδό σηματοδότησης ΝΡκΒ και την ανακούφιση της δραστηριότητας υπεροξειδίου. Στο σύνολό τους τα δεδομένα μας επιτρέπουν να συμπεράνουμε ότι ο TNFα χρησιμοποιεί μια ξεχωριστή και πολύπλοκο μηχανισμό σηματοδότησης για να προκαλέσει συσσώρευση του HIF-1α.

Αποτελέσματα

TNFα είναι ένας σημαντικός φλεγμονώδης κυτοκίνη φέρεται να είναι ένας ισχυρός επαγωγέας του HIF-1α πυρηνική συσσώρευση [5] – [8]. Εξετάσαμε διάφορες καρκινικές κυτταρικές γραμμές για συσσώρευση HIF-1α υπό θεραπεία TNFa. Στα πειράματά μας, TNFa προκάλεσε σημαντική αύξηση στην πυρηνική συσσώρευση του HIF-1α σε αρκετές ακυρώσει κυτταρικές σειρές (Σχ. 1α). Ομοίως, TNFa που προκαλείται πυρηνική συσσώρευση μιας πρωτεΐνης HIF-1α-eGFP χίμαιρα (Εικ. S1a, Σχ. 1β, γ) στη δοκιμασία αναδιανομή HIF-1α_U2OS βασίζονται σε οστεοσαρκώματος κυτταρική γραμμή. Η παρατηρούμενη επίδραση ήταν συγκέντρωσης- και χρονο-εξαρτώμενη (Εικ. 1 b, c). επώαση 24 hr με ΤΝΡα στα 10 ng /mL επιλέχθηκε για όλα τα πειράματα διαλογής να παρέχει ένα κατάλληλο παράθυρο για να μελετήσει επάνω και κάτω για ρύθμιση της συσσώρευσης HIF-1α.

(Α) ΤΝΡα επαγόμενη πυρηνική συσσώρευση του HIF -1α σε LNCaP, DU145, ΜΟΡ10Α και καρκινικές κυτταρικές γραμμές MDA ΜΒ231. Έκφραση και πυρηνική συσσώρευση του HIF-1α προσδιορίσθηκε με απεικόνιση ανοσοκυτταροχημεία όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. (Β) επαγόμενη από τον ΤΝΡα διέγερση του HIF-1α-eGFP πυρηνική συσσώρευση σε U2OS οστεοσάρκωμα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο. (Γ) ΤΝΡα διεγερμένα HIF-1α-eGFP πυρηνική συσσώρευση σε κύτταρα U2OS σε χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Όλα τα δεδομένα (Median +/- MAD) ρυθμίζεται σύμφωνα με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. Για κάθε πίνακα, τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά δύο ανεξάρτητων πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν *, **: ρ. Αξίας έλεγχος τ μεταξύ κατεργασμένα κύτταρα και αντίστοιχης ομάδας ελέγχου, * – ρ & lt? 0,01, ** – ρ & lt? 0,05

υπάρχουν δύο υποδοχείς που περιγράφονται για TNFα, δηλαδή TNF υποδοχέα 1 (TNFR1, υποδοχέα ρ55) και TNF υποδοχέα 2 (TNFR2, υποδοχέα p75). TNFR1 εκφράζεται παντού ενώ TNFR2 εκφράζεται κυρίως σε κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος [9]. Αν και οι δύο υποδοχείς δεσμεύουν TNFa, ο κύριος υποδοχέας διαμεσολαβεί κυτταρικές επιδράσεις στους περισσότερους τύπους κυττάρων είναι TNFR1. Στα πειράματά μας, knockdown του ΤΝΡΚ1 μειωμένη αποτελεσματικά TNFα εξαρτώμενη πυρηνική συσσώρευση του HIF-1α (Εικόνα S1b). ΤΝΡα είναι γνωστό ότι ενεργοποιεί πολλαπλές οδούς κατάντη του TNFR1 [9]. Για να διερευνηθεί ο ρόλος των κινασών στη ρύθμιση της συσσώρευσης HIF-1α υπό θεραπεία TNFa, εμείς απεμπλουτισμένο κινάσες στα κύτταρα HIF-1α-U2OS χρησιμοποιώντας μια βιβλιοθήκη siRNA κινάσης στόχευση 788 κινάσες και στη συνέχεια αναλύθηκαν κυτταρική συσσώρευση του HIF-1α-eGFP μετά από επώαση με ΤΝΡα ( Σχ. 2α). Για την ελαχιστοποίηση siRNA δραστηριότητα εκτός στόχου χρησιμοποιήσαμε ON-TARGET

συν

έκδοση του ανθρώπινου κινασών συλλογή SMART

πισίνα

αντιδραστήρια siRNA [10]. Η ίδια βιβλιοθήκη υποβλήθηκε σε διαλογή κινάσης σε μια κυτταρική γραμμή που εκφράζει τον έλεγχο μόνο eGFP να αφαιρούν το δυνατόν μη ειδικές επιδράσεις. δεδομένων του προσυμπτωματικού ελέγχου του HIF-1α-eGFP υποβλήθηκαν σε t-test ανάλυση Student p-value, Benjamini-Hochberg διόρθωση πολλαπλών συγκρίσεων [11], και την κατάταξη των επιδόσεων που ακολουθείται από τη σύγκριση ανάμεσα σε δύο ανεξάρτητα πειράματα διαλογής με μια φορές όριο 1,5 αλλαγή. Δεδομένα που προκύπτουν περαιτέρω σε σύγκριση με τα δεδομένα από τον πάγκο οθόνης με κύτταρα που εκφράζουν eGFP μόνο (1,2 φορές το όριο αλλαγής για eGFP μόνο, Σχ S2) και επικαλυπτόμενες επιτυχίες απορριφθεί. Μεταξύ των 788 κινασών διαλογή με siRNA μεσολάβηση αποσιώπηση, η εξάντληση των 77 γονιδίων αυξημένη συσσώρευση HIF-1α-eGFP πάνω από 2 φορές (Πίνακας S1) και η εξάντληση των επτά ακόμη γονιδίων στόχων μειωμένη συσσώρευση υπό θεραπεία TNFα (Σχ. 2α). Τα γονίδια επίδειξη ενός siRNA-μεσολαβούσα μείωση της συσσώρευσης HIF-1α ήταν ιδιαίτερου ενδιαφέροντος επειδή αυτά θα μπορούσαν δυνητικά να αντιπροσωπεύουν τα μέλη του μονοπατιών σηματοδότησης TNFa. Αυτές περιλαμβάνουν

PRKAR2B, ADCK2, TRPM7, RIOK2, ΤΡΙΟ, ADRA1B και TRIB2

. Για να επιβεβαιωθεί ότι η μείωση της συσσώρευσης HIF-1α ΤΝΡα επαγόμενη σε κύτταρα siRNA επιμολυσμένα είχε άμεση σχέση με την ελάττωση της επιλεγμένους στόχους επαναλάβαμε το πείραμα με τη χρήση νεοσυντιθέμενες πισίνες siRNA (Σχ. 2β). Μόνο ένας στους επτά επιλεγμένους υποψηφίους χτύπημα δεν επιβεβαιώθηκε:. SiRNA που στοχεύει

ADRA1B

(τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται), τα οποία στη συνέχεια παραλειφθεί από την περαιτέρω ανάλυση

(Α) Εκπρόσωπος δεδομένα που από kinome ανώτερου ανοικτού οθόνη των 788 siRNAs. Δεδομένων (Μέσος όρος +/- MAD) είναι αντιπροσωπευτικά των τριών μεμονωμένων επιμολύνσεις και κανονικοποιούνται για τον έλεγχο siRNA. (Β) Επιλεγμένα siRNA χτύπησε υποψήφιοι εξετάστηκαν σε ξεχωριστά πειράματα. siRNAs που στοχεύουν

ADCK2, RIOK2, PRKAR2B, TRIB2, TRIO και TRPM7

επιβεβαιώθηκαν ως υποψήφιοι χτύπημα και να υποβληθεί σε περαιτέρω ανάλυση. Όλα τα δεδομένα κανονικοποιούνται σε κύτταρα επιμολυσμένα με τον έλεγχο siRNA NTC1. (Γ) η επίδραση των επιλεγμένων siRNA χτύπησε υποψήφιοι για HIF-1α συσσώρευση σε LNCaP καρκίνου του προστάτη κυτταρική γραμμή. Δεδομένων (Μέσος όρος +/- MAD) είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων που εκτελούνται εις τριπλούν. Όλα τα δεδομένα κανονικοποιούνται σε κύτταρα ΤΝΡα φάρμακο. *, **:. Τιμή p έλεγχος τ μεταξύ επεξεργασμένα κύτταρα και αντίστοιχη ομάδα ελέγχου, * – p & lt? 0,01, ** – p & lt? 0,05

Η

Μια υψηλής προσέγγιση Ανάλυση Περιεχομένου επιτρέπει την ταυτόχρονη εξαγορά πολλαπλών ροές δεδομένων από το ίδιο σύνολο των δειγμάτων. Αξιοποιήσαμε αυτήν την προσέγγιση να αναλύσει περαιτέρω τα δεδομένα ελέγχου. Συλλέγονται δεδομένα (αριθμός κυττάρων ανά πεδίο) πρότεινε ότι κανένα από τα επιλεγμένα siRNAs (

PRKAR2B, ADCK2, TRPM7, RIOK2, ΤΡΙΟ, και TRIB2)

παράγεται καμία επίδραση στην βιωσιμότητα των κυττάρων (Σχ S3). Εκτός από τον έλεγχο της σταθερότητας της πρωτεΐνης, η λειτουργία HIF-1α μπορεί να ρυθμιστεί με μεθόδους που επηρεάζουν υποκυτταρικού εντοπισμού του, π.χ. κυτταροπλασματική εναντίον των πυρηνικών. Ταυτόχρονη μέτρηση της συσσώρευσης HIF-1α στους πυρήνες και κυτταρόπλασμα έδειξε ότι κανένας από τους στόχους siRNA που επιλέγονται για μία μείωση στην πυρηνική συσσώρευση παρήγαγε μια αύξηση στο κυτταροπλασματικό κατακράτηση του HIF-1α (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Για να εξεταστεί εάν επιλεγεί υποψήφιος χτυπήματα μπορεί να επηρεάσει τον ΤΝΡα με τη μεσολάβηση συσσώρευσης του HIF-1α σε άλλους τύπους κυττάρων που προσδιορίζεται HIF-1α πυρηνική συσσώρευση σε καρκινικές κυτταρικές σειρές προστάτη. συσσώρευση HIF-1α σε LNCaP και κυττάρων DU145 βρέθηκε να είναι ευαίσθητα σε ΤΝΡα ενώ PC3, μια κυτταρική σειρά προστάτη με σημαντικές επεμβατική δυναμικό [12], δεν έδειξε καμία τέτοια ευαισθησία (Εικ. 1a,). Εξάντληση των

PRKAR2B

,

ADCK2

,

TRPM7

και

TRIB2

μειώθηκε σημαντικά τη συσσώρευση HIF-1α σε LNCaP, μία κυτταρική αδενοκαρκίνωμα ανθρώπινου προστάτη ανδρογόνα-ευαίσθητο σύμφωνα με χαμηλή επεμβατική δυναμικό (Σχ. 2γ). Δεδομένα παρόμοια με U2OS και LNCaP ελήφθησαν επίσης από ΜΟΡ10Α, ένα μη ογκογόνων μαστική επιθηλιακή κυτταρική γραμμή (Σχ S4A). Σε κύτταρα DU145, ένας καρκίνος του προστάτη κυτταρική γραμμή με μέτρια επεμβατική δυναμικό, μόνο

TRIB2

εξάντληση ήταν αποτελεσματική στην κατάργηση της συσσώρευσης HIF-1α TNFα που προκαλείται (Εικ S4b). Με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα

PRKAR2B, ADCK2, TRPM7 και TRIB2

επιλέχθηκαν για περαιτέρω ανάλυση. πισίνες siRNA που στοχεύει αυτά τα γονίδια που παράγονται εξαρτάται από τη συγκέντρωση επιδράσεις στην συσσώρευση ΤΝΡα-διεγερμένα HIF-1α σε κύτταρα οστεοσαρκώματος U2OS (Εικ. 3α)

(Α) Επιλεγμένα siRNAs μειώνουν τη συσσώρευση HIF-1α ΤΝΡα μεσολάβηση σε μια συγκέντρωση που εξαρτάται maner. (Β) πισίνες siRNA και μεμονωμένων μορίων siRNA που παράγονται συγκρίσιμα αποτελέσματα σε συσσώρευση HIF-1α. (C) πισίνες siRNA και μεμονωμένων μορίων siRNA για τους επιλεγέντες υποψηφίους χτύπημα παρέχει αποτελεσματική μείωση του γονιδίου στόχου. κύτταρα U2OS επωάστηκαν με ΤΝΡα για 24 ώρες. Όλα τα δεδομένα κανονικοποιούνται σε κύτταρα επιμολυσμένα με τον έλεγχο siRNA NTC1. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά δύο ανεξάρτητα πειράματα, τρεις (Α, Β, Median +/- MAD) ή δύο (C, Μέση +/- STDEV) επιμέρους επιμολύνσεις καθένα.

Η

Σε όλα τα πειράματά μας χρησιμοποιήσαμε τις στρατηγικές που είναι γνωστό ότι μειώνει siRNA εκτός στόχου αποτελέσματα: εφαρμογή του χημικά τροποποιημένων μορίων siRNA και χρήση ενός συγκέντρωσης στρατηγική siRNA. Για την περαιτέρω επιβεβαιώνουν ότι η μείωση στη συσσώρευση HIF-1α ΤΝΡα επαγόμενη σε κύτταρα siRNA επιμολυσμένα είχε άμεση σχέση με on-στόχο επιδράσεις του siRNA, επαναλάβαμε το πείραμα με τη χρήση πρόσφατα συντεθεί πισίνες siRNA και τέσσερις ξεχωριστές siRNA δίπολα (τα οποία περιλαμβάνουν κάθε πισίνα ) να καταστρέφουν τα τέσσερα κυτταρικούς στόχους. Αυτά τα πειράματα έδωσαν αποτελέσματα παρόμοια με τα δεδομένα ελέγχου – και για τις τέσσερις πισίνες στόχους siRNA και τέσσερα μεμονωμένα siRNA δίπολα που παράγεται σημαντική μείωση στην HIF-1α συσσώρευση (& gt? 2 φορές, Σχήμα 3β.). Αποτελεσματικότητα του γονιδίου νοκ ντάουν στόχου για επιλεγμένες επιτυχίες siRNA προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας Q-PCR και Solaris ανιχνευτές. εξάντληση του γονιδίου-στόχου συσχετίζεται με την φαινοτυπική ανάλυση HIF-1α – για όλες τις τέσσερις πισίνες στόχους siRNA που χρησιμοποιούνται στην εκστρατεία ελέγχου και τέσσερα μεμονωμένα siRNA δίπολα αποδειχθεί ισχυρό νοκ ντάουν (& gt? 60%, Σχήμα 3γ.). TRPM7 είναι κακώς εκφράζεται σε κύτταρα U2OS και εφαρμογή οποιουδήποτε αντιδραστηρίου RNAi εξαλειφθεί αποτελεσματικά η έκφραση αυτού του στόχου σε ένα μη ανιχνεύσιμο επίπεδο (Σχ. 3c).

ΤΝΡα είναι γνωστό ότι ρυθμίζει την έκφραση των πρωτεϊνών εντός των καταρρακτών σηματοδότησης του. Βρήκαμε ότι η έκφραση του ADCK2 και TRIB2 mRNA ρυθμίζεται από ΤΝΡα σε καρκινικά κύτταρα U2OS (Εικ S5). Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική αλλαγές ανιχνεύθηκαν για PRKAR2B και TRPM7.

Πρόσφατες εκθέσεις δείχνουν ότι HIF-1α σταθερότητα και η δραστηριότητα μπορεί να ρυθμιστεί μέσω του οξειδωτικού στρες ευαίσθητα μονοπάτια [6], [13], [14]. Τέτοιες πορείες είναι επίσης καλά γνωστά ρυθμιστές του TNFα σηματοδότησης [6], [15]. Για να εξεταστεί ένα πιθανό ρόλο του οξειδωτικού στρες σε μηχανισμούς συσσώρευση HIF-1α ΤΝΡα-διεγερμένα ερευνήσαμε την επίδραση του εξωγενούς υπεροξειδίου του υδρογόνου. Ενώ το υπεροξείδιο του υδρογόνου μόνο παρήγαγε μια σημαντική αύξηση στη συσσώρευση HIF-1α, ένα αντίθετο αποτέλεσμα παρατηρήθηκε επί ΤΝΡα προεπεξεργασμένων κύτταρα (Σχ. 4α). Το αποτέλεσμα αυτό υποδεικνύει πιθανή αρνητική ρύθμιση της συσσώρευσης HIF-1α από υπεροξειδίου, μια κύρια πηγή της ενδοκυτταρικής υπεροξειδίου [16]. Υποθέσαμε ότι πρόσφατα ανακαλύφθηκε θετικοί ρυθμιστές της συσσώρευσης HIF-1α μπορεί να ελέγχει, είτε υπεροξειδίου παραγωγής ή μετατροπή σε υπεροξείδιο. Σε κύτταρα U2OS, TNFa σθεναρά αυξημένη έκφραση MnSOD, ένα από τα κύρια ένζυμα μετατροπής υπεροξειδίου /υπεροξειδίου (Σχ S6). Ωστόσο, η εξάντληση των προσδιορισμένων θετικών ρυθμιστών της συσσώρευσης HIF-1α δεν είχε καμία επίδραση στην έκφραση του MnSOD (Σχ S6).

(Α) ενώ η προσθήκη του υπεροξειδίου του υδρογόνου (100 μΜ, 3 ώρες επώασης) μπορεί να διεγείρει HIF -1α συσσώρευση, μειώνει τέτοια συσσώρευση σε κύτταρα ΤΝΡα φάρμακο (21 ώρες επώαση με ΤΝΡα ακολουθείται μόνο από 3 ώρες επωάσεως με την παρουσία τόσο του ΤΝΡα όσο και υπεροξείδιο του υδρογόνου). Δεδομένων (Μέσος όρος +/- MAD) κανονικοποιημένη σε κύτταρα επιμολυσμένα με τον έλεγχο siRNA NTC1 και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με DMSO. (Β) Η υπεροξειδική οδοκαθαριστές διάσωσης συσσώρευση HIF-1α σε κύτταρα επιμολυσμένα με siRNAs που στοχεύουν

ADCK2

και

TRIB2

αλλά όχι

PRKAR2B

ή

TRPM7

. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΤΝΡα παρόμοιες με (Α) και επωάστηκε με Tiron (0,3 mM), 4-υδροξυ-ΤΕΜΡΟ (0.1 mM) ή DMSO (έλεγχος οχήματος) για 3 ώρες. Δεδομένων (Μέσος όρος +/- MAD) κανονικοποιημένη σε κύτταρα επιμολυσμένα με τον έλεγχο siRNA NTC1 και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με DMSO. Για κάθε πίνακα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά δύο ανεξάρτητων πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν εις τετραπλούν. *, **:. Τιμή p έλεγχος τ μεταξύ επεξεργασμένα κύτταρα και αντίστοιχη ομάδα ελέγχου, * – p & lt? 0,01, ** – p & lt? 0,05

Η

Παρατηρήσαμε ότι υπεροξειδίου οδοκαθαριστές Tiron και TEMPOL είναι σε θέση να διασώσουν συσσώρευση HIF-1α σε κύτταρα ΤΝΡα επεξεργασμένα επιμολυσμένα με siRNA κατά ADCK2, και TRIB2 όταν εφαρμόζεται σε μία συγκέντρωση που δεν επηρεάζει σημαντικά τα κύτταρα ελέγχου (Σχ. 4β). Κύτταρα επιμολυσμένα με PRKAR2B και TRPM7 siRNA δεν επηρεάστηκαν από καθαριστών υπεροξειδίου (Σχ. 4β). Στο σύνολό τους τα δεδομένα μας δείχνουν ότι ο TNFa προκαλεί συσσώρευση HIF-1α μέσω ενός μηχανισμού που μετριάζει την παραγωγή υπεροξειδίου, και ADCK2, PRKAR2B και TRIB2 είναι θετικοί ρυθμιστές αυτού του μηχανισμού.

Οι πολλαπλές οδούς και τους παράγοντες που αναφέρονται ως ρυθμιστές της HIF- δραστηριότητα 1α σε άλλα πειραματικά συστήματα και τις προϋποθέσεις, συμπεριλαμβανομένων των συμβατικών ΝΡκΒ, JNK, STAT3, και τη δραστηριότητα του πρωτεασώματος [5]. Επιπλέον, TNFa είναι γνωστό ότι προκαλεί σηματοδότηση μέσω της συμβατικής οδού ΝΡκΒ [9], [17]. Ανάλυση των αποτελεσμάτων μας αποκάλυψαν ότι η εξάντληση των κινασών που είναι απαραίτητα για αυτά τα μονοπάτια που παράγονται δεν επηρεάζουν αρνητικά την συσσώρευση HIF-1α ΤΝΡα μεσολάβηση. Στα πειράματά μας, TNFa δεν παρήγαγε σημαντική επίδραση επί της STAT3 που εξαρτάται οδού (Εικ S7a). Υποθέσαμε ότι επειδή TNFα διεγείρει συσσώρευση HIF-1α, μπορεί επίσης να αναστέλλουν τη δραστηριότητα του πρωτεασώματος. Για το σκοπό αυτό θα δοκιμαστεί TNFα ως ένα πιθανό αγωνιστή στην U2OS_E6-AP: υποβάθμιση p53 και U2OS_SCF-Skp2 E3: δοκιμασίες Ανακατανομή υποβάθμιση p27. Η δραστηριότητα πρωτεασώματος αναστολέα MG132 επαγόμενη συσσώρευση eGFP χιμαιρών σε αμφότερες τις δοκιμασίες, ενώ η επώαση με ΤΝΡα δεν είχε καμία επίδραση (Εικ S7b, c).

Δεδομένα από πειράματα διαλογής μας υποδεικνύουν ότι η εξάντληση των ανάντη ρυθμιστές των αποτελεσμάτων JNK οδού σε ένα αύξηση της συσσώρευσης HIF-1α σε απόκριση σε θεραπεία TNFa (Πίνακας S1). Η εξάντληση των ανάντη ρυθμιστές του συμβατικού οδού ΝΡκΒ

Chuk, IKBKB ή IKBKE

δεν διαμορφώνουν συσσώρευση HIF-1α σε απόκριση σε θεραπεία ΤΝΡα (Σχήμα S8). Επιπλέον, siRNA μεσολάβηση εξάντληση αποκάλυψε ότι NFkB πρωτεΐνες RELA και NFκB2 μπορούν να ενεργούν ως αρνητικοί ρυθμιστές αυτών συσσώρευση επειδή knockdown τους παράγονται απότομη αύξηση της συσσώρευσης HIF-1α (Σχ. 5α). Σε αντίθεση, NFkB πρωτεΐνες RELB, CreL και NFκB1 φαίνεται να είναι αναγκαία για την συσσώρευση HIF-1α ΤΝΡα επαγόμενη λόγω εξάντλησης των αντίστοιχων γονιδίων που παράγονται ισχυρά αρνητικά αποτελέσματα επί της συσσώρευσης (εικ. 5α). Η ενεργοποίηση των πρωτεϊνών ΝΡκΒ συσχετίζεται με την ενδοκυτταρική μεταφορά τους [17]. Βρήκαμε ότι σε κύτταρα οστεοσαρκώματος U2OS, TNFα διεγείρει μετατόπιση των RELB και CREL μεταξύ του πυρήνα και του κυτταροπλάσματος, με RELB να αποκλειστούν από τον πυρήνα και CREL συσσωρεύεται στον πυρήνα. Παρόμοια με την εξάντληση των TNFR1, εξάντληση των TRIB2 και TRPM7 εμπόδισε την πυρηνική αποκλεισμό RELB (Εικ. 5β). CreL μετατόπιση δεν επηρεάστηκε από εξάντληση των επιλεγμένων στόχων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, η επίδραση της εξάντλησης RELB εξασθένισε με καθαριστών υπεροξειδίου Tiron και TEMPOL (Εικ. 5c). Στο σύνολό τους τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ο TNFa-προκαλούμενη συσσώρευση HIF-1α μπορεί να διέπεται τουλάχιστον εν μέρει από ένα μη συμβατικό NFκB οδός σηματοδότησης ενεργοποιείται από TRIB2 και TRPM7.

(Α) Μείωση του NFκB1, RELB και CREL αλλά δεν NFκB2 και RELA παρεμβαίνουν συσσώρευση HIF-1α σε κύτταρα ΤΝΡα φάρμακο. (Β) Η εξάντληση των ADCK2 και PRKAR2B αποτρέπει τη συσσώρευση των RELB στους πυρήνες των κυττάρων ΤΝΡα φάρμακο. (C) Επίδραση της εξάντλησης των RELB διασώζεται από ROS οδοκαθαριστές. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όμοια με το Σχ. 4C. (D) Όλα τα δεδομένα (Μέσος όρος +/- MAD) ομαλοποιείται σε κύτταρα επιμολυσμένα με τον έλεγχο siRNA NTC1 αγωγή με TNFa (10 ng /ml, 24 ώρες). Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά δύο ανεξάρτητων πειραμάτων που εκτελούνται εις τριπλούν. *, **:. Τιμή p έλεγχος τ μεταξύ επεξεργασμένα κύτταρα και αντίστοιχη ομάδα ελέγχου, * – p & lt? 0,01, ** – p & lt? 0,05

Η

Συζήτηση

TNFα είναι καλά γνωστό για να προκαλέσει πολλαπλούς μηχανισμούς σηματοδότησης όπου διάφορες κινάσες παίξει αναντικατάστατο ρόλο. Οι πρόσφατες εξελίξεις της λειτουργικής γονιδιωματικής και τεχνικές απεικόνισης κυττάρων μας επέτρεψε να εκτελέσει συστηματική διερεύνηση των πιθανών μηχανισμών συσσώρευσης HIF-1α TNFα μεσολάβηση. Για να διερευνηθεί ο ρόλος των κινασών στη ρύθμιση του HIF-1 δραστηριότητα υπό αγωγή με ΤΝΡ-α, εμείς απεμπλουτισμένο κινάσες στα κύτταρα οστεοσαρκώματος U2OS χρησιμοποιώντας ένα χημικά τροποποιημένο βιβλιοθήκη κινάσης siRNA που στοχεύει 778 κινάσες και στη συνέχεια αναλύθηκαν πυρηνική συσσώρευση του HIF-1α-eGFP χίμαιρα συστατικώς εκφράζεται σε αυτά τα κύτταρα. Σε αυτή τη δοκιμασία, TNFa αυξήθηκε σημαντικά HIF-1α-eGFP συσσώρευση πρωτεΐνης (Εικ. 1 b, c).

Υπό κανονικές φυσιολογικές συνθήκες συσσώρευσης HIF-1α είναι σε μεγάλο βαθμό καταστέλλεται από διάφορες ρυθμιστικές οδούς. Κινάσες και σχετικών πρωτεϊνών είναι ευρέως γνωστό ότι παίζουν ένα σημαντικό ρόλο σε αυτές τις οδούς. Έτσι, αναμένεται ότι η πλειονότητα των siRNA χτυπήσει υποψήφιοι θα παρείχε μια απελευθέρωση από την καταστολή της συσσώρευσης HIF-1α. Πράγματι, μεταξύ των 788 κινασών διαλογή με siRNA μεσολάβηση αποσιώπηση, εξάντληση των 6 κινασών μειώθηκε σημαντικά συσσώρευση HIF-1α και η εξάντληση του άλλου 89 κινασών αυξημένη HIF-1 δραστικότητα σε κύτταρα κατεργασμένα με ΤΝΡα (Σχ. 2α, b και Πίνακας S1).

Σε κάποιο βαθμό, τα δεδομένα μας ανακεφαλαιώνει τα προηγούμενα ευρήματα σχετικά με αρνητικοί ρυθμιστές της δραστηριότητας HIF-1α [18]. Έχει αναφερθεί ότι SMG-1 καταστέλλει δραστικότητα HIF-1 υπό συνθήκες υποξίας και ότι siRNA μεσολάβηση εξάντληση του προϊόντος γονιδίου αυξάνει σημαντικά δραστικότητα ενός HIF-1α-ευαίσθητο ρεπόρτερ [18]. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων διαλογής μας δείχνουν ότι η εξάντληση των SMG-1 ειδικά up-ρυθμίζει ΤΝΡα επαγόμενη HIF-1α συσσώρευση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Αρκετές οδοί βρέθηκαν να είναι σημαντικά υπερεκπροσωπούνται στην ομάδα των 77 αρνητικοί ρυθμιστές: 16 γονίδια που αντιπροσωπεύει GO: 0007049 κυτταρικού κύκλου (

NEK4

,

TAF1L

,

CKS2

,

TTK

,

MAP3K8

,

PIM2

,

TLK1

,

PPP2CA

,

NEK9

,

PRKAG1

,

NEK6

,

PLK4

,

DGKZ

,

DUSP1

,

Pim1

,

PRKAA2

), 11 γονίδια που αντιπροσωπεύει GO: καταρράκτη σηματοδότησης 0.000.165 ΜΑΡΚΚΚ (

PPP2CA

,

RPS6KA3

,

DUSP5

,

MAPKAPK3

,

MAPK8IP3

,

MAP4K5

,

DUSP2

,

MAPK11

,

MAP4K1

,

DUSP1

,

MAP3K9

), και τέσσερις κινάσες αντιπροσωπεύουν GO: κλιμακωτού συστήματος 0.007.254 JNK (

MAP4K1

,

MAP4K5

,

MAPK8IP3

,

MAP3K9

) (Πίνακας S1). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι οι εν λόγω οδοί μπορεί να αντιταχθεί σηματοδότησης TNFa και αναστέλλουν συσσώρευση HIF-1α.

Η εξάντληση πολλών γονιδίων στόχων αναστέλλουν τον ΤΝΡα με τη μεσολάβηση HIF-1α συσσώρευση (Εικ. 2). Αυτά τα γονίδια μπορεί να αντιπροσωπεύουν έναν ή περισσότερους μηχανισμούς σηματοδότησης TNFa, και είναι ιδιαίτερου ενδιαφέροντος. Στην εκστρατεία ελέγχου μας εντόπισε έξι στόχους αυτού του είδους (Σχ. 2β). Επιπλέον, τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι τέσσερα από αυτά τα γονίδια –

ADCK2

,

PRKAR2B

,

TRIB2

και

TRPM7

– φαίνεται να ρυθμίζει τη συσσώρευση HIF-1α σε πολλαπλές καρκινικές κυτταρικές σειρές (Εικ. 2, το Σχ S4). Και τα τέσσερα γονίδια που περιγράφηκε προηγουμένως σε σχέση με ρύθμιση του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων και την κινητικότητα, αλλά τα υπάρχοντα δεδομένα δεν υποδηλώνουν τη συμμετοχή τους σε TNFα σηματοδότηση [19] – [23]. Οι λειτουργίες του

ADCK2

πρωτεΐνη δεν είναι ακόμη σαφές. Δεν είναι γνωστό αν έχει δραστηριότητα κινάσης πρωτεΐνης και τι είδους υπόστρωμα θα φωσφορυλιώνει. Αρκετές αναφορές δημιουργήσει μια σύνδεση του

ADCK2

για τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και την κινητικότητα [20].

PRKAR2B

κωδικοποιεί την cAMP-εξαρτώμενη πρωτεϊνική κινάση τύπου II-βήτα ρυθμιστική υπομονάδα. Η cAMP-εξαρτώμενη πρωτεϊνική κινάση Α (ΡΚΑ) είναι μία πανταχού παρούσα πρωτεϊνική κινάση σερίνης /θρεονίνης. ΡΚΑ γίνεται αποδεκτή ως ένας κύριος μεσολαβητής ενδοκυτταρικών σημάτων cAMP στα ευκαρυωτικά. Μέχρι σήμερα, ένας μεγάλος αριθμός των κυτταροπλασματικών και μερικά υποστρώματα πυρηνική ΡΚΑ έχει αναφερθεί [23]. Είναι ενδιαφέρον ότι, η εξάντληση του

PRKAA1

(η καταλυτική υπομονάδα του ΡΚΑ) παρήγαγε επίσης μια μείωση στην συσσώρευση HIF-1α αν και σε μικρότερο βαθμό από ό, τι

PRKAR2B

εξάντληση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Περαιτέρω μελέτες είναι απαραίτητο να διευκρινιστεί ο ακριβής ρόλος της PKA στη συσσώρευση HIF-1α TNFα-τονωθεί. Αν και η μοριακή λειτουργία του TRIB2 (Tribbles ομόλογο 2) είναι ακόμα ασαφής, έχει αναγνωριστεί ως ένα δυναμικό πρόγραμμα οδήγησης του πνεύμονα ογκογένεσης και μυελοειδούς ογκογονιδίου [21], [22]. TRPM7 είναι μια εκφράζεται παντού και ουσιαστικά δραστική δισθενούς κανάλι κατιόν. Παρέχει ένα μηχανισμό για την είσοδο Mg2 + και ως εκ τούτου είναι σημαντικό για την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό κυττάρων [19], [24]

Βασικά ρυθμιστές των σηματοδοτικών οδών TNFα είναι αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS?.

π.χ.

., δισμουτάση, υπεροξείδιο του υδρογόνου, και ρίζα υδροξυλίου) [6], [15]. ROS έχουν προταθεί για να διαμορφώνει σηματοδότηση TNFa, παρέχοντας τόσο θετική και αρνητική ρύθμιση του συστήματος ΝΡκΒ κατάντη του TNFR1, ανάλογα με το πειραματικό σύστημα και τις συνθήκες [6], [25]. Τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι το υπεροξείδιο του υδρογόνου καταστέλλει συσσώρευση HIF-1α ΤΝΡα μεσολάβηση (Σχ. 4α). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η πηγή του ενδοκυτταρικού υπεροξειδίου του υδρογόνου, το ανιόν υπεροξειδίου μπορεί να αναστέλλει τη συσσώρευση HIF-1α ΤΝΡα μεσολάβηση, καθώς και. Υποθέσαμε ότι τα πρόσφατα περιγράφεται ρυθμιστές της συσσώρευσης μπορεί να προκαλέσει την επίδρασή τους μέσω της διαφοροποίησης της παραγωγής υπεροξειδίου. Πράγματι, ανακούφιση της δραστηριότητας ανιόντος υπεροξειδίου διασώζει συσσώρευση HIF-1α στο φόντο της εξάντλησης των ADCK2 και TRIB2 (Εικ. 4β). Όλα αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι η συσσώρευση HIF-1α ΤΝΡα επαγόμενη μπορεί να ρυθμίζεται από μια ευαίσθητη οδό υπεροξειδίου και ότι οι πιο πάνω τρεις πρωτεΐνες μπορεί να εμπλέκονται σε αρνητική ρύθμιση της παραγωγής υπεροξειδίου (Εικ. 6).

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ο υποδοχέας TNFR1 μπορούν να μεταβιβάσουν επίδραση του μέσω ενός πολύπλοκου μηχανισμού που περιλαμβάνει ένα μη συμβατικό NFkB-εξαρτώμενη οδό. Αυτός ο μηχανισμός μπορεί να ρυθμίζει αρνητικά την παραγωγή των δραστικών μορφών οξυγόνου και φαίνεται να ελέγχεται από TRIB2, ADCK2 και PRKAR2B.

Η

Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι τα συμβατικά και μη συμβατικά NFκB σηματοδότησης καταρράκτες είναι σημαντικοί μηχανισμοί που μεταφέρουν αποτελέσματα του TNFα σε ενδο-κυτταρική φυσιολογία [26]. αποτελέσματα ελέγχου μας υποδηλώνουν ότι η μείωση των θετικών ρυθμιστών ανάντη των συμβατικών NFκB – ΙΚΚ-α (

Chuk

), ΙΚΚ-β (

IKKB

) ή ΙΚΚ-ε (

IKBKE

) – δεν προσκόμισε κανένα αρνητικό αντίκτυπο στην HIF-1α πυρηνική συσσώρευση (Σχ S8)

Επίσης, βρήκαμε ότι η εξάντληση των

RELA

και

NFKB2

οδηγεί σε σημαντική. προς τα πάνω ρύθμιση της συσσώρευσης HIF-1α ενώ εξάντληση των

RELB

,

CREL

και

NFKB1

προκαλεί μια μείωση στην συσσώρευση HIF-1α. Μια τέτοια μείωση μπορεί να διασωθεί από τον μετριασμό του υπεροξειδίου δραστηριότητα ανιόντων (Εικ. 5). Επιπλέον, η εξάντληση

TRIB2

και

TRPM7

βρέθηκε να αποτρέψει την ενδοκυτταρική μεταφορά του RELB κατά την κατεργασία με TNFa. Τα ευρήματα αυτά μας επέτρεψε να κάνουμε εικασίες ότι ο TNFα μπορεί να ρυθμίζει τη συσσώρευση του HIF-1α, μέσω των δύο συμβατικών και μη συμβατικών οδών NFκB. Το πραγματικό ποσό των συσσωρευμένων HIF-1α θα εξαρτηθεί, στη συνέχεια, σε μια ισορροπία μεταξύ των διαφόρων οδών NFκB TNFα που προκαλείται. Το προτεινόμενο μοντέλο φαίνεται να είναι σύμφωνη με τη γνωστή πολυπλοκότητα της φλεγμονής του καρκίνου σχέσεις [3].

Όλα μαζί τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ο TNFa που προκαλείται από HIF-1α συγκέντρωση ρυθμίζεται από διάφορες οδούς (Εικ. 6 ). Τουλάχιστον εν μέρει, TNFα μπορεί να μεταφέρει ισχύ του μέσω της σηματοδότησης του υποδοχέα ΤΝΡΚ1 που οδηγεί σε ένα μη-συμβατικό ΝΡκΒ-εξαρτώμενο μηχανισμό που ρυθμίζει αρνητικά την παραγωγή δραστικών ειδών οξυγόνου. Αυτός ο μηχανισμός φαίνεται να ελέγχεται από ADCK2 και TRIB2. TRPM7 φαίνεται να διεγείρει RELB μετατόπιση, αλλά φαινότυπο εξάντληση της δεν μπορεί να διασωθεί από την ανακούφιση του υπεροξειδίου δραστηριότητας. Έτσι TRPM7 μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα ανεξάρτητο μονοπάτι της ρύθμισης της συσσώρευσης HIF-1α. Περαιτέρω μελέτες είναι απαραίτητες για να κατανοήσουν την μεγαλύτερη πολυπλοκότητα του TNFα-εξαρτώμενη διέγερση της πυρηνικής συσσώρευσης HIF-1α και ο ρόλος του στην ογκογένεση και την εξέλιξη του όγκου.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές

PC3, DU145, LNCaP, ΜΟΡ10Α, ΜϋΑΜΒ-231, MCF7, SW480 και HepG2 ελήφθησαν από την ATCC και συντηρούνται σύμφωνα με τις συνιστώμενες πρωτόκολλα.

δοκιμασία Ανακατανομή HIF-1α_U2OS χρησιμοποιήθηκε στην εκστρατεία ελέγχου για την παρακολούθηση της HIF- 1α πυρηνική συσσώρευση: ανασυνδυασμένα κύτταρα U2OS σταθερώς εκφράζουν ανθρώπινο

HIF-1α

(NM_001530) συντηγμένο με το Ο-άκρο της ενισχυμένης πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (eGFP). κύτταρα U2OS είναι προσκολλημένα επιθηλιακά κύτταρα που προέρχονται από ανθρώπινο οστεοσάρκωμα. Η έκφραση του eGFP-HIF-1α ελέγχεται από ένα πρότυπο υποκινητή CMV και συνεχή έκφραση διατηρείται με την προσθήκη G418 στο μέσο καλλιέργειας σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. U2OS σταθερή κυτταρική σειρά που εκφράζει eGFP μόνο χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος αφαίρεση στην εκστρατεία διαλογής

Εκτός από HIF-1α_U2OS η επίδραση της θεραπείας TNFα δοκιμάστηκε σε τρεις χωριστές Thermo Fisher Scientific αναδιανομή Δοκιμασίες:. Η δοκιμασία STAT3_U2OS αναδιανομή , το Ε6-ΑΡ: υποβάθμιση του p53 Ανακατανομή Δοκιμασία (U2OS), και η SCF-Skp2 E3 λιγάσης: υποβάθμιση του p27 Ανακατανομή Δοκιμασία (U2OS). Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή για όλες τις ενώσεις αναφοράς. Για TNFα-θεραπεία, κάθε κύτταρο δοκιμασία γραμμή υποβλήθηκε σε επεξεργασία για 24 ώρες στους 37 ° C με ΤΝΡα στις ακόλουθες συγκεντρώσεις: 80 ng /ml, 40 ng /mL, 20 ng /mL, 10 ng /mL, 5 ng /ml, 2,5 ng /mL, 1,25 ng /mL, και 0.63 ng /mL. Κάθε τιτλοδότηση ΤΝΡα εκτελέστηκε εις τετραπλούν σε πλάκες δοκιμασίας 96 φρεατίων, και κάθε πλάκα ανάλυσης πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν. Μετά τη θεραπεία TNFa, πλάκες σταθεροποιήθηκαν, χρωματίστηκαν με Hoechst 33258, και απεικονίζεται όπως περιγράφεται παρακάτω. ΤΝΡα αγοράστηκε από την R &? D Systems, υπεροξείδιο του υδρογόνου, Hoechst 33258, Tiron και 4-υδροξυ-ΤΕΜΡΟ (TEMPOL) αγοράστηκαν από την Thermo Fisher Scientific

Η επιμόλυνση

Όλες οι κυτταρικές σειρές επιμολύνθηκαν. με Dharmafect (DF) αντιδραστήρια επιμόλυνσης (Thermo Fisher Scientific): DF1 (HepG2, MCF7, ΜΟΡ10Α), DF2 (SW480), DF3 (HIF-1α_U2OS, DU145, LNCaP, PC3) και DF4 (MDA-MB-231).